CN105287475A - 丹酚酸a减少胶质细胞疤痕功效的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种丹酚酸A减少胶质细胞疤痕功效的应用，本发明首次阐述了丹酚酸A能减少中风导致的胶质细胞疤痕，从而直接产生对神经损伤的修复功效。其意义在于丹酚酸A减少胶质细胞疤痕后，使得内源性神经修复机理如新生血管、新生神经细胞得迁移进入损伤部位，也使得其它治疗药物能到达损伤部位实现神经损伤的修复。

Description

丹酚酸A减少胶质细胞疤痕功效的应用

技术领域

该发明涉及丹酚酸A减少胶质细胞疤痕的功效，直接制备药物或作为某药物的添加剂用于促进神经损伤的修复。

背景技术

各种类型的神经损伤普遍导致胶质细胞的过度增生。增生的胶质细胞具有较长的突起，相互铰链形成密集的胶质疤痕。研究进展表明胶质疤痕对于神经损伤既有保护作用，也有不利影响。神经损伤的初期阶段(急性期)，胶质疤痕把神经损伤部位封闭起来，避免神经损伤继续扩大。然而，密集的胶质疤痕在后期不仅妨碍了新生血管、新生神经细胞迁移进入神经损伤部位，也妨碍了任何药物穿透进入损伤部位实现神经损伤修复的功效。最典型的例子是缺血性中风导致的胶质疤痕。缺血性中风不仅是导致人类死亡的主要因素之一，也是导致生存者躯体运动障碍，语言、情绪和记忆等认知功能障碍的主要因素之一。缺血性中风后，中风部位普遍存在胶质细胞的过度和迅速增生，形成密集的胶质疤痕。目前，组织纤溶酶原活化因子(tPA)广泛应用于治疗中风后4.5小时内的患者。但是，100多个拟治疗中风后神经损伤的新药临床试验均以失败告终。尽管这些临床失败的原因仍然不完全清楚，胶质疤痕可能是妨碍这些药物顺利到达损伤部位从而发挥应有功效的重要原因之一。因此，要实现中风后神经损伤部位的修复，需要先消融或减少胶质细胞的密度，使治疗药物能到达损伤部位，同时使新生血管、新生神经细胞能够迁移生长进入损伤部位，最终才能真正实现神经损伤后的修复。研究具有减少胶质细胞疤痕密度的新药可能是治疗中风后神经损伤的关键，具有重大的临床意义和经济价值。

丹酚酸A(SalvianolicacidA)，是唇形科植物丹参(SalviamiltiorrhizaBunge)干燥根及茎中所含的一种水溶性酚酸类化合物。研究报道表明，丹酚酸A具有抗氧化作用，可以对抗超氧阴离子和羟基自由基导致的过氧化反应和损伤；对缺血再灌注引起的脑细胞损伤有明显的保护作用；改善小鼠脑缺血再灌注导致的学习记忆功能障碍。但是，丹酚酸A是否具有减少或消融胶质疤痕的功效，由此促进神经损伤后的修复迄今未见报道。

发明内容

本发明的目的旨在利用丹酚酸A减少或消融胶质疤痕，以促进神经损伤的修复过程，最终实现神经组织和功能障碍的康复。

优选的，丹酚酸A直接在用于制备药物促进胶质疤痕的减少或消融的应用。

优选的，丹酚酸A作为添加剂应用于制备其它药物促进胶质疤痕的减少或消融的应用。

优选的，丹酚酸A直接用于制备药物或作为添加剂制备其它药物促进神经损伤后的修复过程，预防或治疗与胶质细胞过度增生相关的神经组织损伤或相关疾病。

优选的，丹酚酸A减小或消融胶质疤痕，因而直接用于制备药物或作为添加剂制备其它药物，应用于神经损伤后的胶质疤痕治疗，最终有助于神经损伤修复。

优选的，丹酚酸A直接用于制备药物或作为添加剂制备其它药物，用于预防或治疗与胶质疤痕相关的其它特定疾病。

优选的，所述特定疾病是指专业上显而易见的胶质细胞过度增生形成胶质疤痕因而妨碍了神经损伤后的修复。

优选的，所述特定疾病是指血管性痴呆症、老年痴呆症和脊髓损伤。

尽管本发明是以中风导致胶质细胞疤痕为例阐述丹酚酸A减少胶质细胞疤痕的功效为基础的应用。许多慢性疾病如血管性痴呆症、老年痴呆症、脊髓损伤等也广泛存在过度增生的胶质疤痕问题。本发明还包括这些在专业上显而易见的应用范围。

