CN103222459B - 一种烟草花粉冷冻真空干燥、低温中长期保存方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种烟草花粉冷冻真空干燥、低温中长期保存方法。所述烟草花粉保持方法具体步骤：将新鲜花粉装入花粉储存容器中加盖置于冷冻干燥机的冷阱内，在-45℃至-50℃预冷冻2-4小时后取出，平摊在干燥盘或冷冻干燥机的物料盒中，然后放在冷冻干燥机内在-40℃至-50℃条件下冷冻干燥8-12小时后取出，放入花粉贮藏瓶或花粉储藏袋中密封，置于温度-4℃至-18℃的冷冻冰柜内低温长期保存至授粉期，再取出，撤除封口，在室温下复水恢复花粉活力。本发明解决了烟草杂交制种过程中的花期不遇问题，提前种植父本，并根据父本收集的量来安排母本的种植，减少了父母本种植的盲目性和土地资源的浪费，大大提高了授粉率，大幅降低成本。

Description

一种烟草花粉冷冻真空干燥、低温中长期保存方法

技术领域

本发明涉及农作物花粉储藏方法，特别涉及一种适用于烟草等作物的花粉冷冻干燥低温中长期保存方法。 

背景技术

在烟草雄性不育杂交一代种子制种过程中，有效地克服父母本花期不遇、保证活力高、数量充足的花粉供应，是获得高质量烟草种子和提高种子产量的重要前提条件和保证。传统的烟草雄性不育杂交一代种子制种技术是采用新鲜父本花粉直接给母本授粉，花粉活力高、效果好，但若母本生育期短、开花早，而父本生育期长、开花晚，则易造成母本满园花等待父本花粉的误花现象，虽然在种子生产上普遍采用适当多栽父本和父本早移栽等措施，有效地缓解了父本母本花期不遇的难题，但因授粉方式仍采用新鲜父本花粉直接给母本授粉，一是父本种植量大增加生产成本，二是过剩的花粉，因其寿命短(室温下24小时活力下降50％-80％)，无妥当的贮藏方法，造成大量浪费。特别是遇到阴雨天无法授粉时，父本花朵浪费更为严重。 

如何将花粉(包括上年花粉)采用一种适宜的储藏方法长期保存起来，然后等到母本花开时，将保存的父本花粉拿出去进行授粉，已成为烟草杂交制种中急需解决的关键技术。虽然关于烟草花粉贮藏方法研究有少量报道，但目前用于生产的仅是保鲜冰箱短期保存和液氮中长期保存法，如《中华人民共和国烟草行业标准烟草种子雄性不育系种子生产技术规程(YC/T  367-2010)》中规定，是将花粉密封置于4℃下短期贮藏，或用冻存管封存于液氮中长期贮藏。《一种烟草雄性不育系种子的繁殖方法》(CN101731140A)是将花粉在3～5℃的冰箱内封存备用。保鲜冰箱保存法，保存时间短，一般是20-30天；而液氮保存法，需常添加液氮，成本较高，加之液氮来源、运输的局限，限制了该方法的应用。 

花粉贮藏条件和其它生命体贮藏一样，一是水分控制，二是温度控制。冷冻真空干燥技术其原理是使生物体完全冻结，在一定的真空条件下使冻晶升华，从而达到低温脱水的目的，其优点是干燥彻底，能排查95-99％的水分，保持了生物原有形态、生理机能。现已广泛用于菌种、疫苗、生物高分子、血清及一些医药产品等保存。截止目前未见将其用于烟草花粉贮藏的报道。将冷冻真空干燥技术应用于烟草花粉贮藏，首先要解决花粉的预冻方法、冷冻干燥方法，其次是冷冻后的花粉贮藏方法和经冷冻、贮藏后花粉的活力恢复方法，而每个步骤的均会影响花粉的活力，目前并没有一套完整技术方案来实现烟草花粉冷冻真空技术。 

发明内容

本发明根据现有技术的不足，经过反复研究发明了一种从花粉预冻数量、预冻时间、冷冻干燥温度、冷冻干燥时间、冷冻干燥后的花粉长期贮藏方式，到贮藏后的花粉应用于授粉前的活力恢复方式等一整套系统方法，本发明操作简单，设备一次投入多年使用，采用该方法保藏的花粉，活力强，田间授粉的坐果率高，种子生产的综合成本大幅降低。 

