CN104877909A - 一种稻瘟病菌菌种的长期保存方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种稻瘟病菌菌种的长期保存方法，是以稻杆作为保存载体对稻瘟病菌进行保存，具体是将培养基倒入培养皿平板中，待培养基凝固后快速将稻杆均匀放置于培养基上，待稻杆吸收培养基冷凝水及其携带的少量营养物质后，将稻瘟病菌菌种接种在培养基中心无稻杆处，使稻瘟病菌菌种在稻杆上生长和繁殖，再将生长好的稻杆于30℃恒温烘干后于-80℃至4℃放置，实现稻瘟病菌菌种的长期保存。本发明保存方法操作简单、方便、快速，经处理后稻瘟病菌菌种保存周期长、菌种性状稳定，且保存周期内不用定期移植，不仅可节省保存成本及保存空间，安全可靠，还可使菌种活化更加方便，对稻瘟病菌生物学特性及发展水稻抗病育种研究具有重要的应用价值。
Description
技术领域
本发明属于微生物学和植物保护学技术领域，具体涉及一种稻瘟病菌菌种的长期保存方法。
背景技术
由稻瘟病菌Magnaporthe grisea Barr.引起的稻瘟病是水稻的主要病害之一，每年由其造成的水稻损失可占水稻总产量的10%-30%，是阻碍水稻高产、稳产的关键因素之一。而根据发病时期和稻瘟病菌侵染水稻的部位，可将水稻稻瘟病分为苗瘟、叶瘟、穗颈瘟和谷粒瘟，其中以穗颈瘟对水稻产量和品质造成的影响最为严重。种植抗病品种是防治稻瘟病最经济有效的措施，而抗病水稻品种单一大面积推广种植3-5年后容易丧失抗病性，造成稻瘟病的爆发流行。一般认为抗病品种抗性的丧失主要原因是由于稻瘟病菌群体复杂、易变异，其生理小种发生变化常导致新的生理小种的出现和积累。因此，鉴定和监测稻瘟病菌群体生理小种组成类型和变化动态对抗病育种、主栽品种推广布局和抗病性变化都有重要的意义，而稻瘟病菌保存是完成这一科研工作的基础。
真菌菌种常用的保存方法有菌种定期移植培养保存法、矿物油保存法、冷冻干燥保存法。其中，菌种定期移植保存法是将菌种接种在适宜的固体斜面培养基上，待菌种长满斜面后，棉塞部分用灭菌报纸包好，置于4℃冰箱中保存，其优点是操作简单，使用方便，能避免螨类为害，并能随时检查保存菌种是否感染杂菌；但其缺点是菌种的生长和代谢并未完全被抑制，菌种容易变异，且培养基成分会逐渐被菌种消耗，每隔6-8个月需要移植转代一次，同时存在需要较大的存储空间、玻璃器皿容易破裂等问题。矿物油保存法是在生长好的菌种斜面上加一层灭菌的石蜡油，石蜡油的量超过菌种斜面顶部1cm，可以置于室温或冰箱保存，其优点是不需要特殊设备，菌种存活期较长，菌种在矿物油下生长虽然没有停止，但受到明显抑制，培养基不容易干燥，无需经常移植，不易受到螨类为害；其缺点是需要的存储空间大，玻璃器皿容易破裂，同时由于菌丝体外有矿物油，菌种恢复时生长缓慢且外观带有粘性，使恢复菌种较为繁琐，一般需要再移植1-2次才能得到良好的菌种。冷冻干燥保存法是将菌种孢子悬浮在保护剂中，再把小量孢子悬浮液在无菌条件下分盛在灭菌的安瓿中，然后接上干燥器和抽气系统，将安瓿放在干冰和乙酸乙酯的混合冷冻液中，抽气使悬浮液完全干燥，安瓿封口后置于室温或冰箱中保存，其优点是保存时间长，菌种不易变异；其缺点是该方法不适用于不产生孢子只有菌丝体类型的真菌保存，且需要专门设备，费用较高。
发明内容
针对上述问题，本发明的目的是提供一种稻瘟病菌菌种的长期保存方法，其操作简单，不需要专门的设备，且保存的稻瘟病菌菌种性状稳定、不易变异、不需定期移植，并能节约存储空间，避免螨类为害和菌种污染，对提高菌种保存的效率和质量有显著效果。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种稻瘟病菌菌种的长期保存方法，是用稻杆作为稻瘟病菌的保存载体对稻瘟病菌进行保存；其具体包括如下步骤：
步骤1：将培养基倒入培养皿平板中，待培养基凝固后快速将剪切好的稻杆均匀放置于培养基上；
