CN103232422A - 光敏感扩张性聚合物及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了光敏感扩张性聚合物及其制备方法和应用,属于光敏感的药物载体领域。本发明将邻硝基苯乙酮依次经还原、羟基活化后引入乙醇胺，最后与甲基丙烯酰氯反应得到式Ⅰ所示的光敏感扩张性聚合物单体。通过交联剂和引发剂将本发明光敏感扩张性聚合物单体采用微乳聚合的方法包载药物得到光敏药物纳米粒。动态光散射（DLS）和扫描电镜（SEM）观察所获得的纳米粒粒径分布在100-200nm之间，纳米粒稳定性好，光刺激后,纳米粒体积发生100到400倍的扩张，能有效改善药物的生物利用度，通过光照控制所包载药物的释放有效延长药物的作用时间。

Description

光敏感扩张性聚合物及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及聚合物，尤其涉及光敏感扩张性聚合物及其制备方法，本发明进一步涉及该光敏感扩张性聚合物作为光敏感药物载体的应用，属于光敏感的药物载体领域。

背景技术

微粒或纳米粒被应用于很多领域，比如生物成像和药物载体。脂类，糖类，羟基酸聚合物，树枝状分子或双亲性分子等都能形成药物载体。它们能够提高药物的溶解度和稳定性，改善药代动力学，减少药物副作用。即使微粒或纳米微粒领域已经取得重大突破，但是在医学和药学领域响应性药物输送系统因为其对能感受环境因素的变化，实现药物的控制释放而备受关注。目前的响应性药物输送系统刺激因素主要有温度，pH，氧化还原，酶，光或受体等。在这些刺激中，光具有自己独特的特点，它能在时间和空间上对药物释放进行调控，同时作为外部刺激能随用随给，副反应发生时也能迅速方便的撤走，同时可以通过调节光强和波长实现其对反应的调控作用。因为具有以上优点，光因而作为外部刺激被广泛的应用于生物方面和药物载体方面。

关于光敏感的药物载体报道很多，如光敏胶束，光敏囊泡，光敏树枝状分子，光敏脂质体，光敏纳米粒，光敏共价物等。这些报道以溶液中光照释放实验为主，关于细胞水平方面的报道很少。迄今为止，临床前研究的光敏感的药物载体报道几乎没有。

姜黄素是从姜黄根茎中提取的多酚黄色，大量的文献报道了其在临床前的抗肿瘤和化学治疗的作用。但因为其生物利用度差，病人需要一天口服摄取8-10g的姜黄素，血液中浓度才能被检测到，因而其临床前向临床之间的转换受到限制。如果将姜黄素用光敏感扩张性聚合物包载得到纳米粒中能够提高其溶解度，改善生物利用度，通过光照控制其释放从而延长其作用的时间，克服其临床应用存在的缺陷。

发明内容

本发明的目的之一是提供光敏感扩张性聚合物，该光敏感扩张性聚合物能作为光敏感药物载体包载药物得到纳米粒，进而改善药物生物利用度，延长药物的作用时间；

本发明的目的之二是提供一种制备所述光敏感扩张性聚合物的方法；

本发明的目的之三是将提供所述光敏感扩张性聚合物作为光敏感的药物载体的用途。

本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：

本发明首先提供了式Ⅰ所示的光敏感扩张性聚合物单体：

R为

或

其中，n为1-6的任意整数；X为氧或NH；R₁为氢或CH₃;R₂为氢或OCH₃;R₃为氢或OCH₃;R₄为氢、OH、OCH₃、N(CH₃)₂或N(CH₂CH₃)₂。

优选的，n为2，R₁为甲基;R₂为氢;R₃为氢。

本发明的另一目的是提供一种合成式Ⅰ所述光敏感扩张性聚合物单体的化合物的方法，包括以下步骤：将邻硝基苯乙酮依次经NaBH₄还原、羟基活化后引入乙醇胺，最后与甲基丙烯酰氯反应，即得。

本发明还提供了一种合成式Ⅰ所述光敏感扩张性聚合物单体的方法，包括以下步骤：将N，N-二乙胺基-4-甲基香豆素依次经过氧化、还原、羟基活化后引入乙醇胺,最后与甲基丙烯酰氯反应，即得。

