CN103255164A - 构建体及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了构建体及其用途。其中，该构建体包含SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。利用该构建体能够将SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列即烟草ERF2基因成功引入受体植物中，进而能够显著增强受体植物的光合作用效率，提高植物产量。

Description

构建体及其用途

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域。具体地，本发明涉及构建体及其用途。更具体地，本发明涉及构建体、重组细胞及其在制备转基因植物细胞、组织、器官或其培养物、转基因植物中的用途，转基因植物细胞、组织、器官或其培养物，以及制备转基因植物的方法。 

背景技术

作物的物质积累途径主要是通过光合作用，现阶段高光效育种是培育高产植物品种的新途径。然而，常规育种能够利用的遗传资源十分有限，要获得更好的高光效株系或品种，需通过现代生物技术特别是分子育种技术引入优异的基因资源，从而创新出高光效种质。 

随着基因测序、分子育种技术、转基因技术的不断成熟和完善，筛选发掘优异的光合效率及产量相关基因并利用该基因进行遗传转化以获得高光效植物及种质，已得以实现，然而，上述研究仍有待改进。 

发明内容

本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提出一种能够提高植物光合作用效率及产量的手段。 

需要说明的是，本发明是基于发明人的下列发现而完成的： 

发明人采用常规育种与生物技术相结合的方法，将植物高光效基因-烟草ERF2基因成功导入受体水稻并表达，并通过多次试验验证了烟草ERF2基因的转化能够提高受体植物光合作用效率，进而提高其产量。 

具体地，发明人人工合成烟草ERF2基因——制备含有该基因的构建体（即重组表达载体）——通过直接法转化根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）LBA4404——利用上述农杆菌转化水稻愈伤组织——愈伤组织GUS染色——再生植株GUS染色——转基因小苗移植到大田中进行性状观察，并测定光合速率。结果，发明人发现： 

1、通过根癌农杆菌介导法将烟草ERF2基因转入水稻愈伤组织中，愈伤组织和再生植物GUS染色的结果表明，烟草ERF2基因已成功导入受体水稻基因组中； 

2、田间性状调查结果表明，转ERF2基因水稻的基本农艺性状和经济性状都明显优于野生对照组。具体表现为：在生育期，转基因水稻的长势旺盛，分蘖快且多，植株健壮，有效穗、剑叶宽、穗长等性状显著优于对照组，初步说明转ERF2基因水稻的光合作用效率提高；此外，光合速率测定结果表明转ERF2基因水稻的光合速率明显高于野生对照组。在成熟期，转基因水稻的单株饱粒数性状表现明显优于野生对照组，而单株饱粒数性状直接与产 量正相关，从而表明转ERF2基因可以提高水稻产量。 

由此，本发明提出了包含烟草ERF2基因的构建体及其在提高植物光合作用效率中的用途。 

根据本发明的一个方面，本发明提供了一种构建体。根据本发明的实施例，该构建体包含SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。发明人惊奇地发现，利用该构建体能够将SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列即烟草ERF2基因（在本文中有时也简称为“ERF2基因”）成功引入受体植物中，进而能够通过ERF2基因的表达而显著增强受体植物的光合作用效率，进一步能够有效提高受体植物的产量，从而为高光效育种提供了理论基础，为培育具有高光合能力、低呼吸消耗、光合机能持久、株型与长势长相均理想的高产植物品种例如水稻品种提供了新途径。 

根据本发明的一些实施例，本发明的构建体呈选自质粒、噬菌体、人工染色体、粘粒以及病毒的至少一种的形式，优选质粒的形式。由此，能够有效提高利用该构建体进行遗传转化的效率。 

根据本发明的一个实施例，本发明的构建体进一步包含：玉米Ubi启动子；以及NOS终止子。由此，能够有效提高遗传转化的效率。 

根据本发明的又一方面，本发明还提供了一种重组细胞。根据本发明的实施例，该重组细胞包含前面所述的构建体。利用该重组细胞转化植物，能够将烟草ERF2基因成功引入受体植物中，进而能够显著增强受体植物的光合作用效率，从而能够有效提高受体植物的产量。 

根据本发明的一些具体示例，优选地，本发明的重组细胞为重组根癌农杆菌EHA105-p6+ERF2细胞。发明人发现，利用该重组细胞转化受体植物，获得的转基因植物的阳性率非常高。 

根据本发明的再一方面，本发明还提供了前面所述的构建体和重组细胞，在制备转基因植物细胞、组织、器官或其培养物及转基因植物中的用途。 

根据本发明的另一方面，本发明还提供了一种转基因植物细胞、组织、器官或其培养物。根据本发明的实施例，该转基因植物细胞、组织、器官或其培养物是通过使用前面所述的构建体或者重组细胞转化受体植物细胞、组织或器官而获得的。根据本发明的实施例，该转基因植物细胞、组织、器官或其培养物，能够有效表达烟草ERF2基因，将其于适宜条件下培养后，能够有效获得具有高光合能力、低呼吸消耗、光合机能持久的高产转基因植物。 

根据本发明的又一方面，本发明还提供了一种制备转基因植物的方法，根据本发明的实施例，该方法包括：使用前面所述的构建体或者重组细胞，转化受体植物细胞、组织或器官；以及分离转基因植物细胞、组织或器官，并于适宜条件下进行培养，以便获得转基因植物。发明人惊奇地发现，利用该方法能够高效地制备能够有效表达烟草ERF2基因的转基因植物，并且该转基因植物，具有高光合能力、低呼吸消耗、光合机能持久的等优点，光合作用效率非常高。 

