CN103251655A - 一种治疗类风湿性关节炎中药组合物的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种治疗类风湿性关节炎的中药组合物的制备方法，所述方法为：将地龙冻干粉和蕲蛇冻干粉混合，然后加入山梨酸钾，混合均匀，在紫外照射下灭菌，获得所述治疗类风湿性关节炎的中药组合物；所述地龙冻干粉与蕲蛇冻干粉质量比为1:0.5～2，所述山梨酸钾质量用量为地龙冻干粉与蕲蛇冻干粉总质量的0.1%；本发明将蕲蛇和地龙切段后制成冻干粉的制备工艺保留了药材几乎全部的活性成分，大大提高了药物的生物利用度；本发明所述的中药组合物在急性毒性分级标准评价中属实际无毒级，可以明显延长小鼠的痛阈时间6～7s，明显地降低大鼠的关节炎指数，降低幅度达37.89%～55.37%，明显降低大鼠左侧踝关节肿胀程度，降低16.73%～31.87%。

Description

一种治疗类风湿性关节炎中药组合物的制备方法

（一）技术领域

本发明涉及一种中药组合物的制备方法，特别涉及一种治疗类风湿性关节炎的中药组合物的制备方法。

（二）背景技术

类风湿性关节炎（rheumatoid arthritis,RA）是一种以关节病变为主的慢性全身自身免疫性疾病。主要临床表现为小关节滑膜所致的关节肿痛，继而软骨破坏、关节间隙变窄，晚期因严重骨质破坏、吸收导致关节僵直、畸形、功能障碍。目前，世界范围内RA发病率为1%，在我国类风湿性关节炎的患病率为0.24～0.5%，女性多于男性，约2～3:1，任何年龄均可发病，以20～50岁最多。本病多为一种反复发作性疾病，致残率较高，预后不良。

西医一般采用非甾体类抗炎药（NSAID）、改善病情抗风湿药物（DMARDS）、糖皮质激素、生物制剂等进行治疗。常用的非甾体类抗炎药有布洛芬、萘普生、塞来昔布、美洛昔康，用于急性期及病情活动期；改善病情抗风湿药物有甲氨蝶呤（MTX）、羟基氯喹（HCQ）、柳氮磺吡啶（SASP）、来氟米特、环孢素A、金制剂、青霉胺、雷公藤总甙等；糖皮质激素只适用于有关节外症状者或关节炎明显而又不能为非甾体类抗炎药所控制或改善病情抗风湿药物尚未起效时的患者；生物制剂中使用较多的是TNF-α拮抗剂。这些药物虽有疗效，但有的毒副作用多，有的费用昂贵。

RA根据其临床表现，属于中医“痹证”或“痹病”范畴，中医学认为痹病是“机体正气不足，卫外不固，邪气乘虚而入，致使气血凝滞，经络痹阻不通”。大量临床资料表明，中医药治疗RA在控制疾病，减轻症状，改善愈后等各方面比西药更具优势，而且治疗药物疗效确切、副作用小，适合长期应用，部分单味药及其复方制剂已在临床上得到应用，但疗效还不够理想。随着现代科学的发展，发现动物药的药理性质更强，且动物药组成更接近于人体。因为动物药主要成分为氨基酸、多肽、蛋白质及多糖等物质，这些成分都是我们日常食物的主要组成物质，对人体无毒副作用。由于动物活性成分具有疗效确切、活性强等特点，已逐渐得到科研工作者的重视。

