CN103239502B - 一种核桃青皮提取物及其制备方法和作为抗氧化剂的用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种核桃青皮提取物及其制备方法，以及该提取物的抗氧化作用及其作为抗氧化剂有效成分的新用途。

Description

一种核桃青皮提取物及其制备方法和作为抗氧化剂的用途

技术领域

本发明涉及一种核桃青皮提取物及其制备方法，特别是一种核桃青皮提取物的新用途。属于天然产物提取领域。

背景技术

核桃(Juglans regia Linn.)是胡桃科核桃属落叶乔木，在我国栽培历史悠久，资源丰富，分布广泛，我国栽培的核桃品种约有40余种，全国24个省(区)都有栽培和分布，其面积和产量均居世界首位。核桃青皮（walnut green husk）又称青龙衣，为核桃外部一层厚厚的绿色果皮，青皮产量一般都高于干果产量，是核桃的主要副产品。

目前，核桃青皮大多没有得到有效利用，主要是作为废弃物丢弃于田间地头。由于核桃青皮含有毒性物质，所以是一种环境污染源。现在已有一些核桃青皮开发利用的研究报道，主要集中在核桃青皮中活性物质成分在杀虫、杀菌及医药的应用潜力等方面。

生物的抗氧化能力与其抗病性、抗逆性及延缓衰老密切相关，天然抗氧化剂的开发一直是相关领域的热点之一。天然抗氧化剂是指从天然动、植物体或其代谢物中提取出来的具有抗氧化活性的物质，和人工合成抗氧化剂相比，它们具有天然、高效、低毒等优点。天然植物及其材料是天然抗氧化剂的重要来源。

蓝晶晶等研究表明，核桃青皮黑色素对DPPH·和·OH的清除能力均强于核桃壳黑色素和人工合成的抗氧化剂BHT，还原能力与BHT相仿，清除O^2-·的能力强于核桃壳黑色素，而稍弱于Vc。赵国建等通过体外抗氧化体系对核桃青皮多酚的抗氧化能力进行研究，结果表明，核桃青皮多酚在各体系中均有一定的抗氧化性能，并且其抗氧化能力随着浓度的增加而增强。Ivo Oliveira等提取核桃青皮多酚，测试了青皮沸水提取物的总酚含量，并从清除自由基能力、还原能力等方面测定了核桃青皮水提取物的抗氧化能力。

上述研究都从不同角度证明了核桃青皮的抗氧化作用，但都是测定的核桃的特定成分（如黑色素、多酚）。而获得特定成分往往要经过提取、分离、纯化等过程，操作繁琐，成本高，并且单一成分的活性作用不一定最好。能否找到一种更为简便的提取方法，将青皮中不同抗氧化活性成分尽可能同时提取出来，进而获得具有更高活性的提取物呢？

基于以上背景，发明人进行了核桃青皮抗氧化作用提取物的提取方法和抗氧化活性研究。

发明内容

本发明目的是提供一种核桃青皮提取物以及该提取物的制备方法，以及所述核桃青皮提取物作为抗氧化剂的用途。

为实现上述目的，本发明包括以下技术方案：

本发明首先提供一种核桃青皮提取物的提取方法，该方法包括：取青核桃并将核桃青皮剥离，将核桃青皮置于50℃烘箱内烘干至恒重并粉碎，过90目筛，称取核桃青皮粉以无水甲醇为提取溶剂，料液比为1:15，65℃下回流提取3次，每次2h，合并提取液减压浓缩成浸膏状至恒重。然后用丙酮-水（1:1）溶解至100mg/mL，依次用等体积的石油醚（60-90℃）、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取，分别获得石油醚提取物、氯仿提取物、乙酸乙酯提取物、正丁醇提取物和萃余物。

其中，上述方法中提到的料液比1:15为质量/体积比（w/v)，即1克材料用15毫升溶剂；上述方法中提到的丙酮-水（1：1）为体积/体积比（v/v)，即1毫升丙酮与1毫升水混合。

