CN103221060A - 靶向半乳糖神经酰胺表达因子-1的肿瘤增殖控制方法 - Google Patents

靶向半乳糖神经酰胺表达因子-1的肿瘤增殖控制方法 Download PDF

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Abstract

本发明的目的是提供具有抑制血管形成作用和/或抑制肿瘤增殖作用的抗肿瘤剂或抑制肿瘤增殖的方法。本发明提供了上述抗肿瘤剂，其含有下述多肽：该多肽是在去除了半乳糖神经酰胺表达因子-1的Q区的多肽中、至少含有C区或其一部分的多肽，且该抗肿瘤剂具有抑制血管形成作用和/或抑制肿瘤增殖作用。

Description

靶向半乳糖神经酰胺表达因子-1的肿瘤增殖控制方法
技术领域
本发明涉及靶向半乳糖神经酰胺表达因子-1的抗肿瘤剂和抑制肿瘤增殖的方法。
背景技术
半乳糖神经酰胺(GalCer)是由1个半乳糖残基和1个神经酰胺残基组成的最小的鞘糖脂，在髓鞘少突胶质细胞和/或肾上皮细胞中大量表达，是具有绝缘机能、耐受高盐浓度机能的糖脂。
半乳糖神经酰胺表达因子-1(GalCer Expression Factor-1(GEF-1))是半乳糖神经酰胺的表达因子(Ogura，K.等人，J.Neurochem.，71，1827-1836，1998)，是由具有锌指序列(FYVE)的区域(Z)、富含脯氨酸的区域(P)、卷曲-卷曲序列区域(C)、富含脯氨酸2/富含谷氨酰胺的区域(Q)这4个区域组成的蛋白质。此外，大鼠GEF-1是小鼠Hrs(HGF调节酪氨酸激酶底物,HGF-regulatedtyrosine kinase substrate)的大鼠同源物(Komada，M.等人，Mol.Cell Biol.，15，6213-6221，1995)，已知参与小泡转运和胞内信号传导。
本发明人已发现，GEF-1/Hrs对于MDCK细胞显示出成纤维细胞样的形态变化，还发现GEF-1/Hrs与细胞的迁移性相关(特开2005-247735号公报)。然而，GEF-1/Hrs及其缺失了Q区域的突变，没有表现出抑制肿瘤增殖的作用(特开2005-247735号公报)。
已知肿瘤在增殖过程中，为了弥补低氧和营养缺乏，而释放VEGF、TGF-β等诱导血管形成因子，诱导向肿瘤形成血管。因此，为了抑制肿瘤增殖，考虑抑制所述肿瘤性血管形成的对策。然而，目前尚不清楚GEF-1/Hrs与血管形成之间的关系。
发明内容
鉴于上述情况，本发明要解决的问题是提供具有抑制血管形成作用和/或抑制肿瘤增殖作用的抗肿瘤剂和抑制肿瘤增殖的方法。
本发明人为了解决上述问题进行了深入的研究，结果发现了GEF-1参与血管形成和肿瘤增殖。从而发现了通过抑制GEF-1的表达，可以抑制血管形成和肿瘤增殖，完成了本发明。
换言之，本发明内容如下。
【1】肿瘤增殖抑制剂，其含有下述多肽：该多肽是在去除了半乳糖神经酰胺表达因子-1的Q区的多肽中、至少含有C区或其一部分的多肽。
【2】肿瘤增殖抑制剂，其含有下列(a)或(b)的多肽：
(a)由序列号8、10或12所示氨基酸序列组成的多肽，
(b)由在序列号8、10或12所示氨基酸序列中缺失、取代或添加1个或多个氨基酸而成的氨基酸序列组成、且具有抑制肿瘤增殖作用的多肽。
【3】肿瘤增殖抑制剂，其含有下列(a)或(b)的多肽：
(a)含有序列号8、10或12所示氨基酸序列中的至少10个连续的氨基酸残基的多肽，
(b)由下列氨基酸序列组成、且具有抑制肿瘤增殖作用的多肽，该氨基酸序列是在含有序列号8、10或12所示氨基酸序列中的至少10个连续的氨基酸残基的氨基酸序列中缺失、取代或添加1个或多个氨基酸而形成的。
【4】上述【3】记载的肿瘤增殖抑制剂，其中，上述(a)中记载的多肽含有序列号44-65中任一项所示的氨基酸序列。
【5】肿瘤增殖抑制剂，其含有编码下述多肽的多核苷酸，该多肽是在去除了半乳糖神经酰胺表达因子-1的Q区的多肽中、至少含有C区或其一部分的多肽。
【6】肿瘤增殖抑制剂，其含有编码下列(a)或(b)的多肽的多核苷酸，
(a)由序列号8、10或12所示氨基酸序列组成的多肽，
(b)由在序列号8、10或12所示氨基酸序列中缺失、取代或添加1个或多个氨基酸而成的氨基酸序列组成、且具有抑制肿瘤增殖作用的多肽。
【7】肿瘤增殖抑制剂，其含有编码下列(a)或(b)的多肽的多核苷酸，
(a)含有序列号8、10或12所示氨基酸序列中的至少10个连续的氨基酸残基的多肽，
(b)由下列氨基酸序列组成、且具有抑制肿瘤增殖作用的多肽，该氨基酸序列是在含有序列号8、10或12所示氨基酸序列中的至少10个连续的氨基酸残基的氨基酸序列中缺失、取代或添加1个或多个氨基酸而形成的。
【8】肿瘤增殖抑制剂，其含有下列(a)或(b)的多核苷酸：
(a)由序列号7、9或11所示碱基序列组成的多核苷酸，
(b)与由下列碱基序列组成的多核苷酸在严格条件下杂交、且编码具有抑制肿瘤增殖作用的多肽的多核苷酸，所述碱基序列是与序列号7、9或11所示碱基序列互补的碱基序列。
【9】肿瘤增殖抑制剂，其含有抑制半乳糖神经酰胺表达因子-1表达的物质。
【10】上述【9】记载的肿瘤增殖抑制剂，其中，所述抑制半乳糖神经酰胺表达因子-1表达的物质是针对编码半乳糖神经酰胺表达因子-1的多核苷酸的siRNA或shRNA。
【11】上述【10】记载的肿瘤增殖抑制剂，其中，所述编码半乳糖神经酰胺表达因子-1的多核苷酸含有编码下列(a)或(b)的多肽的碱基序列，
(a)由序列号2、4或6所示氨基酸序列组成的多肽，
(b)由在序列号2、4或6所示氨基酸序列中缺失、取代或添加1个或多个氨基酸而成的氨基酸序列组成、且具有抑制肿瘤增殖作用的多肽。
【12】上述【10】记载的肿瘤增殖抑制剂，其中，所述编码半乳糖神经酰胺表达因子-1的多核苷酸含有下列(a)或(b)的多核苷酸：
(a)由序列号1、3或5所示碱基序列组成的多核苷酸，
(b)与由下列碱基序列组成的多核苷酸在严格条件下杂交、且编码具有抑制肿瘤增殖作用的多肽的多核苷酸，所述碱基序列是与序列号1、3或5所示碱基序列互补的碱基序列。
【13】血管形成抑制剂，其含有下述多肽：该多肽是在去除了半乳糖神经酰胺表达因子-1的Q区的多肽中、至少含有C区或其一部分的多肽。
【14】血管形成抑制剂，其含有下列(a)或(b)的多肽：
(a)由序列号8、10或12所示氨基酸序列组成的多肽，
(b)由在序列号8、10或12所示氨基酸序列中缺失、取代或添加1个或多个氨基酸而成的氨基酸序列组成、且具有抑制血管形成作用的多肽。
【15】血管形成抑制剂，其含有下列(a)或(b)的多肽：
(a)含有序列号8、10或12所示氨基酸序列中的至少10个连续的氨基酸残基的多肽，
(b)由下列氨基酸序列组成、且具有抑制血管形成作用的多肽，该氨基酸序列是在含有序列号8、10或12所示氨基酸序列中的至少10个连续的氨基酸残基的氨基酸序列中缺失、取代或添加1个或多个氨基酸而形成的。
【16】上述【15】记载的血管形成抑制剂，其中，上述(a)中记载的多肽含有序列号44-65中任一项所示的氨基酸序列。
【17】血管形成抑制剂，其含有编码下述多肽的多核苷酸，该多肽是在去除了半乳糖神经酰胺表达因子-1的Q区的多肽中、至少含有C区或其一部分的多肽。
【18】血管形成抑制剂，其含有编码下列(a)或(b)的多肽的多核苷酸，
(a)由序列号8、10或12所示氨基酸序列组成的多肽，
(b)由在序列号8、10或12所示氨基酸序列中缺失、取代或添加1个或多个氨基酸而成的氨基酸序列组成、且具有抑制血管形成作用的多肽。
【19】血管形成抑制剂，其含有编码下列(a)或(b)的多肽的多核苷酸，
(a)含有序列号8、10或12所示氨基酸序列中的至少10个连续的氨基酸残基的多肽，
(b)由下列氨基酸序列组成、且具有抑制血管形成作用的多肽，该氨基酸序列是在含有序列号8、10或12所示氨基酸序列中的至少10个连续的氨基酸残基的氨基酸序列中缺失、取代或添加1个或多个氨基酸而形成的。
【20】血管形成抑制剂，其含有下列(a)或(b)的多核苷酸：
(a)由序列号7、9或11所示碱基序列组成的多核苷酸，
(b)与由下列碱基序列组成的多核苷酸在严格条件下杂交、且编码具有抑制血管形成作用的多肽的多核苷酸，所述碱基序列是与序列号7、9或11所示碱基序列互补的碱基序列。
【21】血管形成抑制剂，其含有抑制半乳糖神经酰胺表达因子-1表达的物质。
【22】上述【21】记载的血管形成抑制剂，其中，所述抑制半乳糖神经酰胺表达因子-1表达的物质是针对编码半乳糖神经酰胺表达因子-1的多核苷酸的siRNA或shRNA。
【23】上述【22】记载的血管形成抑制剂，其中，所述编码半乳糖神经酰胺表达因子-1的多核苷酸含有编码下列(a)或(b)的多肽的碱基序列，
(a)由序列号2、4或6所示氨基酸序列组成的多肽，
(b)由在序列号2、4或6所示氨基酸序列中缺失、取代或添加1个或多个氨基酸而成的氨基酸序列组成、且具有诱导血管形成作用的多肽。
【24】上述【22】记载的血管形成抑制剂，其中，所述编码半乳糖神经酰胺表达因子-1的多核苷酸含有下列(a)或(b)的多核苷酸：
(a)由序列号1、3或5所示碱基序列组成的多核苷酸，
(b)与由下列碱基序列组成的多核苷酸在严格条件下杂交、且编码具有诱导血管形成作用的多肽的多核苷酸，所述碱基序列是与序列号1、3或5所示碱基序列互补的碱基序列。
【25】癌细胞特性消除剂，其含有下列(a)或(b)的多肽：
(a)由序列号8、10或12所示氨基酸序列组成的多肽，
(b)由在序列号8、10或12所示氨基酸序列中缺失、取代或添加1个或多个氨基酸而成的氨基酸序列组成、且具有消除癌细胞特性作用的多肽。
【26】上述【25】记载的癌细胞特性消除剂，其是使癌细胞获得接触抑制能力的癌细胞特性消除剂。
【27】抑制肿瘤增殖的方法，该方法包括：抑制半乳糖神经酰胺表达因子-1的表达。
【28】抑制血管形成的方法，该方法包括：抑制半乳糖神经酰胺表达因子-1的表达。
通过本发明，可以提供含有下述多肽的抗肿瘤剂，该多肽是在去除了半乳糖神经酰胺表达因子-1的Q区的多肽中、至少含有C区或其一部分的多肽。此外，通过本发明，可以提供含有抑制半乳糖神经酰胺表达因子-1表达的物质的抗肿瘤剂。由于除了抑制癌转移的作用外，本发明还具有抑制血管形成作用和/或抑制肿瘤增殖的作用，因此作为抗肿瘤剂是非常有效的。
附图简介
图1是显示GEF-1的结构的模式图。
图2A是显示B16细胞、B16/bsr细胞、B16/GEF-1细胞、B16/C细胞和B16/shRNA细胞的集落形态的图。
图2B是显示给予B16细胞、B16/GEF-1细胞、B16/C细胞和B16/shRNA细胞后第21天的肺转移图像的图。图中的“HE”表示HE染色图像。
图2C是显示给予B16细胞、B16/bsr细胞、B16/GEF-1细胞、B16/C细胞和B16/shRNA细胞后的小鼠生存天数的图。
图3是显示管腔形成实验的结果的图。A)显示了KOP细胞和KOP/C细胞的管腔形成结果。B)显示了MDCK/GEF-1细胞、MDCK细胞和MDCK/C细胞的管腔形成结果。
图4是显示在小鼠背部皮下(体内)的血管形成的诱导和抑制结果的图。上图显示了血管形成的情况，下图显示了血管长度和血管面积的测量结果。
图5是显示B16/C细胞在体外增殖能力的测量结果的图。
图6是显示B16/C细胞的细胞密度和细胞周期的测量结果的图。
图7是显示用于测量转录因子活性和启动子活性的载体的构造的模式图。
图8是显示HGF和TGF-β对MDCK/GEF-1细胞和MDCK/C细胞的SMAD转录活性的影响的测量结果的图。
图9是显示MDCK细胞/GEF-1细胞和MDCK/C细胞中的各转录因子的活性的测量结果的图。
图10是显示B16细胞/GEF-1细胞、B16/shRNA细胞和B16/C细胞中的各转录因子的活性的测量结果的图。
图11是显示B16/bsr细胞、B16细胞/GEF-1细胞和B16/C细胞中的TGF-β-SMAD信号诱导性的PAI-1启动子活性的测量结果的图。
图12是显示培养基中所含的TGF-β变化量的测量结果的图。
图13A是显示B16细胞/GEF-1细胞和B16/C细胞在软琼脂培养基中的增殖能力的测量结果的图。上图是显示集落形成的情况，下图是显示集落数的相对值的测量结果的图。
图13B是显示LLC/C细胞在软琼脂培养基中的增殖能力的测量结果的图。上图是显示集落形成的情况，下图是显示集落数的相对值的测量结果的图。
图13C是显示MDCK细胞和MDCK/GEF-1细胞在软琼脂培养基中的增殖形态的图。
图14A是显示B16细胞/GEF-1细胞、B16/shRNA细胞和B16/C细胞在C57BL/6小鼠中的肿瘤形成/增殖能力的测量结果的图。
图14B是显示MDCK细胞和MDCK/GEF-1细胞在裸鼠中的肿瘤形成/增殖能力的测量结果的图。
图15是显示GEF-1siRNA的抑制管腔形成的效果的研究结果图。上图显示导入了siRNA的细胞的管腔形成情况，下图显示了管腔形成率的相对值的测量结果。
