CN103228675A - 组合物、抗体、哮喘诊断方法和制备抗体的方法 - Google Patents

组合物、抗体、哮喘诊断方法和制备抗体的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了用于制备抗体的方法，该方法包括将3-溴-4-羟基-苯甲酸掺入蛋白质中，以形成抗原，用该抗原免疫哺乳动物宿主，和从宿主收集对抗原具有亲和性的抗体。提供了对单卤代酪氨酸具有结合亲和性的抗体，以及包含与单卤代酪氨酸结合的抗体的组合物。还提供了包含具有3-溴-4-羟基-苯甲酸部分的蛋白质的组合物。提供了用于评价哮喘严重性的方法，该方法包括使用对单卤代酪氨酸具有结合亲和性的抗体分析病人的痰，并测量与蛋白质结合的抗体的量。还提供了测定体液中嗜伊红粒细胞活性的方法，该方法包括将体液暴露于对单卤代酪氨酸具有结合亲和性的抗体，并测量结合的抗体的量，以确定嗜伊红粒细胞活性。

Description

组合物、抗体、哮喘诊断方法和制备抗体的方法
相关申请的交叉参考
本申请要求2010年10月19日提交的美国临时申请系列No.61/394,640和2011年4月28日提交的美国临时申请系列No.61/480,154的优先权，在此将每一篇文献的全部内容引入作为参考。
政府权利声明
本发明是依据合同DE-AC0576RLO1830在美国能源部授予的政府支持下进行的。政府在本发明中具有某些权利。该研究还得到了NIEHS暴露生物学项目（Exposure Biology Program）（U54/ES016015）和美国国防部乳癌博士后奖学金（postdoctoral fellowship）W81XWH-10-1-0031的支持。
技术领域
本发明的公开内容涉及抗体的制备及其用途。公开内容的特定实施方案涉及对单卤代酪氨酸具有亲和性的抗体的制备和具有单卤代酪氨酸部分的蛋白质。
背景
哮喘是一种特征在于气道短暂变窄的常见病。其是影响了美国约23百万成人的主要公众健康问题。认为激活的嗜伊红粒细胞浸润至支气管中是哮喘的主要诱因。痰和肺活体样本中的嗜伊红粒细胞计数和分泌的嗜伊红粒细胞颗粒蛋白（如，嗜伊红粒细胞过氧化物酶（EPO））的存在表示哮喘的严重性。在哮喘病人中由于EPO，溴酪氨酸蛋白质修饰增加，EPO催化次溴酸盐的形成，以及随后溴酪氨酸的形成。之前使用气相色谱和质谱检测的研究发现了在来自哮喘患者的支气管肺泡灌洗流体和痰样本中，3-溴酪氨酸和3,5-二溴酪氨酸各自显著升高。对溴化蛋白质在哮喘中的作用的研究受限于缺乏快速、简单的方法来监控生物流体中的溴酪氨酸水平。
公开内容概述
如下将列出本发明的其他优点和新的特征，并且从在此所列的描述和证明是显而易见的。因此，本发明公开内容的以下描述应当看作是公开内容的说明而不是以任何方式限制。
溴酪氨酸修饰的蛋白质可以用作用于气道氧化应激的稳定的生物标记。据信3-溴酪氨酸是体内产生的主要溴酪氨酸；然而，之前的尝试不能产生识别3-溴酪氨酸的有用抗体。例如，在1930年，Wormall报道了产生对抗3,5-二溴酪氨酸的兔抗血清，但他的尝试未能产生3-溴酪氨酸抗体。更近一些，Kambayashi等和Kato等产生了针对溴化蛋白质的多克隆和单克隆抗体，但他们的抗体还是只能与3,5-二溴酪氨酸反应。
这些产生识别3-溴酪氨酸的抗体的失败可能源于用于产生抗原的条件。质谱和核磁共振分析表明作为体外蛋白质溴化的结果，相对于3-溴酪氨酸修饰，优先产生二溴酪氨酸修饰。当使用预期模拟体内溴化的试剂时，可能难以产生良好的用于3-溴酪氨酸的抗原。
本发明公开内容描述了提供可以包括具有3-溴-4-羟基-苯甲酸部分的蛋白质的抗原组合物。本发明公开内容还提供了生产这种抗原的方法。
从这种抗原，可以鉴定出不仅显示出识别单溴化的酪氨酸残基并且还结合其他卤化的酪氨酸残基的对卤代酪氨酸具有亲和性的抗体。提供了生产这些对这种抗原以及卤代酪氨酸（包括单卤代酪氨酸）具有亲和性的抗体的方法。提供了对具有卤代酪氨酸部分的蛋白质具有亲和性的抗体以及包括结合卤代酪氨酸的抗体的组合物。