蕲蛇（Deinagkistrodon Gloyd），又名白花蛇、褰鼻蛇、五步蛇，属于蛇亚目蝰科蝮亚科尖吻蝮属。中药药材蕲蛇为其除去内脏的干燥全体，性温，味甘咸，有毒，归肝经，具有祛风、通络、镇痉攻毒之功，为我国名贵药材之一。其功效为搜风通络、攻毒定惊，能外达皮肤，内走脏腑，其透骨搜风之力为历代医家所推崇，称本品为“截风要药”，广泛应用于治疗风湿顽痹如肢体麻木、关节肿胀、筋骨麻木。有关蕲蛇的文字记载，最早见于战国时期的《山海经》，蕲蛇入药首载于《雷公炮制论》，李时珍在《本草纲目》中首次以蕲蛇作为白花蛇的别名，详细记载了蕲蛇的形态及功效，并提出服药禁忌，“凡服蛇酒药，切忌见风”。

地龙（Geosaurus），为环节动物门钜蚓科动物参环毛蚓、通俗环毛蚓、威廉环毛蚓或栉肓毛蚓的干燥体。性味咸寒，人肝、脾、肺三经，具有舒筋活络、清热镇痉、平喘利尿、降低血压之功，可用于治疗风湿性关节疼痛、半身不遂等病证。现代研究发现，地龙体内含有一种酶，能溶解纤维蛋白形成血栓的酶，故可溶解血栓，改善局部血液循环，加速新陈代谢，减轻关节肿痛；同时还有抗组胺的作用，能促进炎症的消退，降低局部的炎症反应，有益于风湿性关节炎病情的改善，故风湿性关节炎患者可以食用蚯蚓。

山梨酸及山梨酸钾是良好的食品防腐剂，在西方发达国家的应用量很大，但在我国国内的应用范围还不广。作为一种公认安全、高效防腐的食品添加剂，山梨酸及山梨酸钾在我国食品行业的应用越来越广泛。山梨酸是一种不饱和脂肪酸，是一种世界公认的安全防腐剂，英文名为Sorbicacid，又名2,4-已二烯酸、2-丙烯基丙烯酸。与其他天然的脂肪酸一样，山梨酸在人体内参与新陈代谢过程，并被人体消化和吸收，产生二氧化碳和水。从安全性方面来讲，山梨酸是一种国际公认安全(GRAS)的防腐剂，安全性很高。联合国粮农组织、世界卫生组织、美国FDA都对其安全性给予了肯定。山梨酸的毒副作用比苯甲酸、维生素C和食盐还要低，毒性仅有苯甲酸的1／4、食盐的一半。山梨酸对人体不会产生致癌和致畸作用。

通过对现代医家运用中医治疗类风湿性关节炎的系列方剂进行归纳性的回顾，探讨其治疗组方的配伍规律发现，养血药与补气药、活血化瘀药与补气药、祛风湿药与益气养血药等配伍，为现代医家治疗类风湿性关节炎的遣药组方特点。另外，综合分析了近十年中医药治疗RA的临床用药情况，发现虽然各类方剂治疗以及所针对的RA证型与病程各不相同，但治疗复方中多数注意了寒热配伍的应用形式，认为其配伍机理在于针对RA的寒热错杂病证特点，调整机体阴阳寒热、疏通气血经络。这些配伍原则在类风湿性关节炎的临床治疗中得到了充分的印证，并且由于其灵活的运用，使得该病获得了较好的临床疗效。

（三）发明内容

本发明目的是提供一种治疗类风湿性关节炎的中药组合物的制备方法，本发明采用先进的冻干粉制胶囊技术，充分利用有效药材资源，并配合安全防腐剂，保证药材质量稳定，起效快，确定蕲蛇与地龙配伍后对抗风湿性关节炎疗效增强，并发现蕲蛇与地龙抗风湿性关节炎作用的最佳比例配伍。