图16是显示GEF-1siRNA#3在体内抑制肿瘤增殖的效果的研究结果图。左图显示了肿瘤体积和肿瘤重量的测量结果，右图显示了在裸鼠中形成的肿瘤的外观。
图17是显示GEF-1/C组成寡肽的模式图。
图18A是显示GEF-1/C组成寡肽对B16细胞的SMAD转录活性的影响的测量结果的图。
图18B是显示GEF-1/C组成寡肽对COLO205细胞的SMAD转录活性的影响的测量结果的图。
图19是显示GEF-1/C组成寡肽对KOP细胞的管腔形成的影响的测量结果的图。
图20A是显示GEF-1/C组成寡肽对B16细胞在软琼脂培养基中的增殖的影响的测量结果的图。
图20B是显示GEF-1/C组成寡肽对HeLa细胞在软琼脂培养基中的增殖的影响的测量结果的图。
图20C是显示GEF-1/C组成寡肽对COLO205细胞在软琼脂培养基中的增殖的影响的测量结果的图。
图20D是显示GEF-1/C组成寡肽对KATOIII细胞在软琼脂培养基中的增殖的影响的测量结果的图。
图21A是显示GEF-1/C组成寡肽对A549细胞在软琼脂培养基中的增殖的影响的测量结果的图。
图21B是显示GEF-1/C组成寡肽对PT45细胞在软琼脂培养基中的增殖的影响的测量结果的图。
图22是显示使用B16细胞，GEF-1/C组成寡肽在体内抑制肿瘤增殖的效果的研究结果的图。左图显示了肿瘤体积和肿瘤重量的测量结果，右图显示了在裸鼠中形成的肿瘤的外观。
图23是显示使用COLO205细胞，GEF-1/C组成寡肽在体内抑制肿瘤增殖的效果的研究结果的图。左图显示了肿瘤体积和肿瘤重量的测量结果，右图显示了在裸鼠中形成的肿瘤的外观。
图24是显示使用A549细胞，GEF-1/C组成寡肽在体内抑制肿瘤增殖的效果的研究结果的图。左图显示了肿瘤体积和肿瘤重量的测量结果，右图显示了在裸鼠中形成的肿瘤的外观。
图25是显示EL4/C细胞在体外的增殖能力的测量结果的图。
图26是显示PT45/C细胞在软琼脂培养基中的增殖能力的测量结果的图。上图显示了集落形成的情况，下图显示了集落数的相对值的测量结果。
图27是显示COLO205/C细胞在软琼脂培养基中的增殖能力的测量结果的图。上图显示了集落形成的情况，下图显示了集落数的相对值的测量结果。
图28是显示使用COLO205细胞，结合了细胞膜透过肽的GEF-1/C组成寡肽(r9-OP10-11)在体内抑制肿瘤增殖的效果的研究结果的图。左图显示了肿瘤体积变化和肿瘤湿重的测量结果，右图显示了在裸鼠中形成的肿瘤的外观。
发明的具体实施方式
下面详细的说明本发明。下列实施方式是用于说明本发明的示例，本发明并非旨在限于这些实施方式。在不脱离其精神的条件下，本发明可以实施多种方式。此外，本说明书包含了作为本申请优先权基础的、于2010年6月25日提交的日本专利申请(特愿2010-144763号)的说明书和附图中记载的内容。
1、概述
半乳糖神经酰胺表达因子-1(GEF-1)是诱导半乳糖神经酰胺的表达的因子(Ogura，K.等人，J.Neurochem.，71，1827-1836，1998)。本发明人之前已经通过表达包含GEF-1的C区、且不含Q区的多肽，成功抑制了癌细胞的转移能力(特开2005-247735号公报)。另一方面，所述多肽没有显著抑制肿瘤增殖(同一公报)。
然而，本发明人再次研究了GEF-1对于肿瘤增殖的效果，结果发现GEF-1促进肿瘤增殖。此外，研究了GEF-1对血管形成的效果，结果发现GEF-1还促进血管形成。针对GEF-1的C区的效果的研究结果发现，通过表达GEF-1的C区或其组成寡肽，可以抑制肿瘤增殖和血管形成。此外发现，通过使用抑制GEF-1表达的物质抑制GEF-1的表达，可以抑制肿瘤增殖和血管形成。基于上述结果，GEF-1的C区多肽、其组成多肽以及抑制GEF-1表达的物质，兼具抑制癌细胞转移、抑制血管形成和抑制肿瘤增殖这3种效果，显示作为抗肿瘤剂是非常有效的。此外，本发明的抗肿瘤剂不仅通过抑制肿瘤血管形成从而间接的抑制癌细胞转移和肿瘤增殖，还通过抑制癌细胞自身的迁移性而直接抑制癌转移，而且通过抑制与癌细胞的肿瘤增殖相关的转录因子的表达从而直接抑制肿瘤增殖。因此，本发明的抗癌剂可以发挥上述3种效果的协同效果，对于治疗癌症或肿瘤是非常有效的。
2、半乳糖神经酰胺表达因子-1
(1)半乳糖神经酰胺表达因子-1的功能
GEF-1具有使GalCer及其硫酸化衍生物硫苷酯(sulfatide)在源自上皮细胞的MDCK细胞中高度表达的功能。此外，还具有在MDCK细胞中诱导上皮细胞-间充质细胞转换(Epithelial-Mesenchymal Transition(EMT))，使其变为成纤维细胞样形态的功能。上皮细胞-间充质细胞转换(EMT)是指由Wnt等信号诱导的在胚胎形态建成初期必需的过程，是与癌细胞转移中的浸润和血管内迁移有极大关系的过程(Bean，A.等人，Nature，385，826-829，1997)。实际上，已知在作为癌细胞的小鼠黑素瘤B16细胞中表达GEF-1时，促进癌细胞的转移。此外，GEF-1具有诱导血管形成作用和肿瘤增殖作用。
(2)GEF-1多肽
本发明中使用的GEF-1多肽没有特殊的限制，可以源自大鼠、人、小鼠中的任一种。大鼠GEF-1是小鼠或人的HGF调节酪氨酸激酶底物(下文称为“Hrs”或“Hgs”)的同源物。大鼠GEF-1和小鼠Hrs、大鼠GEF-1和人Hrs、小鼠Hrs和人Hrs的氨基酸序列同源性如下。
(a)大鼠GEF-1和小鼠Hrs的氨基酸序列同源性为97%，
(b)大鼠GEF-1和人Hrs的氨基酸序列同源性为93%，
(c)小鼠Hrs和人Hrs的氨基酸序列同源性为93%。
因此，本发明中使用的GEF-1多肽涵盖源自大鼠的GEF-1多肽、源自人的Hrs多肽、源自小鼠的Hrs多肽。
源自大鼠、源自人、源自小鼠的GEF-1(Hrs)多肽的氨基酸序列分别用序列号2、4、6显示。此外，编码源自大鼠、源自人、源自小鼠的GEF-1的多核苷酸的碱基序列分别用序列号1、3、5显示。上述碱基序列和氨基酸序列都登录在GenBank中。各种GEF-1(Hrs)的碱基序列和氨基酸序列的GenBank登录号如下所示。
大鼠GEF-1(序列号1、2)：AB002811，
人Hrs(序列号3、4)：U43895，
小鼠Hrs(序列号5、6)：D50050。
用于本发明中的GEF-1多肽涵盖由上述序列号2、4或6所示氨基酸序列组成的多肽以外，还包括由在序列号2、4或6所示氨基酸序列中缺失、取代或添加(或其组合)1个或多个氨基酸而变异成的氨基酸序列组成，且具有诱导血管形成作用或肿瘤增殖作用的多肽。
在上述序列号2、4或6所示氨基酸序列中，缺失、取代或添加(或其组合)1个或多个氨基酸而变异成的氨基酸序列可列举例如：
(i)序列号2、4或6所示氨基酸序列中的1-10个(例如，1-5个，优选1-3个，更优选1-2个，更优选1个)氨基酸缺失而成的氨基酸序列，
(ii)序列号2、4或6所示氨基酸序列中的1-10个(例如，1-5个，优选1-3个，更优选1-2个，更优选1个)氨基酸被其他的氨基酸取代而成的氨基酸序列，
(iii)在序列号2、4或6所示氨基酸序列中添加1-10个(例如，1-5个，优选1-3个，更优选1-2个，更优选1个)氨基酸而成的氨基酸序列，
(iv)由所述(i)-(iii)组合而成的变化的氨基酸序列等。
在本发明中，“诱导血管形成作用”意指在体外诱导管腔形成的作用，或在体内诱导血管形成的作用。此外，“肿瘤增殖作用”意指促进癌细胞增殖的作用。
此外，“具有诱导血管形成作用或肿瘤增殖作用”意指，与将具有序列号2、4或6所示氨基酸序列的多肽的诱导血管形成作用或肿瘤增殖作用作为100时相比，具有10%以上、20%以上、30%以上、40%以上、50%以上、60%以上、70%以上、80%以上，优选90%以上的活性。
诱导血管形成的作用可以通过公知的方法，例如使MDCK细胞表达突变多肽，针对相比于对照MDCK细胞而言管腔形成能力是否亢进来进行实验从而确定。此外，使用在小鼠背部皮下诱导血管形成的实验(DAS方法)，通过测量血管长度和血管面积，可以测量诱导血管形成的作用。此外，可以使得在任何癌细胞中表达突变多肽，通过用公知的方法测量肿瘤的增殖量，测量肿瘤增殖作用。
作为为了制备具有上述突变的多肽而将突变导入到多核苷酸中的方法，可以使用利用了Kunkel法或Gapped duplex法等位点特异性突变诱发方法的导入突变试剂盒，例如QuikChangeTM定点诱变试剂盒(Stratagne公司生产)、GeneTailorTM定点诱变系统(Invitrogen公司生产)、TaKaRa定点诱变系统(Mutan-K、Mutan-Super Express Km等：TaKaRa Bio公司生产)等。此外，可以使用Molecular Cloning，A Laboratory Manual，第2版(Cold Spring HarborPress(1989))；Current Protocols in Molecular Biology(John Wiley&Sons(1987-1997))；Kunkel(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA82：488-92；Kramer和FritZ(1987)Method.Enzymol.154：350-67；Kunkel(1988)Method.Enzymol.85：2763-6等记载的位点特异性诱变法等方法。
此外，用于本发明中的GEF-1多肽涵盖上述序列号2、4或6所示氨基酸序列，还包括具有与序列号2、4或6所示氨基酸序列有约85%以上，优选约90%以上，更优选约93%以上的同源性的氨基酸序列，且具有诱导血管形成作用或肿瘤增殖作用的多肽(与序列号2、4、6所示氨基酸序列实质上相同的氨基酸序列)。同源性可以在利用因特网的同源性检索网址(例如日本DNA数据库(DDBJ))中，利用FASTA、BLAST、PSI-BLAST等同源性检索。此外，可以在国家生物学信息中心(National Center for Biotechnology Information(NCBI))中，利用BLAST进行检索。
(3)编码GEF-1的多核苷酸
如上所述，大鼠GEF-1是小鼠或人Hrs的同源物。因此，编码本发明的GEF-1的多核苷酸涵盖编码Hrs的多核苷酸，例如编码人和小鼠Hrs的多核苷酸(序列号3和5)，还包括编码由序列号4和6所示氨基酸序列组成的人和小鼠Hrs的多肽的多核苷酸。此外，还包括编码大鼠Hrs的多核苷酸。
在本发明中，就编码GEF-1的多核苷酸而言，除了序列号1、3或5所示碱基序列之外，只要是包含编码上述GEF-1多肽的碱基序列的多核苷酸即可，也没有特殊的限制。例如，除了编码由序列号2、4或6所示氨基酸序列组成的多肽的多核苷酸以外，编码下述多肽的多核苷酸也可用于本发明中，该多肽是由在序列号2、4或6所示氨基酸序列中缺失、插入、取代或添加1个或多个氨基酸而成的氨基酸序列组成的突变多肽、且是具有诱导血管形成作用或肿瘤增殖作用的多肽。
在本文中，“多核苷酸”是指由多个脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)等碱基或碱基对组成的聚合物，包括DNA、cDNA、基因组DNA、化学合成DNA和RNA。此外，还包括必要时含有非天然的人工碱基的多核苷酸。
编码本发明的GEF-1的多核苷酸包括由序列号1、3或5所示碱基序列组成的多核苷酸，或者是与由下列碱基序列组成的多核苷酸在严格条件下杂交、且编码具有抑制肿瘤增殖作用的多肽的多核苷酸，所述碱基序列是与序列号1、3或5所示碱基序列互补的碱基序列。这样的多核苷酸可以以由序列号1、3或5所示碱基序列组成的多核苷酸或其片段作为探针，通过集落杂交、噬斑杂交、Southern印记等公知的杂交方法，由人的cDNA文库或基因组文库获得。制备cDNA文库的方法可参见Molecular Cloning，A Laboratory Manual，第2版(Cold Spring Harbor Press(1989))。此外，也可以使用市售的cDNA文库或基因组文库。
在本发明的杂交条件中，作为严格条件，可列举例如“2×SSC、0.1%SDS、25℃”、“1×SSC、0.1%SDS、25℃”、“0.2×SSC、0.1%SDS、42℃”，作为更严格的条件，可列举例如“0.1×SSC、0.1%SDS、68℃”等条件。除上述缓冲液的盐浓度、温度等条件外，本领域技术人员可以增加其他的各种条件如探针浓度、探针长度、反应时间等，来设定用于获得编码本发明的GEF-1基因的多核苷酸的条件。
杂交方法的详细步骤可参见Molecular Cloning，A Laboratory Manual，第2版(Cold Spring Harbor Press(1989)；特别是9.47-9.58章节)；Current Protocolsin Molecular Biology(John Wiley&Sons(1987-1997)；特别是6.3-6.4章节)等。