此外，公开内容证明了所公开的抗体能够区分来自健康对照和哮喘患者之间的人痰蛋白质中的卤代酪氨酸水平。提供了评价哮喘严重性的方法以及确定嗜伊红粒细胞计数的方法。
附图简述
以下将参照以下的附图来描述公开内容的实施方案。
图1是用于生产根据公开内容的实施方案的抗原的合成图解。
图2是根据公开内容的实施方案生产的抗体的试验描绘。
图3是利用根据公开内容的实施方案生产的抗体获取的数据的描绘。
图4是蛋白质的描绘部分，和利用根据公开内容的实施方案生产的抗体获取的数据。
图5是利用根据公开内容的实施方案生产的抗体获取的数据的描述。
描述
在此将描述本发明的各种优点和新的特征，并且对本领域技术人员而言从以下的详细描述将变得显而易见。在之前和之后的描述中，通过说明和描述来提供公开内容的实施方案。如将会认识到的，公开内容能够在各个方面有所改变而没有脱离公开内容。因此，下文中所列的附图和实施方案的描述应视为本质上是说明性的，而不是作为限制。
本发明的公开内容提供了组合物、抗体、抗原、生产抗原的方法、生产抗体的方法和评价哮喘的方法，以及确定嗜伊红粒细胞计数的方法。
提供了制备抗体的方法。该方法可以包括将卤代酪氨酸类似物（如3-溴-4-羟基-苯甲酸）掺入蛋白质中，以形成抗原。该方法可以进一步包括用该抗原免疫哺乳动物宿主，并且从宿主收集对抗原具有亲和性的抗体。根据实施例实施，该蛋白质可以是钥孔
Figure BDA00003270693200031
血蓝蛋白（KLH）。根据这种方法，组合物包括通过用模拟3-溴酪氨酸的化合物修饰KLH提供的抗原。因此，提供了一种包括具有3-溴-4-羟基-苯甲酸部分的蛋白质的组合物，例如，该蛋白质是KLH。
根据该公开内容的各个方面，这可以避免与体外蛋白质溴化和主要生产二溴酪氨酸相关的问题。然后可以在优化单溴化的条件下溴化牛血清白蛋白（BSA），并且随后用于筛选杂交瘤细胞系和鉴定可能对生理上相关的酪氨酸修饰具有亲和性的克隆。这种所得到的BTK-94C抗体对3-溴酪氨酸和3,5-二溴酪氨酸具有亲和性，对3-氯酪氨酸和3,5-二氯酪氨酸也具有亲和性，但对未修饰的酪氨酸、3-硝基酪氨酸或3-羟基酪氨酸不具有亲和性（参见，例如，图2和4）。
还提供了使用次氯酸盐的蛋白质的氯酪氨酸修饰，次氯酸盐是髓过氧化物酶的产物，髓过氧化物酶是在嗜中性粒细胞和巨噬细胞中发现的一种酶。因为这种抗体看来似乎结合所有四种生理上相关的卤化蛋白质酪氨酸残基，因此BTK-94C可以认为是一种通用卤代酪氨酸抗体。
因此，该公开内容的方法提供了一种对蛋白质卤代酪氨酸（并且在特定的实施方案中，单卤代酪氨酸）具有结合亲和性的抗体。卤代酪氨酸可以是单卤代酪氨酸和/或二卤代酪氨酸之一或两者。单卤代酪氨酸可以是溴酪氨酸和/或氯酪氨酸之一或两者。单卤代酪氨酸也可以是3-溴酪氨酸和/或3-氯酪氨酸之一或两者。二卤代酪氨酸也可以是3,5-二溴酪氨酸和/或3,5-二氯酪氨酸之一或两者。还提供了包括与抗原结合的本发明公开内容的抗体的组合物，所述抗原是卤代酪氨酸和/或卤代酪氨酸蛋白质。
使用本发明公开内容的抗体的实施例实施可以克服与之前所用方法相关的各种问题。尽管已经存在几种报道了与溴化蛋白质反应的多克隆和单克隆抗体，但那些抗体看来似乎只与二溴酪氨酸反应，而不与3-溴酪氨酸反应。因为3-溴酪氨酸是体内观察到的主要修饰，因此这是重要的限制。
本发明公开内容进一步提供了可以包括将抗体暴露于体液以确定例如，一种或多种嗜伊红粒细胞活性、炎症和/或具有单卤代酪氨酸和/或二卤代酪氨酸部分的蛋白质的量的方法。
还提供了评价哮喘严重性的方法。该方法可以包括使用对单卤代酪氨酸具有结合亲和性的抗体分析病人的痰，并且测量结合蛋白质的抗体的量。该方法可以是定性和/或定量中的一种或两种。该方法可以包括关联结合抗体的量，以确定炎症的量。该方法可以分开或一起包括使用结合抗体的量来监控对哮喘发作的药物反应。