本发明采用的技术方案是：

本发明提供一种治疗类风湿性关节炎的中药组合物的制备方法，所述方法为：（1）预处理：取鲜蕲蛇，去头，去内脏，切成2～3cm长度的蕲蛇段，洗净，沥干水，获得预处理后的蕲蛇段；再取鲜地龙，剪成4cm地龙段，洗净，沥干水，获得预处理后的地龙段；（2）中药组合物的制备：将地龙冻干粉和蕲蛇冻干粉混合，然后加入山梨酸钾，混合均匀，在紫外照射下灭菌，获得所述治疗类风湿性关节炎的中药组合物；所述地龙冻干粉与蕲蛇冻干粉质量比为1:0.5～2，所述山梨酸钾用量为地龙冻干粉与蕲蛇冻干粉总质量的0.1%；所述蕲蛇冻干粉按如下方法制备：将步骤（1）中预处理后的蕲蛇段于-70℃～-90℃冷冻11～13h后，再置于-60℃～-40℃、真空度为0.7～0.9MPa条件下真空干燥24～30h（本发明所述的冷冻温度、冷冻时间以及真空干燥温度及压力范围内各个取值对蛇粉性能无影响），将真空干燥后的蕲蛇段粉碎，过80目筛，获得蕲蛇冻干粉；所述地龙冻干粉的制备方法同蕲蛇冻干粉的制备方法。

进一步，步骤（1）中所述蕲蛇段预处理过程中沥干水的方法为：将蕲蛇段置于网架（优选四面通风的不锈钢网架）上，室温下自然阴干（光照无要求）至无水滴；所述地龙段预处理过程中沥干水的方法同蕲蛇段预处理。

进一步，步骤（2）中所述冷冻条件为-80℃冷冻12h。

进一步，步骤（2）中所述真空干燥是在-50℃、0.8MPa真空度下真空干燥25h。

进一步，步骤（2）中所述蕲蛇段粉碎方法为：将真空干燥后的蕲蛇段用粉碎机粉碎后再用研钵研磨，然后过80目筛，获得蕲蛇冻干粉。

进一步，步骤（2）中所述紫外灭菌时间为25～35min，更优选在40W下紫外灭菌30min。

进一步，步骤（2）中地龙冻干粉与蕲蛇冻干粉质量比优选为1:1。

本发明所述治疗类风湿性关节炎的中药组合物还包含人体可接受的常规辅料，所述辅料为山梨酸钾。

本发明所述治疗类风湿性关节炎的中药组合物可制备成胶囊型、注射剂型、片剂型等。

本发明所述中药组合物在用于制备治疗类风湿性关节炎的药物中的应用中，所述中药组合物的最佳疗效剂量为30mg/kg。

本发明所述蕲蛇和地龙均含有大量的人体所需氨基酸，维生素，蛋白质，微量元素和多种酶等。中医认为，蕲蛇性温，能透骨搜风，截惊定搐，为风痹惊搐、癞癣恶疮要药。地龙性寒，能治疗热病惊狂、小儿惊风、咳喘、头痛目赤、咽喉肿痛、小便不通、风湿关节疼痛，半身不遂等症。用地龙者，泥盘之物，湿土所化，故能引诸药以就湿；蕲蛇者，奔腾之类，风动之象，故能君诸药以驱风。本发明将祛风湿药蕲蛇和活血化瘀通络药地龙进行配伍，且属于寒热配伍的应用形式，更有利于补血益气，阴阳调和，舒筋活络，强身健体，搜风定惊，祛风除湿。

本发明采用冷冻真空干燥技术对药材进行处理。该方法有效地防止了制品理化及生物特性的改变，对生物组织和细胞结构、特征的损伤较小，使其快速进入休眠状态，有效保护了许多热敏性药物生物制品有效成份的稳定性。如蛋白质、微生物类不会发生变性和丢失其生物活性；其次，冻干制品在干燥后形态疏松、颜色基本不发生改变，加水后能够快速溶解并恢复原有水溶液的理化特性和生物活性。第三，由于干燥在真空条件下进行，对于一些易氧化的物质具有很好的保护作用。第四，制品经过冻干后水份含量非常低，使制品的稳定性提高，受污染的机会减小，方便运输。而且对药材进行切段的前处理方式可缩短冻干时间，大大提高冻干效率。