本发明中，上述涉及的丹酚酸A功效，减少或消融胶质细胞疤痕，是丹酚酸A通过促进胶质细胞(GFAP阳性细胞)的重编程，把胶质细胞在原位转化为新生的神经细胞(NeuN阳性细胞)，从而不仅减少或消融胶质疤痕，也直接促进神经组织的修复。本发明所述的脑疾病或脑损伤是指缺血性脑中风以及显而易见的胶质细胞过度增生相关疾病或损伤。所述的GFAP阳性细胞，是指胶质细胞特异表达的胶质纤维酸性蛋白(Glialfibrillaryacidprotein(GFAP))，被认为是用免疫组化方法检测胶质细胞的一个典型标记分子。

本发明实验内容如下：

一、丹酚酸A治疗缺血性中风的量-效关系研究

(一)丹酚酸A(SalA)治疗小鼠缺血性中风的量-效关系研究

1实验动物

该实验所使用的昆明品系小鼠购买于北京华埠康生物科技股份有限公司。选用小鼠4-5周龄，雄性，体重30-35g，合格证号为SCXK(京)2014-0004。每组动物数量见表1和2。受试品为SalA。实验设置SalA不同剂量组、溶媒对照组(阴性对照)以及阳性对照药物依达拉奉组(Edaravone)。

2实验步骤

采用光化学诱导小鼠海马缺血性中风模型。腹腔注射玫瑰红(RB，100mg/kg)，随后腹腔注射戊巴比妥钠(约80mg/kg)麻醉动物。头皮下注射适量盐酸普鲁卡因后，于头正中线切开头皮，清理结缔组织，用脱脂棉蘸取70％酒+精擦干颅骨表面。随后使用脑立体定位仪固定动物头部，参照脑立体定位操作规范调整左右前后水平，颅骨钻孔(钻头直径约1mm)，海马坐标位置为(AP：-2.5mm，ML：±1.8mm)，暴露硬脑膜，用手术针挑破硬脑膜。光纤(直径200μm)下至颅骨下1.4mm(DV)。腹腔注射玫瑰红后1小时，给予蓝色激光(473nm)照射20min。术后不同时间点通过腹腔给予药物治疗或对照处理。手术期间使用电热毯保持动物正常体温，供给动物医用混合氧气，必要时补充麻醉剂以避免动物的疼痛感受。手术结束后等到动物清醒、恢复自主运动后把动物放回饲养笼。给药后的第5天处死动物，取出大脑(切除小脑和嗅球)，称取脑重量，将脑置于人工脑积液环境下进行切片(厚度为350μm)，把脑片放置于PH值为7.4的4％TTC染液中，于37℃避光孵育染色15min，然后取出脑片放入多聚甲醛(PFA)液中固定15min。正常脑组织染成红色，呈白色部分为缺血脑区。将白色缺血区域用手术刀取材，随后称取其重量。

给药方式：腹腔注射给予治疗药物SalA、Edaravone以及对照组生理盐水。腹腔注射SalA的时间点分别为中风造模后0h、3h、5h和8h。

检测指标：脑梗死指数(Infarctindex)＝梗死灶湿重量(g)/梗死灶湿重量(g)×100％。

数据统计：各实验组的梗死指数,以mean±SEM表示，用SPSS11.5统计软件进行独立样本t检验，显著差异设置为P<0.05。

3实验结果

3.1SalA减小小鼠脑梗死指数的剂量-效应关系研究

表1SalA减小小鼠脑梗死指数的剂量-效应关系

*P<0.05(vs.Saline)