本发明的多核苷酸的碱基序列可以通过常用的序列确定方法来确定。例如可以通过双脱氧核苷酸链终止测序法(Sanger等人，(1977)Proc.Natl.Acad.Sci.USA74：5463)等进行。此外，还可以使用适当的DNA测序仪(例如，ABIPRISM(Applied Biosystem公司))来解析序列。
3、GEF-1的C区和Q区
(1)GEF-1的C区和Q区的功能
GEF-1蛋白质，如图1所示，是由自氨基末端依次是具有锌指序列(FYVE)的区域(Z)、富含脯氨酸的区域(P)、卷曲-卷曲序列区域(C)和富含脯氨酸2/谷氨酰胺的区域(Q)这4个区域组成的蛋白质。
至少含有GEF-1的C-Q区的多肽具有诱导EMT的能力，而不含Q区但含有C区的多肽(例如，ZPC、PC、C)具有抑制EMT诱导的活性。此外，在使用了transwell小室的体外细胞迁移实验中，表达全长GEF-1(ZPCQ)的细胞，迁移能力增加，另一方面，采用缺少Q区且含有C区的GEF-1突变体(ZPC、PC、C)时，其迁移能力则显著降低，特别是表达C区的细胞，迁移能力显著降低(特开2005-247735号公报)。
进一步的，如后文实施例记载的，GEF-1的C区的多肽抑制癌细胞的转移。
因此，在去除了GEF-1的Q区的多肽中、至少含有C区的多肽，即，GEF-1的ZPC区，优选PC区，更优选C区的多肽，具有抑制癌细胞转移的作用。此外，GEF-1的C区的多肽，具有抑制血管形成作用和抑制肿瘤增殖作用。
(2)在去除了GEF-1的Q区的多肽中、至少含有C区的多肽
在本发明中，“在去除了半乳糖神经酰胺表达因子-1的Q区的多肽中、至少含有C区的多肽”表示，不含GEF-1的Q区，且含有C区的多肽。作为这样的多肽，除GEF-1的C区的多肽(GEF-1/C)外，还可列举在C区的氨基末端侧含有P区的全长或一部分的多肽(GEF-1/PC)、在PC区的氨基末端侧含有Z区的全长或一部分的多肽(GEF-1/ZPC)，优选C区的多肽(GEF-1/C)。
基于下表1和上述的突变体制备方法，本领域技术人员可以容易的制备GEF-1/ZPC、GEF-1/PC和GEF-1/C的各个多肽及其突变体。序列号2、序列号4和序列号6所示氨基酸序列中的Z、P、C和Q区的位置显示在下表1中。[表1]GEF-1/Hrs的全长氨基酸序列中的Z、P、C和Q区的位置
Z P C Q
大鼠(序列号2) 1-233 234-390 391-562 563-771
人(序列号4) 1-233 234-390 391-563 564-777
小鼠(序列号6) 1-233 234-390 391-561 562-775
(3)编码在去除了GEF-1的Q区的多肽中至少含有C区的多肽的多核苷酸
作为编码上述(2)记载的多肽的多核苷酸，可列举编码GEF-1/C、GEF-1/PC、GEF-1/ZPC的多核苷酸。基于下表2和上述杂交方法，本领域技术人员可以容易的制备这些多核苷酸及其突变体。序列号1(大鼠GEF-1)、序列号3(人Hrs)和序列号5(小鼠Hrs)的碱基序列中的Z、P、C和Q区的位置如下表2所示。
[表2]编码Z、P、C和Q区的多核苷酸的位置
Z P C Q
大鼠(序列号1) 21-719 720-1190 1191-1706 1707-2333
人(序列号3) 76-774 775-1245 1246-1764 1765-2406
小鼠(序列号5) 37-735 736-1206 1207-1719 1720-2361
4、GEF-1的C区多肽
(1)GEF-1的C区多肽(GEF-1/C)
在本发明中，在去除了GEF-1的Q区的多肽中、至少含有C区的多肽，包括GEF-1的C区多肽。
GEF-1的C区多肽具有抑制癌细胞转移作用、抑制血管形成作用和抑制肿瘤增殖作用。
作为GEF-1的C区多肽，可列举由序列号8(大鼠GEF-1/C)、序列号10(人Hrs/C)或序列号12(小鼠Hrs/C)所示氨基酸序列组成的多肽。
此外，作为GEF-1的C区多肽，除上述由序列号8、10或12所示氨基酸序列组成的多肽以外，还包括由在序列号8、10或12所示氨基酸序列中缺失、取代或添加(或其组合)1个或多个氨基酸而变异成的氨基酸序列组成，且具有诱导血管形成作用或肿瘤增殖作用的多肽。
作为在上述序列号8、10或12所示氨基酸序列中，缺失、取代或添加(或其组合)1个或多个氨基酸而变异成的氨基酸序列，可列举例如：
(i)序列号8、10或12所示氨基酸序列中的1-10个(例如，1-5个，优选1-3个，更优选1-2个，更优选1个)氨基酸缺失而成的氨基酸序列，
(ii)序列号8、10或12所示氨基酸序列中的1-10个(例如，1-5个，优选1-3个，更优选1-2个，更优选1个)氨基酸被其他的氨基酸取代而成的氨基酸序列，
(iii)在序列号8、10或12所示氨基酸序列中添加1-10个(例如，1-5个，优选1-3个，更优选1-2个，更优选1个)氨基酸而成的氨基酸序列，
(iv)由所述(i)-(iii)组合而变异成的氨基酸序列等。
本发明中涉及诱导血管形成作用和肿瘤增殖作用的说明和测量方法与上述相同。此外，向为了制备具有上述突变的多肽的多核苷酸中导入突变的方法也与上述相同。
GEF-1的C区多肽涵盖序列号8、10或12所示氨基酸序列，还包括与序列号8、10或12所示氨基酸序列具有约85%以上，优选约90%以上，更优选约95%以上的同源性的氨基酸序列，且具有抑制血管形成作用或抑制肿瘤增殖作用的多肽(与序列号8、10或12所示氨基酸序列实质上相同的氨基酸序列)。同源性的检索方法与上述相同。
(2)编码GEF-1的C区多肽(GEF-1/C)的多核苷酸
在本发明中，编码GEF-1/C的多核苷酸涵盖序列号7、9或11所示碱基序列，还包括只要是包含编码GEF-1的C区多肽的碱基序列的多核苷酸即可，没有特殊的限制。例如，除编码由序列号8、10或12所示氨基酸序列组成的多肽的多核苷酸以外，编码下述多肽的多核苷酸也可以用于本发明中，所述多肽为由在序列号8、10或12所示氨基酸序列中缺失、取代或添加1个或多个氨基酸而成的氨基酸序列组成的突变多肽、且具有诱导血管形成作用或肿瘤增殖作用。
编码本发明的GEF-1/C的多核苷酸包括，由序列号7、9或11所示碱基序列组成的多核苷酸，或是与由下列碱基序列组成的多核苷酸在严格条件下杂交、且编码具有抑制血管形成作用或抑制肿瘤增殖作用的多肽的多核苷酸，所述碱基序列是与序列号7、9或11所示碱基序列互补的碱基序列。这样的多核苷酸可以基于由序列号7、9或11所示碱基序列组成的多核苷酸，通过公知的方法而获得。此外，上述杂交条件和碱基序列的确定方法与上述相同。
5.GEF-1的C区的组成寡肽(GEF-1/C组成寡肽，GEF-1/C constituentoligopeptides)
由于GEF-1的C区多肽具有抑制癌细胞转移作用、抑制血管形成作用和抑制肿瘤增殖作用，因此考虑它的一部分的多肽也具有相同的作用。实际上，如后述实施例中记载的，GEF-1的C区的组成寡肽具有抑制癌细胞转移作用、抑制血管形成作用和抑制肿瘤增殖作用。
因此，用于本发明的多肽涵盖在去除了GEF-1的Q区的多肽中至少包含C区或其一部分的多肽。此处，“其一部分”表示C区的一部分，对于其氨基酸序列的长度没有特殊的限制。此外，本发明中的“多肽”还包括氨基酸残基数为2-20的寡肽。
作为包含C区的一部分的多肽，可列举例如，包含序列号8、10或12所示氨基酸序列中至少6个连续的氨基酸残基以上，优选8个氨基酸残基以上，更优选10个氨基酸残基以上的氨基酸残基的多肽。更具体而言，可列举包含序列号8、10或12所示氨基酸序列中连续的6-140个氨基酸残基，优选8-30个氨基酸残基，更优选8-20个氨基酸残基，进一步优选10个氨基酸残基的多肽。
此外，作为“C区的一部分”而选择的氨基酸序列的范围，只要是在序列号8、10或12所示氨基酸序列的范围内即可，没有特殊的限制，例如，在序列号10所示氨基酸序列的情况下，优选第33位(甲硫氨酸)-第172位(丙氨酸)的氨基酸序列，更优选第83位(赖氨酸)-第152位(谷氨酸)的氨基酸序列。此外，对于序列号8或12所示氨基酸序列，也可以选择与此相对应的范围的氨基酸序列作为C区的一部分。
进一步的，作为C区的一部分的氨基酸序列，可列举例如包含以下任一项氨基酸序列的序列，但不限于此。
OP20-1：MKSNHMRGRSITNDSAVLSL（序列号44）
OP20-2：ITNDSAVLSLFQSINTMHPQ（序列号45）
OP20-3：FQSINTMHPQLLELLNQLDE（序列号46）
OP20-4：LLELLNQLDERRLYYEGLQD（序列号47）
OP20-5：RRLYYEGLQDKLAQIRDARG（序列号48）
OP20-6：KLAQIRDARGALSALREEHR（序列号49）
OP20-7：ALSALREEHREKLRRAAEEA（序列号50）
OP20-8：EKLRRAAEEAERQRQIQLAQ（序列号51）
OP20-9：ERQRQIQLAQKLEIMRQKKQ（序列号52）
OP20-10：KLEIMRQKKQEYLEVQRQLA（序列号53）
OP20-11：EYLEVQRQLAIQRLQEQEKE（序列号54）
OP20-12：IQRLQEQEKERQMRLEQQKQ（序列号55）
OP20-13：RQMRLEQQKQTVQMRAQMPA（序列号56）
OP10-1：MGRGSGTFER（序列号57）
OP10-3：FQSINTMHPQ（序列号58）
OP10-6：KLAQIRDARG（序列号59）
OP10-7：ALSALREEHR（序列号60）
OP10-8：EKLRRAAEEA（序列号61）
OP10-9：ERQRQIQLAQ（序列号62）
OP10-10：KLEIMRQKKQ（序列号63）
OP10-11：EYLEVQRQLA（序列号64）
OP10-12：IQRLQEQEKE（序列号65）
此外，在包含上述C区的一部分的多肽中，涵盖有由下述氨基酸序列组成、且具有抑制血管形成作用或肿瘤增殖抑制作用的多肽，所述氨基酸序列是在包含序列号8、10或12所示氨基酸序列中的连续的至少6-10个氨基酸残基的氨基酸序列中，缺失、取代或添加(或其组合)1个或多个氨基酸而变异成的氨基酸序列。在本文中，“多个”表示1-10个(例如，1-5个，优选1-3个，更优选1-2个，更优选1个)，当上述多肽中包含的氨基酸残基总数为20个左右时，表示1-5个，当上述多肽中包含的氨基酸残基总数为10个左右时，表示1-3个。
进一步的，在包含上述C区一部分的多肽中，涵盖有在由C区的一部分的氨基酸序列组成的肽或其突变体上添加(结合)了细胞膜透过性肽而成的多肽。
细胞膜透过性肽是高比例地含有赖氨酸残基或精氨酸残基的碱性肽，已知有HIV-1病毒来源的TAT蛋白质(转录蛋白的反式激活蛋白)等。细胞膜透过性肽中所含的碱性氨基酸残基的比例是例如30%-100%，优选100%。作为人工合成的细胞膜透过肽，已知有将7个残基至11个残基的精氨酸残基连接而成的细胞膜透过性肽。此外，细胞膜透过性肽中所含的精氨酸残基优选是D型。
细胞膜透过性肽可以添加于任何物质，添加有所述肽的物质可以透过细胞膜，移动到细胞内。
在本发明中，例如，透过将细胞膜透过性肽添加到上述由C区的一部分的氨基酸序列组成的肽上，可以使所述由C区的一部分的氨基酸序列组成的肽移动到靶细胞内。
例如，制备将含有9个D型精氨酸残基的细胞膜透过性肽(RRRRRRRRRGPG(序列号66))添加到上述由C区的一部分的氨基酸序列组成的肽OP10-11(EYLEVQRQLA)上而形成的多肽(RRRRRRRRRGPGEYLEVQRQLA(序列号67))，通过使所述多肽与靶细胞接触，可以将OP10-11导入到靶细胞内。
关于包含C区的一部分的多肽的诱导血管形成作用和肿瘤增殖作用的说明和测量方法，与上述相同。此外，向为了制备具有上述突变的多肽的多核苷酸中导入突变的方法也与上述相同。
此外，编码上述包含C区的一部分的多肽的多核苷酸，本领域技术人员可以根据上述包含C区的一部分的多肽的氨基酸序列信息和/或编码上述C区多肽的多核苷酸的碱基序列信息等，通过公知的方法可以容易的制备。
6、多肽的制备
去除了GEF-1的Q区的多肽中、至少包含C区或其一部分的多肽(下文称为“本发明的多肽”)，可以使用公知的方法制备，具体如下所述。
(1)制备表达载体
表达本发明的多肽的载体只要可以在表达宿主细胞中保持即可，没有特殊的限制，可列举例如，质粒DNA、噬菌体等。
作为质粒DNA，可列举例如pME18S、pcDNA3、pBR322、pUC18、pUC19、pUC118、pUC119、pBluescript等，也可以是源自大肠杆菌(E.coli)、源自枯草菌(Bacillus subtilis)、源自酵母等的其他质粒。作为噬菌体DNA，可列举λ噬菌体(Charon4A、Charon21A、EMBL3、EMBL4、λgt10、λgt11、)等。
将编码本发明的多肽的多核苷酸组入到载体中的方法，可采用用适当的限制酶切断后，使连接酶作用而连接的方法等(参见上述Molecular cloning，CSHL Press等)。