本发明向蕲蛇粉和地龙粉中参入一定比例山梨酸钾，可起到安全且良好的防腐作用，延长了蕲蛇粉和地龙粉的保存期限。

与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：本发明将蕲蛇和地龙切段后制成冻干粉的制备工艺保留了药材几乎全部的活性成分，大大提高了药物的生物利用度；在满足治疗或预防类风湿性关节炎的同时，充分利用珍贵动物药材资源，避免浪费；通过对佐剂型关节炎（adjuvantarthritis，AA）大鼠的治疗作用研究，寻找到蕲蛇与地龙在治疗类风湿性关节炎方面的高效配比；本发明所制备的治疗类风湿性关节炎的中药组合物（即地龙冻干粉与蕲蛇冻干粉质量比为1:0.5～2）与单独地龙冻干粉、单独蕲蛇冻干粉、蝮蛇冻干粉与乌梢蛇冻干粉混合，乌梢蛇冻干粉与地龙冻干粉混合相比，本发明所述的中药组合物在急性毒性分级标准评价中属实际无毒级，可以明显延长小鼠的痛阈时间6～7s，明显地降低大鼠的关节炎指数，降低幅度达37.89%～55.37%，明显降低大鼠左侧踝关节肿胀程度（降低16.73%～31.87%）。

（四）具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1：

地龙冻干粉:蕲蛇冻干粉=1:0.5、1:1及1:2的制备过程包括如下步骤：

（1）材料预处理：取新鲜的两斤以上的蕲蛇，去除含有毒腺的头部，沿腹部中间剪开，去除含有脂肪的内脏，切成2～3cm长度的蛇段，洗净外表和内部，置于四面通风的不锈钢网架上，室温下自然阴干至无水滴，获得预处理后的蕲蛇段，备用。取新鲜地龙，剪成4cm长段，洗净，置于四面通风的不锈钢网架上，室温下自然阴干至无水滴或室温下自然阳光直射晒干至无水滴，获得预处理后的地龙段，备用；

（2）冷冻：将预处理后的蕲蛇段和预处理后的地龙段分别放入冰箱-80℃冷冻约12h；

（3）真空干燥：分别取出冷冻后的蕲蛇段和地龙段，放入型号为ALPHA1-2LD plus的冷冻干燥机中，在-50℃，真空度为0.8MPa的条件下真空干燥25h，使蛇段和地龙段内的水分直接升华；

（4）粉碎：将真空干燥后的蕲蛇段和地龙段分别经粗粉碎机（天津市泰斯特仪器有限公司，型号：FZ102）粗粉碎后再用研钵进行反复细粉碎，分别过80目筛，制得蕲蛇冻干粉及地龙冻干粉；

（5）混料：称取60mg蕲蛇冻干粉（样品1），60mg地龙冻干粉（样品2），20mg蕲蛇冻干粉与40mg地龙冻干粉制成的混合冻干粉（样品3），30mg蕲蛇冻干粉与30mg地龙冻干粉制成的混合冻干粉（样品4），40mg蕲蛇冻干粉与20mg地龙冻干粉制成混合冻干粉（样品5），然后分别向样品1～样品5中加入0.1%（以冻干粉的总重量计）山梨酸钾反复混匀，分别制成中药组合物1～5；

（6）灭菌：所有样品均需经过40W紫外灯照射30min，以达到灭菌的效果。

对比例1：

地龙晒干粉:蕲蛇晒干粉=1:1的制备过程包括如下步骤：

（1）材料预处理：取新鲜的大约两斤重的蕲蛇，去除含有毒腺的头部，沿腹部中间剪开，去除含有脂肪的内脏，切成2～3cm长度的蛇段，洗净外表和内部，制成蕲蛇段，备用。取新鲜地龙，剪成4cm长段，洗净，制成地龙段，备用；