本发明的技术方案：一种烟草花粉冷冻真空干燥、低温中长期保存方法，其特征在于具体步骤如下： 

(1)新鲜花粉的预冻处理：将新鲜花粉装入花粉储存容器中，并加盖，置于冷冻干燥机的冷阱内预冷冻2-4小时，冷冻干燥机的温度设定在-45℃至-50℃；预冻的目的是使花粉细胞内的自由水凝结到细胞间隙形成冰晶，瓶内花粉厚度越厚，要求冷冻温度越低、冷冻时间越长； 

(2)花粉的真空干燥处理：将步骤(1)中装有新鲜花粉经过预冻处理的花粉储存容器取出，去盖后将花粉倒出平摊在专用干燥盘内放入冷冻干燥机的干燥架上，或直接平摊在冷冻干燥机的物料盒中，合上密封罩，启动冷冻干燥机，当冷阱温度达-40℃至-50℃时，开始抽真空，要求在0.4-0.6小时内达到真空度达到10Pa以下，真空度低于10Pa均可实现真空干燥，一般情况下真空度越小真空干燥效果越好，冷冻干燥的时间为8-12小时，冷冻干燥时的温度设定在-40℃至-50℃； 

(3)花粉的低温贮藏：将步骤(2)中经冷冻真空干燥处理后的花粉取出，放入花粉贮藏瓶或花粉储藏袋中，并将其密封，置于温度-4℃至-18℃的冷冻冰柜内低温长期保存至授粉期； 

(4)花粉的复水处理：在需要授粉时，将步骤(3)中长期保存在冷冻冰柜内的花粉取出，撤出封口，并在室温下，用蒸馏水或0.9％生理盐水复水浸泡花粉15-20分钟，然后迅速摊开自然风干，或在生物培养箱中温度25-30℃、相对湿度95％以上的条件下吸水20-30分钟，或在温度30-35℃的水溶锅中吸水15-30分钟后，便可完全复水，恢复花粉活力。 

所述复水即恢复花粉细胞的水分，其作用是细胞经冷冻干燥后，水分基本完全丧失，各种酶的活性处于停滞状态，在25℃-30℃条件下，细胞自然吸收水分快，各种酶的活性得以迅速恢复。 

在步骤(1)中装有花粉的容器为广口瓶，容量125ml-250ml，每瓶装花粉5-8cm厚。 

在步骤(2)中的专用干燥盘为直径小于20cm，高度2cm以下，底面平整的金属盘；预冻花粉平摊在专用干燥盘或冷冻干燥机的物料盒中的厚度为10-20mm； 

在步骤(4)中花粉的复水处理室温为25℃-30℃，在生物培养箱和水溶锅中复水时间均为30分钟。 

步骤(4)中复水处理后的花粉必须在两个小时内完成授粉工作，且每次复水的花粉量以够两个小时授粉用即可。在常温下，两个小时后花粉活力迅速下降，为了不让复水后的花粉浪费，一般控制每次复水的花粉量保证在两个小时内授粉完。 

本发明中所用的冷冻干燥机、冷冻冰柜均采用现有的冷冻干燥机和冷冻冰柜。 

本发明的主要优点： 

1.本发明将新鲜的花粉直接利用冷冻干燥机的冷阱进行预冻，节省了超低温冰箱预冻(医药等多采用)的设备投入，一机多用，减少了成本费用。 

2.本发明将新鲜的花粉置于-45℃至-50℃的条件下进行预冻处理，保持了花粉细胞原有的形态、生理机能，同时细胞内的自由水凝结到细胞间隙形成冰晶，避免了直接冷冻干燥和其它直接冷冻、冷藏方法对细胞组织的破坏而导致花粉活性下降的问题； 

3.本发明将预冻处理后的花粉，利用冷冻真空干燥机的冻晶真空升华 脱水原理进行冷冻干燥处理，在保持花粉原有形态、生理机能的前提下，排查了95-99％的水分，由于是在低温条件下进行的真空冻晶升华干燥，因此与其它保存方法比较，脱水更彻底，花粉细胞组织损伤最小，各种酶的活性迅速停滞，细胞内营养物质消耗小； 