缺血性中风模型造模后，给予小鼠SalA治疗，其低、中、高剂量SalA组的梗死指数低于对照组。与对照组比较，中剂量组(3mg/kg)的梗死指数显著降低(P<0.05)，表明SalA对小鼠缺血性中风具有显著的神经保护作用。

(二)SalA治疗大鼠缺血性中风的剂量-效应关系研究

1实验动物

SD品系大鼠购买自北京华埠康生物科技股份有限公司。使用雄性SD大鼠，体重300-350g，合格证号为SCXK(京)2014-0004。每组动物数量见表2。受试品为SalA。实验设置SalA不同剂量组、溶媒对照组(阴性对照)以及阳性对照药物依达拉奉组(Edaravone)。

2实验步骤

采用光化学诱导大鼠海马缺血性中风模型。尾静脉注射玫瑰红(RB，100mg/kg)，缓慢推注，推注时间至少1min。戊巴比妥钠(腹腔注射约80mg/kg)麻醉SD大鼠，电热毯保持大鼠体温、呼吸机供给大鼠医用氧气。头皮下注射适量盐酸普鲁卡因，手术刀由正中间切开头皮，清理颅骨结缔组织，将动物固定于脑立体定位仪。颅骨钻孔(直径约1mm)，打孔位置为(AP：-3.8mm，ML：±2.8mm)，暴露硬脑膜，用手术针挑破硬脑膜。光纤(直径200μm)下至颅骨下2.5mm(DV)。等至玫瑰红注射1小时时，给予蓝色激光(473nm)照射20min。造模后给药。给药后第五天处死动物，取脑，在人工脑积液环境下进行切片(厚度为350μm)，把脑片放于PH值为7.4的4％TTC溶液中，于37℃避光孵育染色15min，取出后放入多聚甲醛(PFA)中固定15min。然后拍照、梗死体积计算。

给药方式：舌下静脉注射给予治疗药物SalA，Edaravone或生理盐水。SalA的给药时间点为中风后0h、5h、8h和12h。

指标检测：测量每一脑片的梗死面积。梗死体积(Infarctvolume)＝脑片梗死面积之和×脑片厚度。

数据统计：各实验组的梗死体积，以mean±SEM表示。用SPSS11.5统计软件进行独立样本t检验。显著差异设置为P<0.05。

3实验结果

3.1SalA减小大鼠缺血性中风梗死体积的剂量-效应关系研究

表2SalA减小大鼠缺血性中风梗死体积的剂量-效应关系

*P<0.05(vs.Saline)

SalA对缺血性中风脑梗死体积的影响有一定的剂量-效应关系。

其中2mg/kg剂量可显著减少梗死体积(P<0.05)。更低或更高的剂量没有显著效果。

二、SalA减少缺血性中风模型导致的胶质细胞疤痕

1实验动物

昆明品系小鼠购买自北京华埠康生物科技股份有限公司。使用4-5周龄，雄性，体重30-35g，合格证号为SCXK(京)2014-0004。

2实验步骤

用戊巴比妥钠麻醉小鼠(60mg/kg)后，把小鼠固定于脑立体定位仪上。呼吸机给予小鼠医用氧气、电热毯维持小鼠正常体温。在双侧海马脑区进行埋管，管长7mm，管为深圳瑞沃德，以颅骨冠状缝与矢状缝会合处(bregma)点为原点，定位光纤埋置的坐标为：(AP：-2.5mm，ML：±2.0mm，DV：-1.2mm)。用牙科水泥(dentalcement)将埋入的光纤导管固定于小鼠颅骨。手术结束后，等至小鼠清醒恢复自主运动后放回饲养箱中恢复7天。

小鼠在清醒可自由移动的情况下，进行海马缺血性中风造模。先腹腔给予小鼠玫瑰红(rosebengal，sigma,i.p.，100mg/kg)或生理盐水(10mg/ml)，1小时后将直径为200μm的光纤沿导管插入并与导管壁螺纹旋紧固定。饲养环境中给予30min的蓝色激光照射(473nm，20mW)。