其中，所述的氧化是将N，N-二乙胺基-4-甲基香豆素中的4位甲基经二氧化硒氧化成醛基，并用于下一步还原成醇。

本发明的另一目的用本发明光敏感扩张性聚合物包载药物得到光敏药物纳米粒，改善药物的生物利用度并通过光照控制药物的释放达到延长药物的作用时间的效果。

本发明提供一种用所述的光敏感扩张性聚合物包载药物得到药物纳米粒的方法，包括：（1）制备油相：将本发明的光敏感扩张性聚合物单体、药物、交联剂和引发剂溶解在有机溶剂中得到油相；（2）将水相加入到油相，超声处理后在通氮气下条件下反应，挥干有机溶剂，除去表面活性剂和未聚合的单体，即得。

其中，步骤（1）中所述的交联剂优选为乙二醇二甲基丙烯酸酯；所述的引发剂优选为偶氮二异丁腈；所述的有机溶剂优选为重蒸的二氯甲烷。

为了达到更好的包载效果，按摩尔比计，光敏感扩张性聚合物单体、交联剂和引发剂的比例优选为100:5-25：1.8。

所述的药物可以是任意一种临床上有治疗功效的活性成分，例如，可以任何一种的抗肿瘤或治疗心血管等疾病的药物等，优选为脂溶性药物，更优选为姜黄素。

步骤（2）中所述的水相可以是十二烷基磺酸钠（SDS）水溶液或醋酸缓冲溶液等；所述的超声处理是80W超声5min；所述的反应温度优选为80°C，反应时间优选为18h。

为了达到更好的包载效果，油相和水相的体积比优选为1:10。

通过微乳聚合的方法，用本发明光敏感扩张性聚合物作为光敏药物载体将药物包载得到光敏药物纳米粒，扫描电镜观察到纳米粒的粒径分布在100-200nm之间；纳米粒的形态为圆球性，大小均一，稳定性好；光刺激后体积发生100到400的扩张，能更充分的释放所包载的药物，达到光控释放药物的效果，有效改善药物的生物利用度并延长药物的作用时间。此外，本发明扩张型光敏药物纳米粒通过诱导扩张能够对病灶部位（例如肿瘤部位）进行靶向定位，从而提高药物的治疗效果。

本发明涉及到的缩略术语：

FDA：二乙酰荧光素

AIBN：偶氮二异丁腈

SDS：十二烷基磺酸钠

DCM：二氯甲烷

附图说明

图1本发明光敏感扩张性聚合物单体的结构式。

图2本发明光敏感扩张性聚合物单体的合成路线图。

图3空白纳米粒的红外图谱。

图4空白样品不光照及光照后的扫描电镜。（a）eNP1-blk-10%不光照的扫描电镜；（b）eNP1-blk-10%光照后的扫描电镜；（c）eNP2-blk-10%不光照的扫描电镜；（d）eNP2-blk-10%光照后的扫描电镜。

图5空白纳米粒的紫外吸收或荧光发射图谱；（a）eNP1-blk-10%紫外吸收图谱随光照时间的变化；（b）310nm处对应的吸收值和光照时间的拟合曲线；（c）eNP2-blk-10%荧光发射光谱随时间的变化；（d）最大波长480nm处的荧光值和光照时间的拟合曲线。

图6具有不同比例交联剂（5%，10%，25%）且包载香豆素Coumarin6的纳米粒在不同光照时间点下荧光变化图谱及最大发射波长处的荧光强度和光照时间的拟合曲线。

图7包载姜黄素的纳米粒（eNP1-curcumin-10%）在不同光照时间点下荧光变化图谱以及最大发射波长处的荧光强度和光照时间的拟合曲线（a）在不同光照时间点下荧光变化图谱；（b）最大发射波长处的荧光强度和光照时间的拟合曲线。

图8包载二乙酰荧光素（FDA）的纳米粒的荧光定量分析；（a,b）eNP1-FDA-10%和RAW264.7,HeLa,MCF-7三种细胞孵育12小时后，光照组和非光照组荧光显微镜图及酶标仪对光照组和非光照组荧光定量分析；（c,d）eNP2-FDA-10%和RAW264.7,HeLa两种细胞孵育12小时后，光照组和非光照组荧光显微镜图（c_上：FDA水解产物对应的荧光，c_下：eNP2对应的荧光）及酶标仪对光照组和非光照组FDA降解引起的荧光定量分析（标尺为50μm）。