4.本发明将低温真空干燥处理后的花粉密封放置在-4℃至-18℃的条件下长期保存，由于真空干燥处理后的花粉是密封状态，花粉的水分含量极低，又置在-4℃至-18℃的条件下，花粉细胞内的各种酶的活性仍处于停滞状态，因此，同样是在-4℃至-18℃的条件下，经冷冻干燥处理后的花粉比其它未进行脱水处理而直接冷冻、冷藏的花粉，保存期更长； 

5.在授粉前，将冷冻的花粉取出，进行复水处理，其方法简单，授粉效果好，且可以根据授粉所需的花粉量对花粉进行复水，不会造成花粉的浪费。 

本发明根据冷冻真空干燥原理，提供了一种烟草花粉冷冻真空干燥、低温中长期贮藏方法，将烟草花粉收集起来，进行冷冻真空干燥处理后置于低温冰箱、冰柜贮藏，随时取出进行复水后授粉，彻底解决了烟草杂交制种过程中的花期不遇问题，可以提前种植父本，并根据父本收集的量来安排母本的种植，减少了父母本种植的盲目性和土地资源的浪费，大大提高了授粉率，方便实用、设备费用少，且一次投入多年使用，贮藏时间长、效果好，种子生产的综合成本大幅度降低。 

具体实施方式

下面结合实施例对本发明进一步说明。 

实例1：2011年7月19日，中国烟草恩施良种繁殖基地，取当天采 集的B37花粉20g，装入4个125ml的白色广口瓶中，每瓶5g，分别编号I、II、III、IV，进行不同贮藏方式的对比试验。 

一、贮藏方式如下： 

将装有花粉编号为I的广口瓶瓶口采用石蜡密封后直接置于冰箱保鲜贮藏(YC/T 367-2010法)； 

将装有花粉编号为II的广口瓶放入有干燥剂(硅胶)的干燥器中，干燥器口面涂抹凡士林加盖封口，再将干燥器置于-18℃的冰柜中采用低温冰柜贮藏法进行储存； 

将装有花粉编号为III的广口瓶采用本发明所述的冷冻真空干燥、低温中长期保存方法进行保存，具体步骤如下：打开冷冻干燥机(型号：FD-1A-50北京博医康生产)的密封罩，将装有新鲜花粉广口瓶加盖后，置于冷冻干燥机的冷阱内，合上密封罩，设定冷冻机的温度-50℃，时间3小时，合上电源进行预冻，达到预定时间时，冷冻机自动停止，断开电源，冷冻干燥结束；打开冷冻干燥机的密封罩，取出花粉瓶、去盖，将花粉倒出花粉平摊在直径为10cm、高2cm的铝质专用干燥盘内，花粉厚度15mm，然后将专用干燥盘放在冷冻干燥机干燥架上的物料盒内，合上密封罩，设定冷冻机温度-50℃，时间10小时，合上电源，冷冻干燥机启动，当冷冻干燥机的冷阱温度达到-50℃时，打开真空泵(型号：2XZ-II)电源开关，开始抽真空，0.5小时后观察真空度，显示在10Pa以下，真空度保持在10Pa以下进行真空干燥，达到预定的干燥时间时，真空泵、冷冻干燥机自动停止，切断电源，冷冻干燥结束；打开冷冻干燥机的密封罩，迅速取出花粉干燥盒，将花粉放入花粉贮藏瓶，加盖，用石蜡封口，再用铝箔纸袋包装， 封口机封口，然后放入-18℃的冰柜贮藏内保存。 

将装有花粉编号为IV的广口瓶采用冷冻真空干燥-干燥器常温保存方法进行储存：冷冻真空干燥处理的步骤与编号为III广口瓶的冷冻真空干燥处理方法相同，冷冻干燥结束后，打开冷冻干燥机的密封罩，迅速取出花粉瓶，装入花粉贮藏瓶，加盖，用石蜡封口，然后放入有干燥剂(硅胶)的干燥器中，干燥器口面涂上凡士林，加盖封口，在种子检测室作常温保存。 

2、花粉活力鉴定方法： 

贮藏1周(7月26日)、2周(8月2日)、3周(8月9日)、1个月(8月19日)、2个月(9月19日)、3个月(10月19日)、5个月(12月19日)、8个月(2012年3月19日)、12个月(2012年7月20日)后检测花粉活力，其中，花粉活力鉴定在恩施良繁基地实验室进行，其方法为离体培养法，培养液为葡萄糖3mg+硼酸50mg+CaCL₂20mg+水1000ml，恒温箱温度28℃，培养时间3小时，显微镜(重庆奥特光学仪器有限公司生产的SMART型)检测花粉萌发率，3次重复，每次重复取3个视野，用显微标尺测量花粉管长度，花粉管长度大于花粉粒2倍为有效数，花粉萌发率％＝萌发有效数/花粉粒总数×100％，取加权平均值。 