（2）晒干：将步骤（1）蕲蛇段和地龙段分别置于四面通风的不锈钢网架上，室外阳光直射晒干。

（3）粉碎：将晒干后的蕲蛇段和地龙段分别经粗粉碎机（天津市泰斯特仪器有限公司，型号：FZ102）粗粉碎后再用研钵进行反复细粉碎，分别过80目筛，制得蕲蛇晒干粉及地龙晒干粉；

（4）混料：称取30mg蕲蛇晒干粉与30mg地龙晒干粉制成混合晒干粉（样品6），向样品6中加入0.1wt%（以晒干粉的总重量计）山梨酸钾反复混匀，制成中药组合物6；

（5）灭菌：样品6经过40w紫外灯照射30min，以达到灭菌的效果。

对比例2：

参照专利《活性纯蛇粉胶囊及其制作工艺》（申请号200910012446.5，申请日为2009年7月10日），蝮蛇冻干粉:乌梢蛇冻干粉=2.33:1的制备过程制备纯蛇粉，包括如下步骤：

（1）选料：取鲜蝮蛇和鲜乌梢蛇，去头，去皮，去内脏，清洗；

（2）冷冻：将清洗后的蝮蛇和乌梢蛇，送入冷冻干燥机，在温度-40℃下，冷冻8小时；

（3）真空干燥：启动真空泵，在真空度为5Pa状态下，第一次升温，在30℃下，加温升华10小时；第二次升温，在60℃下，加温升华12小时；第三次升温，在80℃下，加温升华10小时；

（4）粉碎：将真空干燥后的蝮蛇和乌梢蛇分别经轧辊粗碎，再细粉碎，制得蝮蛇冻干粉和乌梢蛇冻干粉；

（5）混料：将42mg蝮蛇冻干粉和乌梢蛇冻干粉18mg混合均匀，过80目筛，取筛下物（样品7），向样品7中加入0.1%（以冻干品的总重量计）山梨酸钾反复混匀，制成中药组合物7；

（6）灭菌：筛下物经隧道式微波杀菌机，控制速度250mm/秒，微波杀菌；

对比例3：

地龙冻干粉:乌梢蛇冻干粉=1:1的制备过程包括如下步骤：

（1）材料预处理：取新鲜的两斤以上的乌梢蛇，去除头部，沿腹部中间剪开，去除含有脂肪的内脏，切成2～3cm长度的蛇段，洗净外表和内部，置于四面通风的不锈钢网架上，室温下自然阴干至无水滴，制成预处理后的乌梢蛇段，备用。取新鲜地龙，剪成4cm长段，洗净，置于四面通风的不锈钢网架上，室温下自然阴干至无水滴，制成预处理后的地龙段，备用；

（2）冷冻：分别将步骤（1）预处理后的乌梢蛇段和预处理后的地龙段放入冰箱-80℃冷冻约12h；

（3）真空干燥：取出步骤（2）冷冻后的乌梢蛇段和地龙段，放入型号为ALPHA1-2LD plus的冷冻干燥机中，在-50℃，真空度为0.8MPa的条件下真空干燥25h，使蛇段和地龙段内的水分直接升华；

（4）粉碎：将步骤（3）真空干燥后的乌梢蛇段和地龙段分别经粗粉碎机（天津市泰斯特仪器有限公司，型号：FZ102）粗粉碎后再用研钵进行反复细粉碎，分别过80目筛，制得乌梢蛇冻干粉及地龙冻干粉；

（5）混料：称取30mg乌梢蛇冻干粉与30mg地龙冻干粉制成的混合冻干粉（样品8），向样品8中加入0.1%（以冻干粉的总重量计）山梨酸钾反复混匀，分别制成中药组合物8；