图9细胞内药物的选择性光调控释放实验。（a,b）eNP1-FDA-10%在RAW264.7细胞内荧光模型图和对应的明场图；(c,d)eNP2-FDA-10%在RAW264.7细胞内荧光图和对应的明场图；(e,f）eNP1-FDA-10%在HeLa细胞内荧光图和对应的明场图；（g,h)eNP2-FDA-10%在HeLa细胞内荧光图和对应的明场图。图a-h中每个图的上半部分光照15分钟，下半部分不光照（标尺为100μm）。

图10细胞毒性考察实验。（a）UV15min对细胞成活率的影响；（b）姜黄素光照和不光照对细胞成活率的影响；（c）空白颗粒eNP1-blk-10%进细胞不光照和光照对细胞成活率的影响；（d）eNP1-curcumin-10%进细胞不光照和光照对细胞成活率的影响。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

具体实施方式

实施例11-（2-硝基苯基）乙醇(化合物2)的制备

邻硝基苯乙酮（化合物1）（5g，30mmol）溶解在30mL的1,4-二氧六环，在冰浴条件下加入10%NaBH₄水溶液（34.4mL），冰浴条件下反应一小时后，室温下反应半个小时。未反应的NaBH₄用丙酮淬灭，旋蒸除去丙酮后，用乙酸乙酯萃取，饱和NaCl洗涤，旋蒸除去溶剂，得到黄色油状液体。不经纯化，直接投下一步，产率98%.

¹H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.91(d,J=8.1Hz,1H),7.85(d,J=7.8Hz,1H),7.66(t,J=7.7Hz,1H),7.42(t,J=7.7Hz,1H),5.43(q,J=6.4Hz,1H),1.58(d,J=6.4Hz,3H).13C NMR(101MHz,CDCl3)δ147.92,141.04,133.70,128.19,127.67,124.38,65.64,24.31.

实施例21-（2-硝基苯基）乙基（2-羟基乙基）氨基甲酸叔丁酯(化合物3)的制备

将化合物2（1.1g,6.6mmol）溶解在60mL乙腈中，加入N，N'-二琥珀酰亚胺基碳酸酯2.7g(10.5mmol)后，加入2.7mL三乙胺，室温条件反应过夜后，加入乙醇胺（1g,16.4mmol），反应6个小时。蒸干乙腈，残留物用二氯甲烷萃取，饱和碳酸氢钠洗两遍，饱和氯化钠洗两遍。无水硫酸钠干燥后蒸干溶解，残留物过柱子，用石油醚：乙酸乙酯（2:1）过柱子，得到黄色油状液体。产率77.8%。

¹H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.91(d,J=8.2Hz,1H),7.64-7.62(t,J=2.3Hz,3.6Hz，2H),7.45-7.39(m,1H),6.24(q,J=6.4Hz,1H),5.41(s,1H),3.63(t,J=4.9Hz,2H),3.26(t,J=5.2Hz,2H),2.56(s,1H),1.62(d,J=6.4Hz,3H).13C NMR(101MHz,CDCl3)δ161.06,152.60,143.48,138.56,133.24,132.15,129.34,73.77,66.84,48.29,27.19.Calcd:[M+Na]⁺(C11H14N2O5Na)m/z=277.09.Found:[M+Na]⁺=277.21.

实施例32-（（（1-（2-硝基苯基）乙氧基）羰基）氨基）乙基甲基丙烯酸酯（M1单体）（化合物4）的制备

化合物3（0.8g,3.2mmol）溶解在20mL二氯甲烷，加入1.4mL干燥三乙胺，通氮，将甲基丙烯氯（0.53mL,5.5mmol）在冰浴下滴加入溶液，反应过夜，用饱和碳酸氢钠洗三遍，饱和氯化钠洗一遍，无水硫酸钠干燥，蒸干溶剂，过柱子，石油醚：乙酸乙酯（3:1）柱分，得到黄色的油状液体。产率88.7%。

¹H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.93(d,J=8.1Hz,1H),7.61(d,J=4.1Hz,2H),7.44-7.38(m,1H),6.25(q,J=6.5Hz,1H),6.10(s,1H),5.59(d,J=1.4Hz,1H),5.02(s,1H),4.19(t,J=5.2Hz,2H),3.49-3.40(m,2H),1.93(s,3H),1.62(d,J=6.5Hz,3H).13C NMR(101MHz,CDCl3)δ172.28,160.40,152.49,143.56,140.85,138.62,133.20132.07,131.05,129.29,73.61,68.54,45.04,27.14,23.19.Calcd:[M+Na]⁺(C15H18N2O6Na)m/z=345.12.Found:[M+Na]⁺=345.20.