3、田间授粉坐果率调查：贮藏后1周(7月26日)、2周(8月2日)、3周(8月9日)、12个月(2012年7月20日)分别在恩施良繁基地鄂烟1号杂交种制种田进行田间授粉试验，统计坐果率，编号I取出花粉后直接授粉，编号II、编号III、编号IV在生物培养箱(温度25-30℃、相对湿度95％以上)复水30分钟后授粉，田间授粉3次重复，每次重复20株(母本)， 每株50朵花，一周后统计坐果率，坐果率％＝青果数/授粉花数×100％，取加权平均值。 

4、水分检测方法；红外线水分检测仪检测处理前和处理后的花粉水分含量，水分丧失率％＝(处理后花粉水分含量-处理前花粉水分含量)/处理前花粉水分含量)×100％。 

5、试验结果比较： 

(1)、编号I、编号II和冷冻干燥处理前的花粉水分均7.68％，经冷冻干燥处理后，编号III的水分0.18％，水分丧失率为97.66％，编号IV的水分0.22％，水分丧失率为97.13％。 

(2)、花粉活力检测结果： 

编号I保鲜冰箱贮藏法：2周后花粉活力由贮藏前的76.82％下降到61.58％，下降幅度为19.84％，5个月后下降到10.51％，下降幅度为86.32％，到第8个月丧失活力。 

编号II低温冰柜贮藏法：该方式由于采用了干燥剂(硅胶)干燥和-18℃的冰柜贮藏，花粉活力比保鲜冰箱贮藏法有所提高，3周后下降到63.81％，下降幅度为16.94％，8个月后下降到23.75％，下降幅度为69.08％，到第12个月丧失活力。 

编号III冷冻真空干燥-低温保存方法(即本发明所述的方法)：由于采用冷冻干燥(花粉水分丧失率为97.8％)和-18℃的冰柜贮藏，花粉活力贮藏12个月后仍达72.48％，仅下降5.65％。 

编号IV冷冻真空干燥-干燥器常温保存方法：冷冻干燥处理后，花粉水分丧失率为97.39％，采用干燥器常温保存，2个月后活力下降15.59％， 12个月后下降56.3％。 

表1不同贮藏方式花粉活力检测结果％ 

表2不同贮藏方式花粉活力递减结果比较％ 

(3)、田间坐果率调查结果： 

未经处理的新鲜花粉的田间授粉坐果率为96.92％(对照)，其它处理： 

表3不同花粉贮藏方式的授粉后坐果率结果比较％ 

表4不同花粉贮藏方式的授粉后坐果率递减率比较％ 

编号I保鲜冰箱贮藏法：贮藏1周后的花粉授粉后坐果率为的88.58％下降幅度为8.61％，2周后下降幅度为27.56％，12个月丧失活力。 

编号II低温冰柜贮藏法：贮藏2周后下降到93.27％，下降幅度为 3.77％，3周后下降幅度为21.00％，12个月丧失活力。 

编号III冷冻真空干燥-低温冰柜保存方法：贮藏12个月后坐果率仍达92.51％，仅下降4.55％。 

编号IV冷冻真空干燥-干燥器常温保存方法：3周后坐果率90.72％，下降幅度为6.40％，12个月坐果率34.15％，下降64.76％。 

经过以上的试验对比，得到以下结论： 

编号I保鲜冰箱贮藏法：花粉未经任何干燥处理，直接在4℃-6℃的冰箱保鲜贮藏，2周后花粉活力和授粉后坐果率大幅下降，第8个月后完全丧失活力，因此，该方式的贮藏时间以2周以内为宜。 

编号II低温冰柜贮藏法：该方式由于采用了干燥剂(硅胶)干燥和-18℃的冰柜贮藏，花粉活力比保鲜冰箱贮藏法有所提高3周后花粉活力和授粉后坐果率大幅下降，该方式的贮藏时间以3周以内为宜。 

