CN103257155A

CN103257155A - 基于电子鼻的小麦中矮腥黑穗病菌的快速定量检测方法

Info

Publication number: CN103257155A
Application number: CN2012100390408A
Authority: CN
Inventors: 曹学仁; 周益林; 段霞瑜; 陈万权
Original assignee: Institute of Plant Protection of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Plant Protection of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2012-02-21
Filing date: 2012-02-21
Publication date: 2013-08-21

Abstract

本发明“基于电子鼻的小麦中矮腥黑穗病菌(TCK)的快速定量检测方法”可用于对小麦中TCK的快速定量检测，属于农作物病害防治和植物检疫技术领域。该发明通过分别建立电子鼻中10号传感器响应值与熏蒸或未熏蒸的小麦中不同TCK冬孢子含量之间的关系模型，从而实现对未知小麦样品中TCK冬孢子含量的定量检测。该发明不仅缩短了实现定量检测所需的时间，而且不会对损害待测样品，在检测过程中基本上不需要其他试剂，可节约定量检测成本。该发明可在我国口岸TCK检疫中大规模推广。

Description

基于电子鼻的小麦中矮腥黑穗病菌的快速定量检测方法

(一)技术领域

本发明“基于电子鼻的小麦中矮腥黑穗病菌(TCK)的快速定量检测方法”可用于对小麦中TCK的快速定量检测，属于农作物病害防治和植物检疫技术领域。

(二)背景技术

小麦矮腥黑穗病菌(Tilletia controversa Kühn，简称TCK)是一种重要的世界性检疫病原菌，由其引起的小麦矮腥黑穗病是麦类黑穗病中危害最大、极难防治的检疫性病害之一。目前，该病害已在欧洲、美洲、亚洲、非洲等30多个国家发生，尤其是美国西北部的小麦染病尤为普遍。小麦矮腥黑穗病至今仍被我国列为严禁入境的A1类检疫病害。

小麦矮腥黑穗病菌能侵染小麦、大麦、黑麦等15属60多种禾本科植物，其中对小麦危害最易且严重，小麦矮腥黑穗病引起的产量损失一般为20％-50％，严重时可达75％-90％，甚至绝产。

TCK以菌瘿混在小麦种子中或以冬孢子粘附在种子表面进行远距离传播，而且冬孢子存活时间长，可在土壤中存活3-10年，此病一旦传入和定殖很难根除。我国口岸检疫机构曾多次在由美国、加拿大、欧盟进口小麦中截获TCK冬孢子。目前研究发现该病害传入和定殖中国的风险较高，因此必须采取严格地检疫检验措施。

实现对小麦中TCK冬孢子含量的定量检测是检疫所必需的，关于对此病害的检测和定量主要从形态学、生物学及分子生物学等方面进行，但这些均需要进行病原菌的分离或病原菌DNA的提取，时间较长而且需要损害样品，因此对于口岸检疫来说，急需更加快速、准确和无损的定量检测方法。

电子鼻(electronic nose)是一种由具有选择性的化学传感器阵列和适当的模式识别系统组成，能识别简单或复杂气味的仪器。受TCK危害后的小麦籽粒变为菌瘿，具有鱼腥味，这就为利用电子鼻技术来检测小麦中的TCK提供了可能。

目前已有利用电子鼻识别小麦中TCK的研究报道，但还未见有利用该技术对小麦中TCK含量进行定量检测的研究报道。

(三)发明内容

技术问题为了减少目前用于TCK定量检测所需的时间及实现对样品的无损，本发明的目的是提供用于快速定量检测小麦中TCK含量的电子鼻方法。该方法不仅缩短了实现定量检测所需的时间，而且不会对检测样品带来任何损害。同时除了需要电子鼻仪器本身外，基本上不需要其他试剂，可节约定量检测成本。该方法可在我国口岸TCK检疫中大规模推广。

技术方案

基于电子鼻的小麦中矮腥黑穗病菌的快速定量检测方法，包括：

1)用于小麦中TCK含量定量检测的样品制备

称取50g待测小麦样品加入三角瓶中，用双层的保鲜膜封口。

2)电子鼻测定方法

采用直接顶空吸气法。即直接将进样针头插入装有小麦的双层保鲜膜密封的三角烧瓶中，电子鼻进行测定。电子鼻选用由德国AIRSENSE公司生产的PEN3型电子鼻系统，该系统含有10个不同的金属氧化物传感器，组成传感器阵列。

3)测定条件

采样时间为1秒/组，传感器自清洗时间为100秒，传感器归零时间为10秒，样品准备时间为3秒，进样流量为300ml/min，分析采样时间为40秒。

4)小麦中TCK冬孢子含量的定量

对未知样品进行电子鼻测定得到10号传感器的响应值后，根据样品是否经过熏蒸，通过建立好的熏蒸和未熏蒸小麦中TCK冬孢子含量与10号传感器响应值的关系模型计算未知样品中TCK冬孢子的含量。

