CN103215216A

CN103215216A - 黑色素瘤治疗性质粒DNA疫苗pSVK-CAVA的制备方法及其专用工程菌及发酵培养基

Info

Publication number: CN103215216A
Application number: CN2013101315663A
Authority: CN
Inventors: 于继云; 阎瑾琦; 王宇; 徐元基; 张巍; 吴昊; 张亮; 朱晓明
Original assignee: Institute of Basic Medical Sciences of AMMS
Current assignee: Institute of Basic Medical Sciences of AMMS
Priority date: 2013-04-16
Filing date: 2013-04-16
Publication date: 2013-07-24
Anticipated expiration: 2033-04-16
Also published as: CN103952367A; CN103215216B; CN103952367B

Abstract

本发明公开了一种黑色素瘤治疗性质粒DNA疫苗pSVK-CAVA的制备方法及其专用工程菌及高产发酵培养基。所述工程菌是转化有黑色素瘤治疗性质粒DNA pSVK-CAVA的大肠杆菌XL10-Gold，命名为E.coli XL10-Gold/CAVA。每1L高产发酵培养基含：酪蛋白胨12g，酵母提取物16.61g，甘油3.05mL，NH₄Cl 1g，0.17mol/L KH₂PO₄和0.72mol/L K₂HPO₄混合溶液100mL，MgSO₄ 0.185g，微量元素1mL。本发明的工程菌稳定性高、能连续传代30次以上，能满足质粒DNA疫苗pSVK-CAVA中试工艺的需要，利用高产培养基发酵后获得的质粒容积产率高，可用在黑色素瘤治疗性DNA疫苗pSVK-CAVA的发酵生产中。

Description

黑色素瘤治疗性质粒DNA疫苗pSVK-CAVA的制备方法及其专用工程菌及发酵培养基

技术领域

本发明属于生物技术领域中质粒DNA疫苗的制备方法及其专用工程菌及高产发酵培养基，特别是涉及一种黑色素瘤治疗性质粒DNA疫苗pSVK-CAVA的制备方法及其专用工程菌及高产发酵培养基。

背景技术

质粒DNA疫苗是近年来经研究发现的一种极具发展潜力的新疫苗，从上世纪九十年代初期质粒DNA疫苗受到了科学家的关注，到现在发展近三十年，已经有了长足的发展。质粒DNA疫苗具有高安全性、无载体免疫原性和易于生产等特点，因此，同活病毒和病毒基础的疫苗相比，其具有独特的优势。数百项疫苗进入临床试验阶段，目前已有4种动物用质粒DNA疫苗及产品上市（Michele AK,David BW.DNA vaccines:ready for prime time?Nature Reviews Genetics,2008,9:776-788.），人用质粒DNA疫苗及产品呼之欲出。因此，随着质粒DNA疫苗及产品的快速发展，建立符合药用标准的质粒DNA的大规模生产平台成为一个重大的研究课题。本发明针对质粒DNA疫苗的发酵工艺进行探索，是质粒DNA疫苗大规模生产发展中的基石，其重要性不言而喻。

在质粒DNA疫苗大规模生产中，建立稳定的质粒DNA（或简称质粒）的种子库非常关键，由于质粒DNA（pSVK-CAVA）的分子量比较大，达到15kb左右，对于宿主菌是一种沉重的负担，在宿主菌的生长过程中，极易造成质粒DNA的不稳定性。质粒DNA的不稳定性，是指工程菌在生长过程中质粒DNA发生变化，结果不呈现原有的表型特征。质粒DNA的不稳定可分为两类：分离不稳定性和结构不稳定性(Filomena AQ,Fernanda CD.Plasmid DNA fermentation stratagies:influence on plasmid stability and cell physiology.Applied Microbial Biotechnology,2012,93:2571-2580.)。分离不稳定是指在细胞分裂中由于缺陷分配引起部分或全部质粒DNA的丢失；结构不稳定则是由于质粒DNA上的缺失、插入或重排引起的，质粒DNA的分配不稳定性和结构不稳定性的结果都将使我们得不到预期的质粒DNA产量和质量。如果发生质粒DNA的分离不稳定，由于部分质粒DNA的丢失，工程菌的发酵过程实际上是工程菌和不含有质粒DNA的宿主菌的混合培养(Clarence MO,Raelene P,Diane W,et al.Cultivation of E.coli carrying a plasmid-based Measles vaccine construct(4.2kbp pcDNA3F)employing medium optimisation and pH-temperature induction techniques.Microbial Cell Factories,2011,10:16.doi:10.1186/1475-2859-10-16.)，在非选择性条件下，含有质粒DNA的工程菌的比生长速率（μ⁺）往往小于宿主细胞的比生长速率(μ^-)，经过25代后，培养液中几乎都是无质粒DNA的细胞。由此可见，设计和筛选一种合适的工程菌来提高质粒DNA的生产率是非常重要的。

培养基对质粒的稳定性和质粒质量也起着非常重要的作用，Silva(Silva,Filomena,Passarinha L,et al.Influence of growth conditions on plasmid DNA production.Journal of Microbiology and Biotechnology,2009,19(11):1408-1414.)研究表明质粒在以葡萄糖作为碳源时的丢失频率大于以淀粉为碳源的培养基。FDA认为开环和线性化质粒DNA的治疗效果不如超螺旋质粒DNA(Food and Drug Administration(FDA),Guidance for industry:considerations for plasmid deoxyribonucleic acid vaccines for infectious disease indications,2007,http://www.fda.gov/cber/gdlns/plasdnavac.htm.)，然而质粒DNA的几种形态在纯化的过程中很难分开，所以在发酵过程中应该在如何得到高比例的超螺旋质粒DNA方面进行优化(Ying C,Rodriguez S,Hebel H.DNA vaccine manufacture:scale and quality.Expert Reviews Vaccines,2009,8(9):1277-1291.)。由此可见，设计和筛选一种合适的工程菌发酵培养基来提高质粒DNA的生产率是至关重要的。

