CN103251578A - 丹酚酸a用于制备防治老年痴呆症药物的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一个具有抑制β-淀粉样蛋白产生，聚集或者纤维形成及解聚活性的化合物丹酚酸A。同时该化合物还可以与金属离子螯合。它作为β-淀粉样蛋白聚集抑制活性，表现出化合物对神经细胞无毒性而且能降低Aβ诱导的细胞毒性；作为金属离子螯合剂，可以抑制金属离子诱导的Aβ聚集。本发明化合物来源丰富，极易从丹参中分离得到。此类化合物可用于制备治疗或预防阿尔茨海默病的药物。
Description
技术领域
本发明属于药物应用领域，具体涉及丹酚酸A作为β-淀粉样蛋白聚集或纤维形成的抑制剂在阿尔茨海默病的预防和治疗及其在药效学上的新应用。
背景技术
阿尔茨海默症（Alzheimer's disease, AD）是以进行性记忆和认知功能退化为特征的一种神经退行性疾病。随着世界人口趋向老龄化，该病的发病率越来越多。据报道, 2009年全球已有1700万阿尔茨海默病病人，如果没有有效的治疗或预防措施，这一数量到2050年将达到7000万。目前临床上使用的药物只能用于缓解AD症状，并不能从根本上改善疾病状态和终止疾病进程。严重影响患者的工作能力和生活质量，也为家庭和社会带来沉重的负担。故研究和开发新的治疗药物有重要的临床和社会意义。
然而到目前为止，AD的发病病因和机制尚未完全阐明，研究认为AD的发生是由于遗传、代谢和环境等因素综合作用所致，目前得到普遍接受的发病机制是β-淀粉样蛋白(β-amyloid protein，Aβ)学说，该学说的核心是Aβ在脑内聚集，会形成老年斑，从而进一步引起一系列病理症状的产生，Aβ是形成老年痴呆症的主要原因。Aβ是由β-淀粉样前蛋白(β-amyloid precursor protein，APP)经过β-分泌酶( β-APP cleaving enzyme, BACE)和γ-分泌酶剪切形成的由39-43个氨基酸组成的多肽，在AD的病理过程中起着主要作用。Aβ是一个聚集性很高的多肽，在正常状态下，Aβ可稳定地被分解、去除，仅以可溶性状态微量存在于脑组织中。1994年，从AD病人大脑皮层提取的水溶性片段被命名为水溶性的Aβ。在早期的生理状态中，Aβ聚集物也是一种可溶性的Aβ。水溶性的Aβ存在于正常人的脑脊液和血浆中，但是在正常的脑中却难以检测到，表明存在着一种快速降解Aβ的机制，这种降解机制一旦被破坏，就会进一步的聚集，导致AD的发生。正常人体内也存在浓度非常低的Aβ，但它们在脑内沉积需要很长的时间，并且脑内有抑制Aβ聚集的因子，如卟啉、谷氨酰胺合成酶、载脂蛋白等。在AD脑中，由于某种原因Aβ代谢平衡被破坏，即变成高度不溶性的Aβ沉着在细胞间，与变性的神经突起、反应性神经胶质细胞一起形成老年斑。而AD患者由于Aβ浓度升高或抑制Aβ聚集的物质缺乏等原因，Aβ聚集沉积，导致神经元坏死缺失、激活补体、使胶质细胞活性增加、细胞的骨架蛋白tau蛋白过度磷酸化等，最终引起痴呆。
Maynard等研究发现, 在AD 的脑组织中的老年斑内或其周围有高浓度的铜。Opazo等也发现在老年斑附近, 铜、锌的浓度显著升高。最近, 越来越多的研究证据表明Aβ 的沉积是通过与金属离子, 尤其是与锌、铜、铁异常地螯合引起的。金属离子通过作用于神经细胞代谢, 参与氧化应激以及氧化损伤作用, 促进Aβ 沉积以及老年斑形成。
目前，临床使用的一些药物只是改变临床症状，并不能彻底治愈治疗老年痴呆病人。因此，研究开发高效低度的药物是必要的。
