CN103234946A

CN103234946A - 动物食品中阿散酸、硝苯砷酸及洛克沙砷的测定方法

Info

Publication number: CN103234946A
Application number: CN2013101149042A
Authority: CN
Inventors: 肖亚兵; 张霞; 王伟; 崔颖
Original assignee: Tianjin Entry Exit Inspection and Quarantine Bureau of Animals Plants and Food Inspection Center
Current assignee: Tianjin Entry Exit Inspection and Quarantine Bureau of Animals Plants and Food Inspection Center
Priority date: 2013-03-19
Filing date: 2013-03-19
Publication date: 2013-08-07

Abstract

一种动物食品中阿散酸、硝苯砷酸及洛克沙砷的测定方法，其特征在于，所述测定方法包括以下步骤为：称取待测样品A克于研钵中，加入弗罗里硅土3A克充分拌匀后，用甲醇比水的体积比为3∶7的甲醇水溶液做提取剂，用加速溶剂萃取仪提取，提取完成后，再用水定容到体积5A毫升；经滤膜过滤后，供液相色谱-原子荧光光谱测定；所述A为不为零的整数。与现有技术相比，本发明的优点在于：本实施例研究并建立了加速溶剂萃取-液相色谱-原子荧光同时测定动物源性食品中阿散酸、硝苯砷酸、洛克沙砷残留量的方法；优化了加速溶剂萃取技术的提取溶剂比例、提取温度、提取时间和提取次数，提取溶剂用量少，快速，基体影响小，萃取效率高，选择性好。

Description

动物食品中阿散酸、硝苯砷酸及洛克沙砷的测定方法

技术领域

本发明涉及一种动物源性食品中阿散酸、硝苯砷酸与洛克沙砷残留量的测定方法。

背景技术

近年来，作为动物抗病原微生物和促生长类的饲料添加剂——有机砷类制剂在世界范围内广泛使用。其种类主要有阿散酸(ASA)、洛克沙砷(ROX)、硝苯砷酸(NIT)。

现有技术中，关于它们的检测方法主要是色谱和检测器联用技术：如采用高效液相色谱-紫外检测器测定了饲料中的阿散酸、硝苯砷酸和洛克沙砷，但此法仅适用于饲料样品的检测；

另如低检出限、低溶剂消耗量、少量固定相的液相色谱-质谱法测定有机砷兽药的方法，特别是色谱与电感耦合等离子体质谱联用技术。该法灵敏度高，样品前处理简单。但由于其价格昂贵，运行成本高，目前很难普及，而且样品中的盐分对ICP-MS测定砷时的干扰较大。另外，HPLC的流动相中通常会含有一定比例的有机溶剂，有机溶剂在ICP中所产生的碳可造成ICP-MS的进样管堵塞和采样锥、截取锥两锥孔变得越来越小甚至堵塞，从而导致ICP-MS的信号不稳定；

再如现有的改进方案中，利用液相色谱-氢化物发生-原子荧光联用同时检测，砷化合物在一定的浓度范围内与荧光峰面积呈良好的线性关系，但该类方案对于复杂基质样品的溶剂提取和萃取效率低，因此，有必要对动物源性食品中阿散酸、硝苯砷酸与洛克沙砷残留量的测定方法作进一步的改进。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对上述现有技术现状而提供一种提取溶剂用量少，快速，基体影响小，萃取效率高且检测准确度高的动物食品中阿散酸、硝苯砷酸及洛克沙砷的测定方法。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：本发明的测定动物源性食品中阿散酸、硝苯砷酸与洛克沙砷残留量的方法，其特征在于，所述方法为：称取质量A的试样于研钵中，加入质量B的弗罗里硅土充分拌匀后，用体积比为3∶7的甲醇-水溶液做提取剂，用加速溶剂萃取仪提取，提取完成后，再用水定容到体积C。经滤膜过滤后，供液相色谱-原子荧光光谱测定；上述的质量A与质量B的质量比为1∶3。

作为改进，所述试样选取猪肝或鸡肝，动物源性样品种类繁多，其中动物的肝脏和肾由于对砷有富集作用，因而有机砷绝大多数都残留在这两个部位，因此，我们选择肝脏作为实验样品。