根据本发明的一些实施例，在本发明的制备转基因植物的方法中，利用农杆菌介导法进行所述转化，所述受体植物呈愈伤组织的形式。由此，遗传转化效率非常高。 

根据本发明的再一方面，本发明还提供了一种转基因植物或其后代。根据本发明的实施例，该转基因植物或其后代是通过权前面所述的制备转基因植物的方法获得的。发明人发现，该转基因植物或其后代，具有高光合能力、低呼吸消耗、光合机能持久的等优点，光合作用效率非常高。 

根据本发明的又一方面，本发明还提供了一种增强植物光合作用，提高产量的方法。根据本发明的实施例，该方法为：根据前面所述的制备转基因植物的方法，制备转基因植物，使所述转基因植物表达烟草ERF2基因。由此，能够有效地使得转基因植物的光合作用增强，产量显著提高。 

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。 

附图说明

本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中： 

图1显示了根据本发明一个实施例，ERF2基因PCR扩增产物的电泳检测图； 

图2显示了根据本发明一个实施例，经含有p6+ERF2重组载体的根癌农杆菌转化的水稻愈伤组织及对照的GUS染色结果； 

图3显示了根据本发明一个实施例，经含有p6+ERF2重组载体的根癌农杆菌转化的水稻幼苗及对照的根、叶的GUS染色结果； 

图4显示了根据本发明一个实施例，转ERF2基因水稻田间种植后的生育期性状调查结果； 

图5显示了根据本发明一个实施例，转ERF2基因水稻T1代田间种植后各株系灌浆期的光合速率测定结果。 

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。 

其中，烟草ERF2基因的核苷酸序列如下所示： 

ATGTATCAACCAATTTCGACCGAGCTACCTCCGACGAGTTTCAGTAGTCTCATGCCATGTTTGACGGATACATGGGGTGACTTGCCGTTAAAAGTTGATGATTCCGAAGATATGGTAATTTATGGGCTCTTAAGTGACGCTTTAACTGCCGGATGGACGCCGTTTAATTTAACGTCCACCGAAATAAAAGCCGAGCCGAGGGAGGAGATTGAGCCAGCTACGATTCCTGTTCCTTCAGTGGCTCCACCTGCGGAGACTACGACGGCTCAAGCCGTTGTTCCCAAGGGGAGGCATTATAGGGGCGTTAGGCAAAGGCCGTGGGGGAAATTTGCGGCGGAAATAAGGGACCCAGCTAAAAACGGCGCACGGGTTTGGCTAGGGACTTATGAGACGGCTGAAGAAGCCGCGCTCGCTTATGATAAAGCAGCTTACAGGATGCGCGGCTCCAAGGCTCTATTGAATTTTCCGCATAGGATCGGCTTAAATGAGCCTGAACCGGTTAGACTAACCGCTAAGAGACGATCACCTGAACCGGCTAGCTCGTCAATATCATCGGCTTTGGAAAATGGCTCGCCGAAACGGA GGAGAAAAGCTGTAGCGGCTAAGAAGGCTGAATTAGAAGTGCAAAGCCGATCAAATGCTATGCAAGTTGGGTGCCAGATGGAACAATTTCCAGTTGGCGAGCAGCTATTAGTCAGTTAA（SEQ ID NO：1） 

发明人发现并证明了烟草ERF2基因是与植物光合作用效率相关的功能基因，进而提出了下述提高植物光合作用效率及产量的手段。 

构建体、重组细胞及其用途 

根据本发明的一个方面，本发明提供了一种构建体。根据本发明的实施例，该构建体包含SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。发明人惊奇地发现，利用该构建体能够将SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列即烟草ERF2基因（在本文中有时也简称为“ERF2基因”）成功引入受体植物中，进而能够通过ERF2基因的表达而显著增强受体植物的光合作用效率，进一步能够有效提高受体植物的产量，从而为高光效育种提供了理论基础，为培育具有高光合能力、低呼吸消耗、光合机能持久、株型与长势长相均理想的高产植物品种例如水稻品种提供了新途径。 

在本发明中所使用的术语“构建体”是指这样的一种遗传载体，其包含特定核酸序列，并且能够将目的核酸序列转入宿主细胞中，使目的核酸序列整合到宿主细胞的基因组上，以获得重组细胞。根据本发明的实施例，构建体的形式不受特别限制。根据本发明的实施例，其可以为质粒、噬菌体、人工染色体、粘粒（Cosmid）、病毒的至少一种。根据本发明的具体示例，构建体呈质粒的形式。质粒作为遗传载体，具有操作简单，可以携带较大片段的性质，便于操作和处理。质粒的形式也不受特别限制，既可以是环形质粒，也可以是线性质粒，即可以是单链的，也可以是双链的。本领域技术人员可以根据需要进行选择。在本发明中所使用的术语“核酸”可以是任何包含脱氧核糖核苷酸或者核糖核苷酸的聚合物，包括但不限于经过修饰的或者未经修饰的DNA、RNA，其长度不受任何特别限制。对于用于构建重组细胞的构建体，优选所述核酸为DNA，因为DNA相对于RNA而言，其更稳定，并且易于操作。 