发明内容
本发明的目的在于提供一种新的用于作为β-淀粉样蛋白聚集抑制剂，用于预防和/或治疗老年痴呆疾病的药物。
本发明通过以下技术方案实现上述目的：
本发明首次将丹酚酸A作为β-淀粉样蛋白(Aβ)生成抑制剂或聚集抑制剂，或聚集Aβ纤维解聚剂。
发明同时公开并保护了丹酚酸A在制备预防和/或治疗阿尔茨海默病药物上的应用。
发明同时提供了一种具有抑制β-淀粉样蛋白聚集或纤维形成的药物，其特征在于含有丹酚酸A，或其衍生物，或其与酸或碱形成的可药用的盐。
发明同时提供了一种用于预防和/或治疗阿尔茨海默病的药物，其特征在于有丹酚酸A，或其衍生物，或其与酸或碱形成的可药用的盐。
发明发现，丹酚酸A可用于预防或治疗由多种金属元素诱导的β-淀粉样蛋白(Aβ)生成/聚集或阿尔茨海默病。例如，金属元素为铜、铁或锌。
上述所说的抑制β-淀粉样蛋白聚集或纤维形成的药物，或预防和/或治疗阿尔茨海默病的药物，还可以包括药学上可接受的载体和\或赋形剂。
丹酚酸A (Salvianolic acid A), 结构式如下：
分子式为C26H22O10，为淡黄色结晶，分子量为494.45，能溶于乙醇、乙醚，熔点315～323℃。
该化合物可由唇形科植物丹参(Salviae miltiorrhiza Bunge)中提取制得。其制备方法通常为：将丹参药材用水或醇提取,初步除去固体杂质，柱色谱纯化丹酚酸A，浓缩洗脱液，再经调pH值有机溶剂萃取，浓缩干燥，即得丹酚酸A。据报道，丹酚酸A有抗凝作用，脑保护作用，抗氧化作用，肝保护作用，白内障的防治作用，抗动脉粥样硬化作用，抗肿瘤，抗炎，心肌保护作用，改善血液循环等。但至今未见有关丹酚酸A具有防治老年痴呆有关的报道。
我们在对大量化合物进行活性筛选的基础上，找到具有显著活性的β-淀粉样蛋白的聚集抑制剂，并且可以降低β-淀粉样蛋白聚集引起的细胞毒性，延缓线虫的瘫痪。同时，该化合物还可以与金属离子螯合，从而抑制因金属离子在老年痴呆病人脑内大量产生，而引起的痴呆。因此，该化合物具有双靶点同时抑制的作用，有望开发成一种预防和治疗老年痴呆疾病的临床药物。
本发明采用了硫磺素T法对化合物丹酚酸A进行了体外抑制Aβ1-42自聚集以及解聚实验，以姜黄素为阳性对照药物；采用MTT法检测化合物丹酚酸A的神经细胞SH-SY5Y的毒性大小，以及对Aβ诱导的细胞毒性的影响；采用紫外分光光度法检测丹酚酸A的金属离子螯合能力；利用秀丽隐杆线虫的老年痴呆模型（CL4176），研究丹酚酸A对Aβ过表达引起线虫瘫痪的影响。
本发明的目的通过以下具体措施来达到：
本发明式Ⅰ化合物丹酚酸A结构式如下所示：
式Ⅰ
本发明的具体步骤如下： （1）采用硫磺素T法，对丹酚酸A进行了体外抑制Aβ1-42聚集以及解聚实验，以姜黄素为阳性对照药物。
（2）采用紫外分光光度（UV-vis）法，研究化合物丹酚酸A体外金属离子（Cu2+，Fe3+，Zn2+）螯合作用，以及采用硫磺素T法，检测丹酚酸A对金属离子诱导的Aβ聚集抑制活性的大小。
（3）采用MTT法，研究化合物丹酚酸A对神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y的毒性大小，以及对Aβ诱导的细胞毒性的影响。
（4）应用秀丽隐杆线虫的阿尔茨海默病模型（CL4176），检测化合物丹酚酸A对线虫瘫痪时间的影响，以及线虫体内Aβ表达的影响。
与现有的抑制剂相比，本发明具有如下有益效果：
本发明化合物丹酚酸A具有较好的β-淀粉样蛋白的产生，聚集或纤维形成的抑制作用；本发明化合物对细胞无毒性；本发明化合物来源丰富，极易从中药丹参中分离得到。