还提供了确定体液中嗜伊红粒细胞活性的方法。该方法可以包括将体液暴露于对单卤代酪氨酸具有结合亲和性的抗体，并且测量结合抗体的量来确定嗜伊红粒细胞活性。体液可以是例如痰或灌洗流体。该方法还可以包括关联结合抗体的量，例如以确定炎症和/或药物反应。
因此，用从哮喘患者和健康对照收集的人痰样品测试了BTK-94C。ELISA微矩阵分析证明了人痰样品中的4种蛋白质在哮喘患者中的卤化水平提高。这些数据表明溴化是嗜伊红粒细胞活性的特异性指示并且这4种特异性蛋白质响应哮喘相关的嗜伊红粒细胞活性而得到修饰。此外，这些蛋白质的卤化水平在监控哮喘中是有用的。
以下描述了一种新的单克隆抗体（BTK-94C），其识别溴化和氯化蛋白质。这些卤代酪氨酸蛋白质修饰是炎性细胞活性的表示。将这种抗体用作夹层ELISA中的检测试剂来证明四种痰蛋白质的卤代酪氨酸水平在哮喘患者中是升高的。因此，BTK-94C抗体可以提供哮喘患者中炎症的指示，并且这些ELISA可以证明对于预测或监控哮喘或具有强烈炎性成分的其他疾病中的药物反应是有用的。
实施例材料和方法
牛血清白蛋白（BSA）购自Jackson ImmunoResearch实验室。3-溴-4-羟基苯甲酸购自Indofine Chemical Company Inc。3,5-二溴-4-羟基苯甲醛、3,5-二氯-4-羟基苯甲酸、3,4-二羟基苯甲酸、3-硝基酪氨酸和L-酪氨酸购自Sigma-Aldrich。钥孔血蓝蛋白（KLH）、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺（EDC）、腹水调节试剂、Melon单克隆抗体纯化试剂盒和生物素化试剂盒EZ-link硫-NHS-生物素购自Pierce-Thermo Scientific（Rockford，IL）。次溴酸钠溶液购自Fisher-Thermo Scientific。如增补数据中所述的，购买了用于23个ELISA的捕获抗体。
实施例溴化抗原和相关修饰蛋白质的制备
对于抗原的制备，使用了如“A Simple Modified CarbodiimideMethod for Conjugation of Small-Molecular-Weight Compounds toImmunoglobulin G with Minimal Protein Crosslinking”（使用最小蛋白质交联将小分子量化合物缀合免疫球蛋白G的简单改进碳二亚胺方法），Minh-Tam B.Davis and James F.Preston,AnalyticalBiochemistry116，402-407（1981）中所述的碳二亚胺方法的改进实验方案，在此将该篇文献引入作为参考。简而言之，将0.12mM3-Br-HBA溶解于2.5ml甲醇中，并且与2.5ml的20mM磷酸钾缓冲液（pH5.0）中的0.75mM EDC在室温下混合2分钟。然后将该5ml溶液与8ml200mM磷酸钾缓冲液（pH8.0）中的2.5mg/ml KLH混合并且使其在室温下孵育过夜。通过在4℃下相对120mM PBS的渗析来除去任何剩余的EDC和3-Br-HBA。渗析后，通过在4℃下在50,000g下离心2小时来除去沉淀物。通过测量吸光值来定量pH8.0的200mM磷酸钾缓冲液中的修饰抗原，在280nm处测量蛋白质浓度，在310nm处测量溴化。将修饰的KLH等分，并且存储在-80℃。在Washington StateUniversity Monoclonal Antibody Center（Pullman），将小鼠免疫，收集血清以及杂交瘤细胞系及其上清液，产生腹水和测定抗体同种型。根据制造商的实验方案，使用EZ-Link硫-NHS-LC-生物素化试剂盒（Pierce，Rockford，IL），将BTK-94C抗体生物素化。