编码本发明的多肽的多核苷酸，例如，可以设计分别扩增Z、P、C各区域的多核苷酸的引物，用PCR法等扩增所述区域，然后使用限制酶或连接酶仅将所期望的部分连接到载体中。此外，也可以设计扩增目标部分的引物，用PCR法扩增，连接到载体中。
(2)转化
在本发明中使用的宿主，只要是在导入了编码包含GEF-1的C区等的多肽的基因后，表达包含GEF-1的C区等的多肽的宿主即可。可列举例如，哺乳动物细胞、双歧杆菌(bifidobacteria)、乳酸菌、大肠杆菌等细菌、昆虫细胞、酵母、霉菌等，但不限于此。
向宿主导入重组DNA的方法可以通过公知的方法进行。向宿主导入上述载体的方法可列举例如，磷酸钙法、DEAE-葡聚糖法、电穿孔法、阳离子性脂质法等。
此外，可以使用选择标记基因(例如，青霉素抗性基因、新霉素抗性基因、潮霉素抗性基因、四环素抗性基因、氯霉素抗性基因、卡那霉素抗性基因、零霉素抗性基因、杀稻瘟素抗性基因等)，来确认导入了DNA。
(3)多肽的产生
本发明的多肽，可以通过培养含有编码所述多肽的多核苷酸或其突变体的上述转化体，从其培养物中收集多肽来获得。
“培养物”表示培养上清液、培养细胞、培养菌体、或细胞或菌体的破碎物的任一种。本发明的转化体的培养，按照用于宿主培养的常规方法来进行。
在将导入有使用了诱导型转录启动子作为启动子的表达载体的重组体进行培养的情况下，需要时也可以向培养基中添加诱导剂。在诱导剂使用IPTG的情况下，IPTG的添加量可以是0.1～1.0mM，在开始培养后2～12小时后添加，添加后再继续培养1～12小时。
培养後、当本发明的多肽积累在菌体内或细胞内时，通过实施均浆化处理等来破碎菌体或细胞，收集目的多肽。当本发明的多肽在菌体外或细胞外产生时，直接使用培养液，或者是通过离心分离等去除菌体或细胞。之后，通过硫酸铵沉淀操作等，从前述培养液中收集多肽，需要时进一步使用各种层析等进行分离纯化。
此外，在本发明中，可以采用完全不使用活细胞的无细胞蛋白质合成体系，生产本发明的多肽。
无细胞蛋白质合成体系，是使用细胞提取液在试管等人工容器内合成蛋白质，例如读取mRNA的信息，在核糖体上合成蛋白质。此外，用于本发明中的无细胞蛋白质合成体系还包括以DNA为模板合成RNA的无细胞转录体系。
上述细胞提取液可以使用源自真核细胞或源自原核细胞的提取液，例如小麦胚芽、兔网织红细胞、小鼠L-细胞、HeLa细胞、CHO细胞、出芽酵母、大肠杆菌等的提取液。此外，这些细胞提取液可以是浓缩的和未浓缩的。
在本发明中，无细胞蛋白质合成可以使用市售的试剂盒。此类试剂盒可列举例如试药试剂盒PROTEIOSTM(東洋紡)、TNTTMSystem(Promega)、合成装置PG-MateTM(東洋紡)、RTS(Roche Diagnostics)等。
通过无细胞蛋白质合成而获得的本发明的多肽，可以如前所述选择适当的层析，进行纯化。此外，本发明的多肽的分离纯化，可以通过SDS-PAGE等来确认。
此外，本发明的多肽还可以由全长GEF-1等通过溴化氰或肽酶等的切割来获得。肽酶只要可以切割所述多肽即可，没有特殊的限制，可列举胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、赖氨酰内肽酶等。
(4)肽合成
本发明的多肽可以通过化学合成而获得。可以通过已知的方法，用Model433A肽合成仪(Applied Biosystems)、PSSM-8(島津製作所)等合成装置进行肽合成。此外，还可以通过委托林化成株式会等肽合成受托公司进行肽合成，购买获得本发明的多肽。同样也可以如此获得添加了细胞膜透过性肽的多肽。
7、抑制GEF-1表达的物质
(1)抑制GEF-1表达的物质
GEF-1促进癌转移、诱导血管形成且促进肿瘤增殖，因此，通过抑制所述GEF-1的表达，可以抑制这些作用。
抑制GEF-1表达的物质可列举例如，用于RNA干涉的核酸(microRNA、shRNA、siRNA)、反义核酸、诱杀核酸或适体等。通过这些抑制表达的物质，可以抑制GEF-1的表达。作为抑制对象的GEF-1基因的碱基序列如上所述是公知的，可以分别获得各自的序列信息。在本发明中，GEF-1基因的碱基序列是序列号1、3和5所示，不仅可以使用GEF-1的编码区，而且可以使用非编码区作为对象。
(2)RNA干涉
在本发明中，可以利用对GEF-1基因的RNA干涉(RNAi)来抑制表达。作为用于这样的RNAi的核酸，可列举例如siRNA、microRNA(miRNA)和shRNA。
siRNA(小干扰RNA)分子是与作为靶标的GEF-1基因相对应的各种RNA。作为这样的RNA，可列举mRNA、GEF-1基因的转录后修饰RNA等。
一般而言，mRNA上的靶序列可从与mRNA对应的cDNA序列中进行选择。但是，本发明中并不限于该区域。
siRNA分子可以根据本领域普遍已知的标准进行设计。例如，靶mRNA的靶片段，优选可以选择以AA、TA、GA或CA开始的连续15-30个碱基，优选19-25个碱基的片段。siRNA分子的GC比是30-70%，优选35-55%。
siRNA可以是作为由于产生双链部分而在自身的核酸上折叠的单链发夹RNA分子而产生。siRNA分子可以是通过普通的化学合成获得的，也可以是使用表达载体而生物学方法来生成。
将siRNA导入细胞内的方法，可以使用将合成的siRNA连接到质粒DNA中，将其导入细胞内的方法，将双链RNA退火的方法等。
此外，在本发明中，作为siRNA，也可以使用StealthTM RNAi、StealthTMSelect RNAi(invitrogen公司)等市售的siRNA。
此外，为了实现RNAi的效果，本发明也可以使用shRNA。shRNA是指短发夹RNA，由于单链的一部分区域与其他区域形成互补链，从而具有茎环结构的RNA分子。
可以设计shRNA的一部分形成茎环结构。例如，可以设计将某区域的序列作为序列A、与序列A互补的链作为序列B，按照序列A、间隔区(spacer)、序列B的顺序，将这些序列连接使得它们存在于一条RNA链中，总长度为45-60个碱基。间隔区的长度也没有特殊的限制。序列A是作为靶标的GEF-1基因的一部分区域的序列，靶区域没有特殊的限制，任何区域都可以候选。序列A的长度是19-25个碱基，优选19-21个碱基。
如上设计的shRNA，可以通过例如，以PCR法扩增作为shRNA的模板的多核苷酸，将所述多核苷酸导入到pSuperior.neo.gfp载体(oligoengine公司)等适当的shRNA表达用载体中，通过向以该shRNA表达载体作为对象的细胞中进行基因导入，从而来生产。
进一步的，本发明可以使用microRNA抑制GEF-1的表达。microRNA(miRNA)是存在于细胞内的长度为20-25个碱基左右的单链RNA，是已知具有调节其他基因表达的功能的ncRNA(非编码RNA)。miRNA是在RNA转录时经过加工产生的，作为形成抑制靶序列表达的发夹结构的核酸而存在。
miRNA也是基于RNAi的核酸，因此可以根据shRNA或siRNA而设计合成。
(3)反义核酸
在本发明的其他方式中，可以使用反义核酸抑制GEF-1表达。反义核酸是可以结合GEF-1基因的mRNA或DNA序列的单链核酸序列(RNA或DNA的任一种)。反义核酸序列的长度至少是14个核苷酸，优选14-100个核苷酸。反义核酸与上述基因序列结合形成双链，抑制GEF-1基因的转录或翻译。
可以使用本领域公知的化学合成方法或生物化学合成方法制备反义核酸。例如，可以使用利用了一般所采用的DNA合成装置的核酸合成法。反义核酸，例如，通过各种DNA转染或电穿孔等基因导入方法，而导入到表达GEF-1的癌细胞中。
(4)诱杀核酸(decoy nucleic acid)
在本发明的其他方式中，可以通过使用被称为诱杀核酸的诱杀核酸，来抑制GEF-1的表达。
诱杀核酸是通过结合GEF-1基因抑制启动子活性，从而抑制GEF-1基因表达的核酸，意指包含转录因子的结合位点的短小诱杀核酸。将该核酸导入到细胞内时，转录因子结合到该核酸上。据此，竞争性地抑制转录因子向基因组结合位点的结合，结果抑制转录因子的表达。
本发明优选的诱杀核酸，可列举例如结合GEF-1基因的启动子的核酸，或结合GEF-1的mRNA或位于GEF-1上游的因子的启动子的核酸等。诱杀核酸可以根据GEF-1基因的启动子序列，按单链或双链设计。诱杀核酸的长度没有特殊的限制，可以是15-60个碱基，优选20-30个碱基。
诱杀核酸可以是DNA或RNA，也可以包含修饰的核酸。
可以使用本领域公知的化学合成方法或生物化学合成方法制备用于本发明的诱杀核酸。例如，可以使用利用了基因重组技术中常用的DNA合成装置的核酸合成法。此外，在分离或合成作为模板的碱基序列后，可以使用PCR方法或利用了克隆载体的基因扩增方法。进一步的，为了获得在细胞内更稳定的诱杀核酸，可以在碱基上添加烷基化、酰基化等化学修饰。
此外，使用了诱杀核酸时的启动子的转录活性的分析，可以采用常用的萤光素酶测定、凝胶迁移测定、RT-PCR等。用于这些测定的试剂盒也是市售的(例如promega的双重萤光素酶测定试剂盒)。
(5)适体
进一步的，本发明可以使用适体抑制GEF-1的表达。
适体是具有特异性结合靶标物质的能力的合成DNA或RNA分子和肽分子，可以在试管内短时间地化学合成。因此，以序列号1、3或5所示碱基序列为基准，或者通过体外选择法或SELEX法等已知的进化工学方法获得。
由于核酸适体在血液中被核酸酶快速的分解和去除，因此，必要时优选进行聚乙二醇(PEG)链等的分子修饰，延长半衰期。
8、抗肿瘤剂
本发明的多肽、表达所述多肽的载体和本发明制备的shRNA和siRNA，具有抑制癌转移、抑制血管形成作用和/或抑制肿瘤增殖作用。因此，含有上述物质的组合物可作为抗肿瘤剂使用。
本发明的抗肿瘤剂不仅可以通过抑制肿瘤血管形成而间接的抑制癌转移和抑制肿瘤增殖，而且可以通过抑制癌细胞的迁移性而抑制癌转移，还可以通过抑制与肿瘤增殖相关的转录因子表达而抑制肿瘤增殖。因此，本发明的抗肿瘤剂可以分别直接地抑制癌转移、抑制血管形成和抑制肿瘤增殖这三种作用，并进一步地，可以利用该协同效果来治疗肿瘤，这与公知的抗肿瘤剂相比，对于癌症治疗非常有效。
本发明中的“癌”或“肿瘤”是例如，实体癌，可列举脑瘤、食道癌、舌癌、肺癌、乳腺癌、胰腺癌、胃癌、小肠或十二指肠癌、大肠癌(结肠癌、直肠癌)、膀胱癌、肾癌、肝癌、前列腺癌、子宫癌、子宫颈癌、卵巢癌、甲状腺癌、胆嚢癌、咽喉癌、肉瘤(例如，骨肉瘤、软骨肉瘤、卡波氏肉瘤、肌肉瘤、血管肉瘤、纤维肉瘤等)、黑素瘤等；血液肿瘤可列举白血病(例如，慢性骨髄性白血病(CML)、急性骨髄性白血病(AML)、慢性淋巴性白血病(CLL)和急性淋巴性白血病(ALL))、淋巴瘤、多发性骨髓瘤(MM)等，但不限于此。
此外，本发明中的“血管形成”是指包括生理性血管形成和病理性血管形成这两者，优选是病理性血管形成。生理性血管形成是在有限的部位和时期观察到的血管形成，一般是被抑制的。另一方面，病理性血管形成是不受生物体控制机制的调控，无序进行的血管形成，是在癌或肿瘤、糖尿病视网膜病变、类风湿性关节炎、牛皮癣(psoriasis vulgaris)、动脉粥样硬化等中观察到的血管形成。
本发明中的病理性血管形成优选是肿瘤血管形成。
“转移”表示癌细胞通过血液或淋巴系统、或者在手术时，离开原发灶运输到其他部位，因而产生新的增殖灶。或者，“转移”是指“癌细胞传播，在不连续的部位形成新的增殖灶(即形成转移)的能力”(Hill，R.P，“Metastasis”，The Basic Science of Oncology，Tannock等人编辑，178-195(McGraw-Hill，NewYork，1992)。
本发明的抗肿瘤剂除了包括本发明的多肽、表达所述多肽的载体、本发明制备的shRNA或siRNA以外，还可以包括药学上可接受的载体。“药学上可接受的载体”是指适合作为抗肿瘤剂使用的任何载体(脂质体、脂质小囊泡、胶束等)、稀释剂、赋形剂、湿润剂、缓冲剂、悬浮剂、润滑剂、佐剂、乳化剂、崩解剂、吸收剂、防腐剂、表面活性剂、色素、香味剂或甜味剂。
本发明的抗肿瘤剂的剂型可以是注射剂、冻干制品、片剂、硬胶囊剂、软胶囊剂、颗粒剂、散剂、丸剂、糖浆、栓剂、巴布剂、软膏剂、乳膏、滴眼剂等。
本领域技术人员可以通过已知的任何方法，局部或全身的给予本发明的抗肿瘤剂。可以根据患者的年龄、体重、健康状态、性别、症状、给药途径、给药次数、剂型等因素改变给药量，具体可以由本领域技术人员根据给药程序来决定。例如，当作为片剂向成人给药本发明的抗肿瘤剂时，可以按一天1-5次，给予0.1μg-10g，优选1μg-1g，更优选10μg-100mg。
进一步的，当本发明的抗肿瘤剂作为基因治疗剂使用时，除通过注射本发明的抗肿瘤剂直接给药的方法外，还可以列举给予组入有核酸的载体的方法。上述载体可列举腺病毒载体、腺相关病毒载体、疱疹病毒载体、痘苗病毒载体、反转录病毒载体、慢病毒载体等，可以通过使用这些病毒载体而更有效地给药。