有益效果

本发明基于电子鼻的小麦中矮腥黑穗病菌的快速定量检测方法，可用来定量检测小麦中TCK冬孢子的含量，与国内外现有方法相比，本发明具有以下的技术优势：

1)操作简单。本发明只需将电子鼻的进样针头插入装有样品的容器中后即可进行测定，不需要其他操作如冬孢子的分离或冬孢子DNA的提取等。

2)检测所需时间短。由于省去了冬孢子的分离或DNA的提取等步骤，本发明单个样本检测所需时间仅2Min左右。

3)成本低。本发明在样品检测过程中不需要其他试剂，大大节约了检测成本。

4)灵敏度高。利用本发明可以实现对小麦中不同TCK冬孢子含量的定量检测，包括对每50g小麦种子中TCK冬孢子含量为10个左右的样品。

因此本方法实用性强，可满足植物检疫及病害监测的需要。

(四)附图说明

图1：10号传感器响应值与未熏蒸后小麦中不同TCK冬孢子含量之间的关系

图2：10号传感器响应值与熏蒸后小麦中不同TCK冬孢子含量之间的关系

(五)具体实施方式

实施例1：未熏蒸小麦中TCK冬孢子含量与电子鼻传感器响应值关系模型的建立

1)未熏蒸小麦中不同TCK冬孢子含量样品的制备

称取50g未熏蒸小麦种子放入100ml的三角瓶中，利用血球计数板在显微镜下将TCK的冬孢子浓度配成10⁸个ml^-1并梯度稀释后，加入装有小麦种子的三角瓶中，使每50g种子中的冬孢子含量分别10⁵、10⁴、10³、10²、10¹、10⁰个和对照。用双层的保鲜膜封口。

2)电子鼻测定方法

3)测定条件

采样时间为1秒/组，传感器自清洗时间为100秒，传感器归零时间为10秒，样品准备时间为3秒，进样流量为300ml min^-1，分析采样时间为40秒。

4)小麦中TCK冬孢子含量的定量

通过不同传感器响应值和小麦中TCK冬孢子含量的关系，筛选合适的传感器，建立TCK冬孢子含量与传感器响应值的关系模型。

实施结果

传感器筛选分析结果表明，10号传感器响应值与未熏蒸小麦中TCK冬孢子数有极显著的相关性(见附图1)，建立了响应值与TCK冬孢子含量的关系模型y＝47.88x-53.568(R²＝0.7136)，其中y表示Log₁₀(TCK冬孢子含量)，x表示10号传感器的响应值。利用该模型，通过测定未知样品的响应值，可以计算未知样品中TCK冬孢子的含量，因而实现对未熏蒸小麦中TCK冬孢子含量的定量检测。

实施例2：熏蒸后小麦中TCK冬孢子含量与电子鼻传感器响应值关系模型的建立

1)熏蒸后小麦中不同TCK冬孢子含量样品的制备

称取50g经熏蒸后的小麦种子放入100ml的三角瓶中，利用血球计数板在显微镜下将TCK的冬孢子浓度配成10⁸个ml^-1并梯度稀释后，加入装有小麦种子的三角瓶中，使每50g种子中的冬孢子含量分别10⁵、10⁴、10³、10²、10¹个和对照。用双层的保鲜膜封口。

2)2)电子鼻测定方法

3)测定条件

4)小麦中TCK冬孢子含量的定量

实施结果

传感器筛选分析结果表明，10号传感器响应值与经熏蒸后小麦中TCK冬孢子数有极显著的相关性(见附图2)，建立了响应值与TCK冬孢子含量的关系模型y＝21.335x-25.313(R²＝0.7543)，其中y表示Log₁₀(TCK冬孢子含量)，x表示10号传感器的响应值。利用该模型，通过测定未知样品的响应值，可以计算未知样品中TCK冬孢子的含量，因而实现对经熏蒸后的小麦样品中TCK冬孢子含量的定量检测。

实施例3：未熏蒸小麦中TCK冬孢子含量的定量检测

1)用于小麦中TCK含量定量检测的样品制备

称取50g待测小麦样品加入三角瓶中，用双层的保鲜膜封口。

2)电子鼻测定方法

3)测定条件

4)小麦中TCK冬孢子含量的定量

对未知样品进行电子鼻测定得到10号传感器的响应值后，根据样品经过熏蒸，通过建立好的熏蒸小麦中TCK冬孢子含量与10号传感器响应值的关系模型计算未知样品中TCK冬孢子的含量。

实施结果

待测样品中10号传感器响应值为1.1974，根据熏蒸小麦中TCK冬孢子含量与10号传感器响应值的关系模型y＝47.88x-53.568(其中y表示Log₁₀(TCK冬孢子含量)，x表示10号传感器的响应值)计算得知待测样品中Log₁₀(TCK冬孢子含量)为3.77，待测样品中Log₁₀(TCK实际冬孢子含量)为4，估计值和实际值差异小于0.25，证实了可以利用电子鼻的10号传感器定量检测未熏蒸小麦中TCK冬孢子的含量。

实施例4：熏蒸后小麦中TCK冬孢子含量的定量检测

1)用于小麦中TCK含量定量检测的样品制备

称取50g待测小麦样品加入三角瓶中，用双层的保鲜膜封口。

2)电子鼻测定方法

3)测定条件

4)小麦中TCK冬孢子含量的定量

实施结果

待测样品中10号传感器响应值为1.3716，根据熏蒸小麦中TCK冬孢子含量与10号传感器响应值的关系模型y＝21.335x-25.313(其中y表示Log₁₀(TCK冬孢子含量)，x表示10号传感器的响应值)计算得知待测样品中Log₁₀(TCK冬孢子含量)为3.95，待测样品中Log₁₀(TCK实际冬孢子含量)为4，估计值和实际值相差值仅为0.05，证实了可以利用电子鼻的10号传感器定量检测熏蒸小麦中TCK冬孢子的含量。

Claims

1.在“基于电子鼻的小麦中矮腥黑穗病菌的快速定量检测方法”发明中，通过对不同传感器的筛选，发现对于熏蒸或未熏蒸的小麦，均可用10号传感器的响应值来估计小麦样品中TCK冬孢子的含量。电子鼻测定方法采用直接顶空吸气法。测定条件为：采样时间为1秒/组，传感器自清洗时间为100秒，传感器归零时间为10秒，样品准备时间为3秒，进样流量为300ml/min，分析采样时间为40秒。所需小麦样品为50g。