（6）灭菌：所有样品均需经过40W紫外灯照射30min，以达到灭菌的效果。

实施例2：

小鼠热板法对蕲蛇地龙组方的评价

选取清洁级健康ICR雌性小鼠（购于浙江省医学科学院），体重18～22g，置于恒温(55±0.5)℃热板上，实验时室内温度控制在26℃，以舔足为指标，筛选痛阈值在10～30s内的小鼠100只，随机分为10组，10只/组，即：空白组（normal），阿司匹林阳性组（positive用生理盐水配制成100mg/ml的药物），蕲蛇冻干粉组（实施例1制备的样品1用生理盐水配制成60mg/ml的药物），地龙冻干粉组（实施例1制备的样品2用生理盐水配制成60mg/ml的药物），蕲蛇冻干粉:地龙冻干粉=0.5:1组（实施例1制备的样品3用生理盐水配制成60mg/ml的药物），蕲蛇冻干粉:地龙冻干粉=1:1组（实施例1制备的样品4用生理盐水配制成60mg/ml的药物），蕲蛇冻干粉:地龙冻干粉=2:1组（实施例1制备的样品5用生理盐水配制成60mg/ml的药物），蕲蛇晒干粉:地龙晒干粉=1:1组（实施例2制备的样品6用生理盐水配制成60mg/ml的药物），蝮蛇冻干粉：乌梢蛇冻干粉=7:3（对比例2制备的样品7用生理盐水配制成60mg/ml的药物），乌梢蛇冻干粉：地龙冻干粉=1:1（对比例3制备的样品8用生理盐水配制成60mg/ml的药物）。灌胃（ig）给予相应的药物，给药体积为0.2mL/只，空白组给予等体积的生理盐水，给药后30min、60min、90min分别测定各组小鼠的痛阈值，为防止小鼠足部烫伤，观察时间为60s，超过60s的按60s计，结果统计处理用t检验，结果见表1。

药理作用研究结果：

实验结果显示蕲蛇冻干粉:地龙冻干粉=1:1组（实施例1制备的样品4）和蕲蛇冻干粉:地龙冻干粉=2:1组（实施例1制备的样品5）较除阳性组外其余各样品组能明显延长小鼠的痛阈时间6～7秒，结果见表1。

表1  对热板法所致小鼠疼痛的影响

注：α=0.05，与空白组比较^*P<0.05^**P<0.01

实施例3：

大鼠AA模型对蕲蛇地龙组方的评价

（1）动物分组：取Wistar雄性大鼠（购于浙江中医药大学实验动物中心）110只，随机分为11组，每组10只。分别为空白组，模型组，阳性组（塞来昔布给药组，用生理盐水配制成3.6mg/ml的药物），

蕲蛇冻干粉组（实施例1制备的样品1用生理盐水配制成6mg/ml的药物），地龙冻干粉组（实施例1制备的样品2用生理盐水配制成6mg/ml的药物），蕲蛇冻干粉:地龙冻干粉=0.5:1组（实施例1制备的样品3用生理盐水配制成6mg/ml的药物），蕲蛇冻干粉:地龙冻干粉=1:1组（实施例1制备的样品4用生理盐水配制成6mg/ml的药物），蕲蛇冻干粉:地龙冻干粉=2:1组（实施例1制备的样品5用生理盐水配制成6mg/ml的药物），蕲蛇晒干粉:地龙晒干粉=1:1组（实施例2制备的样品6用生理盐水配制成6mg/ml的药物），蝮蛇冻干粉：乌梢蛇冻干粉=7:3（对比例2制备的样品7用生理盐水配制成6mg/ml的药物），乌梢蛇冻干粉：地龙冻干粉=1:1（对比例3制备的样品8用生理盐水配制成6mg/ml的药物）。

（2）造模：除空白组外，每只大鼠右后足趾皮下注射0.1mL弗氏完全佐剂（含卡介苗10mg/mL）致炎，空白组注射等体积生理盐水。弗氏完全佐剂的配制是按照液体石蜡与羊毛脂体积比2:1混合，混合物共热（70℃水浴10min），充分混匀，高压灭菌（121℃，60min），制成不完全弗氏佐剂。将卡介苗与不完全弗氏佐剂按10mg/mL比例混匀，后充分研磨90min，使其充分乳化，制成完全弗氏佐剂，置4℃冰箱中保存备用。