所述培养基为可溶性淀粉培养基，其成分为：可溶性淀粉10.0g，酵母膏2.0g，CaCO3 3.0g，琼脂粉16.0g，蒸馏水1000.0ml，pH6.5；
步骤2：用接种针挑取一块待保存的稻瘟病菌菌块，将其置于培养基中心无稻杆处，使其菌丝面向下；
步骤3：将培养皿平板放置于恒温培养箱中，25℃恒温培养至菌种长满培养皿；
步骤4：用镊子将稻杆夹出放置于纸袋中；
步骤5：用透明胶带将纸袋封口；
步骤6：在纸袋上标注菌种信息及保存日期；
步骤7：将纸袋置于烘箱中，30℃恒温烘干48h；
步骤8：将烘干后的纸袋装入收纳盒，用透明胶带封口，并标注菌种信息，再将收纳盒置于-80℃至4℃保存。
步骤1所用培养皿平板的直径为90mm；所述剪切好的稻杆长20mm；
步骤2所取稻瘟病菌菌块的直径为5mm；
步骤4所用纸袋的规格为138mm×67mm；
步骤5纸袋封口所用透明胶带的宽为20mm；
步骤8收纳盒封口所用透明胶带的宽为50mm。
上述步骤中，步骤1、步骤2、步骤4和步骤5均须在无菌操作台上进行无菌操作，且操作中所用培养基、培养皿、稻杆、接种针、镊子、纸袋均需预先在121℃条件下灭菌处理25min。
本发明的显著优点在于：
（1）水稻是稻瘟病菌的天然寄主，本发明以稻杆为保存载体对稻瘟病菌进行保存，不仅可为稻瘟病菌的生长提供最适宜的载体，且在操作过程中，稻杆会吸取培养基凝固后的冷却水及培养基中少量营养物质，从而为稻瘟病菌提供生长必需的营养物质，又可避免营养过于优裕引起的稻瘟病菌菌种退化，使保存的稻瘟病菌菌种生长良好，且性状稳定；
（2）本发明保存方法操作方便快速，且一个培养皿可以放置约30根稻杆，有利于实现稻瘟病菌的快速、大批量保存；
（3）按本发明进行保存，可使菌种保存周期延长，且保存周期内不用定期移植，节省了保存成本；
（4）该保存方法不仅节省了保存空间，还便于菌种查找，且避免了使用玻璃器皿易碎易破的缺点，安全可靠；
（5）按本发明保存的菌种活化方便，即将透明胶带撕开，夹出稻杆放在培养基上就可以进行活化培养，而将纸袋再次封口放入冰箱仍可继续保存，同时可将一个菌种再分装多个纸袋，每次使用一个纸袋，可有效避免多次活化菌种造成的污染。
附图说明
图1为本发明移入菌种待保存的培养示意图，其中，1-稻杆，2-培养基，3-稻瘟病菌菌块。
具体实施方式
为了使本发明所述的内容更加便于理解，下面结合具体实施方式对本发明所述的技术方案做进一步的说明，但是本发明不仅限于此。
操作中所用培养基、培养皿、稻杆、接种针、镊子、纸袋均预先在121℃条件下灭菌处理25min；且所述步骤中步骤1、步骤2、步骤4和步骤5均须在无菌操作台上进行无菌操作。
实施例1
一种稻瘟病菌菌种的长期保存方法，具体包括如下步骤：
步骤1：在超净工作台上将灭菌的可溶性淀粉培养基倒入灭菌的直径为90mm的培养皿平板中，待培养基凝固后快速将剪切好的、长为20mm的灭菌稻杆均匀放置于培养基上；所述可溶性淀粉培养基的成分为：可溶性淀粉10.0g，酵母膏2.0g，CaCO3 3.0g，琼脂粉16.0g，蒸馏水1000.0ml，pH6.5；
步骤2：在超净工作台上用灭菌的接种针挑取一块待保存的、直径为5mm的稻瘟病菌菌块，将其置于可溶性淀粉培养基中心无稻杆处，使其菌丝面向下；
步骤3：将培养皿平板放置于恒温培养箱中，25℃恒温培养至菌种长满培养皿；
步骤4：在超净工作台上用灭菌镊子将稻杆夹出，放置于规格为138mm×67mm的灭菌纸袋中；
步骤5：在超净工作台上用宽度为20mm的透明胶带将纸袋封口；
步骤6：在纸袋上标注菌种信息及保存日期；
步骤7：将纸袋置于烘箱中，30℃恒温烘干48h；
步骤8：将烘干后的纸袋装入收纳盒，用宽度为50mm的透明胶带封口，并标注菌种信息，再将收纳盒置于4℃保存。
实施例2
一种稻瘟病菌菌种的长期保存方法，具体包括如下步骤：
步骤1：在超净工作台上将灭菌的可溶性淀粉培养基倒入灭菌的直径为90mm的培养皿平板中，待培养基凝固后快速将剪切好的、长为20mm的灭菌稻杆均匀放置于培养基上；所述可溶性淀粉培养基的成分为：可溶性淀粉10.0g，酵母膏2.0g，CaCO3 3.0g，琼脂粉16.0g，蒸馏水1000.0ml，pH6.5；