根据本发明的实施例，构建体中还可以包含其他的元件，从而为构建体赋予额外的有益效果。根据本发明的一个实施例，构建体可以进一步包含启动子序列和终止子序列。在本发明中所使用的术语“启动子”指的是这样一种核酸序列，其能够指导与其可操纵地连接的核酸分子的转录。在本发明中所使用的术语“可操纵地”指的是核酸表达控制序列例如启动子、信号序列、增强子等与目标核酸序列之间的功能连接，其中当合适的分子例如转录活化分子与表达控制序列结合时，表达控制序列影响着对应于目标核酸序列的核酸的转录和/或翻译。由此，可以直接通过构建体在植物细胞中引入特定的启动子，并且该启动子可以用于启动SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列即烟草ERF2基因的转录和表达，由此，可以提高所获得的重组细胞中ERF2基因的表达效率。 

根据本发明的一些具体示例，本发明的构建体进一步包括玉米泛素(ubi)启动子和NOS终止子。由此，能够显著提高目的核酸序列ERF2基因的整合效率。 

根据本发明的一个实施例，构建体可以进一步包括筛选标记基因。在本发明中所使用的 术语“筛选标记基因”指的是这样的一种基因，其编码的产物能够赋予连同载体接受该基因的细胞一种特殊的性质，该特殊的性质使得接受该基因的细胞与未接受该基因的细胞很容易被区分开。由此，便于筛选接受构建体的植物细胞。根据本发明的实施例，筛选标记基因的类型不受特别限制，根据本发明的一些具体示例，所述筛选标记基因为药物抗性基因。由此，容易地通过接受外源构建体的重组细胞的抗药性来进行筛选，例如在培养基中添加杀菌剂，则相应连同载体接受并表达杀菌剂抗性基因的细胞将在培养基上能够存活下来。根据本发明的具体示例，该筛选标记基因可以为选自新霉素抗性基因、潮霉素抗性基因和羧苄青霉素抗性基因的至少一种，优选霉素抗性基因和羧苄青霉素抗性基因。由此，能够进一步提高筛选接受外源构建体的重组细胞的效率。 

根据本发明的一个实施例，构建体可以进一步包括编码报告蛋白的序列。在本发明中所使用的术语“报告蛋白”是指这样的一种蛋白质，其在表达后，能够产生可以直接或者间接检测的信号，进而能够反映构建体所携带的外源核酸序列是否已经在细胞中被成功表达。根据本发明的实施例，报告蛋白的种类并不受特别限制，只要其具有可检测的活性即可。根据本发明的实施例，报告蛋白可以是一种能够产生光学信号的蛋白质例如发光蛋白或者荧光蛋白例如绿色荧光蛋白等。由此，可以根据常规的方法，对所述报告蛋白进行监测。例如可以采用：比色法、荧光法、生物发光法、化学发光法、酶联免疫法(ELISA)及原位染色法对报告蛋白进行检测。从而，通过上述方法，就能够便捷高效地确定构建体所携带的外源核酸序列是否已经在细胞中被成功表达。 

在本发明中，重组载体P6是指，包含玉米泛素启动子和NOS终止子的Pcambia-1301载体。 

根据本发明的一个具体示例，本发明的构建体为重组载体p6+ERF2。发明人惊奇地发现，利用该构建体进行遗传转化效率非常高。 

上面对根据本发明实施例的构建体进行了描述。当然，本领域技术人员能够理解的，构建体还可以包含其他常规的元件以促进构建体被转入宿主细胞中并且整合到宿主细胞的基因组上，正常发挥功能，例如复制起点、多克隆位点等。在此对这些元件不再赘述。 

根据本发明的又一方面，本发明还提供了一种重组细胞。根据本发明的实施例，该重组细胞包含前面所述的构建体。利用该重组细胞转化植物，能够将烟草ERF2基因成功引入受体植物中，进而能够显著增强受体植物的光合作用效率，从而能够有效提高受体植物的产量。 

根据本发明的一些具体示例，优选地，本发明的重组细胞为重组根癌农杆菌EHA105-p6+ERF2细胞。由此，利用该重组细胞转化受体植物，获得的转基因植物的阳性率非常高。 

根据本发明的再一方面，本发明还提供了前面所述的构建体和重组细胞，在制备转基因植物细胞、组织、器官或其培养物及转基因植物中的用途。 

转基因植物细胞、组织、器官或其培养物、转基因植物及其制备方法 

根据本发明的另一方面，本发明还提供了一种转基因植物细胞、组织、器官或其培养物。 根据本发明的实施例，该转基因植物细胞、组织、器官或其培养物是通过使用前面所述的构建体或者重组细胞转化受体植物细胞、组织或器官而获得的。根据本发明的实施例，该转基因植物细胞、组织、器官或其培养物，能够有效表达烟草ERF2基因，将其于适宜条件下培养后，能够有效获得具有高光合能力、低呼吸消耗、光合机能持久的高产转基因植物。这里所使用的术语“培养物”指的是，将转基因植物细胞、组织、器官在适于生长的条件下进行培养，所得到的衍生物，这些衍生物具有与原始的转基因植物细胞、组织、器官相同的基因组。 

其中，根据本发明的一些实施例，使用前面所述的构建体或者重组细胞转化受体植物细胞、组织或器官的方法不受特别限制，只要能够将构建体或者重组细胞中所携带的ERF2基因有效地引入受体植物细胞、组织或器官中即可。根据本发明的一些具体示例，可以通过农杆菌介导法进行所述转化。由此，能够有效提高遗传转化的效率。 