（3）给药：造模成功后开始给予灌胃治疗，阳性组给予塞来昔布治疗，模型组和空白组给予同体积的生理盐水，其他各组给予相应样品（6mg/ml）1ml进行治疗，1次/日，连续21天，见表2所示。

表2  各实验组给药剂量

（4）大鼠关节炎指数评定：造模前对大鼠关节指数进行评定，造模后至治疗结束每3天进行一次关节炎指数的评定，并记录全身关节病变程度，全身病变按大鼠多发性关节炎全身病变5级评分记录法进行评分，见表3所示。

表3  关节炎指数的评分标准

注：累计四肢关节的得分，每只大鼠的得分最高为16分。

（5）双后肢足肿胀度测量：用YLS-7B足容积测定仪（天津安合盟科技发展有限公司）对大鼠右后足的足容积进行测定，造模前测量1次，造模后每3天测量1次，观察大鼠的足容积的变化情况，以造模前后大鼠右后足容积差值为肿胀度。

研究数据以均数±标准差表示，采用SPSS16.0统计软件进行统计学处理。数据经正态检验和方差齐性检验后，组间比较用单因素方差分析，方差齐时，各组间两两比较采用LSD-t检验，干预组与对照组比较采用Dunnett-t检验，全面比较用SNK-q检验；方差不齐时选用Tamhane’s T2检验。P<0.05为差异有统计学意义。

药理作用研究结果：

（1）关节炎指数是反映关节炎发生与发展的一个重要客观指标。AA大鼠关节炎体征于造模后3天开始出现原发性关节炎，造模后6天原发性关节炎较为明显，造模后12天开始出现继发性关节炎。模型组大鼠于造模后20天左右达到高峰，治疗组大鼠在给药一周后开始关节炎指数积分开始呈下降趋势，给予阳性对照药的AA大鼠关节炎指数积分下降迅速，给予冻干粉水溶液后均能降低大鼠的关节炎指数，但给予蕲蛇冻干粉:地龙冻干粉=1:1能明显地降低大鼠的关节炎指数，如表4所示。

表4  各组大鼠关节炎指数变化情况

注：α=0.05，与模型组相比^*P<0.05，^**P<0.01。

（2）造模后一周，各模型大鼠右侧（致炎侧）踝关节肿胀程度比正常组显著增加（P<0.05）；造模2周左右，各造模动物左侧（继发侧）踝关节肿胀程度比正常组显著增加。

给药前，各造模大鼠左侧踝关节肿胀无明显差异。造模后20天左右，各造模组大鼠踝关节肿胀程度开始降低，模型组较各治疗组下降缓慢。给药7天左右，给予阳性对照药、蕲蛇地龙组方的大鼠左侧踝关节肿胀程度开始降低，与模型组比较，有显著性差异（P<0.05），且发现给予蕲蛇冻干粉:地龙冻干粉=1:1降低大鼠左侧踝关节肿胀程度最为明显，如表5所示。

表5  各组大鼠足容积变化情况

注：α=0.05，与模型组相比^*P<0.05，^**P<0.01，与空白组相比▲▲P<0.01。

实施例4：

大鼠急性毒性实验对蕲蛇地龙组方的评价

取Wister种大鼠（购于浙江中医药大学实验动物中心）20只，体重100～120g，雌雄各半，经适应7d后进入实验。经1次灌胃10g/kg样品4(实施例1制备，蕲蛇冻干粉:地龙冻干粉=1:1)后，观察两周。