附图说明
图1为化合物丹酚酸A对β-淀粉样蛋白聚集的抑制以及解聚影响；
图2为化合物丹酚酸A与金属离子螯合作用及抑制金属离子诱导的Aβ聚集的作用；其中Sal A 表示丹酚酸A；
图3为化合物丹酚酸A对人神经母细胞瘤细胞（SH-SY5Y）的细胞毒活性及对Aβ诱导的细胞毒性的影响；其中Sal A 表示丹酚酸A；
图4化合物丹酚酸A在秀丽隐杆线虫的阿尔茨海默病模型中线虫瘫痪的影响以及线虫体内Aβ表达的影响；其中Sal A 表示丹酚酸A，Hup A表示石杉碱甲。
具体实施方式
以下结合实施例来进一步解释本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。
实施例1
丹酚酸A对β-淀粉样蛋白的聚集或纤维形成的抑制以及解聚活性测试
1.1实验方法：建立β-淀粉样蛋白体外老化模型，采用硫磺素T荧光分析，通过体外孵育方式观察候选药物干预β-淀粉样蛋白聚集和纤维形成作用以及对老化纤维的解聚作用。
（1）溶液配制：
硫磺素T溶液：取3 mg粉末溶于甘氨酸－NaOH缓冲液（50 mM，pH8.5）中，储备液浓度为1 mM。工作浓度稀释为5 μM；
β-淀粉样蛋白溶液：β-淀粉样蛋白粉末用磷酸缓冲液PBS（0.02M，pH7.4）配制成440 μM的溶液，分装储存于-80 ℃，用时融化、稀释；
药物溶液：溶于二甲亚砜（DMSO，dimethylsulfoxide），配成10 mm/L浓度，-20 ℃低温冰箱保存，临用时按要求（用培养液或PBS）稀释至所需浓度，使DMSO终浓度小于或等于1％（v／v）。
（2）药物抑制β-淀粉样蛋白聚集或解聚的影响：取100 μM的β-淀粉样蛋白蛋白10 μL，加入10 μL的化合物，混匀（冰上操作），于37℃中共同孵育48 h。孵育结束后，所有样品加入5 μM的 Th-T磷酸缓冲液180 μL，充分混合后，用96孔黑板，立即进行荧光检测。或者不加药物，孵育48 h后，再加入化合物丹酚酸A，再孵育48小时，再进行荧光检测。设定激发波长（excitation wavelength，λEx）＝450 nm，发射波长（emission wavelength，λEm）＝482 nm，记录5 min末的荧光强度（Fluorescence Intensity，FI），重复测定三次实验所测结果的平均值代表其荧光程度。
1.2实验结果：随着化合物丹酚酸A浓度增加，对β-淀粉样蛋白聚集的抑制（见图1 A and B）或解聚（见图1 C and D）活性逐渐增加。在（图1A）中姜黄素在50 μM时对β-淀粉样蛋白聚集的抑制活性大小为70%，而丹酚酸A的活性在40 μM时为98%，由此可见，丹酚酸A的活性明显强于姜黄素。在（图1B）中可见，丹酚酸A对β-淀粉样蛋白聚集的抑制活性呈现剂量依赖性，且IC50在1-4 μM之间。在（图1C）中，姜黄素在50μM对β-淀粉样蛋白的解聚活性大小为53%明显弱于在此浓度下解聚活性为75%的丹酚酸A。在（图1D）中可见，丹酚酸A对β-淀粉样蛋白的解聚活性呈现剂量依赖性。
实施例2
丹酚酸A与金属离子螯合作用及抑制金属离子诱导的Aβ聚集的作用。
2.1 实验方法：
（1）溶液配制：
丹酚酸 A 溶液：称取一定量化合物用无水乙醇配制到1 mM。
金属离子溶液：称取一定量的ZnSO4, CuSO4 和 Fe2(SO4)3用无水乙醇配制到浓度为1 mM。