实施例47-二乙胺基-4–羟甲基香豆素（化合物5）的制备

二氧化硒（414mg，3.73mmol）和N，N-二乙胺基-4-甲基香豆素（570mg，2.63mmol）置于50mL二甲苯中，在氮气保护下回流反应18h。反应液过滤，减压浓缩。浓缩物溶解在50mL乙醇中，加入硼氢化钠（414mg，3,73mmol），室温反应四个小时，浓缩除去乙醇，用二氯甲烷萃取，饱和碳酸氢钠洗两次。有机相用无水硫酸镁干燥。浓缩过柱，展开剂为二氯甲烷/丙酮（20:1）。两步总产率为46.2%。

¹H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.30(d,J=9.0Hz,1H),6.55(dd,J=8.9,2.1Hz,1H),6.47(d,J=2.0Hz,1H),6.27(s,1H),4.82(d,J=3.6Hz,2H),3.38(q,J=7.1Hz,4H),1.18(t,J=7.1Hz,6H).¹³C NMR(101MHz,CDCl₃)δ162.92,156.14,155.14,150.54,124.44,108.65,106.36,105.34,97.72,60.094,44.77,12.49.

实施例57-二乙氨基-4-甲基香豆素-4-基甲基（2-羟基乙基）氨基甲酸叔丁酯（化合物6）的制备

化合物5（0.3g,1.21mmol)）和N，N'-二琥珀酰亚胺基碳酸酯(0.65g,2.63mmol)溶解在40mL乙腈中，向溶液中加入0.67mL三乙胺，室温反应过夜后，加入乙醇胺（250mg,4.10mmol），继续反应6h，蒸干溶剂，用二氯甲烷萃取，饱和碳酸氢钠洗，无水硫酸钠干燥，浓缩，过柱，展开剂为二氯甲烷/丙酮（5:1）。产率42.1%。

¹H NMR(400MHz,DMSO)δ7.48-7.43(m,1H),6.69(d,J=8.5Hz,1H),6.54(s,1H),5.98(s,1H),5.21(s,2H),4.69(t,J=4.9Hz,1H),3.42(d,J=6.6Hz,6H),3.09(d,J=5.6Hz,2H),1.11(t,J=6.5Hz,6H);13C NMR(101MHz,DMSO)δ160.86,155.79,155.64,152.03,150.48,125.35,108.79,105.29,104.43,96.87,60.91,59.92,44.06.43.23,12.35.Calcd:[M+Na]⁺(C17H22N2O5Na)m/z=357.15.Found:[M+Na]⁺=357.23.

实施例6（7-二乙氨基-4-甲基香豆素-4-基甲氧基羰基氨基）乙基甲基丙烯酸酯（M2单体）的制备

化合物6(0.13g，0.39mmol)溶解在二氯甲烷中，加入0.17mL三乙胺（0.11mmol），通氮气保护，冰浴下搅拌5min。0.1mL丙烯酰氯控制滴加速度缓慢加入。反应液用二氯甲烷萃取，饱和碳酸氢钠洗三次。浓缩过硅胶柱，展开剂为二氯甲烷/丙酮（20:1）。产率43.6%。

¹H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.30(d,J=9.0Hz,1H),6.59(dd,J=8.9,2.0Hz,1H),6.51(d,J=2.1Hz,1H),6.12(d,J=5.9Hz,2H),5.61(s,1H),5.34(s,1H),5.23(s,2H),4.27(t,J=5.2Hz,2H),3.55(q,J=5.6Hz,2H),3.40(q,J=7.0Hz,4H),1.94(s,3H),1.19(t,J=7.0Hz,6H).13C NMR(101MHz,CDCl3)δ167.33,162.01,156.18,155.56,150.53,150.21,135.86,126.26,124.39,108.72,106.07,97.82,63.54,61.90,44.81,40.42,18.33,12.41.Calcd:[M+Na]⁺(C17H22N2O5Na)m/z=425.18.Found:[M+Na]⁺=425.27