按照之前报道的，使用次溴酸钠（Fisher Scientific，Pittsburg，PA）制备了溴化BSA。为了最大化3-溴酪氨酸相对于3,5-二溴酪氨酸的含量，按照之前报道的，我们使用了优化条件。即，将1ml的10mgBSA/ml与200μl新鲜制备的20mM次溴酸钠（在pH7.2的PBS中）在25℃下反应15小时。然后将溶液在4℃下相对PBS渗析，以除去未反应的试剂。为了产生氯化BSA和硝基化BSA，按照之前所报道的，分别使用了6%次氯酸钠（The Clorox Company）和过亚硝酸盐（peroxynitrite）（Millipore Corporation，Boston，MA）。
实施例，ELISA微矩阵试验和使用修饰酪氨酸类似物的抑制研究
按照之前所述的进行了夹层ELISA微矩阵，除了通过缀合辣根过氧化物酶的山羊-抗-小鼠-IgM（Jackson ImmunoReasearchLaboratories）结合生物素酪胺（biotinyltyramide）产生了最初的生物素信号。简而言之，在离心除去任何颗粒后，将痰样品在PBS中的0.1%BSA中稀释5倍。在三个芯片上分析了25μl每种稀释的样品/芯片。对于每个捕获抗体，每个芯片含有4个重复斑点，使得对于23个ELISA中的每一个，总共存在12个复制品/样品（参见，例如，以下的表1）。
表S1-选定的血浆生物标记以及将这些蛋白质与哮喘相关的参考
捕获抗体 缩写 目录#和来源
α-乳白蛋白 a-LB Sc-586722
双调蛋白 AmR MAB2621
血浆铜蓝蛋白 CP sc-697672
c-反应蛋白 CRP MAB170711
表皮生长因子(EGF) EGF DY236kit1
EGF受体 EGFR AF-2311
E-选择蛋白 Ese1 AF-7241
碱性成纤维细胞生长因子 FGFb MAB2331
纤维蛋白原 Fibr ID6-2503103
肝素-结合表皮生长因子 HBEGF AF-2921
肝细胞生长因子 HGF MAB6941
胞内粘附分子1 ICAM MAB7201
胰岛素样生长因子1 IGF-1 MAB2911
瘦素 Leptin MAB3981
基质金属蛋白酶1 MMP1 AF9011
基质金属蛋白酶2 MMP2 AF9021
基质金属蛋白酶9 MMP9 AF9111
血小板衍生生长因子A PDGF MAB2211
RANTES RANTES MAB6781
表面活性蛋白A SP-A LS-C179574
转化生长因子α TGFa AF-2391
肿瘤坏死因子α TNFa MAB6101
血管内皮生长因子 VEGF AF-2931
1.R&D Systems：明尼阿波利斯，MN，USA。
2.Santa Cruz Biotechnology，Inc，圣克鲁斯，CA USA。
3.ABBiotek，圣地亚哥CA，USA。
4.Lifespan Biosciences，西雅图WA，USA。
对于用于阐释抗体结合特性的微矩阵试验，将修饰和未修饰的蛋白质单独印记在氨丙基硅烷覆盖的载玻片上。然后用PBS中的2%BSA阻断载玻片。用50μL特定浓度的化学竞争剂（在0.1%BSA/PBS）在室温下预先培养50μL杂交瘤上清液12小时。在与杂交瘤上清液混合之前，连续稀释单独的化学竞争剂。将25μL混合物装载于每个微矩阵芯片上，然后在室温下培养16小时。按照之前所述的，用PBS中的0.05%吐温-20将平板洗涤三次。使用缀合Cy3的抗生物素蛋白链菌素检测生物素信号，然后使用ScanArray Express HT激光扫描仪（Perkin-Elmer，Downer Grove，IL）成像。将ScanArray Express软件用于分析图像并且测定斑点荧光信号。
实施例ELISA微矩阵