其中，所得氯仿提取物和乙酸乙酯提取物即为具有抗氧化作用的提取物。

其次，本发明还提供一种核桃青皮提取物，该提取物为按照上述提取方法获得的氯仿提取物或乙酸乙酯提取物分别经减压浓缩获得的氯仿膏状物或乙酸乙酯膏状物。

另外，本发明还提供上述核桃青皮提取物在作为抗氧化剂中的用途。

优选地，所述用途为将上述核桃青皮提取物作为抗氧化剂的有效成分用于医药、保健及化妆品领域。

附图说明

图1是核桃青皮不同提取相不同浓度时清除DPPH自由基能力变化趋势图；

图2是核桃青皮不同提取物还原能力图。

具体实施方式

以下结合实施例详细地说明本发明。实施方案为便于更好的理解本发明，但并非对本发明的限制。

实施例1：提取物的制备

称取核桃青皮粉60g，加入无水甲醇900mL，65℃下回流提取3次，每次2h，合并提取液减压浓缩成浸膏状至恒重，得甲醇提取物20.02g。然后，加入丙酮-水（1:1）至完全溶解，依次用等体积的石油醚（60-90℃）、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取，减压浓缩后分别获得石油醚提取物、氯仿提取物、乙酸乙酯提取物、正丁醇提取物和萃余物分别为1.38g、0.81g、1.45g、4.33、12.1g。

实施例2：提取物清除自由基能力

采用DPPH法测定样品清除自由基能力。DPPH（1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl radical)）在517nm处有最大的吸收峰。DPPH捕捉一个电子后在517nm处的吸收消失，其褪色程度与抗氧化剂的清除自由基能力成定量关系。依此原理用分光光度计检测DPPH自由基与试样液反应后吸光值的变化，可检定试样提供氢原子、清除自由基抗氧化的能力。

实施例1中的提取物分别用丙酮-水（1:1）溶解成不同浓度（100-500μg/mL），同时用无水乙醇配制浓度为l×10^-4mol／L的DPPH溶液，避光保存备用。分别用取不同浓度的提取物样品溶液0.3mL和DPPH溶液2.7mL于具塞试管中，充分混合，30min后测定波长517nm处的吸光度As；同时，测0.3mL样品溶液和2.7mL无水乙醇的混合液的吸光度A₀；以及0.3mL无水乙醇和2.7mL DPPH溶液的混合液吸光度A_DPPH。平行测定3次，计算吸光度。以无水乙醇作阴性对照，以TBHQ作阳性对照。对DPPH的清除率计算公式为：

$p=\frac{A_{\mathrm{DPPH}}-(A_S-A_0)}{A_{\mathrm{DPPH}}}\×100\%$

式中：

A_DPPH:2.7mL DPPH溶液+0.3mL1:1的丙酮和水混合液的吸光度；

A₀:2.7mL无水乙醇+0.3mL样品溶液的吸光度；

A_S:2.7mL DPPH溶液+0.3mL样品溶液的吸光度。

实验结果如附图1和表1所示。

表1清除DPPH自由基能力

上述结果表明：核桃青皮提取物有较强的清除自由基能力。从图1中可以看出，随着样品浓度的增加（10-50μg/mL），各溶剂提取物DPPH自由基清除率也相应增加（石油醚相从4.46%增加到22.02%，氯仿相从25.54%增加到71.35%，乙酸乙酯相从40.70%增加到93.89%，正丁醇相从8.0%增加到33.46%、萃余相从0.88%增加到4.49%）。各溶剂萃取相对于DPPH清除能力EC₅₀如表1所示（石油醚相、氯仿相、乙酸乙酯相、正丁醇相、萃余相EC₅₀分别为108.97、26.11、14.05、75.48、641.79μg/mL）。清除DPPH自由基能力主要集中于氯仿和乙酸乙酯提取物中（其EC₅₀与分别为26.11、14.05μg/mL）。与清除自由基的阳性药物TBHQ（其EC₅₀为19.75μg/mL）相比较，同等条件下的乙酸乙酯相DPPH清除率略高于TBHQ的清除率，氯仿相DPPH清除率略低于TBHQ清除率，其他提取相远低于TBHQ清除率。