实施例7空白纳米粒（1）（eNP1-blk-10%）的制备

2-（（（1-（2-硝基苯基）乙氧基）羰基）氨基）乙基甲基丙烯酸酯（M1单体）50mg，交联剂乙二醇二甲基丙烯酸酯（M1单体与交联剂的摩尔比例为100:10），引发剂AIBN（10μL，5%（w/w）溶解在DCM中；M1单体与交联剂的摩尔比例为100:1.8），溶解在重蒸的二氯甲烷中，作为油相，体积500μL；同时5mL十二烷基磺酸钠（SDS）水溶液（1mg/mL）作为水相加入上述油相中，80W超声5min，通氮80°C下反应18h，挥干有机溶剂，在水中透析两天，除去表面活性剂和未聚合的单体，即得空白纳米粒。

实施例8包载香豆素（Coumarin）6（eNP1-Coumarin6-10%）的纳米粒制备

包载香豆素6的纳米粒制备方法同实施例7的空白纳米粒的制备，所不同的在油相中还加入0.5mg香豆素6。

实施例9包载香豆素（Coumarin）6（eNP1-Coumarin6-5%）的纳米粒制备

制备方法同实施例8，所不同的是M1单体与交联剂的摩尔比例为100:5。

实施例10包载香豆素（Coumarin）6（eNP1-Coumarin6-25%）的纳米粒制备

包制备方法同实施例8，所不同的是M1单体与交联剂的摩尔比例为100:25。

实施例11包载二乙酰荧光素（FDA）（eNP1-FDA-10%）的纳米粒的制备

制备方法同实施例7空白纳米粒的制备，所不同的是在油相中还加入4mg二乙酰荧光素，同时将水相换成pH=4的醋酸缓冲溶液，因为在80°C下FDA只有在酸性条件下才能稳定存在，其它条件相同。

实施例12包载姜黄素（Curcumin）（eNP1-Curcumin-10%）的纳米粒的制备

制备方法同实施例7空白纳米粒的制备，所不同的是在油相中还加入2.1mg姜黄素，同时加入50μL丙酮作为助溶剂，其它条件相同。

实施例13空白纳米粒（2）（eNP2-blk-10%）的制备

（7-二乙氨基-4-甲基香豆素-4-基甲氧基羰基氨基）乙基甲基丙烯酸酯（M2单体）50mg，交联剂乙二醇二甲基丙烯酸酯（M2单体与交联剂的摩尔比例为100:10），引发剂AIBN（10μL，5%（w/w）溶解在DCM中；M2单体与引发剂的摩尔比例为100:1.8），溶解在重蒸的二氯甲烷中，作为油相，体积500μL；同时5mL十二烷基磺酸钠（SDS）水溶液（1mg/mL）作为水相加入上述油相中，80W超声5min，通氮80°C下反应18h，挥干有机溶剂，在水中透析两天，除去表面活性剂和未聚合的单体，即得空白纳米粒。

实施例14包载香豆素（Coumarin）6（eNP2-Coumarin6-10%）的纳米粒制备

包载香豆素6的纳米粒制备方法同实施例13空白纳米粒的制备，所不同的在油相中还加入0.5mg香豆素6。

实施例15包载二乙酰荧光素（FDA）（eNP2-FDA-10%）的纳米粒的制备

制备方法同实施例13空白纳米粒的制备，所不同的是在油相中还加入4mg二乙酰荧光素，同时将水相换成pH=4的醋酸缓冲溶液，因为在80°C下FDA只有在酸性条件下才能稳定存在，其它条件相同。

实施例16包载姜黄素（Curcumin）（eNP2-Curcumin-10%）的纳米粒的制备

制备方法同实施例13空白纳米粒的制备，所不同的是在油相中还加入2.1mg姜黄素，同时加入50μL丙酮作为助溶剂，其它条件相同。

实验例1纳米粒光照前后粒径电势的考察及相应体积扩张系数实验

1、供试材料：实施例7-16所制备的纳米粒。

2、对照材料：NPa-blk-10%为用甲基丙烯酸-1-邻硝基苯基乙酯单体制备的不包载药物的空白纳米粒（制备方法同实施例7），NPc-blk-10%为甲基丙烯酸苯乙酯单体制备的不包载药物的空白纳米粒子（制备方法同实施例7）。