之前已经在“An Internal Calibration Method forProtein-Array Studies”（蛋白质矩阵研究的内标方法），Don SimoneDaly等，Statistical Applications in Genetics and MolecularBiology（遗传学和分子生物学的统计学应用），Volume9，Issue1，2010，Article14中详细描述了ELISA微矩阵芯片的印制和处理，在此将该篇文献引入作为参考。将绿色荧光蛋白（100pg/mL）钉（spike）至每个痰样品中并且使用夹层ELISA，使用分开的捕获和检测抗体，在芯片上分析。使用ProMAT Calibrator，将来自该分析的数据用于标准化来自其他ELISA的数据，ProMAT Calibrator是为了该目的，我们特意研发的定制生物信息程序，如以下文献中所述的，“AnInternal Calibration Method for Protein-Array Studies”（蛋白质矩阵研究的内标方法），Don Simone Daly等，StatisticalApplications in Genetics and Molecular Biology（遗传学和分子生物学中的统计学应用），Volume9，Issue1，2010，Article14和“Preparation and Characterization of a Polyclonal AntibodyAgainst Brominated Protein”（相对溴化蛋白质的多克隆抗体的制备和表征），Yasuhiro Kambayashi等，J.Clin.Biochem.Nutr.44,95-103,2009年1月，在此将每一篇的全部内容引入作为参考。ProMATCalibrator可以在www.pnl.gov/statistics/ProMAT/自由获得。用于处理微矩阵芯片的程序基本上与之前在“An Internal CalibrationMethod for Protein-Array Studies”（蛋白质矩阵研究的内标方法），Don Simone Daly等，Statistical Applications in Genetics andMolecular Biology（遗传学和分子生物学中的统计学应用），Volume9，Issue1，2010，Article14中所述的相同，除了只使用单个检测抗体。
简而言之，将每个捕获抗体印制在每个芯片上，重复四个斑点，每次在四分之一的芯片中。此外，用于GFP的抗体和定向斑点在每个芯片上重复印制四次。用一个稀释的痰样品培养单独的芯片，并且每个样品在三个芯片上分析。将以上描述的生物素化的卤代酪氨酸单克隆抗体（BTK-94C）用于检测捕获抗原中的3-溴酪氨酸。用ScanArrayExpress HT激光扫描仪（Perkin-Elmer，Downer Grove，IL，USA）将处理过的载玻片成像，并使用ScanArray Express软件来分析图像，并确定斑点荧光强度。
实施例  统计学
使用方差的单向分析（Chambers，1992）进行了统计学比较，当统计学显著时，使用Tukey's Honest显著性差异法来限定哪个哮喘组具有升高水平的溴酪氨酸。使用p≤0.05的概率值来描述所有分析的统计学显著性。
实施例  结果
卤代酪氨酸的单克隆抗体的评价
次溴酸盐与蛋白质酪氨酸反应产生3-溴酪氨酸和3,5-二溴酪氨酸修饰（图1B）。用于产生含有3-溴化酪氨酸或相关蛋白质修饰的程序。A.3-溴苯甲酸与蛋白质的缀合，如用于产生免疫小鼠的KLH抗原；B.认为次溴酸钠怎样在体内修饰酪氨酸残基的图。将该相同的化学性质用于产生修饰的BSA抗原，用于筛选杂交瘤细胞系。尽管3,5-二溴酪氨酸修饰主要是体外反应，但3-溴酪氨酸主要在体内。因此，之前相对体外溴化抗原产生的抗体只识别二溴化酪氨酸修饰的事实表明了这种失败反映在抗原。对于抗原，使用了模拟3-溴酪氨酸的蛋白质修饰，即，加合至KLH的3-溴-4-羟基-苯甲酸。因此，证实了这种人造抗原产生了识别生理上相关的溴化蛋白质修饰的抗体。发现了从用修饰的KLH抗原免疫的小鼠的血清收集的抗体确实结合溴化BSA，但不结合未修饰的BSA（数据未显示），表明了溴酪氨酸模拟物确实形成了与生物上相关的蛋白质修饰反应的抗体。