根据本发明的又一方面，本发明还提供了一种制备转基因植物的方法，根据本发明的实施例，该方法包括：使用前面所述的构建体或者重组细胞，转化受体植物细胞、组织或器官；以及分离转基因植物细胞、组织或器官，并于适宜条件下进行培养，以便获得转基因植物。需要说明的是，本文中所使用的表达方式“于适宜条件下进行培养”应作广义理解，其涵盖了从转基因植物细胞、组织或器官获得植物个体过程中所经历的各种为细胞/细胞集合体提供能量的操作，并且对转基因植物细胞、组织或器官进行培养的条件不受特别限制，任何能够实现“培养”的各种操作条件均可。发明人惊奇地发现，利用该方法能够高效地制备能够有效表达烟草ERF2基因的转基因植物，并且相对于野生型，该转基因植物具有高光合能力、低呼吸消耗、光合机能持久的等优点，光合作用效率非常高。 

根据本发明的实施例，使用本发明的构建体或者重组细胞转化受体植物细胞、组织或器官的方法不受特别限制。根据本发明的一些具体示例，可以通过农杆菌介导法进行所述转化。由此，可以提高将构建体引入宿主植物细胞中的效率，并且可以方便地筛选目的核酸序列与宿主细胞的染色体成功地发生整合的转基因细胞、组织或器官，进一步能够提高制备转基因植物的效率。需要说明的是，在本文中所使用的术语“转化”与“转染”是可以互换使用的，均是指将外源核酸序列引入宿主细胞中的操作。 

根据本发明的一个实施例，在本发明的制备转基因植物的方法中，转化受体的形式不受特别限制，可以为细胞、组织或器官，只要能够有效接收构建体或重组细胞中所携带的外源核酸序列即可。根据本发明的一个具体示例，受体植物呈愈伤组织的形式。由此，外源核酸序列的整合效率非常高。 

根据本发明的实施例，在本发明的制备转基因植物的方法中，受体植物的种类不受特别限制。根据本发明的一些实施例，受体植物可以为单子叶植物和双子叶植物，优选单子叶植物，更优选水稻、谷子、小麦和玉米，最优选水稻。 

需要说明的是，在本文中所使用的表达方式“分离转基因植物细胞、组织或器官”是指，根据构建体所携带的核酸序列例如筛选标记基因或报告蛋白基因，以及所采用的遗传转化方法，来选择相应的筛选方法，以便区分接受目的基因的个体与未接受目的基因的个体，分离 选择出接受构建体的植物细胞、组织或器官，即转基因植物细胞、组织或器官。例如，当构建体携带有筛选标记基因例如药物抗性基因时，能够通过接受外源构建体的转基因细胞的抗药性来进行筛选，例如在培养基中添加杀菌剂，则相应连同载体接受并表达杀菌剂抗性基因的细胞、组织或器官将在培养基上能够存活下来；当构建体携带有报告蛋白例如发光蛋白或者荧光蛋白时，可以采用：比色法、荧光法、生物发光法、化学发光法、酶联免疫法(ELISA)及原位染色法对报告蛋白进行检测，则连同载体接受并表达报告蛋白基因的细胞、组织或器官发出荧光。从而，通过上述方法，就能够便捷高效地区分接受目的基因的与未接受目的因的受体植物细胞、组织或器官，进而筛选分离出转基因植物细胞、组织或器官。 

根据本发明的再一方面，本发明还提供了一种转基因植物或其后代。根据本发明的实施例，该转基因植物或其后代是通过权前面所述的制备转基因植物的方法获得的。发明人发现，该转基因植物或其后代，具有高光合能力、低呼吸消耗、光合机能持久的等优点，光合作用效率非常高。 

根据本发明的又一方面，本发明还提供了一种增强植物光合作用，提高产量的方法。根据本发明的实施例，该方法为：根据前面所述的制备转基因植物的方法，制备转基因植物，使所述转基因植物表达烟草ERF2基因。由此，能够有效地使得转基因植物的光合作用增强，产量显著提高。其中，根据本发明的一些实施例，所述植物为水稻。由此，获得的转基因水稻，相对于野生型，光合作用显著增强，产量提高明显。 

需要说明的是，本发明的构建体及其用途，是本申请的发明人经过艰苦的创造性劳动和优化的工作才发现以及完成的。 

下面参考具体实施例，对本发明进行说明，需要说明的是，这些实施例仅仅是说明性的，而不能理解为对本发明的限制。 

若未特别指明，实施例中所采用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，可以参照《分子克隆实验指南》第三版或者相关产品进行，所采用的试剂和产品也均为可商业获得的。未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法，所用试剂的来源、商品名以及有必要列出其组成成分者，均在首次出现时标明，其后所用相同试剂如无特殊说明，均与首次标明的内容相同。 