在小鼠缺血性中风造模后1小时，通过光纤导管给予小鼠海马SalA或生理盐水。给药时把给药管沿导管插入，并与导管壁旋紧固定，给药管的另一端与微量注射泵连接。微量注射泵购买自迷醉夏新源同德医疗设备有限公司，型号为WZ-50C6。模型小鼠的一侧海马给予生理盐水1μl；另一侧海马给予SalA(3μg，1μl)：生理盐水溶(1μl)。

在造模后第7天，将小鼠用戊巴比妥钠(60mg/kg)麻醉。用pH值为7.4的0.1MPBS50ml和pH值为7.4的4％PFA50ml灌流和固定。随后取出脑组织，放入上述相同4％PFA溶液中4℃过夜后固定。将后固定好的组织放入30％蔗糖生理盐水溶液中4℃过夜脱水。将脱水后的组织进行冠状切片(LeicaVT1000)，脑片为40μm厚。将脑片用0.1MPBS洗脱3次，每次10分钟。

随后将脑片放入含有H₂O₂的TritonX-100溶液中(0.3％H₂O₂，0.1％TritonX-100，PBS溶)进行室温下通透30min。用PBS溶液洗脱三次，10min/次。放入封闭液中(5％羊血清，碧云天，PBS)室温封闭1小时。再将封闭好的孵育一抗GFAP(ab4647，Abcam)，抗体稀释比为1：2000(稀释液：5％羊血清，0.1％TritonX-100，PBS溶)，4℃过夜。将孵育完一抗的脑片用PBS洗脱3次，10min/次。将上述脑片孵育二抗，Rabbit-IgG-biotin(ABC试剂盒，碧云天)，抗体稀释比为1：500(稀释液：5％羊血清，0.1％TritonX-100，PBS溶)，室温下2小时。之后用PBS洗脱3次，10min/次，洗脱后，孵育抗体avidin-HRP(ABC试剂盒，碧云天)，抗体稀释比为1：200(稀释液：5％羊血清，0.1％TritonX-100，PBS溶)，室温下2小时。孵育用PBS洗脱3次，10min/次。将洗脱液完毕的脑片放入DAB溶液中显色，最后将染好色的脑片贴片，用70％甘油进行封片，显微镜观察。

3实验结果

通过GFAP免疫组化染色发现，在小鼠缺血性中风后的第7天，中风部位显示了大量密集的胶质细胞，其长伪足相互铰链形成胶质疤痕。在3μgSalA治疗的海马侧中风部位，不仅胶质细胞有显著的减少，其胶质细胞的伪足突出变短，表明SalA能显著的减小或消融胶质疤痕。

通过上述例举实验，本发明首次阐述了丹酚酸A能减少中风导致的胶质细胞疤痕，从而直接产生对神经损伤的修复功效。其意义在于丹酚酸A减少胶质细胞疤痕后，使得内源性神经修复机理如新生血管、新生神经细胞得迁移进入损伤部位，也使得其它治疗药物能到达损伤部位实现神经损伤的修复。

Claims (4)

1.一种丹酚酸A减少胶质细胞疤痕功效的应用，其特征在于，丹酚酸A减小或消融胶质疤痕，因而直接用于制备药物或作为添加剂制备其它药物，应用于神经损伤后的胶质疤痕治疗，最终有助于神经损伤修复。

2.根据权利要求1所述的丹酚酸A减少胶质细胞疤痕功效的应用，其特征在于，丹酚酸A直接用于制备药物或作为添加剂制备其它药物，用于预防或治疗与胶质疤痕相关的其它特定疾病。

3.根据权利要求2所述的丹酚酸A减少胶质细胞疤痕功效的应用，其特征在于，所述特定疾病是指专业上显而易见的胶质细胞过度增生形成胶质疤痕因而妨碍了神经损伤后的修复。

4.根据权利要求2所述的丹酚酸A减少胶质细胞疤痕功效的应用，其特征在于，所述特定疾病是指血管性痴呆症、老年痴呆症和脊髓损伤。