然后将免疫的小鼠用于产生225个单克隆杂交瘤细胞系。使用含有溴化BSA、氯化BSA、硝化BSA和未修饰BSA的单独斑点的定制蛋白质微矩阵芯片，测试来自这些培养的细胞系的上清液的反应性和特异性。这些测试证明了BTK-94抗体与溴化BSA强烈反应，与氯化BSA弱反应，而与未修饰BSA或硝化BSA没有反应（图2）。
图2证明了BTK-94C与不同的体外修饰BSA的识别模式的评价。左：印制在载玻片上的抗原的模式。斑点直径大约为200微米。右：显示出BTK-94C结合模式的Cy3-扫描的荧光图像。用作定向斑点的A543，用Alexa543修饰的抗体；BSA-BrO，次溴酸盐处理的BSA；BSA-CIO，次氯酸盐处理的BSA；BSA-ONOO：过亚硝酸盐处理的BSA。
将该杂交瘤细胞系进一步培养，以确保真正是单克隆的。随后所有测试中使用的BTK-94C抗体源自这些单克隆细胞系。测试表明了该抗体具有与BTK-94所示的相同结合特征（图2）。
实施例  溴化蛋白质的单克隆抗体的制备和表征
BTK-94C的同种型测定表明了这是一种IgM抗体，并且以浓度依赖性方式与溴化BSA反应（图3）。在图3中，使用溴化BSA产生的信号与BTK-94C抗体的浓度相关。还使用蛋白质微矩阵分析，分析了来自该细胞系的腹水流体的特异性和交叉反应性。与来自杂交瘤上清液（参见上文）的结果一致，观察到腹水中产生的BTK-94C抗体结合溴化和氯化BSA，但与未修饰的或过亚硝酸盐处理的BSA没有反应性（数据未显示），进一步证实了该抗体优先与卤代蛋白质反应。
为了进一步表征该抗体的特异性，评价了模拟酪氨酸修饰的试剂抑制BTK-94C抗体结合溴化BSA的能力。BTK-94C与溴化BSA的结合受到3-溴-4-羟基苯甲酸和3,5-二溴-4-羟基苯甲酸的强烈抑制，但3-氯酪氨酸和3,5-二氯-4-羟基苯甲酸的抑制不太有效（图4B）。与溴化BSA的结合没有受到完整酪氨酸、3-硝基酪氨酸或3,4-二羟基苯甲酸的抑制（图4）。
参照图4，显示了基于修饰的酪氨酸类似物的抑制，BTK-94C与溴化白蛋白的结合特性。将单独的化学物质和BTK-94C培养过夜，然后加入印制了溴化BSA的蛋白质微矩阵芯片中。缩写以及相关化学名称和结构显示于图A中：3-Br-HBA，3-溴-4-羟基苯甲酸；DiBr-HBA，3,5-二溴-4-羟基苯甲醛，DiCl-HBA，3,5-二氯-4-羟基苯甲酸，3-OH-HBA，3,4-二羟基苯甲酸，3-NO2-Tyr，3-硝基酪氨酸和Tyr，L-酪氨酸。图B：将结果表达为相对竞争B/B0，其中B是在竞争剂存在下结合的抗体量，而B0是竞争剂不存在下的量。每个点表示重复三次分析的中值。这些结果进一步表明了BTK-94C识别3-溴酪氨酸以及氯酪氨酸蛋白质修饰。
实施例  人痰蛋白质中卤代酪氨酸修饰的BTK-94C分析
为了确定这种抗体是否具有用于评价哮喘患者中嗜伊红粒细胞活性的潜能，利用了ELISA微矩阵平台，使用了BTK-94C作为唯一的检测抗体。在该ELISA芯片上，印制了23个用于可能与哮喘相关的抗原的捕获抗体（参见补充数据）。在这些捕获的抗原中，当与健康对照相比时，观察到痰样本中具有高嗜伊红粒细胞或低嗜伊红粒细胞计数的哮喘患者中的AGT、ICAM、PDGF和RANTES的溴化水平有统计学显著的提高（图5）。