实施例1构建体制备 

一、烟草ERF2基因的合成和载体pMD18-T+ERF2的构建 

1.PCR扩增 

通过Trizol法，利用RNA提取试剂盒(life公司，目录号：15596-026)提取烟草NC89（Tabacco）的总RNA，然后利用反转录试剂盒（TaKaRa，目录号：D6110A）将提取获得的总RNA反转录为cDNA。根据该基因在mRNA中的序列，分别在首尾设计一对PCR特异性扩增引物：上游引物F3（SEQ ID NO:7），加限制性酶切位点BamHI和保护碱基；下游引物R3（SEQ ID NO:8），加限制性酶切位点SbfI和保护碱基。以上述反转录烟草NC89的cDNA为模板，利用上游引物F3、下游引物R3和高保真Ex Taq^TM（TaKaRa，目录号： DRR100B）聚合酶进行PCR扩增。PCR扩增体系如表1所示。 

表1 

PCR扩增程序为：94℃预变性5min，然后以94℃变性45s，55℃退火50s，72℃延伸90s，进行30个反应循环，最后72℃延伸7min。 

其中，上游引物F3：AAGGATCCATGTATCAACCAATTTCGAC（SEQ ID NO:7），其中下划线代表BamHI酶切位点。下游引物R3：AACCTGCAGGTTAACTGACTAATAGCTGCTC（SEQ ID NO:8），其中下划线代表SbfI酶切位点。 

PCR扩增产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳分离，得到大小为702bp的条带（见图1），使用TIANGEN琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒（目录号：DP209-03）进行纯化回收。其中，如图1所示，泳道1：分子量标准DL2000，泳道2：PCR产物。 

2、pMD18-T+ERF2重组载体的构建 

将上述得到的PCR扩增产物进行T/A克隆（pMD18-T质粒，TaKaRa，D103A），转化大肠杆菌，挑取阳性克隆测序，证明目的基因准确。 

其中，T/A克隆的连接条件如下： 

于16℃在节能型智能恒温槽（宁波新芝，SDC-6）中连接8h以上，得到pMD18-T+ERF2重组载体。将经过上述连接后的产物按照如下方法转化大肠杆菌： 

从超低温冰箱中取出按照《分子克隆实验指南》（第三版，科学出版社）所示氯化钙法制备的感受态细胞100μl DH5α（中国科学院昆明动物研究所董杨提供；或者可从例如：上海生工购得），冰上融化后，加入10μl如上所得的连接产物，即pMD18-T+ERF2重组载体，轻轻搅匀，冰浴30min，42℃热激60s，冰浴5min，加入600μl4℃预冷的SOC培养基（具体配方详见《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社，通过参照将其全文并入本文），37℃220rpm复苏45min，8000rpm离心30s，去上清，留取150μl，用剩下的150μl上 清重悬沉淀后的混合物，轻轻吹匀，玻璃珠涂布LB（加卡那霉素，Kan）平板（具体配方详见《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社，通过参照将其全文并入本文），37℃倒置培养16-24h。获得含有pMD18-T+ERF2克隆载体的重组大肠杆菌，命名为DH5α-ERF2。 

委托深圳华大基因科技股份有限公司对上述获得的pMD18-T+ERF2克隆载体中的ERF2基因进行测序，结果如下： 

CGAGCTACCTCCGACGAGTTTCAGTAGTCTCATGCCATGTTTGACGGATACATGGGGTGACTTGCCGTTAAAAGTTGATGATTCCGAAGATATGGTAATTTATGGGCTCTTAAGTGACGCTTTAACTGCCGGATGGACGCCGTTTAATTTAACGTCCACCGAAATAAAAGCCGAGCCGAGGGAGGAGATTGAGCCAGCTACGATTCCTGTTCCTTCAGTGGCTCCACCTGCGGAGACTACGACGGCTCAAGCCGTTGTTCCCAAGGGGAGGCATTATAGGGGCGTTAGGCAAAGGCCGTGGGGGAAATTTGCGGCGGAAATAAGGGACCCAGCTAAAAACGGCGCACGGGTTTGGCTAGGGACTTATGAGACGGCTGAAGAAGCCGCGCTCGCTTATGATAAAGCAGCTTACAGGATGCGCGGCTCCAAGGCTCTATTGAATTTTCCGCATAGGATCGGCTTAAATGAGCCTGAACCGGTTAGACTAACCGCTAAGAGACGATCACCTGAACCGGCTAGCTCGTCAATATCATCGGCTTTGGAAAATGGCTCGCCGAAACGGAGGAGAAAAGCTGTAGCGGCTAAGAAGGCTGAATTAGAAGTGCAAAGCCGATCAAATGCTATGCAAGTTGGGTGCCAGATGGAACAATTTCCAGTTGGC

（SEQ ID NO:2） 

上面的序列中，带下划线的为酶切位点（BamHI/SbfI），斜体为引物序列。 

测序结果表明，获得的pMD18-T+ERF2克隆载体中ERF2基因序列正确。 

二、p6重组载体的构建 

1.玉米泛素(ubi)启动子片段的PCR扩增和pMD18-T+Ubi重组载体的构建 

（1）Ubi启动子的PCR扩增 

使用植物基因组DNA提取试剂盒（TIANGEN新型植物基因组DNA提取试剂盒，目录号：DP320-02）提取玉米品种B73（Zea mays mays cv.B73）的基因组DNA。根据该启动子在玉米B73gDNA中的序列，分别在首尾设计一对PCR特异性扩增引物：上游引物F1：GGCTGCAGTGCAGCGTGACCCGGTCGT（SEQ ID NO:3），加限制性酶切位点Pst I和保护碱基；下游引物R1：GGCTGCAGAAGTAACACCAAAC（SEQ ID NO:4），加限制性酶切位点Pst I和保护碱基。 