此外，也可以将本发明的抗肿瘤剂导入到脂质体等磷脂小泡中，给药这些小泡。通过脂质转染法将保持了siRNA或shRNA的小泡导入到设定的细胞中。然后，将所获得的细胞通过例如静脉内、动脉内等全身给药。还可以局部给药于脑等。例如，当向成人给药上述抗肿瘤剂时，每天可以给药0.1μg/kg-1000mg/kg，优选每天1μg/kg-100mg/kg。为了将siRNA或shRNA导入到靶组织或器官，可以使用市售的基因导入试剂盒(例如AdenoExpress：Clontech公司)。
进一步的，可以将表达本发明多肽的载体在双歧杆菌、乳酸菌、酵母、丝状菌等宿主中进行转化，将所述转化体作为抗肿瘤剂使用。双歧杆菌可列举长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)、两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)、短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)等。乳酸菌可列举乳酸杆菌属(Lactobacillus)、链球菌属(Streptoccoccus)、明串珠菌属(Leuconostoc)、片球菌属(Pediococcus)等。这些转化体可以直接使用，也可以适当的制剂化为上述剂型，作为本发明的抗肿瘤剂使用。
9、血管形成抑制剂和肿瘤增殖抑制剂
本发明的多肽、表达所述多肽的载体和本发明中制备的shRNA和siRNA，具有血管形成抑制作用和肿瘤增殖抑制作用。因此，包含上述物质的组合物可以作为血管形成抑制剂和肿瘤增殖抑制剂使用。关于本发明中的血管形成的说明，如上述“8、抗肿瘤剂”的记载所述。
本发明的血管形成抑制剂和肿瘤增殖抑制剂可以作为试剂或用于哺乳动物的治疗，可以根据上述“8、抗肿瘤剂”的记载，适当的选择其给药形态、添加物、给药途径、给药对象、给药量等。
10.癌细胞特性消除剂
本发明的多肽和表达所述多肽的载体具有消除癌细胞特性的作用。因此，包含上述物质的组合物可以作为癌细胞特性消除剂使用。在本发明中，“癌细胞特性”可列举例如，迁移性、转移性、诱导血管形成、不接触抑制地增殖特性、在软琼脂培养基中增殖(不依赖贴壁的增殖特性)等。
通过向癌细胞给予本发明的癌细胞特性消除剂，可以使癌细胞获得接触抑制的能力。在本文中，“接触抑制”是指正常细胞在增殖时，通过与物理障碍物接触或细胞之间接触，而一定程度的停止增殖。例如，在培养皿上培养动物细胞时，通过与物理障碍物或细胞之间接触，通过细胞膜，细胞骨架发生改变，细胞运动方向改变、或运动减少。此外，正常的成纤维细胞或正常的上皮细胞，与癌细胞不同，接种至培养皿的一整面时就停止增殖。即，正常细胞是细胞密度依赖性的增殖抑制，铺满时就停止增殖。因此，低细胞密度的状态再次接种时，可以再度增殖。与此相对，癌细胞的细胞密度即使达到铺满，也仍然继续增殖，直到氧或营养不足为止都持续增殖。即，接触抑制是正常细胞中可见的现象，是在癌细胞中没有的现象。因此，接触抑制的产生，表示癌细胞的特性消失。接触抑制包括接触抑制增殖和接触阻断(contactblocking)。
本发明的多肽(例如，由序列号8、10或12所示氨基酸序列组成的多肽等)及其突变体的癌细胞特性消失作用，可以通过公知的方法评价，例如，在癌细胞中导入本发明的多肽或表达载体，在培养皿中测量转化了的癌细胞是否是以细胞密度依赖性地抑制增殖，从而进行评价。
本发明的癌细胞特性消除剂可以作为试剂或用于哺乳动物的治疗，可以根据上述“8、抗肿瘤剂”的记载，适当的选择其给药形态、添加物、给药途径、给药对象、给药量等。
11.抑制血管形成的方法和抑制肿瘤增殖的方法
通过向哺乳动物或哺乳动物来源的细胞给药本发明的多肽、表达所述多肽的载体和本发明中制备的shRNA和siRNA，抑制GEF-1的表达，可以抑制血管形成和抑制肿瘤增殖。因此，通过本发明，提供了抑制血管形成的方法和抑制肿瘤增殖的方法。
可以根据上述“8、抗肿瘤剂”的记载，适当的选择用于本发明方法中的本发明多肽等的给药形态、添加物、给药途径、给药对象、给药量等。
下文通过实施例详细说明本发明，但本发明不限于这些实施例。
实施例1
GEF-1突变细胞的制备和转移性研究
1、细胞株
本实施例中使用的小鼠黑素瘤细胞株B16和Louis肺癌(LLC)细胞是自东北大学老年医学研究所医用细胞资源中心获得的，人大肠癌来源的细胞株COLO205、人肺癌细胞株A549、人胃癌来源的细胞株KATOIII和人子宫颈癌细胞株HeLa细胞是自独立行政法人理化学研究所生物资源中心(理研BRC)获得的。
作为人胰腺癌来源的细胞，使用PT45细胞(Egawa N.等人，VirchowsArch.1996429：59-68)，作为小鼠血管内皮细胞，使用KOP2.16细胞(ShimamuraM.等人，Int J Cancer.2004111：111-6)。
犬肾上皮来源的细胞株MDCK细胞和小鼠淋巴瘤来源的EL4细胞是自独立行政法人医药基盘研究所获得的。
各细胞在含有青霉素·链霉素和10%FBS(HyClone公司)的RPMI培养基(Invitrogen公司)中、在37℃、5%CO2的条件下进行了培养。
2、GEF-1突变细胞的制备
(1)GEF-1和缺失突变体的各表达载体的制备
使用包含GEF-1和各缺失突变体的限制酶EcoRI位点和FLAG表位序列的有义链引物(sense strand primer)、与包含限制酶NotI位点的反义链引物(antisense strand primer)，以GEF-1为模板进行PCR，制备了各突变体cDNA。GEF-1采用的是大鼠来源的。
PCR是在94℃变性30秒、60℃退火30秒、72℃延伸反应90秒至300秒的条件下，进行20个循环。作为引物，使用了以下有义引物、反义引物。
Z有义引物：
5'-TTGAATTCATGGACTACAAGGACGACGATGACAAGATGGGGCGAGGCAGCGGCACC-3'（序列号13）
P有义引物：
5'-TTGAATTCATGGACTACAAGGACGACGATGACAAGCCCCCAGAGTACCTGACCAGC-3'（序列号14）
C有义引物：
5'-TTGAATTCATGGACTACAAGGACGACGATGACAAGTTTAGTGAGCAGTACCAGAAC-3'（序列号15）
Q有义引物：
5'-TTGAATTCATGGACTACAAGGACGACGATGACAAGCCCTTGCCTTATGCCCAGCTC-3'（序列号16）
Z-反义引物：
5'-ATAGTTTATGCGGCCGCTAAGTGGTAGAGGCAGCTTT-3'（序列号17）
P-反义引物：
5'-ATAGTTTATGCGGCCGCTCAGGAAGTTATGGGCTGAGA-3'（序列号18）
C-反义引物：
5'-ATAGTTTATGCGGCCGCTAGGCACGCATCTGGACAGTCT-3'（序列号19）
Q-反义引物：
5'-ATAGTTTATGCGGCCGCTCAGTCGAAGGAGATGAGCTGGGT-3'（序列号20）
在确认了各扩增产物的序列后，将待EcoRI和NotI切割的片段导入到pcDNA3动物细胞表达载体(Invitrogen公司)的EcoRI-NotI位点中，制备了GEF-1和Q区缺失的突变体的各表达载体。
(2)GEF-1表达细胞和Q区缺失突变体表达细胞的制备
按公知的方法制备下列细胞(Patki，V.等人，Nature，394，433-434，1998)。具体而言，将如上所述制备的GEF-1(ZPCQ)或Q区缺失突变体(ZPC、PC、C区)的各表达载体与杀稻瘟素(blasticidin)选择基因表达载体(pSV2bsr载体)(Funakoshi公司)同时导入到各种细胞中，用杀稻瘟素(Funakoshi公司)选择(2mg/L)后，获得稳定表达的细胞，用有限稀释法克隆了各表达细胞。
a)表达GEF-1(ZPCQ区)的MDCK细胞(MDCK/GEF-1细胞)
b)表达GEF-1(ZPCQ区)的B16细胞(B16/GEF-1细胞)
c)表达Q区缺失突变体(ZPC、PC或C区)的MDCK细胞(MDCK/ZPC细胞、MDCK/PC细胞、MDCK/C细胞)
d)表达Q区缺失突变体(ZPC、PC或C区)的B16细胞(B16/ZPC细胞、B16/PC细胞、B16/C细胞)
e)表达C区的LLC细胞(LLC/C细胞)
f)表达C区的KOP2.16细胞(KOP/C细胞)
g)表达C区的PT45细胞(PT45/C细胞)
h)表达C区的COLO205细胞(COLO205/C细胞)
i)表达C区的EL4细胞(EL4/C细胞)
此外，作为对照，制备了同时导入了空载体和pSV2bsr载体的对照MDCK细胞(MDCK/bsr细胞)和对照B16细胞(B16/bsr细胞)。
(3)B16细胞的制备，该细胞表达针对GEF-1基因的shRNA
i)shRNA表达载体的制备
通过以下方法制备了3种shRNA(shRNA-74、shRNA-157、shRNA-207)表达载体。需要说明的是，“74”、“157”和“207”是开放读框(ORF)中的碱基序列中的编号，表示各shRNA的5’端的碱基序列中的编号。例如，在shRNA-74的情况下，Hgs74模板的5’端起第3位的鸟嘌呤(G)，相当于GEF-1基因的ORF中的第74位碱基。制备shRNA表达载体时，使用的GEF-1(Hrs/Hgs)基因是小鼠来源的。
用限制酶BglII和XhoI切割pSuperior.neo.gfp载体(oligoengine公司)，用BAP处理。
另一方面，用于导入pSuperior.neo.gfp载体的3种片段通过PCR而获得。PCR使用含有Hgs模板(200pmol)、Hgs有义引物(400pmol)、Hgs反义引物(400pmol)、专用的1x缓冲液、KOD DNA聚合酶(TOYOBO)2.5U、dNTP浓度0.2mM、MgCl2浓度1mM的反应溶液，在“95℃30秒-55℃30秒-68℃30秒”×24个循环＋“95℃30秒-55℃30秒-68℃7分”×1个循环的温度条件下进行。PCR所使用的各种Hgs模板、Hgs有义引物和Hgs反义引物如下所示。
Hgs74有义引物：
ATATAGATCTCCGGGAGTCCATTCTACAGAT（序列号21）
Hgs74反义引物：
GGTACCTCGAGTAAAAAGGGAGTCCA（序列号22）
Hgs74模板：
CCGGGAGTCCATTCTACAGATTTCAAGAGAATCTGTAGAATGGACTCCCTTTTTA（序列号23）
Hgs157有义引物：
ATATAGATCTCCGTTAATGATAAGAACC（序列号24）
HgS157反义引物：
GGTACCTCGAGCTTAAAAAGTTAATGAT（序列号25）
Hgs157模板：
CCGTTAATGATAAGAACCCACTTCAAGAGAGTGGGTTCTTATCATTAACTTTTTA（序列号26）
Hgs207有义引物：
ATATAGATCTCCGTCTGTGGTAAAGAACT（序列号27）
Hgs207反义引物：
GGTACCTCGAGCTTAAAAAGTCTGTGGT（序列号28）
Hgs207模板：
CCGTCTGTGGTAAAGAACTGTTTCAAGAGAACAGTTCTTTACCACAGACTTTTTA（序列号29）
在将上述PCR获得的3种片段纯化后，分别用限制酶BglII和XhoI切割，导入到用BAP处理过的pSuperior.neo.gfp载体中。
ii)表达shRNA的B16细胞的制备
将上述i)制备的各种shRNA表达载体基因导入到B16细胞中，用G418药物(1mg/ml)进行药物选择。最终通过克隆获得了表达各种shRNA的B16细胞(B16/shRNA-74细胞、B16/shRNA-157细胞和B16/shRNA-207细胞)。通过Western印迹法确定了各细胞的GEF-1表达量，用Boyden小室(Boydenchamber)研究了细胞的迁移能力。
结果是，3种细胞都能抑制Hgs表达以及细胞迁移能力80%以上。B16/shRNA-157细胞抑制Hgs表达以及细胞迁移能力95%，在3种细胞中表现出最高的抑制率。因此，将B16/shRNA-157细胞作为B16/shRNA细胞用于以下实验。
上述(2)和(3)制备的细胞中，B16/bsr细胞、B16/GEF-1细胞、B16/C细胞、B16/shRNA细胞和亲代B16细胞的形态如图2A所示。
如图2A所示，B16/GEF-1细胞比亲代B16细胞和B16/bsr细胞更加表现出成纤维细胞样形态，细胞-细胞间接触变少。另一方面，B16/C细胞和B16/shRNA细胞表现出细胞-细胞间接触多的形态。
上述结果显示，GEF-1的表达促进了B16细胞的迁移性，GEF-1的C区和shRNA的表达抑制了B16细胞的迁移性。