3、实验方法及结果

通过马尔文zetasizer激光粒度仪测量实施例7-15所制备的纳米粒和对照材料光照前后的粒径和电势；并计算其体积变化，通过膨胀系数计算发现光照前后体积变化在100到400倍之间（表1）。

将供试材料样品稀释400倍或对照材料置于硅片上，37°C下自然挥干过夜，然后喷金，测定，扫描电镜观察到纳米粒分布在100-200nm之间，形态为圆球性，大小均一，同时对光照后的形态进行观察(图4)。

表1eNP1、eNP2类和对照组（非光敏，光敏不扩张）纳米粒光照前后粒径电势的考察及相应体积扩张系数的计算

实验例2姜黄素包封率的测定实验

1、供试材料：实施例10和16所制备的包载姜黄素的纳米粒。

2、实验方法及结果

包载姜黄素的纳米粒的包封率测定方法如下：

标准曲线的绘制：

乙醇作为溶剂，配置50μg/mL的姜黄素母液。按一定比例稀释成浓度为1μg/mL、2μg/mL、3μg/mL、4μg/mL、5μg/mL。于428nm处测紫外，线性回归，得标准曲线为y=0.117x+0.442。

姜黄素包封率的定量：

精密称定0.5mg包载姜黄素的纳米粒，将其分散在少量乙醇中，超声，定容至1mL，充分放置1个星期，使纳米粒里的姜黄素充分溶解在乙醇中，取300μL在30000转4°C下离心两次，姜黄素的浓度通过紫外进行定量，测定波长为428nm，测两次，取平均值，测得实施例10包载姜黄素的纳米粒的包封率为71.5%，实施例14包载姜黄素的纳米粒的包封率为72.3%。

实验例3纳米粒光降解实验和光致释放实验

一、光降解实验

首先对实施例7和13所制备的空白纳米粒的光诱导行为进行初步观察。分别选用紫外和荧光进行分析，观察不同光照时间对紫外吸收曲线或荧光发射光谱变化影响。将12.5μg/mL的空白纳米粒（1）置于紫外池子中，光照不同时间（5min，10min，15min，20min，25min，30min），从200nm-800nm扫描光照后的样品紫外吸收曲线，从紫外图谱上能明显的看到紫外吸收随光照时间的变化，发现这种变化主要集中在前5min内，光照前吸收峰在260nm附近，随着光照时间的延长，此波长下的峰值降低，同时在310nm处出现一个新的吸收峰，这个峰是光解后产生的亚硝基的吸收峰。将200μg/mL的空白纳米粒（2）置于石英荧光池子中，不同时间点给予光照，然后380nm处激发，观测到其荧光强度随光照时间增长降低（图5）。

二、光致释放实验

选用荧光模型分子香豆素6和一种药理活性分子姜黄素对其进行考察。它们具有共同的特点，在水溶性环境中荧光很弱，但是在脂溶性环境中荧光很强。通过考察其在纳米粒这个脂溶性环境中释放到水性环境同时伴随着荧光的大幅度降低来证明其释放情况。具体操作是：200μg/ml的香豆素6纳米粒（实施例8和14所制备）置于荧光池子中，每次光照30s后，累计光照5min，用450nm激发，500nm到750nm监测，不同波长下的荧光强度对时间作图，得到荧光强度随时间的变化图谱。姜黄素纳米粒（实施例12和实施例16所制备）采用和香豆素6纳米粒相似的操作步骤，激发波长为420nm，从450nm到700nm监测发射光谱。所有结果重复三次。同时也将它们最大波长处的荧光对时间的变化进行归一化。得到其释放的动力学曲线。通过方程进行拟合。曲线如下：

$\frac{I}{I_0}={\left(\frac{I}{I_0}\right)}_m+[1-{\left(\frac{I}{I_0}\right)}_m]\exp \left(\frac{-t}{\mathrm{\τ}}\right)$

t——紫外光照的时间(min)