然后，以上述提取的玉米B73的gDNA为模板，利用上游引物F1、下游引物R1和高保真Ex Taq^TM（TaKaRa，DRR100B）聚合酶进行PCR扩增。其中，PCR扩增体系如表1所示（其中将cDNA改为gDNA）。 

PCR扩增程序为：94℃预变性5min，然后以94℃变性45s，55℃退火50s，72℃ 延伸90s，进行35个反应循环，最后72℃延伸7min。 

PCR扩增产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳分离后，使用TIANGEN琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒（目录号：DP209-03）纯化回收。 

（2）pMD18-T+Ubi重组载体的构建 

将上述得到的PCR扩增产物进行T/A克隆（pMD18-T质粒，TaKaRa，D103A），转化大肠杆菌，挑取阳性克隆由深圳华大基因科技股份有限公司测序，结果准确。 

其中，T/A克隆的连接条件如下： 

于16℃在节能型智能恒温槽（宁波新芝，SDC-6）中连接8h以上，得到pMD18-T+P604重组载体。将经过上述连接后的产物按照如下方法转化大肠杆菌： 

从超低温冰箱中取出按照《分子克隆实验指南》（第三版，科学出版社）所示氯化钙法制备的感受态细胞100μl DH5α（中国科学院昆明动物研究所董杨提供；或者可从例如：上海生工购得），冰上融化后，加入10μl如上所得的连接产物，即pMD18-T+P604重组载体，轻轻搅匀，冰浴30min，42℃热激60s，冰浴5min，加入600μl4℃预冷的SOC培养基（具体配方详见《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社，通过参照将其全文并入本文），37℃220rpm复苏45min，8000rpm离心30s，去上清，留取150μl，用剩下的150μl上清重悬沉淀后的混合物，轻轻吹匀，玻璃珠涂布LB（卡那霉素）平板（具体配方详见《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社，通过参照将其全文并入本文），37℃倒置培养16-24h。获得含有pMD18-T+Ubi克隆载体的重组大肠杆菌，命名为DH5α-Ubi。 

2、pCAMBIA-1301+Ubi重组载体的构建 

按照TIANGEN普通质粒小提试剂盒（目录号：DP103-03）的操作手册，从上述构建获得的转化有启动子Ubi的大肠杆菌DH5α-Ubi中提取带有玉米Ubi启动子序列的克隆载体pMD18-T+Ubi；纯化后用相应的限制性内切酶Pst I（NEB）进行酶切，然后用TIANGEN琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒（目录号：DP209-03）回收相应的启动子片段。 

同时用限制性内切酶Pst I酶切pCAMBIA-1301质粒（中国科学院昆明动物研究所董杨提供；或者可从例如上海国瑞基因科技有限公司购得，该公司的pCAMBIA-1301质粒的原始来源是The CAMBIA Bios (biological open source) Licensee，Australia）并回收。 

将回收的启动子片段Ubi与回收的载体片段根据T4连接酶（TaKaRa，D2011A）操作说明，按照如下条件进行连接： 

于16℃节能型智能恒温槽（宁波新芝，SDC-6）中连接8h以上。 

将100μl氯化钙法制得的感受态细胞DH5α从超低温冰箱取出，冰上融化后，加入10μl上面的连接产物，轻轻搅匀，冰浴30min，42℃热激60s，冰浴5min，加入600μl4℃预冷的SOC，37℃下220rpm复苏45min，8000rpm离心30s，去上清，留取150μl，轻轻吹匀，玻璃珠涂布LB（Kan），37℃倒置培养16-24h。由此，得到重组载体pCAMBIA-1301+Ubi。 

分别以F1（SEQ ID NO:3）和R1（SEQ ID NO:4）为引物对所得重组载体pCAMBIA-1301+Ubi进行PCR检测，以确证所得重组载体pCAMBIA-1301+Ubi中含有所需启动子Ubi。 

3、NOS终止子的PCR扩增和pMD18-T+NOS重组载体的构建 

根据pCAMBIA-1301质粒中NOS终止子的序列，分别在首尾设计一对PCR特异性扩增引物：上游引物F2：GGGAGCTCGAATTTCCCCGATCGTTCAA（SEQ ID NO:5），加限制性酶切位点Sac I和保护碱基；下游引物R2：GGGAATTCCCGATCTAGTAACATAGAT（SEQ ID NO:6），加限制性酶切位点EcoR I和保护碱基。以上述提取的pCAMBIA-1301质粒为模板，利用上游引物F2、下游引物R2和高保真Ex Taq^TM（TaKaRa，DRR100B）聚合酶进行PCR扩增。其中，PCR扩增体系如表1所示（其中cDNA改为pCAMBIA-1301质粒，其体积为0.1μl）。 

将上述得到的PCR扩增产物进行T/A克隆（pMD18-T质粒，TaKaRa，D103A），转化大肠杆菌，获得含有pMD18-T+NOS克隆载体的重组大肠杆菌，命名为DH5α-NOS。挑取阳性克隆由深圳华大基因科技股份有限公司测序，证明准确。 