步骤2：在超净工作台上用灭菌的接种针挑取一块待保存的、直径为5mm的稻瘟病菌菌块，将其置于可溶性淀粉培养基中心无稻杆处，使其菌丝面向下；
步骤3：将培养皿平板放置于恒温培养箱中，25℃恒温培养至菌种长满培养皿；
步骤4：在超净工作台上用灭菌镊子将稻杆夹出，放置于规格为138mm×67mm的灭菌纸袋中；
步骤5：在超净工作台上用宽度为20mm的透明胶带将纸袋封口；
步骤6：在纸袋上标注菌种信息及保存日期；
步骤7：将纸袋置于烘箱中，30℃恒温烘干48h；
步骤8：将烘干后的纸袋装入收纳盒，用宽度为50mm的透明胶带封口，并标注菌种信息，再将收纳盒置于-20℃保存。
实施例3
一种稻瘟病菌菌种的长期保存方法，具体包括如下步骤：
步骤1：在超净工作台上将灭菌的可溶性淀粉培养基倒入灭菌的直径为90mm的培养皿平板中，待培养基凝固后快速将剪切好的、长为20mm的灭菌稻杆均匀放置于培养基上；所述可溶性淀粉培养基的成分为：可溶性淀粉10.0g，酵母膏2.0g，CaCO3 3.0g，琼脂粉16.0g，蒸馏水1000.0ml，pH6.5；
步骤2：在超净工作台上用灭菌的接种针挑取一块待保存的、直径为5mm的稻瘟病菌菌块，将其置于可溶性淀粉培养基中心无稻杆处，使其菌丝面向下；
步骤3：将培养皿平板放置于恒温培养箱中，25℃恒温培养至菌种长满培养皿；
步骤4：在超净工作台上用灭菌镊子将稻杆夹出，放置于规格为138mm×67mm的灭菌纸袋中；
步骤5：在超净工作台上用宽度为20mm的透明胶带将纸袋封口；
步骤6：在纸袋上标注菌种信息及保存日期；
步骤7：将纸袋置于烘箱中，30℃恒温烘干48h；
步骤8：将烘干后的纸袋装入收纳盒，用宽度为50mm的透明胶带封口，并标注菌种信息，再将收纳盒置于-80℃保存。
保存菌种的存活率实验
在实施例1-3所保存的菌种分别于存放1、5、10年时进行活化，测定其存活情况，结果见表1。
表1 保存不同年限后菌种的存活情况
由表1可见，用本发明方法保存稻瘟病菌1年、5年、10年后，稻瘟病菌均存活良好，生长性状稳定。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
Claims (7)
1. 一种稻瘟病菌菌种的长期保存方法，其特征在于：用稻杆作为稻瘟病菌的保存载体对稻瘟病菌进行保存。
2. 根据权利要求1所述稻瘟病菌菌种的长期保存方法，其特征在于：包括如下步骤：
步骤1：将培养基倒入培养皿平板中，待培养基凝固后快速将剪切好的稻杆均匀放置于培养基上；
步骤2：用接种针挑取一块待保存的稻瘟病菌菌块置于培养基中心无稻杆处，使其菌丝面向下；
步骤3：将培养皿平板于25℃恒温培养至菌种长满培养皿；
步骤4：用镊子将稻杆夹出放置于纸袋中；
步骤5：用透明胶带将纸袋封口；
步骤6：在纸袋上标注菌种信息及保存日期；
步骤7：将纸袋于30℃恒温烘干48h；
步骤8：将烘干后的纸袋装入收纳盒，用透明胶带封口，并标注菌种信息，再将收纳盒置于-80℃至4℃保存。
3. 根据权利要求2所述稻瘟病菌菌种的长期保存方法，其特征在于：步骤1、步骤2、步骤4和步骤5均须在无菌操作台上进行无菌操作。
4. 根据权利要求2所述稻瘟病菌菌种的长期保存方法，其特征在于：步骤1所述培养基为可溶性淀粉培养基，其成分为：可溶性淀粉10.0g，酵母膏2.0g，CaCO3 3.0g，琼脂粉16.0g，蒸馏水1000.0ml，pH6.5。
5.根据权利要求2所述稻瘟病菌菌种的长期保存方法，其特征在于：步骤1所用培养皿平板的直径为90mm。
6. 根据权利要求2所述稻瘟病菌菌种的长期保存方法，其特征在于：步骤1中剪切好的稻杆长20mm。
7. 根据权利要求2所述稻瘟病菌菌种的长期保存方法，其特征在于：步骤2所取的稻瘟病菌菌块直径为5mm。
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