再改进，通过实验的优化，所述加速溶剂萃取条件优选为：提取温度80℃；压强1500psi，静态萃取时间为4分钟；冲洗体积60％；提取次数为3次；氮气吹扫60秒。

再改进，所述滤膜的滤孔大小优选为0.45μm。

再改进，所述液相色谱条件为：色谱柱采用C18柱(250mm×4.60mm，5μm)；流速为1.2mL/min；进样量为100μL；在反相色谱流动相中添加缓冲盐，有助于改善色谱峰形并且提高色谱峰的分离度，因此流动相优选为5％甲醇-0.1％三氟乙酸-0.05mol/L磷酸二氢钾；

再改进，所述原子荧光工作条件为：综合考虑灵敏度、灯的使用寿命、发射谱线的自蚀现象等因素，选择总电流为100mA，负高压为330V；为达到灵敏度最高，载气流速优选为300mL/min，屏蔽气流速优选为900mL/min；

与现有技术相比，本发明的优点在于：本实施例研究并建立了加速溶剂萃取-液相色谱-原子荧光同时测定动物源性食品中阿散酸、硝苯砷酸、洛克沙砷残留量的方法；优化了加速溶剂萃取技术的提取溶剂比例、提取温度、提取时间和提取次数，提取溶剂用量少，快速，基体影响小，萃取效率高，选择性好；研究了液相色谱流动相和原子荧光的工作条件；在0～2.0mg/L范围内内阿散酸、硝苯砷酸和洛克沙砷的线性关系良好，线性相关系数大于0.999，阿散酸、硝苯砷酸、洛克沙砷检出限(S/N＝3)分别为2.4μg/L、7.4μg/L、4.1μg/L。

附图/表说明

图1为发明的阿散酸、硝苯砷酸和洛克沙砷混合标准溶液(1mg/L的LC-AFS谱图)；

图2为载气流量对砷形态荧光信号强度的影响的折线图。

具体实施方式

以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。

如图1至2所示，本实施例的动物食品中阿散酸、硝苯砷酸及洛克沙砷的测定方法，所述方法包括以下步骤：称取2g(精确到0.01g)试样于研钵中，加入6.000g弗罗里硅土充分拌匀后，用体积比为3∶7的甲醇-水溶液做提取剂，用加速溶剂萃取仪提取。提取完成后，用水定容到10mL。此溶液过0.45μm滤膜后，供液相色谱-原子荧光光谱测定。

所述试样选取猪肝或鸡肝。所述加速溶剂萃取条件为：提取温度80℃；压强1500psi；静态萃取时间为4分钟；冲洗体积60％；提取次数为3次；氮气吹扫60秒。所述滤膜的滤孔大小为0.45μm。所述液相色谱条件为：色谱柱采用C18柱(250mm×4.60mm，5μm)；流速为1.2mL/min；进样量为100μL；流动相为5％甲醇-0.1％三氟乙酸-0.05mol/L磷酸二氢钾。所述原子荧光工作条件为：总电流为100mA；负高压为330V；载气流速为300mL/min；屏蔽气流速为900mL/min。

以下结合实施例对本发明作进一步说明：

1实验部分

1.1仪器、试剂与样品

液相色谱/原子荧光光谱仪(LC-AFS9800)：北京海光仪器公司；高速均质器(德国IKA公司)；超声波水浴器(美国Ney公司)；LD4-2型离心机(北京医用离心机厂)；涡旋混合器(美国Fisher公司)；超纯水仪(美国Millipore公司)；加速溶剂萃取仪(ASE300)：美国戴安公司；0.45μm滤膜(直径47mm，美国Millipore公司)。甲醇为色谱纯；盐酸为优级纯；三氟乙酸、氢氧化钠、硼氢化钾、磷酸二氢钾均为分析纯；阿散酸标准品(纯度99％，Dr.Ehrenstorfer GmbH，德国)；硝苯砷酸标准品(纯度95％，日本和光纯药工业株式会社)；洛克沙砷标准品(纯度97.5％，Dr.Ehrenstorfer GmbH，德国)；实验用水为超纯水。猪肝、鸡肝均为市售。

1.2溶液的配制

载流：5％盐酸(优级纯)；还原剂(0.5％氢氧化钠-2.0％硼氢化钾)：称取氢氧化钠5g，硼氢化钾20g溶于水中，并稀释至1000mL混匀；提取剂：取甲醇300mL，倒入700mL水中，混匀；流动相(5％甲醇-0.1％三氟乙酸-0.05mol/L磷酸二氢钾)：取甲醇50mL，三氟乙酸1mL，磷酸二氢钾3.9g溶于水中，并稀释至1000mL混匀；标准储备液：准确称取阿散酸、洛克沙砷、硝苯砷酸标准品各100mg于100mL容量瓶中，用超纯水在超声波水浴中溶解，配制成1000mg/L的标准储备液；标准工作液：使用前将上述储备液以超纯水稀释至所需浓度。