进一步的，研究了B16/GEF-1细胞、B16/C细胞、B16/shRNA细胞和B16细胞的转移能力。具体而言，向C57BL6小鼠尾静脉给予B16/GEF-1细胞、B16/C细胞、B16/shRNA细胞、B16细胞(1×106/0.2mL PBS)，在给予后的第21天，观察肺部转移。此外，还进行了HE染色。进一步的，计测从给予细胞起至个体死亡的天数，测定50%致死天数。
结果是，在从给予起21天后的小鼠中，B16/GEF-1细胞促进向肺转移，与此相对的，B16/shRNA和B16/C细胞表现出抑制向肺转移。特别是B16/C细胞表现出显著抑制向肺转移(图2B)。
此外，采用B16细胞、B16/bsr细胞时，50%生存天数为42天，与此相对的，采用B16/GEF-1细胞时，为25天，大幅减少了50%生存天数。与此相对，采用B16/C细胞时，50%生存天数是87天，增加为B16细胞和B16/bsr细胞的2倍以上。此外，采用B16/shRNA细胞时的50%生存天数也比B16细胞和B16/bsr细胞时大幅增加(图2C)。
根据上述结果显示，GEF-1的表达促进癌细胞转移，GEF-1的C区和shRNA的表达显著抑制了癌细胞的转移。
实施例2
GEF-1的C区多肽对血管形成效果的研究
1、体外的管腔形成实验
使用KOP2.16细胞作为血管内皮细胞，测定了稳定表达GEF-1的C区的KOP2.16细胞(KOP/C细胞)的管腔形成能力。
具体而言，将上述KOP2.16细胞和KOP/C细胞分别调整为一定的细胞数，接种至微型板的基质胶(Matrigel)上。培养18-48小时后，用倒立显微镜拍摄细胞的照片。由图像使用测量软件将管腔形成的状态打分，测定管腔形成能力。
结果是，小鼠血管内皮细胞(KOP2.16)时，形成了细胞集合的管腔形态，与此相对，使用KOP/C细胞时，管腔形成能力消失(图3A)。
此外，MDCK细胞是肾上皮来源的细胞，尽管不是血管内皮来源的细胞，但由于其表现出些许管腔形成能力，因此，使用MDCK细胞进行了与KOP细胞相同的管腔形成实验。
结果是，采用MDCK/GEF-1细胞时，显著促进了管腔形成能力。另一方面，采用MDCK/C细胞时，管腔形成能力完全消失(图3B)。
根据上述结果显示，含有GEF-1的C区的多肽，抑制血管形成中的管腔形成。
2、在体内诱导血管形成的实验
使用体内的背部皮下空气囊(dorsal air sac,DAS)法，研究了B16细胞的诱导血管形成的能力。DAS方法是用于研究肿瘤血管形成等病理性血管形成的方法。
将注入了各种细胞(B16细胞、B16/GEF-1细胞、B16/C细胞、B16/shRNA细胞)的小室(chamber)移植到小鼠的背部皮下，7天后摘除该室，然后用立体显微镜拍摄背部皮下。根据拍摄的图像，用测量软件将肿瘤细胞诱导发生的血管数量和面积打分，测量了管腔形成能力。
结果是，与B16细胞相比，采用B16/GEF-1细胞时，诱导血管形成的能力提高。另一方面，采用B16/C细胞和B16/shRNA细胞时，诱导血管形成的能力降低(图4)。
根据上述结果，在体外和体内两种情况下都显示出，GEF-1的表达诱导了癌细胞诱导性血管形成(病理性血管形成)和血管内皮细胞的血管形成。
此外还显示出，本发明中的多肽(含有GEF-1的C区的多肽)和抑制物质(针对编码GEF-1的多核苷酸的shRNA)，抑制了癌细胞诱导性血管形成和血管内皮细胞的血管形成。
实施例3
1、GEF-1C区多肽对肿瘤增殖影响的研究
(1)B16/C细胞和EL4/C细胞的体外增殖
使用B16细胞和EL4细胞的GEF-1突变细胞株，研究了GEF-1表达与肿瘤增殖的关联性。
用PBS洗净各种细胞(B16细胞、B16/GEF-1细胞、B16/C细胞、B16/shRNA细胞、EL4细胞、EL4/C细胞)后，用TrypLE Express(注册商标)(Invitrogen公司)分离细胞，再悬浮在Opti-MEM I(注册商标)低血清培养基(Opti-MEM I培养基、Invitrogen公司)中。用Countess(注册商标)测量悬浮液的细胞数。
结果显示，B16/GEF-1细胞、B16/shRNA细胞，与亲代B16细胞的增殖模式相同。这些细胞在细胞密度达到约3x106/cm2时全部死亡。
另一方面，B16/C细胞在细胞密度达到5x105/cm2时铺满，细胞增殖停止(图5)。以低细胞密度再次接种该B16/C细胞时，表现出与之前相同的增殖能力。此外，EL4细胞在细胞密度达到约9x105/cm2时全部死亡。另一方面，EL4/C细胞在细胞密度达到约6x105/cm2时铺满，细胞增殖停止。确认了EL4/C细胞也表现出细胞密度依赖性的细胞增殖停止(图25)。
根据上述结果显示，表达GEF-1的C区多肽的B16/C细胞和EL4/C细胞，具有可见于正常细胞中的细胞密度依赖性接触抑制增殖的能力，癌细胞特性消失。
(2)B16/C细胞的细胞增殖和细胞周期
为了研究GEF-1的C区多肽对细胞周期的影响，通过FACS法分析了B16/C细胞的细胞周期。具体而言，将使用CycleTest(注册商标)Plus试剂盒(BD公司)制备的细胞，通过FACScariver(Becton·Dickinson公司(下文称为BD公司))进行分析。
结果是，B16/C细胞在低细胞密度的增殖期的G1期：S期：G2/M期＝41：51：8，铺满时变为72：21：7，在其4周后，变为90：2：8(图6)。
根据上述结果显示，B16/C细胞表现出细胞密度依赖性的在G1期停止，成为G1停滞，增殖能力显著降低，癌细胞特性消失。
2、DNA微阵分析和分布图(profiling)解析
为了明确B16/GEF-1细胞、B16/shRNA细胞、B16/C细胞和B16细胞的细胞特性，从各细胞中提取mRNA，进行了DNA微阵(Agilent公司)分析。进一步的，使用解析软件KeyMolnet(医药设计研究所)，对上述数据进行了分布分析。
结果如下表所示。
根据上述结果显示，B16/GEF-1细胞、B16/shRNA细胞和B16/C细胞，与亲代B16细胞相比，SMAD途径和Rb/E2F途径的下游的蛋白质表达变化很大。
此外，根据上述结果显示，细胞内GEF-1表达量的变化，通过TGF-β-SMAD信号传导途径和Rb/E2F信号传导途径，对所述途径的下游的蛋白质表达产生影响。TGF-β-SMAD信号传导途径与细胞增殖、分化、凋亡关系较大。此外，Rb是与p53同样重要的抑癌基因产物。此外，Rb通过与E2F结合而具有控制细胞周期的功能。
因此，根据上述结果提示，通过调节GEF-1的表达量，可以调节TGF-β-SMAD信号传导途径和Rb/E2F信号传导途径，可以进一步控制或抑制肿瘤细胞的增殖。
需要说明的是，在使用了MDCK细胞的实验中，采用MDCK/GEF-1细胞时，SMAD7和Rb的表达降低，与此相对，采用MDCK/C细胞时，Rb表达增加，CyclinA，D、E、p53、c-Ski、CTGF(结缔组织生长因子)、HDAC4、ATM的表达降低。此外，采用MDCK/shRNA细胞时，c-Myc和c-Fos的表达增加，而Cyclin A、B、D、E和Aurora B的表达降低。
3、转录调节因子的活性分析
根据上述DNA阵列分析的结果提示，GEF-1表达量的变化可能影响SMAD转录因子或Rb转录因子的活性，因此，下文针对MDCK/GEF-1细胞和MDCK/C细胞中各转录因子的活性等进行了研究。
(1)MDCK/GEF-1细胞和MDCK/C细胞中，HGF和TGF-β对SMAD转录 活性的影响
使用pSmad RE-TK hRluc(F)和phRL-TK(均来自理研BRC)，测量了SMAD转录活性。pSmad RE-TK hRluc(F)是在TATA样启动子的上游具有各应答元件(顺式作用DNA序列)、在下游具有萤光素酶基因作为报道基因的载体。所述载体的模式图如图7所示。
将5.0x104个MDCK/GEF-1细胞和MDCK/C细胞分别接种到48孔板的各孔中。24小时后，用Opti-MEM培养基洗净细胞，向细胞中加入含有pSmad-RE-TK-hRluc(F)0.5μg和pGL4.13(Promega公司)0.05μg和Lipofectamin2000(Invitrogen公司)0.5μl的Opti-MEM培养基混合液(100μl)，导入基因。在CO2温箱中培养4小时后，加入0.4ml的Opti-MEM培养基。在导入基因24小时后，将培养基换为含有HGF(40ng/ml，PeproTech EC)或TGF-β(5ng/ml，PeproTech EC)的Opti-MEM培养基。在导入基因48小时后，用PBS洗净细胞，通过双重萤光素酶定量系统测量萤光素酶活性。
结果是发现，相比于MDCK细胞，MDCK/GEF-1细胞的SMAD转录活性是约570倍高。
确认了MDCK细胞的SMAD转录活性在加入HGF刺激时约2倍增强，与此相对的，在MDCK/GEF-1细胞中未发现进一步的增强。此外，加入TGF-β刺激时，MDCK细胞中的SMAD转录活性约11倍增强，MDCK/GEF-1细胞中的SMAD转录活性约6.4倍增强。
另一方面，MDCK/C细胞的SMAD转录活性比MDCK细胞的SMAD转录活性更加受抑制。进一步的，即使加入HGF刺激或TGF-β刺激，MDCK/C细胞中也完全没有发现SMAD转录活性的增强(图8)。
根据上述结果显示，使GEF-1的C区多肽表达，会抑制MDCK细胞的SMAD转录活性，且HGF刺激或TGF-β刺激的影响也变得没有了。
(2)MDCK突变细胞的转录因子活性
在上述研究中，与MDCK细胞相比，MDCK/GEF-1细胞中的SMAD转录活性增强，MDCK/C细胞中的SMAD转录活性被抑制。其中，测量了MDCK/GEF-1细胞和MDCK/C细胞中与各种信号传导途径相关的转录因子活性。
使用BD Pathway Profiling Luciferase System(BD公司)和BD PathwayProfiling Luciferase System4(BD公司)，测量Rb、p53等各种转录因子的转录活性。
结果显示，在各细胞中，在比SMAD下游的蛋白质的表达中，形成了增强和抑制的控制。特别是，MDCK/C细胞中的p53转录活性增强，Rb转录活性被抑制(图9)。Rb转录活性的降低，显示了E2F/Rb复合体的增加。
(3)B16突变细胞的转录因子活性
用与上述MDCK细胞相同的方法，测量B16/GEF-1细胞和B16/C细胞中与各种信号传导途径相关的转录因子活性。
结果是，与B16/GEF-1细胞中的SMAD转录活性增强相对的，B16/C细胞中的SMAD转录活性和Rb转录活性受抑制，p53转录活性增强(图10)。Rb转录活性的降低，显示了E2F/Rb复合体的增加。
如上所述，在MDCK/C细胞和B16/C细胞这两者中，Rb的转录活性降低，p53的转录活性增强。Rb的转录活性的降低，显示了Rb/E2F复合体形成的增加，促进细胞周期停滞在G1期。此外，p53的转录活性的增强，诱导p21表达，通过p21抑制Rb磷酸化，使细胞周期停止在G1期。
因此，根据上述结果显示，使GEF-1的C区多肽表达，会增强E2F/Rb复合体的形成和p53的表达，藉此使细胞周期停止在G1期，抑制细胞增殖。
(4)B16突变细胞的PAI-1启动子活性
已知μ纤溶酶原激活物抑制剂-1(PAI-1)是由SMAD转录因子诱导表达的。因此，通过测量PAI-1的启动子活性，测量了在MDCK/GEF-1细胞和MDCK/C细胞中的TGF-β-SMAD信号传导量。就PAI-1的启动子活性而言，使用与上述(1)相同的方法，通过双重萤光素酶定量系统测量了萤光素酶活性。图7显示了具有PAI-1的启动子的载体模式图。
结果是，与B16细胞相比，B16/GEF-1细胞中的PAI-1启动子活性约4倍增加，B16/C细胞中的PAI-1启动子活性减少至3/4(图11)。
根据上述结果显示，与B16细胞相比，B16/GEF-1细胞中的TGF-β-SMAD信号传导约4倍增强，B16/C细胞中的TGF-β-SMAD信号传导被抑制至3/4。
4、TGF-β表达量的测量
TGF-β-SMAD信号是细胞外TGF-β藉由存在于细胞表面的其受体、传递到细胞内的SMAD分子。然后，向细胞核内移动的SMAD分子与DNA结合，增强与TGF-β-SMAD信号传导对应的蛋白质的转录活性。此外，TGF-β分子本身也是受TGF-β-SMAD信号传导诱导表达的蛋白质，通过TGF-β-SMAD信号传导的亢进，它的蛋白质合成和向胞外释放也增强。因此，细胞培养液中的TGF-β量，与细胞的TGF-β-SMAD信号传导量成比例。
因此，使用Quantikine(注册商标)TGF-βELISA测量试剂盒(R&DSystems，Inc.)，测量、分析了细胞培养液中的TGF-β表达量。
结果是，在B16细胞和B16/GEF-1细胞培养基中，TGF-β的蛋白质量增加，在B16/C细胞和B16/shRNA细胞培养基中的减少(图12)。