4、pCAMBIA-1301+Ubi+NOS即p6重组载体的构建 

按照TIANGEN普通质粒小提试剂盒（目录号：DP103-03）的操作手册，提取上述构建的克隆载体pMD18-T+NOS；纯化后用相应的限制性内切酶Sac I（NEB）和EcoR I（NEB）进行酶切，然后用TIANGEN琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒（目录号：DP209-03）回收相应的NOS终止子片段。同时用限制性内切酶Sac I和EcoR I酶切pCAMBIA-1301+Ubi质粒并回收。 

其中， 

将回收的终止子片段NOS与回收的载体片段用T4连接酶进行连接，转化感受态细胞DH5α得到重组载体pCAMBIA-1301+Ubi+NOS，即p6。 

三、p6+ ERF2重组载体的构建 

提取pMD18-T+ERF2质粒，用限制性内切酶BamHI/SbfI酶切回收ERF2基因片段，同时提取p6质粒，并用相应的限制性内切酶BamHI/SbfI酶切后回收大片段，将回收产物进行连接，随后转化感受态细胞DH5α得到重组载体p6+ERF2。筛选阳性克隆进行PCR检测后测序确定目的片段的正确插入。由此，制备获得p6+ERF2构建体，备用。 

实施例2重组根癌农杆菌EHA105-p6+ERF2细胞的制备 

按照《分子克隆实验指南》（第三版，科学出版社）中所述氯化钙方法，将实施例1中制备的p6+ERF2重组载体质粒转化根癌农杆菌EHA105（Agrobacterium tumefaciens EHA105，于2009年12月24日保藏于地址为中国.武汉.武汉大学的中国典型培养物保藏中心（CCTCC），保藏编号为CCTCC NO：M209315）的感受态细胞，具体方法如下： 

将根癌农杆菌感受态细胞EHA105于超低温冰箱中取出，至于冰上解冻。融化后，加入5μl的p6+ERF2重组载体，轻轻混匀，冰浴10min，放入液氮中冷冻5min，37℃解冻5min，加入800μl常温的LB液体培养基，28℃160rpm复苏3h，8000rpm离心30s，吸去上清，留下200μl吹匀，涂布于加有kan-rif（卡那霉素－利福平）双抗的YM培养基平板上（50mg/lKan，10mg/lRif）。28℃倒置培养2-3天。 

以F1（SEQ ID NO:3）和R1（SEQ ID NO:4）为引物进行PCR检测和通过BamHI/SbfI酶切筛选转化子。 

PCR扩增出约720bp条带和酶切出约710bp条带的为包含重组载体p6+ERF2的重组根癌农杆菌。 

本发明中，按照如上述方法得到的带有重组载体p6+ERF2的重组农杆菌，命名为重组根癌农杆菌EHA105-p6+ERF2。 

实施例3水稻愈伤组织的诱导和转化 

按照如下步骤诱导水稻愈伤组织，并利用实施例2制备获得的重组根癌农杆菌EHA105-p6+ ERF2转化所述愈伤组织： 

（1）将水稻日本晴种子（2009年12月18日保藏于地址为中国.武汉.武汉大学的中国典型培养物保藏中心（CCTCC），保藏编号为CCTCC NO：P200910）去壳，70%乙醇表面消毒30s，然后用有效氯1.5%的次氯酸钠消毒30min，期间剧烈摇动，消毒后用 灭菌水清洗5次；将消毒后的种子置于N6D培养基上，用封口膜封口；28℃暗培养6-8周； 

（2）选取活跃生长的愈伤组织（黄白色，干燥，直径1-3mm），在新N6D培养基上28℃暗培养2-3周； 

（3）分别挑取如实施例2所构建的重组根癌农杆菌单菌落（重组根癌农杆菌EHA105-p6+ERF2），于添加抗生素（50mg/lKan，10mg/lRif）的YM培养基上划线培养3天，培养温度28℃；分别刮取上述重组根癌农杆菌置于添加了30μl100mM的AS（Acetosyringone，乙酰丁香酮）的30mlAAM培养基中，温和重悬所述重组根癌农杆菌细胞（实施例2制备获得的重组根癌农杆菌EHA105-p6+ERF2）； 

（4）将继代培养的愈伤组织置于灭菌培养皿中；将如步骤3制备的重组根癌农杆菌悬液倒入培养皿中，将愈伤组织浸入其中15min； 

（5）倒掉重组根癌农杆菌悬液，将愈伤组织用灭菌吸水纸吸掉多余的液体；于N6-AS培养基上放一张灭菌滤纸，加1ml如上述含AS的AAM培养基，将愈伤组织转移至滤纸上；密封培养皿，22℃暗培养48-60h； 

（6）将受感染的愈伤组织置于50ml灭菌管中，用灭菌水摇动清洗，直至上清液变澄清；将愈伤组织浸泡于含500mg/l羧苄青霉素（Carb）的无菌水中30min以杀死重组根癌农杆菌；用灭菌吸水纸除去愈伤组织上多余的水分，然后将其转移至含50mg/l潮霉素B（HmB）和250mg/l Carb的N6-AS培养基上；用封口膜密封培养皿，28℃光照培养2-3周。待抗性愈伤长出来后再转移至新的含50mg/l潮霉素B（HmB）和250mg/l Carb的N6-AS培养基上；用封口膜密封培养皿，28℃光照培养2-3周。 

实施例4水稻愈伤组织GUS表达检测 

按照Chen S Y等描述的方法(Journal of Integrative Plant Biology，2008，50(6)：742-751，通过参照将其全文并入本文)，对实施例3中获得的经重组根癌农杆菌EHA105-p6+ERF2转化的水稻愈伤组织进行GUS染色，以便检测经转化的水稻愈伤组织中GUS的表达情况。 