药理作用研究结果

试验期间无动物死亡，LD₅₀>10000mg/kg，按急性毒性分级标准评价，本品属实际无毒级。蓄积毒性试验至20d末见动物死亡。

实施例5：

大鼠亚慢性毒性实验对蕲蛇地龙组方的评价

Wister种大鼠（购于浙江中医药大学实验动物中心），体重100～120g，经适应7d后进入实验，每个动物灌胃1次/d，2ml/100g/次，共90d。实验室内温度20±2℃。取健康大鼠60只，随机分为3组，每组20只，雌雄各半，单笼饲养，给药前观察1周，各组动物活动，进食，粪便等情况均无异常。设样品4(实施例1制备，蕲蛇冻干粉:地龙冻干粉=1:1)高剂量组2g/kg（1/5LD₅₀)、低剂量组0.5g/kg（1/20LD₅₀)和空白对照组。定时给药1次/d，空白对照组每日定时给予自来水。自由饮水，自由摄食标准块状饲料。

药理作用研究结果

实验期间，无动物死亡，实验至90d，各实验组动物体重与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。

血常规测定：各实验组动物红细胞总数、白细胞总数、血红蛋白含量与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。各组白细胞分类变化均在正常值范围内。

血清生化测定：血清谷丙转氨酶、尿素氮、总胆固醇、总蛋白、白蛋白、球蛋白含量与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。

脏器系数：取心、肝、肾、脾、肺、脑6个脏器，测定脏器系数，结果各组间相应各器官系数值无显著性差异(P>0.05)。

病理组织形态学检查：光镜下肝、肾组织排列整齐，末发现有意义的病理改变。

Claims (7)

1.一种治疗类风湿性关节炎的中药组合物的制备方法，其特征在于所述方法为：（1）预处理：取鲜蕲蛇，去头，去内脏，切成2～3cm长度的蕲蛇段，洗净，沥干水，获得预处理后的蕲蛇段；再取鲜地龙，剪成4cm地龙段，洗净，沥干水，获得预处理后的地龙段；（2）中药组合物的制备：将地龙冻干粉和蕲蛇冻干粉混合，然后加入山梨酸钾，混合均匀，在紫外照射下灭菌，获得所述治疗类风湿性关节炎的中药组合物；所述地龙冻干粉与蕲蛇冻干粉质量比为1:0.5～2，所述山梨酸钾质量用量为地龙冻干粉与蕲蛇冻干粉总质量的0.1%；所述蕲蛇冻干粉按如下方法制备：将预处理后的蕲蛇段于-70℃～-90℃冷冻11～13h后，再置于-60℃～-40℃、真空度为0.7～0.9MPa条件下真空干燥24～30h，将真空干燥后的蕲蛇段粉碎，过80目筛，获得蕲蛇冻干粉；所述地龙冻干粉的制备方法同蕲蛇冻干粉的制备方法。

2.如权利要求1所述治疗类风湿性关节炎的中药组合物的制备方法，其特征在于所述步骤（1）中所述蕲蛇段预处理过程中沥干水的方法为：将蕲蛇段置于网架上，室温下自然阴干至无水滴；所述地龙段预处理过程中沥干水的方法同蕲蛇段预处理。

3.如权利要求1所述治疗类风湿性关节炎的中药组合物的制备方法，其特征在于所述步骤（2）中所述冷冻条件为-80℃冷冻12h。

4.如权利要求1所述治疗类风湿性关节炎的中药组合物的制备方法，其特征在于所述步骤（2）中所述真空干燥是在-50℃、0.8MPa真空度下真空干燥25h。

5.如权利要求1所述治疗类风湿性关节炎的中药组合物的制备方法，其特征在于所述步骤（2）中所述蕲蛇段粉碎方法为：将真空干燥后的蕲蛇段用粉碎机粉碎后再用研钵研磨，然后过80目筛，获得蕲蛇冻干粉。

6.如权利要求1所述治疗类风湿性关节炎的中药组合物的制备方法，其特征在于步骤（2）中所述紫外灭菌时间为25～35min。

7.如权利要求1所述治疗类风湿性关节炎的中药组合物的制备方法，其特征在于步骤（2）中地龙冻干粉与蕲蛇冻干粉质量比为1:1。