I₀——初始的溶液荧光强度

I——光照时间t是溶液荧光强度

τ——完成初始量的63.2%时所用的光照时间(min)，越小敏感性越高

实验结果发现香豆素6纳米粒和姜黄素纳米粒在5min内就能有效的释放内容物，包载香豆素6的纳米粒在三种交联剂浓度下（5%，10%，25%）释放率在83%-85%之间。姜黄素纳米粒在光照10min的条件下释放效率也达78%（图6、图7）。

实验例4细胞内摄取实验

在细胞评价方面首先要考察的是纳米粒能否被细胞所摄取。本实验选用了三种细胞（RAW264.7，HeLa，MCF-7），用包载香豆素6的纳米粒（实施例8和实施例14所制备）对其摄取进行观察。62.5μg/mL香豆素6纳米粒和三种细胞（RAW264.7，HeLa，MCF-7）孵育8h后，用PBS洗掉未摄取的纳米粒，然后用PBS填充，置于倒置荧光显微镜下观察拍照。在细胞摄取方面另一个有力的证明是二乙酰荧光素纳米粒（FDA）的光控释放实验。

包载二乙酰荧光素（FDA）纳米粒的摄取及其细胞内光控释放

二乙酰荧光素是一种特殊的荧光指示剂，本身没有荧光，只有被细胞内的酯酶水解脱乙酰基才使分子具有荧光，而且酶解过程是一个迅速的过程。包载FDA的纳米粒和细胞孵育，没有光照的细胞因为纳米粒这个结构对FDA的保护作用，FDA失去了和细胞内酯酶接触的机会，细胞内是没有荧光的，但是光照细胞，因为纳米粒结构的破坏引起了FDA的释放，接着被细胞内的酯酶水解，使整个细胞发亮。基于这个思路，本实验将制备的包载二乙酰荧光素（FDA）纳米粒（eNP1-FDA-10%）或（eNP2-FDA-10%）62.5μg/mL和细胞孵育12h后，用PBS除去未包进去的纳米粒，然后在PBS填充的条件下进行光照15min，放置10min，置于倒置荧光显微镜下观察。

除了从现象上对其观察，也对这种现象进行定量分析。采用酶标仪仪器，激发波长480nm，发射波长530nm，将非光照细胞荧光校正为1，光照细胞的荧光看作光照细胞和非光照细胞荧光进行比值。从显微结果的图片上看到没有光照的细胞荧光很弱，几乎是背景的荧光，但是光照后的细胞的荧光却很强（图8）。这种一明一暗的鲜明对比，很好的反应了本发明所制备纳米粒在细胞内光控释放的能力。酶标仪的结果显示同等条件下操作，光照细胞的荧光值在HeLa细胞内高达7倍左右，在巨噬细胞内高达8倍左右。

细胞模型试验

将RAW264.7(6×10⁵)和HeLa（2×10⁵）分别种在35mm玻璃底的小皿中，贴壁后加入62.5μg/mL的包载二乙酰荧光素（FDA）纳米粒（eNP1-FDA-10%或eNP2-FDA-10%）。孵育12小时后，用PBS小心洗除去未包进去的纳米粒。PBS填充。遮住皿的一半，同时在分界线出做好标记。用LED紫外灯从底部光照15min后，10min钟置于蔡司显微镜5倍镜下观察。观察到给予光照的一半皿因为FDA释放而使整半皿的细胞发亮，未光照部分则看不到荧光（图9）。

实验例5空白样品的细胞毒性实验

选用HeLa细胞，首先考察光照15min对细胞活性的影响，结果发现在此条件下细胞的活性几乎不受影响（图10，a）。接着考察了游离的姜黄素抗肿瘤活性，我们发现光照15min对姜黄素抗肿瘤活性影响很小（图10，b）。最后考察了材料本身对细胞成活率的影响。在4个浓度下对给药不光照，给药光照15min两个条件进行考察，选取的浓度按纳米粒的浓度计为100μg/mL,150μg/mL,200μg/mL,250μg/mL，和细胞孵育12h后，光照组细胞光照15min，非光照组细胞不光照，两组细胞同等条件下孵育48h后，用SRB方法对其进行评价，具体步骤为：先用200μL的10%三氯乙酸4°C下固定细胞1h，用PBS洗固定的细胞5遍后，吸取孔内大部分的水分，自然挥干。完毕加入100μL SRB的1%乙酸溶液（4mg/mL），染色30min后，用1%乙酸小心清洗孔板5次，吸取大部分的残余乙酸，挥干，加入150μL10mM Tris水溶液，置于酶标仪上振荡3次，在540nm处测吸光度。光照组和非光照组都和不给药组细胞对照。发现空白纳米粒（实施例7和13所制备的空白纳米粒）对HeLa细胞成活率影响均较小（图10，c）。