1.3实验条件

LC条件：色谱柱：C18柱(250mm×4.60mm，5μm)；流速：1.2mL/min；进样量：100μL；流动相：5％甲醇-0.1％三氟乙酸-0.05mol/L磷酸二氢钾。

原子荧光工作条件：总电流：100mA；负高压：330V；载气流速：300mL/min；屏蔽气流速：900mL/min。

1.4样品处理

称取2g(精确到0.01g)试样于研钵中，加入6.000g弗罗里硅土充分拌匀后，用体积比为3∶7的甲醇-水溶液做提取剂，用加速溶剂萃取仪提取。提取温度80℃，压强1500psi，静态萃取时间为4分钟，冲洗体积60％，提取次数为3次，氮气吹扫60秒。提取完成后，用水定容到10mL。此溶液过0.45μm滤膜后，供液相色谱-原子荧光光谱测定。

2结果与分析

2.1超声离心提取和加速溶剂萃取的比较

2.1.1超声离心提取样品

称取试样2g置于50mL高速离心管中，加入提取溶剂甲醇-水溶液(体积比3∶7)30mL，均质2分钟，然后置于超声波水浴器中超声20分钟。超声完成后，置于LD4-2型离心机，12000r/min离心10分钟，将上清液转移到50mL容量瓶中。向残渣中滴加10mL3∶7甲醇-水提取剂，在涡旋混合器上充分混合均匀，然后12000r/min高速离心5分钟，合并上清液于50mL容量瓶中，用去离子水定容。此溶液过0.45um滤膜后，供LC-AFS测定。

2.1.2加速溶剂提取样品

称取试样2g于研钵中，加入6.000g弗罗里硅土充分拌匀后，装入到不锈钢的加速溶剂萃取池，放置在加速溶剂萃取仪的样品台卡口处，然后将提取条件输入到加速溶剂萃取仪的控制面板：提取温度80℃，压强1500psi，预热5分钟，用体积比为3∶7的甲醇-水溶液做提取剂，静态萃取时间为4分钟，冲洗体积60％，提取次数为3次，氮气吹扫60秒，收集全部的提取溶液。提取完成后，用水定容到10mL。此溶液过0.45μm滤膜后，供LC-AFS测定。

2.1.3超声离心提取和加速溶剂提取的比较

在超声离心提取方法中，优化了提取溶剂的组成、超声时间、离心时间以及提取次数，最后得到的最优化超声离心提取方法是：提取溶剂∶甲醇∶水(3∶7)，超声时间20分钟，离心时间10分钟，提取次数3次；在加速溶剂提取方法中，优化了提取溶剂的组成、提取温度、提取过程中的静态时间以及提取次数，最后得到的最优化加速溶剂提取方法是：提取溶剂∶甲醇∶水(3∶7)，提取温度80℃，提取过程中的静态时间为4分钟，提取次数为3次。以加标1ug/mL的样品分别采用超声离心提取和快速溶剂提取，两种提取方法均在最优化条件下进行，连续测定4次，其三种砷形态回收率结果见表1和表2。

表1超声离心提取方法的加标回收率

The sp iked recoveries of ultrasound centrifugation extraction

表2加速溶剂提取方法的加标回收率

The sp iked recoveries of accelerated solvent extraction

从表1和表2的结果对比可以看出，加速溶剂提取方法提取动物源性食品(猪肝为研究对象)中阿散酸、硝苯砷酸和洛克沙砷的回收率和稳定性明显优于超声离心提取方法。

2.2流动相的选择

在反相色谱分离中，流动相通常选择甲醇或乙腈与水的混合物。本实验选择甲醇和水的混合溶液作为流动相。但如果只是简单改变甲醇和水的不同体积比混合溶液作流动相，对于改善各有机砷形态的峰形和分离度没有多大影响。因此，通常在反相色谱流动相中添加乙酸、三氟乙酸或甲酸等酸性缓冲液或者磷酸氢二钠、磷酸二氢钾或磷酸氢铵等缓冲盐，这样就有助于改善色谱峰形并且提高色谱峰的分离度。通过实验条件的优化，最终选择5％甲醇-0.1％三氟乙酸-0.05mol/L磷酸二氢钾为最佳流动相。图1为该条件下阿散酸、硝苯砷酸和洛克沙砷混合标准溶液(1mg/L)的谱图。