因此，认为TGF-β-SMAD信号传导在B16细胞和B16/GEF-1细胞中增强，在B16/C细胞中则被抑制。B16/GEF-1细胞的培养基中的TGF-β量是B16细胞培养基的约2倍，因此认为B16/GEF-1细胞的TGF-β-SMAD信号传导量是B16细胞的约2倍增强。
5、体外软琼脂内的细胞增殖能力的测量
不依赖于贴壁的增殖能力是癌细胞的特性之一。正常(非癌)细胞只能依赖于贴壁进行增殖，而不能在软琼脂培养基中增殖。另一方面，癌细胞可以在软琼脂培养基中增殖，形成集落。因此，在软琼脂培养基中测量了各种细胞的增殖能力。
将溶解了0.5%(w/v)浓度的琼脂糖(低凝胶化温度制品)的细胞培养液1.5ml加入到35mmシャーレ培养皿中，冷却，凝胶化。将含有5.0x103个细胞的0.33%琼脂糖/细胞培养培养基1.5ml加到其上。在凝胶化以后，在CO2温箱中培养2周。在凝胶上添加0.005%(w/v)结晶紫水溶液0.5ml，温育过夜，进行细胞染色。用扫描仪拍摄35mmシャーレ培养皿，用图像解析软件测量图像中的集落数。
结果是，B16/GEF-1细胞在软琼脂培养基内的增殖能力是B16细胞的约2倍增强，B16/C细胞中降低至B16细胞的5%以下(图13A)。
使用相同的方法，测量了小鼠肺癌来源的LLC细胞的稳定表达GEF-1/C蛋白质的细胞株(LLC/C细胞)、人胰腺癌来源的细胞株PT45细胞的稳定表达GEF-1/C蛋白的细胞株(PT45/C细胞)和人大肠癌来源的细胞株COLO205细胞的稳定表达GEF-1/C蛋白的细胞株(COLO205/C细胞)在软琼脂培养基中的增殖能力。
其结果是，各种细胞在软琼脂培养基中的增殖能力是，在LLC/C细胞中降低至亲代LLC细胞的20%以下(图13B)。此外，在PT45/C细胞中降低至亲代PT45细胞的5%以下(图26)；在COLO205/C细胞中降低至亲代COLO205细胞的1%以下(图27)。
之后，测量了MDCK细胞在软琼脂培养基中的增殖能力。MDCK细胞是犬肾上皮细胞来源的细胞，没有癌变，保持了正常细胞样形态。因此，不能在软琼脂培养基中增殖。但是，MDCK细胞的稳定表达GEF-1蛋白质的细胞株(MDCK/GEF-1细胞)获得了在软琼脂培养基中增殖的能力(图13C)。
根据上述结果显示，在癌细胞B16细胞和LLC细胞中使GEF-1表达，会增强在软琼脂培养基中的增殖能力，在非癌细胞的MDCK细胞中使GEF-1表达，则获得了本来不具有的在软琼脂培养基中的增殖能力。另一方面，在B16细胞、LLC细胞、PT45/C细胞和COLO205/C细胞中使GEF-1的C区多肽表达，表现出在软琼脂培养基中的肿瘤增殖能力显著降低。
即，通过在B16细胞、LLC细胞、PT45/C细胞和COLO205/C细胞中使GEF-1的C区多肽表达，这些细胞表现出失去了能够不依赖贴壁增殖这一癌细胞的特性。
6、体内肿瘤形成能力实验
将各种细胞(B16细胞、B16/GEF-1细胞、B16/C细胞、B16/shRNA细胞)分别移植到C57BL/6小鼠皮下，每1周测量肿瘤体积。
割去C57BL/6小鼠的毛，在皮下接种各种细胞(2.0x106细胞/0.2ml PBS)。每1周测量肿瘤的长径和短径，计算肿瘤体积(＝长径×(短径)2×π/6)。
结果是，B16/GEF-1细胞比B16细胞约2倍增强了C57BL/6小鼠皮下肿瘤形成能力。另一方面，B16/C细胞、B16/shRNA细胞的肿瘤形成能力都降低(图14A)。
根据上述结果，B16/GEF-1细胞表现出比B16细胞高的体内肿瘤形成能力。另一方面，B16/C细胞和B16/shRNA细胞都表现出受抑制的肿瘤形成能力。
进一步的，为了测量MDCK细胞和MDCK/GEF-1细胞在体内的肿瘤形成能力，将这些细胞(1.0x106细胞/0.2ml PBS)移植到裸鼠皮下。在移植4周后，用二氧化碳将小鼠安乐死，摘出肿瘤，测量了湿重。
结果是，由于MDCK细胞没有癌变，保持了正常细胞样形态，因而在裸鼠皮下没有形成肿瘤。另一方面，MDCK/GEF-1细胞在裸鼠皮下形成了肿瘤(图14B)。
在上述体内肿瘤形成能力实验中，在B16/GEF-1细胞和MDCK/GEF-1细胞中发现肿瘤增殖能力增强。此外，在B16/C细胞或B16/shRNA细胞中发现肿瘤增殖能力降低。根据上述结果显示，通过增加细胞内的GEF-1蛋白量，增强了肿瘤增殖能力，相反，通过抑制GEF-1蛋白量，抑制了肿瘤增殖能力。因此，通过控制GEF-1的表达和功能，可以控制癌细胞的肿瘤增殖能力。
此外，通过GEF-1的C区多肽的表达，降低了B16细胞和LLC细胞的肿瘤增殖能力，因此，本发明的多肽显示出抑制肿瘤的增殖。
实施例4
GEF-1相关小分子的制备
根据上述实施例3的结果可知，通过抑制GEF-1的表达量，或者通过表达GEF-1/C蛋白、抑制GEF-1的功能，可以抑制肿瘤增殖。
上述B16/shRNA细胞是在B16细胞中导入了干涉诱导载体，通过RNA干涉效果来抑制GEF-1表达量的细胞。此外，B16/C细胞是在B16细胞中导入了GEF-1/C蛋白质表达载体，诱导GEF-1/C蛋白表达的细胞。RNA干涉诱导载体和GEF-1/C蛋白质表达载体都是高分子，因此难以导入到人体内的癌细胞中，不易用于临床。
但是，如果是诱导RNA干涉的小分子siRNA或GEF-1/C区组成寡肽，可以更简单的导入、递送(DDS)到人体内的癌细胞中，也可期待用于临床。
在本文中，研究了通过以GEF-1为靶标的GEF-1相关小分子siRNA和GEF-1/C区组成寡肽来抑制肿瘤增殖的方法。
1、siRNA
作为以GEF-1为靶标的siRNA(GEF-1-siRNA)，委托Invitrogen公司合成了针对小鼠Hgs(NM＿008244)的siRNA(stealth RNAi)。6种siRNA(siRNA#1～6)和siRNA#3-scramble的碱基序列如下所示。此外，siRNA#3-scramble表示siRNA#3的乱序(scramble)siRNA，虽然与siRNA#3的碱基序列不同，但碱基的构成比例相等，是所使用的细胞或个体中不存在同源序列的RNA二聚体。siRNA#3-scramble作为siRNA#3的对照而使用。
siRNA#1
NM＿008244＿stealth＿1064
有义链：5'-ACCUCCACGUCUCUGUCGAUCGAUA（序列号30）
反义链：5'-UAUCGAUCGACAGAGACGUGGAGGU（序列号31）
siRNA#2
NM＿008244＿stealth＿677
有义链：5'-GGACGAUACUCGUCGACUUGUUCUU（序列号32）
反义链：5'-AAGAACAAGUCGACGAGUAUCGUCC（序列号33）
siRNA#3
NM＿008244＿stealth＿99
有义链：5'-UAGAAUGGACUCCCAGUCUGACUCC（序列号34）
反义链：5'-GGAGUCAGACUGGGAGUCCAUUCUA（序列号35）
siRNA#3scramble
NM＿008244＿stealth＿scramble＿99
有义链：5'-UAGCAAUAGGCACUCCGACUGUUCC（序列号36）
反义链：5'-GGAACAGUCGGAGUGCCUAUUGCUA（序列号37）
siRNA#4
NM＿008244＿stealth＿74
有义链：5'-AACAGAAGCUGGCUGGUGGCUUUGU（序列号38）
反义链：5'-ACAAAGCCACCAGCCAGCUUCUGUU（序列号39）
siRNA#5
NM＿008244＿stealth＿255
有义链：5'-AUCAUGGACUGUCUGGCCACAGUUC（序列号40）
反义链：5'-GAACUGUGGCCAGACAGUCCAUGAU（序列号41）
siRNA#6
NM＿008244＿stealth＿1026
有义链：5'-UUUCUUCUCCCAGUAGUUCCGGUUG（序列号42）
反义链：5'-CAACCGGAACUACUGGGAGAAGAAA（序列号43）
2、GEF-1/C组成寡肽
用于本实施例中的GEF-1/C组成寡肽是委托林化成株式会公司合成的。
GEF-1/C组成寡肽的模式图如图17所示。此外，合成了的寡肽的氨基酸序列如下所示。在下面所示的合成寡肽中，r9-OP10-11是在OP10-11肽上结合了细胞膜透过性肽(RRRRRRRRRGPG(R表示D型精氨酸)(序列号66))的肽。此外，下列的GEF-1/C组成寡肽是小鼠来源的，仅与人来源的寡肽在OP20-2的N端第16位(OP-20-3和OP10-3的N端第6位)的T(人的是G)不同，其他部分小鼠和人的相同。
OP20-1：MKSNHMRGRSITNDSAVLSL（序列号44）
OP20-2：ITNDSAVLSLFQSINTMHPQ（序列号45）
OP20-3：FQSINTMHPQLLELLNQLDE（序列号46）
OP20-4：LLELLNQLDERRLYYEGLQD（序列号47）
OP20-5：RRLYYEGLQDKLAQIRDARG（序列号48）
OP20-6：KLAQIRDARGALSALREEHR（序列号49）
OP20-7：ALSALREEHREKLRRAAEEA（序列号50）
OP20-8：EKLRRAAEEAERQRQIQLAQ（序列号51）
OP20-9：ERQRQIQLAQKLEIMRQKKQ（序列号52）
OP20-10：KLEIMRQKKQEYLEVQRQLA（序列号53）
OP20-11：EYLEVQRQLAIQRLQEQEKE（序列号54）
OP20-12：IQRLQEQEKERQMRLEQQKQ（序列号55）
OP20-13：RQMRLEQQKQTVQMRAQMPA（序列号56）
OP10-1：MGRGSGTFER（序列号57）
OP10-3：FQSINTMHPQ（序列号58）
OP10-6：KLAQIRDARG（序列号59）
OP10-7：ALSALREEHR（序列号60）
OP10-8：EKLRRAAEEA（序列号61）
OP10-9：ERQRQIQLAQ（序列号62）
OP10-10：KLEIMRQKKQ（序列号63）
OP10-11：EYLEVQRQLA（序列号64）
OP10-12：IQRLQEQEKE（序列号65）
r9-OP10-11:RRRRRRRRRGPGEYLEVQRQLA（序列号67）
实施例5
GEF-1相关小分子所致的抑制血管形成和抑制肿瘤增殖
1、通过siRNA抑制血管形成和抑制肿瘤增殖
(1)siRNA对血管形成的抑制的研究
为了确定GEF-1-siRNA在体外抑制血管形成的效果，使用血管内皮KOP2.16细胞进行了管腔形成抑制实验。
将siRNA(40nmol)与Lipofectamine200010μl混合后，用Opti-MEM I培养基稀释至1.0ml，向用Opti-MEM I培养基洗净了的35mmシャーレ培养皿中加入KOP2.16细胞。4小时后，向培养皿中加入含有20%FBS的Opti-MEMI培养基1.0ml。在48小时后，回收siRNA导入细胞，计算测量细胞数后，悬浮在Opti-MEM I培养基中，再接种在基质胶上。在18-48小时后，观察细胞的管腔形成。作为阴性对照，使用PBS(图15中的“None”)和Stealth RNANegative Control Medium GC Duplex(Invitrogen公司)(图15中的“siRNA-MNC”)。
结果是，在6种siRNA中，确认了siRNA#2和siRNA#3有显著的抑制管腔形成的效果(图15)。
根据上述结果可知，上述siRNA通过抑制GEF-1的表达，表现出抑制血管形成的效果。
(2)siRNA的抑制肿瘤增殖研究
进一步的，研究上述(1)中抑制管腔形成的效果最好的siRNA#3的肿瘤增殖抑制效果。
在裸鼠皮下接种B16细胞，约1周后当肿瘤直径达到约5mm(约100mm3)时，在肿瘤周围注入siRNA#3/atelocollagen混合液(0.2ml)。之后，每1周在肿瘤周围进一步2次注入siRNA#3/atelocollagen混合液。
结果是，给予了siRNA#3的情况与给予了PBS或siRNA#3的scramblesiRNA(siRNA#3-scramble)的情况相比，可以将肿瘤体积和肿瘤重量抑制到50%或更低(图16)。
根据上述结果可知，上述siRNA通过抑制GEF-1的表达，表现出在体内抑制肿瘤增殖的效果。
2.GEF-1/C组成寡肽对血管形成和肿瘤增殖的抑制
(1)GEF-1/C组成寡肽对SMAD转录活性的影响
首先，研究了GEF-1/C组成寡肽对TGF-β-SMAD信号传导中的SMAD转录活性的影响。TGF-β-SMAD信号传导途径与血管形成和癌细胞转移有很大关系。
将GEF-1/C组成寡肽2.5nmol和肽·转运分子Wr-T0.2nmol混合后，用PBS稀释至0.1ml，与用于SMAD转录活性实验的DNA溶液0.1ml混合。向用Opti-MEM I培养基洗净了的48孔板的每孔的各种细胞(B16细胞和COLO205细胞)中加入混合液0.2ml。4小时后，向各孔加入20%FBS/Opti-MEM I培养基0.2ml。48小时后，裂解各种细胞，测量裂解液中的萤光素酶活性。