实验例5姜黄素纳米粒细胞水平的光控抗肿瘤实验

光控抗肿瘤活性实验的核心是考察包载药物的纳米粒在细胞内光控释放引起的抗肿瘤活性。姜黄素是一种常见的中药活性成分，其抗肿瘤活性目前开始被广泛的研究，但是姜黄素自身的一些局限而使其临床应用受到限制并进展缓慢。姜黄素是一个极其疏水性的分子，肠道吸收差。用本发明的光敏感扩张性聚合物包载姜黄素，能提高姜黄素的溶解度，因而有望改善其肠道吸收，同时能在对其释放进行调控。包载姜黄素的纳米粒（实施例12和实施例16所制备）和空白载体纳米粒（实施例7和实施例13所制备）采用相同的方法进行细胞活性考察。姜黄素纳米粒考察的浓度为100μg/mL,150μg/mL,200μg/mL,250μg/mL，对应的姜黄素的浓度为3.14μg/mL,4.71μg/mL,6.28μg/mL,7.85μg/mL。实验结果证明包载姜黄素的纳米粒在细胞内稳定性良好，非光照组对细胞没有伤害，相反光照组的细胞因为光照条件下结构的变化引起姜黄素释放，起到了抗肿瘤活性（图10，d）。

Claims (10)

1.式Ⅰ所示的光敏感扩张性聚合物单体：

R为

或

其中，n为1-6的任意整数；X为氧或NH；R₁为氢或CH₃;R₂为氢或OCH₃;R₃为氢或OCH₃;R₄为氢、OH、OCH₃、N(CH₃)₂或N(CH₂CH₃)₂。

2.按照权利要求1所述的光敏感扩张性聚合物单体，其特征在于：n为2，R₁为甲基，R₂或R₃为氢。

3.一种制备权利要求1或2所述的光敏感扩张性聚合物单体的方法，其特征在于，包括以下步骤：将邻硝基苯乙酮依次经还原、羟基活化引入乙醇胺，最后与甲基丙烯酰氯反应，即得；或者将N，N-二乙胺基-4-甲基香豆素依次经过氧化、还原、羟基活化后引入乙醇胺，最后与甲基丙烯酰氯反应，即得。

4.权利要求1或2所述的光敏感扩张性聚合物作为光敏药物载体的应用。

5.按照权利要求4所述的应用，其特征在于，包括：（1）制备油相：将权利要求1或2的光敏感扩张性聚合物单体、药物、交联剂和引发剂溶解在有机溶剂中得到油相；（2）将水相加入到油相中，超声处理后在通氮气下条件下反应，得到光敏扩张性药物包载纳米粒。

6.按照权利要求5所述的应用，其特征在于：步骤（1）中所述的交联剂为乙二醇二甲基丙烯酸酯；所述的引发剂为偶氮二异丁腈；所述的有机溶剂为重蒸的二氯甲烷;步骤（2）中所述的水相是十二烷基磺酸钠水溶液或醋酸缓冲溶液。

7.按照权利要求5所述的应用，其特征在于：步骤（1）中，按摩尔比计，光敏感扩张性聚合物单体、交联剂和引发剂的比例为100:5-25：1.8；步骤（2）中，油相和水相的体积比例为1:10。

8.按照权利要求5所述的应用，其特征在于：所述的超声处理是80W超声处理5min；所述的反应温度为80°C，反应时间为18小时。

9.一种光敏药物纳米粒，其特征在于：包括权利要求1或2所述的光敏感扩张性聚合物单体和治疗上有效的药物。

10.按照权利要求9所述的光敏药物纳米粒，其特征在于：所包载的药物是脂溶性药物；优选的，所述脂溶性药物是姜黄素。

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