实施例3：提取物还原能力

采用普鲁士兰法测定提取物的还原能力。普鲁士蓝反应原理是铁离子遇到亚铁氰根会产生蓝色的亚铁氰化铁沉淀，即3K₄Fe(CN)₆+4FeCl₃→Fe₄[Fe(CN)₆]₃↓+12KCl。样品的还原能力与产生亚铁氰化铁沉淀成定量关系。取不同浓度的样品溶液0.5mL（制备方法同实施例1），加人0.2mol/LpH=6.6的磷酸盐缓冲液和1%K₃[Fe(CN)₆]溶液各2.5mL并混合均匀，混合液50℃保温20min后加人2.5mL10%的三氯乙酸溶液，混合后以3000rmp离心10min。取上清液2.5mL，加2.5mL蒸馏水和1mL0.1%的FeC1₃，混合均匀，10min后测定700nm吸光度，吸光度值越大，则表明样品的还原能力越强。

实验结果如表2和附图2所示。

表2核桃青皮不同提取相还原能力

由图2可以看出，随着质量浓度的增加，样品还原力也随之增加，还原能力与样品浓度具有正相关关系；由表2可以看出在各溶剂提取物中，乙酸乙酯和氯仿提取物还原能力最强（EC₅₀分别为44.60、34.70μg/mL），与阳性对照TBHQ（EC₅₀为15.97μg/mL）最为接近，而其他溶剂提取物与TBHQ还原能力相差甚远。

实施例1、2结果均表明抗氧化能力（还原能力和清除自由基能力）均集中于乙酸乙酯和氯仿提取物中。

实施例4：提取物总酚含量

为了探明核桃青皮提取物中抗氧化活性的物质基础，对样品中总酚含量进行了测定。

以没食子酸作为标准品，样品总酚含量以GAE(没食子酸的相当值)表示。吸取1mL样品液，加人lmLFohn-Ciocalteu试剂，充分混匀后加人2mL15%碳酸钠，用蒸馏水定容至10mL，在40℃下保温20min后，在760nm测吸光度值，以1mL相应溶剂替代样品作空白对照。用没食子酸标准品做标准曲线计算样品中总酚含量。

样品总酚含量测定公式：

$\mathrm{GAE}(\mathrm{mg}/\mathrm{mL})=\frac{X1\×V1\×V2}{W}$

式中：

X1:根据标准曲线算得样品浓度值(mg/mL)

V1:样品液稀释倍数

V2:样品液总体积(mL)

W:原料干重(g)

测定结果如下表3所示。

表3核桃青皮不同提取物总酚含量

由表3可以看出，核桃青皮各提取相均有不同程度的总酚含量，其中，乙酸乙酯和氯仿提取物总酚含量最高（分别为193.52和174.64mgGAEs/g）。该结果可能预示核桃青皮提取物中抗氧化活性与总酚含量有关。

Claims (4)

1.一种核桃青皮提取物的提取方法，该方法包括：取青核桃并将核桃青皮剥离，将核桃青皮置于50℃烘箱内烘干至恒重并粉碎，过90目筛，称取核桃青皮粉以无水甲醇为提取溶剂，料液比为1:15，65℃下回流提取3次，每次2h，合并提取液减压浓缩成浸膏状至恒重；然后用1:1的丙酮-水溶解至100mg/mL，依次用等体积的沸点范围为60-90℃的石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取，分别获得石油醚提取物、氯仿提取物、乙酸乙酯提取物、正丁醇提取物和萃余物，保留其中所得乙酸乙酯提取物；

其中，上述方法中提到的料液比1:15为质量/体积比(w/v)，即1克材料用15毫升溶剂；上述方法中提到的1：1的丙酮-水为体积/体积比(v/v)，即1毫升丙酮与1毫升水混合。

2.一种核桃青皮提取物，其特征在于，所述提取物为按照权利要求1的方法获得的乙酸乙酯提取物经减压浓缩获得的乙酸乙酯膏状物。

3.权利要求2所述的核桃青皮提取物在制备抗氧化剂中的用途。

4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于，所述用途为将上述核桃青皮提取物作为抗氧化剂的有效成分用于医药、保健及化妆品领域。