编号III冷冻真空干燥-低温保存方法：由于采用冷冻干燥处理和-18℃的冰柜贮藏，花粉水分丧失率97.8％，贮藏12个月后花粉活力和授粉后坐果率仍然较高，该方式可以作为烟草花粉中长期贮藏方式。 

编号IV冷冻真空干燥-干燥器常温保存方法：冷冻干燥处理后，花粉水分丧失率为97.39％，采用干燥器常温保存，该方式的贮藏时间3周至3个月以内为宜。 

实例2：2012年，中国烟草恩施良种繁殖基地，取不同时期采集的B37、KY14、TN90、KY16的花粉分别进行本法发明所述的冷冻真空干燥、低温中长期保存方法贮藏，分别进行花粉活力检测和坐果率调查，方法及结果如下： 

1、冷冻真空干燥、低温保存方法、花粉活力检测方法、花粉复水方法、田间授粉坐果率调查方法同实例1。 

表6不同品种不同采集时期处理后花粉水分结果比较％ 

2、花粉活力检测结果 

截止2013年4月，贮藏8个月的花粉活力检测结果如表7，不同品种的花粉活力均在80％以上，同处理前比较，8个月后活力仅下降1.33％-2.61％。 

表7不同品种冷冻干燥处理后花粉活力检测结果比较％ 

3、田间授粉坐果率结果 

2012年7-8月，即冷冻干燥处理后1周、2周、3周，田间授粉坐果率统计结果为：平均坐果率在92.92％-97.86％，下降率在0.395-0.58％。 

表8不同品种冷冻干燥处理后花粉授粉坐果率比较％ 

Claims (6)

1.一种烟草花粉冷冻真空干燥、低温中长期保存方法，其特征在于具体步骤如下：

(1)新鲜花粉的预冻处理：将新鲜花粉装入花粉储存容器中，并加盖，置于冷冻干燥机的冷阱内预冷冻2-4小时,冷冻干燥机的温度设定在-45℃至-50℃；

(2)花粉的真空干燥处理：将步骤(1)中装有新鲜花粉经过预冻处理的花粉储存容器取出，将花粉倒出平摊在专用干燥盘内放入冷冻干燥机的干燥架上，或直接平摊在冷冻干燥机的物料盒中，并抽取真空使冷冻干燥机内的真空度在0.4-0.6小时内达到10Pa以下，冷冻干燥的时间为8-12小时，冷冻干燥时的温度设定-40℃至-50℃；

(3)花粉的低温贮藏：将步骤(2)中经冷冻真空干燥处理后的花粉取出，放入花粉贮藏瓶或花粉储藏袋中，并将其密封，置于温度-4℃至-18℃的冷冻冰柜内低温长期保存至授粉期；

(4)花粉的复水处理：在需要授粉时，将步骤(3)中长期保存在冷冻冰柜内的花粉取出，撤除封口，并在室温下，用蒸馏水或0.9％生理盐水复水浸泡花粉15-20分钟，然后迅速摊开自然风干，或在生物培养箱中温度25-30℃、相对湿度95％以上的条件下吸水20-30分钟便可完全复水，恢复花粉活力。

2.根据权利要求1所述的一种烟草花粉冷冻真空干燥、低温中长期保存方法，其特征在于：在步骤(1)中装有花粉的花粉储存容器为广口瓶，容量125ml-250ml，每瓶装花粉5-8cm厚。

3.根据权利要求1所述的一种烟草花粉冷冻真空干燥、低温中长期保存方法，其特征在于：在步骤(2)中使用的专用干燥盘为直径小于20cm，高度2cm以下，底面平整的金属干燥盘。

4.根据权利要求1所述的一种烟草花粉冷冻真空干燥、低温中长期保存方法，其特征在于：在步骤(2)中平摊在专用干燥盘或冷冻干燥机的物料盒中的预冻花粉厚度为10-20mm。

5.根据权利要求1所述的一种烟草花粉冷冻真空干燥、低温中长期保存方法，其特征在于：在步骤(4)中花粉的复水处理室温为25℃-30℃，在生物培养箱中复水时间均为30分钟。

6.根据权利要求1所述的一种烟草花粉冷冻真空干燥、低温中长期保存方法，其特征在于：步骤(4)中复水处理后的花粉在两个小时内完成授粉工作，且每次复水的花粉量以够两个小时授粉用即可。