其中，GUS染色液的配方（1ml）：610μl0.2M Na₂HPO₄溶液（pH=7.0）；390μl0.2MNaH₂PO₄溶液和10μl0.1M X-gluc。 

具体地，将用重组根癌农杆菌EHA105-p6+ERF2转化的水稻愈伤组织浸泡在GUS染色液中，37℃保温2h或过夜至出现蓝色，然后拍照记录染色结果，结果见图2。如图2所示，实施例3制备的含有p6+ERF2重组载体的根癌农杆菌介导转化的水稻愈伤组织经染色后呈现蓝色（图2右图），而未经转化的愈伤组织即对照经GUS染色后颜色未发生变化（图2左图）。结果表明，本发明的p6+ERF2构建体已转入水稻愈伤组织。 

实施例5：转基因水稻苗中GUS表达的检测 

将实施例3制备的经转化的愈伤组织转移至含50mg/l潮霉素B（HmB）的MS-R分化培养基分化苗；用封口膜密封培养皿，28℃光照培养4-6周；待幼苗长至3-4cm时转移到含50mg/l潮霉素B（HmB）的1/2MS生根培养基进行生根筛选。 

然后，参照实施例4中愈伤组织的GUS染色方法，将转基因水稻幼苗进行GUS染色，并拍照记录染色结果，结果见图3。由图4可知，经含有p6+ERF2重组载体的根癌农杆菌介导转化的水稻苗的根（图3上图右侧）、叶（图3下图右侧）经染色后呈现蓝色，未经转化的幼苗即对照的根（图3上图左侧）、叶（图3下图左侧）经GUS染色后颜色未发生变化。结果表明，本发明p6+ERF2重组载体已转化入水稻幼苗中。 

实施例6：转基因水稻小苗的农艺性状和光合速率测定 

待幼苗在1/2MS生根培养基中生长20天后，移植到大田，然后测量其田间农艺性状，如在转基因水稻生育期测量其株高、有效穗、剑叶长、剑叶宽、穗长等；在灌浆期测定其光合速率；在收获后测量其一次枝梗数、单株饱粒数、总粒数、结实率、千粒重等。转ERF2基因水稻的农艺性状调查结果如表2和图4所示。 

然后，将T0代转基因水稻的种子进行田间种植，在灌浆期测定转基因水稻T1代各株系的光合速率。结果见图5。 

表2转ERF2基因水稻基本农艺性状和经济性状调查结果 

注：*表示具有显著差异。 

“K021”代表ERF2基因。 

从表2可以看出： 

1、转ERF2基因水稻与对照组相比，株高、有效穗、剑叶宽、穗长等性状，超半数株系表现出显著优势，初步验证了ERF2基因具有提高水稻光合作用的功能； 

2、因为单株饱粒数性状直接与产量正相关，而转基因株系此性状表现明显优于对照株系，说明转ERF2基因可以提高水稻产量。 

其中，图4显示了转ERF2基因水稻田间种植后的生育期性状调查图，如图4所示，其 中左图为野生型对照；右图为转ERF2基因水稻。由该图可知，转ERF2基因水稻的长势都要优于对照，分蘖快且多，植株健壮，有效穗显著多于对照。 

图5显示了转ERF2基因水稻T1代田间种植后各株系灌浆期的光合速率测定结果。如图5所示，图中“K021”均代表ERF2基因。由该图可知，转ERF2基因水稻T1代的光合速率均明显优于野生型对照。 

综上结果可知，利用该构建体能够将SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列即烟草ERF2基因成功引入受体植物中，进而能够显著增强受体植物的光合作用效率，提高植物产量。 

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。 

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。 

Claims (10)

1.一种构建体，其特征在于，包含SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。

2.根据权利要求1所的构建体，其特征在于，所述构建体呈选自质粒、噬菌体、人工染色体、粘粒以及病毒的至少一种的形式，优选质粒的形式。

3.根据权利要求1所的构建体，其特征在于，进一步包含：

玉米Ubi启动子；以及

NOS终止子。

4.一种重组细胞，其特征在于，包含权利要求1-3任一项所述的构建体，

优选地，所述重组细胞为重组根癌农杆菌EHA105-p6+ERF2细胞。

5.权利要求1-3任一项所述的构建体、权利要求4所述的重组细胞，在制备转基因植物细胞、组织、器官或其培养物及转基因植物中的用途。

6.一种转基因植物细胞、组织、器官或其培养物，其是通过使用权利要求1-3任一项所述的构建体，或者权利要求4所述的重组细胞转化受体植物细胞、组织或器官而获得的。

7.一种制备转基因植物的方法，其特征在于，包括：

使用权利要求1-3任一项所述的构建体，或者权利要求4所述的重组细胞，转化受体植物细胞、组织或器官；以及

分离转基因植物细胞、组织或器官，并于适宜条件下进行培养，以便获得转基因植物。

8.根据权利要求7所的方法，其特征在于，利用农杆菌介导法进行所述转化，所述受体植物呈愈伤组织的形式。

9.一种增强植物光合作用，提高产量的方法，其特征在于，

根据权利要求7或8所述的方法，制备转基因植物，使所述转基因植物表达烟草ERF2基因。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述植物为水稻。

Images