2.2原子荧光工作条件的选择

2.2.1光电倍增管负高压和灯电流的选择

试验表明，增大光电倍增管负高压可提高荧光强度，但噪声也相应增大，即增大负高压不改善信噪比；荧光信号随灯电流的增大而增强。综合考虑灵敏度、灯的使用寿命、发射谱线的自蚀现象等因素，本实验选择负高压为330V，灯电流为100mA。

2.2.2载气流速的选择

载气在氢化反应过程中起着两个重要作用，一是将反应产生的氢化物带入到原子化器中，二是提供氩氢火焰燃烧需要的氩气。试验了载气流速为200～600mL/min时对荧光强度的影响，结果见图2。由图2可知，当载气流速为300mL/min的时候，灵敏度最高，载气流速再增大时灵敏度下降。实验选择300mL/min的载气流速。

2.2.3屏蔽气流速的选择

试验了屏蔽气流速分别为700、800、900、1000、1100mL/min时对荧光强度的影响。结果表明，荧光强度随屏蔽气流速的增加而增加，当屏蔽气流量达到900和1000mL/min时，灵敏度最高。本文选择屏蔽气的最佳流速为900mL/min。

2.2.4硼氢化钾质量浓度的选择

考察了硼氢化钾质量浓度在10.0～30.0g/L范围内对1μg/mL混合标准溶液荧光强度的影响，结果见表3。从表3可以看出，随着硼氢化钾浓度的增大，荧光信号值也随着升高，当达到20.0g/L时，荧光信号最大。之后随着硼氢化钾浓度再升高，荧光信号开始降低。实验选择硼氢化钾溶液的浓度为20.0g/L。

表3硼氢化钾浓度对荧光强度的影响

2.3检出限、线性范围及线性关系

在最佳实验测定条件下，阿散酸、硝苯砷酸、洛克沙砷的线性范围、相关系数、线性回归方程及检出限见表2。在所测定的含量范围内，被测物质的质量浓度(ρ，mg/L)与峰面积(A)之间的相关系数均大于0.999，检出限为2.4～7.4μg/L。

表4阿散酸、硝苯砷酸、洛克沙砷的分析性能参数(n＝6)

Table4The analytical parameters of arsanilic，nitarsone and roxarsone(n＝6)

2.4样品分析

按照实验方法对猪肝、鸡肝2种市售样品进行不同添加水平的回收率测定，阿散酸、硝苯砷酸、洛克沙砷结果见表5。从表5中可见在选定的实验条件下阿散酸、硝苯砷酸、洛克沙砷均具有良好的回收率。

表5样品中阿散酸、硝苯砷酸和洛克沙砷的加标回收率(n＝6)

Table5The recoveries of arsanilic、nitarsone and roxarsone spiked in animal foods(n＝6)

*ND：no detected。

Claims

1.一种动物食品中阿散酸、硝苯砷酸及洛克沙砷的测定方法，其特征在于，所述测定方法包括以下步骤为：

称取待测样品A克于研钵中，加入弗罗里硅土3A克充分拌匀后，用甲醇比水的体积比为3∶7的甲醇水溶液做提取剂，用加速溶剂萃取仪提取，提取完成后，再用水定容到体积5A毫升；经滤膜过滤后，供液相色谱-原子荧光光谱测定；所述A为不为零的整数。

2.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于：所述待测样品为猪肝或鸡肝。

3.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于，所述加速溶剂萃取条件为：提取温度80℃；压强1500pa；静态萃取时间为4分钟；冲洗体积60％；提取次数为3次；氮气吹扫60秒。

4.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于：所述滤膜的滤孔大小为0.45μm。

5.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于，所述液相色谱条件为：色谱柱采用C18柱；流速为1.2mL/min；进样量为100μL；流动相为5％甲醇-0.1％三氟乙酸-0.05mol/L磷酸二氢钾。

6.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于，所述原子荧光工作条件为：总电流为100mA；负高压为330V；载气流速为300mL/min；屏蔽气流速为900mL/min。