参照图5，在来自哮喘患者痰中存在的蛋白质中的卤代蛋白质升高。（A）该研究中测试的痰样本中的嗜伊红粒细胞计数。（B）将未免疫的兔子IgG印制在ELISA微矩阵上，作为负对照斑点，显示了在所有测试的痰样本中完全平直的信号。胞内粘附分子1（ICAM）（C）、血小板衍生生长因子AA（PDGF）（D）、AGT（E）和RANTES（F）的卤代酪氨酸水平。侧线表示中值，并且框子是第25次和75分位数。
来自ELISA微矩阵分析的数据表明基于ANOVA和Turkey's检验的显著差异（p<0.05）。相反，使用该芯片进行的其他19个试验没有显示出任何显著差异。对于ELISA微矩阵分析，印制未免疫兔IgG作为负对照。与其他相比，来自该斑点的信号低，并且在该信号中，不存在处理相关的变化（图5B），表明在含有捕获抗体的斑点中观察到的与哮喘相关的不同信号是由于捕获抗原的不同卤化引起的。

Claims (32)

1.一种抗体，其对单卤代酪氨酸具有结合亲和性。
2.权利要求1的抗体，其中单卤代酪氨酸是溴酪氨酸。
3.权利要求1的抗体，其中单卤代酪氨酸是氯酪氨酸。
4.权利要求1的抗体，其中单卤代酪氨酸是蛋白质的一部分。
5.权利要求1的抗体，其中抗体还具有对二卤代酪氨酸的结合亲和性。
6.一种组合物，其包含与单卤代酪氨酸结合的抗体。
7.权利要求6的组合物，其中单卤代酪氨酸是蛋白质的一部分。
8.权利要求6的组合物，其中单卤代酪氨酸是溴酪氨酸和/或氯酪氨酸中的一种或两种。
9.一种组合物，其包含具有3-溴-4-羟基苯甲酸部分的蛋白质。
10.权利要求9的组合物，其中蛋白质是钥孔
Figure FDA00003270693100011
血蓝蛋白（KLH）。
11.一种用于评价哮喘严重性的方法，其包括：
使用对单卤代酪氨酸具有结合亲和性的抗体分析病人的痰；和
测量与蛋白质结合的抗体的量。
12.权利要求11的方法，其中测量是定性和/或定量中的一种或两种。
13.权利要求11的方法，其中单卤代酪氨酸是蛋白质的一部分。
14.权利要求11的方法，其中单卤代酪氨酸是溴酪氨酸和/或氯酪氨酸中的一种或两种。
15.权利要求11的方法，进一步包括关联结合的抗体的量，以确定炎症的量。
16.权利要求11的方法，进一步包括使用结合的抗体的量来监控对哮喘发作的药物反应。
17.一种用于确定体液中嗜伊红粒细胞活性的方法，该方法包括：
将体液暴露于对单卤代酪氨酸具有结合亲和性的抗体；和
测量结合的抗体的量，以确定嗜伊红粒细胞活性。
18.权利要求17的方法，其中体液是痰。
19.权利要求17的方法，其中单卤代酪氨酸是蛋白质的一部分。
20.权利要求17的方法，其中单卤代酪氨酸是溴酪氨酸和/或氯酪氨酸中的一种或两种。
21.权利要求17的方法，进一步包括关联结合的抗体的量，以确定炎症和/或药物反应。
22.一种用于制备抗体的方法，该方法包括：
将3-溴-4-羟基-苯甲酸掺入蛋白质中，以形成抗原；
用该抗原免疫哺乳动物宿主；和
从宿主收集对抗原具有亲和性的抗体。
23.权利要求22的方法，其中蛋白质是钥孔血蓝蛋白（KLH）。
24.权利要求22的方法，其中抗体对单卤代酪氨酸具有结合亲和性。
25.权利要求24的方法，其中单卤代酪氨酸是溴酪氨酸和/或氯酪氨酸中的一种或两种。
26.权利要求22的方法，其中抗体对蛋白质卤代酪氨酸具有结合亲和性。
27.权利要求26的方法，其中卤代酪氨酸是单卤代酪氨酸和/或二卤代酪氨酸中的一种或两种。
28.权利要求27的方法，其中单卤代酪氨酸是3-溴酪氨酸和/或3-氯酪氨酸中的一种或两种。
29.权利要求27的方法，其中二卤代酪氨酸是3,5-二溴酪氨酸和/或3,5-二氯酪氨酸中的一种或两种。
30.权利要求22的方法，进一步包括将抗体暴露于体液，以确定嗜伊红粒细胞活性。
31.权利要求22的方法，进一步包括将抗体暴露于体液，以确定炎症。
32.权利要求22的方法，进一步包括将抗体暴露于体液，以确定具有单卤代酪氨酸和/或二卤代酪氨酸部分的蛋白质的量。
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