β-淀粉样蛋白溶液：β-淀粉样蛋白粉末用磷酸缓冲液PBS（0.02M，pH7.4）配制成440 μM的溶液，分装储存于-80 ℃，用时融化、稀释；
（2）丹酚酸A与：ZnSO4, CuSO4 和 Fe2(SO4)3的作用
取3支1.5 mL梨形管，分别加入10 μL 1 mM 丹酚酸A溶液，再分别加入10 μL 1 mM ZnSO4, CuSO4 和Fe2(SO4)3溶液，最后补加入PBS（0.02M，pH7.4）使总体积为1000 μL，丹酚酸A与金属离子的终浓度均为10 μM。空白对照为10 μL 1 mM化合物溶液补加PBS至与样品中化合物浓度相同。混匀后在室温下放置30 min，倒入石英皿用紫外-可见光谱仪扫描吸收曲线。测试温度为室温，测试范围为200-600 nm，波长间隔为1 nm，扫描速率为200 nm/min，每个样品测试三次，取平均值。
（3）丹酚酸 A 对金属离子诱导的Aβ聚集抑制活性
本实验中，先将两组，每组三份的终浓度为20 μM Aβ1-42和50 μM金属离子20 μL在37 ℃恒温箱中孵育5 min，然后往其中一组中加入化合物丹酚酸A。继续置于在37 ℃恒温箱中孵育45 min。将孵育液转移至黑色96孔板中，加入180 μL 5 μM的硫磺素T溶液，室温下于暗处静置反应5 min。最后，用多功能酶标仪测量荧光吸收值，发波长为450 nm，吸收波长为485 nm。
2.2实验结果：在化合物丹酚酸A溶液中加入等浓度的CuSO4 和Fe2(SO4)3之后发现其紫外光谱发生了红移，在（图2 A）中,丹酚酸A的一个紫外吸收峰为279 nm，加入等浓度的CuSO4之后，紫外吸收峰平移到267nm；加入等浓度的Fe2(SO4)3之后发现其紫外峰平移到287nm，表明化合物可能与Cu2+和Fe3+鳌合形成了复合物（见图2 A）。而加入ZnSO4溶液后，紫外光谱未发现明显变化。表明丹酚酸A能够与Cu2+和Fe3+鳌合，不能与Zn2+螯合。而ThT检测结果表明，这三种金属离子都能快速地诱导Aβ1-42聚集，在（图2 B）中，Aβ1-42的荧光吸收值为6120，而在加入ZnSO4, CuSO4 和Fe2(SO4)3之后，蛋白的荧光吸收值迅速地增加到26341,27542,28546。在加入丹酚酸A的那一组中，荧光值为9986,3219,3845。说明丹酚酸A能显著抑制金属离子诱导的Aβ聚集（见图2 B）。
实施例3
利用SH-SY5Y细胞模型，应用MTT法评估化合物丹酚酸A的细胞毒性及对Aβ诱导的细胞毒性大小的影响。
3.1实验方法：
MTT溶液：取125 mg MTT粉末用50 mL无菌PBS（0.01 mmol／L，pH7.4）溶解，配成2.5mg/mL，在超声清洗仪振荡数十秒，滤过除菌，然后于4℃避光保存。两周内使用有效，最好现配现用。
SH-SY5Y细胞培养：SH-SY5Y细胞使用含10％胎牛血清的DMEM培养基，在37℃、5％CO2培养箱进行培养。
接种细胞：将生长良好的SH-SY5Y细胞，小心弃去培养皿内的大部分细胞培养液，用0.25% 胰酶消化4 min后，1000 rpm／min离心5 min；弃去离心后上清液，重新加入DMEM，用血细胞计数板计数，转移单细胞悬液至培养皿并调整细胞密度为8×104个／mL。用8道加样器吸取单细胞悬液加入96孔板中，100 μL／孔，即8000个细胞／孔。