结果是，在B16细胞中，GEF-1/C组成寡肽OP10-7、OP10-11和OP10-12约50%地抑制SMAD转录活性(图18A)。
此外，在人大肠癌COLO205细胞中，OP10-6～OP10-12约35%至70%地抑制SMAD转录活性(图18B)。
(2)GEF-1/C组成寡肽抑制血管形成的研究
为了确定GEF-1/C组成寡肽在体外对血管形成的抑制效果，使用血管内皮KOP2.16细胞进行了管腔形成抑制实验。
将GEF-1/C组成寡肽2.5nmol和肽·转运分子Wr-T0.2nmol混合后，用Opti-MEM I培养基稀释至0.1ml，添加到用Opti-MEM I培养基洗净了的48孔板的每孔的KOP2.16细胞中。2小时后，向各孔加入含有10%FBS的Opti-MEM I培养基0.4ml。48小时后，回收导入了GEF-1/C组成寡肽的细胞，计算测量细胞数之后，悬浮在Opti-MEM I培养基中。将该细胞接种在基质胶上。
结果是，OP10-10～OP10-12约50%地抑制管腔形成(图19)。
根据上述结果可知，上述GEF-1/C组成寡肽表现出抑制血管形成的效果。
(3)GEF-1/C组成寡肽在体外抑制肿瘤增殖效果的研究
研究了GEF-1/C组成寡肽对各种肿瘤细胞(B16细胞、HeLa细胞、COLO205细胞、KATO III细胞、A549细胞和PT45细胞)在软琼脂培养基内的增殖的抑制效果。
通过与上述(2)相同的方法，将GEF-1/C组成寡肽导入到各种肿瘤细胞中，将这些细胞与0.33%软琼脂培养基一起接种。
下面显示了各种细胞的结果。
a)小鼠黑素瘤B16细胞
OP10-6～OP10-12约30%以上地抑制了B16细胞在软琼脂培养基内的增殖能力。特别是OP10-11约60%地抑制(图20A)。
b)源自人子宫颈癌的HeLa细胞
OP10-11约20%地抑制了HeLa细胞在软琼脂培养基内的增殖能力(图20B)。
c)源自人大肠癌的COLO205细胞
OP10-10、OP10-11约50%地抑制了COLO205细胞在软琼脂培养基内的增殖能力(图20C)。
d)源自人胃癌的KATO III细胞
OP10-10、OP10-11约50%至70%地抑制了KATO III细胞在软琼脂培养基内的增殖能力(图20D)。
e)源自人肺癌的A549细胞
OP10-7、OP10-11、OP10-12约40%至50%地抑制了A549细胞在软琼脂培养基内的增殖能力(图21A)。
f)源自人胰腺癌的PT45细胞
OP10-7、OP10-11、OP10-12约30%至60%地抑制了PT45细胞在软琼脂培养基内的增殖能力(图21B)。
(4)GEF-1/C组成寡肽在体内抑制肿瘤增殖效果的研究
之后，研究了GEF-1/C组成寡肽在体内抑制肿瘤增殖的效果。
将GEF-1/C组成寡肽25nmol和肽·转运分子Wr-T2nmol混合后，用PBS稀释至0.1ml。向其中，加入各种细胞的5.0x106/mlOpti-MEM I培养基溶液0.1ml，混合。在CO2温箱中37℃温育该细胞混合液2小时后，接种到裸鼠皮下。每周测量肿瘤的长径和短径，计算肿瘤体积(＝长径×(短径)2×π/6)。最后，用二氧化碳气体安乐死后，拍摄小鼠的肿瘤照片。之后摘出肿瘤，测量湿重。
下文显示了各种细胞的结果。OP10-11在上述实验中的抑制管腔形成的效果和抑制软琼脂培养基中增殖能力的效果最好，因此还用于了体内实验。图23和24中的#8～12分别表示OP10-8～OP10-12。
a)小鼠黑素瘤B16细胞
OP10-1150%以上地抑制了B16细胞的肿瘤增殖(图22)。
b)人大肠癌来源的COLO205细胞
OP10-9和OP10-11约70%以上地抑制了COLO205细胞的肿瘤增殖(图23)。
c)人肺癌来源的A549细胞
OP10-9、Op10-11和OP10-12抑制了A549细胞的肿瘤增殖，以肿瘤体积表示抑制约50%至80%，以肿瘤重量表示抑制约35%至70%(图24)。
此外，还研究了r9-OP10-11寡肽在体内的肿瘤增殖抑制效果。
在裸鼠皮下接种1.0x106个COLO205细胞，制备了COLO205细胞的肿瘤。在接种10天后，在直径成为5-6mm(约100mm3)的肿瘤周围给予r9-OP10-11(35nmol)/PBS溶液0.1ml。自此次给予后，在7、14、21天后进行同样的给予。测量肿瘤的长径和短径，计算肿瘤体积(＝长径×(短径)2×π/6)。最后，用二氧化碳气体安乐死后，拍摄小鼠的肿瘤照片。之后摘出肿瘤，测量湿重。
结果是r9-OP10-11抑制已在裸鼠皮下形成的、源自人大肠癌的COLO205细胞肿瘤的增殖，以肿瘤体积计抑制了约65%，以肿瘤重量计抑制了约60%(图28)。
基于上述结果可知，r9-OP10-11寡肽在体内表现出抑制肿瘤增殖的效果。
如上所述，本发明的siRNA通过抑制GEF-1的表达，或者GEF-1/C组成寡肽通过抑制GEF-1的功能，在体外和体内能够抑制肿瘤增殖。
产业实用性
本发明可用作具有抑制血管形成作用和/或抑制肿瘤增殖作用的抗肿瘤剂。
序列表文本
序列号13-43：合成的核苷酸
序列号44-67：合成的肽
Figure IDA00002855155700011
Figure IDA00002855155700021
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Figure IDA00002855155700041
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Figure IDA00002855155700071
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Claims (28)

1.肿瘤增殖抑制剂，其含有下述多肽：该多肽是在去除了半乳糖神经酰胺表达因子-1的Q区的多肽中、至少含有C区或其一部分的多肽。
2.肿瘤增殖抑制剂，其含有下列(a)或(b)的多肽：
(a)由序列号8、10或12所示氨基酸序列组成的多肽，
(b)由在序列号8、10或12所示氨基酸序列中缺失、取代或添加1个或多个氨基酸而成的氨基酸序列组成、且具有抑制肿瘤增殖作用的多肽。
3.肿瘤增殖抑制剂，其含有下列(a)或(b)的多肽：
(a)含有序列号8、10或12所示氨基酸序列中的至少10个连续的氨基酸残基的多肽，
(b)由下列氨基酸序列组成、且具有抑制肿瘤增殖作用的多肽，该氨基酸序列是在含有序列号8、10或12所示氨基酸序列中的至少10个连续的氨基酸残基的氨基酸序列中缺失、取代或添加1个或多个氨基酸而形成的。
4.权利要求3记载的肿瘤增殖抑制剂，其中，上述(a)中记载的多肽含有序列号44-65中任一项所示的氨基酸序列。
5.肿瘤增殖抑制剂，其含有编码下述多肽的多核苷酸，该多肽是在去除了半乳糖神经酰胺表达因子-1的Q区的多肽中、至少含有C区或其一部分的多肽。
6.肿瘤增殖抑制剂，其含有编码下列(a)或(b)的多肽的多核苷酸，
(a)由序列号8、10或12所示氨基酸序列组成的多肽，
(b)由在序列号8、10或12所示氨基酸序列中缺失、取代或添加1个或多个氨基酸而成的氨基酸序列组成、且具有抑制肿瘤增殖作用的多肽。
7.肿瘤增殖抑制剂，其含有编码下列(a)或(b)的多肽的多核苷酸，
(a)含有序列号8、10或12所示氨基酸序列中的至少10个连续的氨基酸残基的多肽，
(b)由下列氨基酸序列组成、且具有抑制肿瘤增殖作用的多肽，该氨基酸序列是在含有序列号8、10或12所示氨基酸序列中的至少10个连续的氨基酸残基的氨基酸序列中缺失、取代或添加1个或多个氨基酸而形成的。
8.肿瘤增殖抑制剂，其含有下列(a)或(b)的多核苷酸：
(a)由序列号7、9或11所示碱基序列组成的多核苷酸，
(b)与由下列碱基序列组成的多核苷酸在严格条件下杂交、且编码具有抑制肿瘤增殖作用的多肽的多核苷酸，所述碱基序列是与序列号7、9或11所示碱基序列互补的碱基序列。
9.肿瘤增殖抑制剂，其含有抑制半乳糖神经酰胺表达因子-1表达的物质。
10.权利要求9记载的肿瘤增殖抑制剂，其中，所述抑制半乳糖神经酰胺表达因子-1表达的物质是针对编码半乳糖神经酰胺表达因子-1的多核苷酸的siRNA或shRNA。
11.权利要求10记载的肿瘤增殖抑制剂，其中，所述编码半乳糖神经酰胺表达因子-1的多核苷酸含有编码下列(a)或(b)的多肽的碱基序列，
(a)由序列号2、4或6所示氨基酸序列组成的多肽，
(b)由在序列号2、4或6所示氨基酸序列中缺失、取代或添加1个或多个氨基酸而成的氨基酸序列组成、且具有抑制肿瘤增殖作用的多肽。
12.权利要求10记载的肿瘤增殖抑制剂，其中，所述编码半乳糖神经酰胺表达因子-1的多核苷酸含有下列(a)或(b)的多核苷酸：
(a)由序列号1、3或5所示碱基序列组成的多核苷酸，
(b)与由下列碱基序列组成的多核苷酸在严格条件下杂交、且编码具有抑制肿瘤增殖作用的多肽的多核苷酸，所述碱基序列是与序列号1、3或5所示碱基序列互补的碱基序列。
13.血管形成抑制剂，其含有下述多肽：该多肽是在去除了半乳糖神经酰胺表达因子-1的Q区的多肽中、至少含有C区或其一部分的多肽。
14.血管形成抑制剂，其含有下列(a)或(b)的多肽：
(a)由序列号8、10或12所示氨基酸序列组成的多肽，
(b)由在序列号8、10或12所示氨基酸序列中缺失、取代或添加1个或多个氨基酸而成的氨基酸序列组成、且具有抑制血管形成作用的多肽。
15.血管形成抑制剂，其含有下列(a)或(b)的多肽：
(a)含有序列号8、10或12所示氨基酸序列中的至少10个连续的氨基酸残基的多肽，
(b)由下列氨基酸序列组成、且具有抑制血管形成作用的多肽，该氨基酸序列是在含有序列号8、10或12所示氨基酸序列中的至少10个连续的氨基酸残基的氨基酸序列中缺失、取代或添加1个或多个氨基酸而形成的。
16.权利要求15记载的血管形成抑制剂，其中，上述(a)中记载的多肽含有序列号44-65中任一项所示的氨基酸序列。
17.血管形成抑制剂，其含有编码下述多肽的多核苷酸，该多肽是在去除了半乳糖神经酰胺表达因子-1的Q区的多肽中、至少含有C区或其一部分的多肽。
18.血管形成抑制剂，其含有编码下列(a)或(b)的多肽的多核苷酸，
(a)由序列号8、10或12所示氨基酸序列组成的多肽，
(b)由在序列号8、10或12所示氨基酸序列中缺失、取代或添加1个或多个氨基酸而成的氨基酸序列组成、且具有抑制血管形成作用的多肽。
19.血管形成抑制剂，其含有编码下列(a)或(b)的多肽的多核苷酸，
(a)含有序列号8、10或12所示氨基酸序列中的至少10个连续的氨基酸残基的多肽，
(b)由下列氨基酸序列组成、且具有抑制血管形成作用的多肽，该氨基酸序列是在含有序列号8、10或12所示氨基酸序列中的至少10个连续的氨基酸残基的氨基酸序列中缺失、取代或添加1个或多个氨基酸而形成的。
20.血管形成抑制剂，其含有下列(a)或(b)的多核苷酸：
(a)由序列号7、9或11所示碱基序列组成的多核苷酸，
(b)与由下列碱基序列组成的多核苷酸在严格条件下杂交、且编码具有抑制血管形成作用的多肽的多核苷酸，所述碱基序列是与序列号7、9或11所示碱基序列互补的碱基序列。
21.血管形成抑制剂，其含有抑制半乳糖神经酰胺表达因子-1表达的物质。
22.权利要求21记载的血管形成抑制剂，其中，所述抑制半乳糖神经酰胺表达因子-1表达的物质是针对编码半乳糖神经酰胺表达因子-1的多核苷酸的siRNA或shRNA。
23.权利要求22记载的血管形成抑制剂，其中，所述编码半乳糖神经酰胺表达因子-1的多核苷酸含有编码下列(a)或(b)的多肽的碱基序列，
(a)由序列号2、4或6所示氨基酸序列组成的多肽，
(b)由在序列号2、4或6所示氨基酸序列中缺失、取代或添加1个或多个氨基酸而成的氨基酸序列组成、且具有诱导血管形成作用的多肽。
24.权利要求22记载的血管形成抑制剂，其中，所述编码半乳糖神经酰胺表达因子-1的多核苷酸含有下列(a)或(b)的多核苷酸：
(a)由序列号1、3或5所示碱基序列组成的多核苷酸，
(b)与由下列碱基序列组成的多核苷酸在严格条件下杂交、且编码具有诱导血管形成作用的多肽的多核苷酸，所述碱基序列是与序列号1、3或5所示碱基序列互补的碱基序列。
25.癌细胞特性消除剂，其含有下列(a)或(b)的多肽：
(a)由序列号8、10或12所示氨基酸序列组成的多肽，
(b)由在序列号8、10或12所示氨基酸序列中缺失、取代或添加1个或多个氨基酸而成的氨基酸序列组成、且具有消除癌细胞特性作用的多肽。
26.权利要求25记载的癌细胞特性消除剂，其是使癌细胞获得接触抑制能力的癌细胞特性消除剂。
27.抑制肿瘤增殖的方法，该方法包括：抑制半乳糖神经酰胺表达因子-1的表达。
28.抑制血管形成的方法，该方法包括：抑制半乳糖神经酰胺表达因子-1的表达。
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