药物干预：在37℃，5% CO2培养箱中培养24 h，待细胞贴壁后吸去上清液，分别用培养基稀释的不同浓度药物处理细胞，设立不加任何处理因素的对照组，空白孔，每个浓度设3个平行复孔，加入20 μM的β-淀粉样蛋白与化合物混合液或者化合物丹酚酸A 100 μL，与细胞于37℃，5% CO2培养箱中作用48 h。每孔加入2.5 mg/mL的MTT 20 μL，于37℃，5% CO2培养箱中培养4 h。弃去上清，每孔加入100 μL的DMSO，振荡15秒，测量490 nm处的吸收值（A）。
细胞毒性评价：各组细胞存活率（％）＝（试验组A值/对照组A值）×100%,从而得出各组细胞存活率。
3.2 试验结果：化合物丹酚酸A对SH-SY5Y细胞无明显毒性，在（图3 C）中，丹酚酸A在40 μM,20μM,10μM,5μM均能促进细胞生长，且呈现剂量依赖性。化合物丹酚酸A能降低Aβ诱导的细胞毒性，在（图3 A and B），Aβ在40 μM,20μM,10μM具有明显的细胞毒性。但在20μM 的蛋白中加入40 μM,20μM,10μM,5μM的丹酚酸A，能明显降低Aβ诱导的细胞毒性，且呈现剂量依赖性。
实施例4
化合物丹酚酸A在秀丽隐杆线虫老年痴呆模型中，对线虫瘫痪的影响以及线虫体内Aβ表达的影响。
4.1实验方法：
线虫传代
酒精灯烤刀片，从母板中切一三角形小胶块，有线虫的一面朝下贴与新板之上，封口膜封口，再次烤刀片，一般3天线虫长成可同步化进行实验。
线虫同步化
用ddH2O将线虫及卵从培养皿上洗下来，每次1 mL，洗两次，用ddH2O补至3.5 mL体积，加入0.5 mL 5N NaOH溶液和1 mL NaClO溶液，剧烈振荡数十秒，静置2min，重复5次，1300g离心30s，弃上清，加5mL ddH2O，振荡，1300g离心30s，弃上清，将沉淀（虫卵）转移到新的培养皿中。
AD线虫模型筛选（每个样品要2个板平行做）
传代的CL4176 在15℃下培养3天后同步化，15℃下培养，孵化后24h将虫用1mL双蒸水洗下来，滴加到加药的培养皿中（药物混合OP50菌液滴加在NGM培养皿上），每个皿25条左右。，孵化后36小时将培养皿转移到26℃下培养，转温36h后开始计数，直到全部线虫瘫痪（瘫痪是指在受到刺激时线虫不能移动或者只有头部可以移动的情况）
4.2实验结果：化合物丹酚酸A能降低Aβ在线虫体内的生成，通过Western Blot实验，在（图4 C and D）中，丹酚酸A在50μM 和200μM的浓度下，Aβ在线虫体内的表达量明显减少。化合物丹酚酸A能延缓线虫瘫痪，延长寿命（见图4 A and B）,空白组的线虫平均寿命为45h, 丹酚酸A在50μM 和200μM的浓度下能显著延长线虫寿命到46.7h和47.1h，比500μM的石杉碱甲活性还要好。
Claims (7)
1.丹酚酸A在制备β-淀粉样蛋白生成/聚集抑制剂或聚集Aβ纤维解聚剂上的应用。
2.丹酚酸A在制备预防和/或治疗阿尔茨海默病药物上的应用。
3.如权利要求1或2所述的应用，其特征在于所述的β-淀粉样蛋白生成/聚集或阿尔茨海默病，由金属元素诱导而致。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述的金属元素为铜、铁或锌。
5. 一种具有抑制β-淀粉样蛋白聚集或纤维形成的药物，其特征在于含有丹酚酸A，或其衍生物，或其与酸或碱形成的可药用的盐。
6. 一种用于预防和/或治疗阿尔茨海默病的药物，其特征在于有丹酚酸A，或其衍生物，或其与酸或碱形成的可药用的盐。
7. 如权利要求5或6所述的药物，其特征在于还包括药学上可接受的载体和\或赋形剂。
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