发明内容

本发明的一个目的是提供一个稳定性高、能多次传代的用于制备黑色素瘤治疗性质粒DNA疫苗pSVK-CAVA的工程菌。

本发明所提供的用于制备黑色素瘤治疗性质粒DNA疫苗pSVK-CAVA的工程菌，是转化有黑色素瘤治疗性质粒DNA pSVK-CAVA（或称PSCK-2PFcGB）的大肠杆菌XL10-Gold，命名为E.coli XL10-Gold/CAVA。

将黑色素瘤治疗性pSVK-CAVA质粒DNA转化大肠杆菌XL10-Gold得到转化菌XL10-Gold，转化方法包括但不限于Hananhan法、Inoue法、氯化钙法和电击转化法。将转化菌XL10-Gold涂布于LB固体平板培养基，在37℃、200rpm下培养15小时后挑取单克隆菌落；将单克隆菌落接种于5mL LB液体培养基中，在37℃、200rpm下培养12小时后按照1:100进行连续传代培养，12小时转接传代1次，可连续传代30代；单克隆菌株以及传代30代以内历次传代菌株均为转化大肠杆菌XL10-Gold的工程菌。

用氯化钙法转化大肠杆菌XL10-Gold的工程菌，转化方法为：将-70℃保存的100μl感受态细胞XL10-Gold于冰浴中解冻10分钟，然后加入pSVK-CAVA质粒DNA 25-50ng,轻柔混匀后，置冰浴中30分钟；冰浴结束后，于42℃水浴中热击90秒,后迅速置于冰浴中冷却3-5分钟，加入800μl无抗性的LB液体培养基,混匀后于37℃，200rpm振荡培养1小时,得到pSVK-CAVA质粒DNA的转化菌XL10-Gold。

本发明另一目的是提供一种用于制备黑色素瘤治疗性质粒DNA疫苗pSVK-CAVA的高产发酵培养基。

该制备黑色素瘤治疗性质粒DNA疫苗pSVK-CAVA的发酵培养基ITB，每1L培养基含：酪蛋白胨10-14g，酵母提取物16-20g，甘油2.4-4mL，NH₄Cl 0.75-1g，0.17mol/LKH₂PO₄和0.72mol/L K₂HPO₄混合溶液75-100mL，MgSO₄ 0.168-0.216g，微量元素0.75-1mL。

较佳的，每1L培养基含：酪蛋白胨12g，酵母提取物16.61g，甘油3.05mL，NH₄Cl 1g，0.17mol/L KH₂PO₄和0.72mol/L K₂HPO₄混合溶液100mL，MgSO₄ 0.185g，微量元素1mL。

所述发酵培养基ITB中，微量元素包括：FeCl₃·6H₂O 27g/L、ZnCl₂ 2g/L、CoCl₂·6H₂O2g/L、Na₂MoO₄·2H₂O 2g/L、CaCl₂·2H₂O 1g/L，或无水CaCl₂ 0.76g/L、CuCl₂·2H₂O1.27g/L、H₃BO₃ 0.5g/L，溶于1.2mol/L HCl。

所述发酵培养基ITB中，K₂HPO₄和KH₂PO₄混合溶液的配制方法为：用90mL去离子水溶解2.31g KH₂PO₄和12.54g K₂HPO₄，完全溶解后，用去离子水定容至100mL。

本发明还一目的是提供一种行之有效的用上述工程菌和发酵培养基来进行黑色素瘤治疗性质粒DNA疫苗pSVK-CAVA生产的方法。

本发明提供的黑色素瘤治疗性质粒DNA疫苗pSVK-CAVA的生产方法，是复苏一支所述工程菌E.coli XL10-Gold/CAVA工作种子，按体积比1:100比例接种于5mL LB液体培养基中，在37℃、200rpm下培养12小时，按照1:100再转接于100mL的LB液体培养基中，37℃、200rpm培养12小时左右，得到种子液；

将种子液按体积比1:100的量接种于含3L所述发酵培养基ITB的5L发酵罐内，pH值控制在7.0±0.1，培养温度为37℃，溶解氧控制在30%左右，发酵培养6h；之后按照1mL/min的流速补加发酵培养基ITB，总共补加500mL，发酵15小时后，结束发酵，收菌，提取质粒，得到黑色素瘤治疗性质粒DNA疫苗pSVK-CAVA。

本发明还一目的是提供生产黑色素瘤治疗性质粒DNA疫苗pSVK-CAVA的工程菌E.coli XL10-Gold/CAVA种子库的构建方法及种子库产品。

该种子库的构建包括：

1）制备原始种子库：将所述工程菌E.coli XL10-Gold/CAVA菌液0.5mL扩大至100mL LB液体培养基中，在37℃、200rpm下培养12小时，加入30％甘油，分装50 管并冻存于-70℃冰箱，得到原始种子库；

2)制备主种子库：复苏一支原始种子接种于12管LB液体培养基中，2次传代后小提质粒，选取质粒含量最高的菌液扩大至100mL LB培养基中，在37℃、200rpm下培养12小时后加入30％甘油，并分装50管得到主种子库，冻存于-70℃冰箱，得到主种子库；

3）制备工作种子库：从主种子库中取1管菌种，接种于12管LB液体培养基中，2次传代后小提质粒，选取质粒含量最高的菌液扩大至100mL LB培养基中，在37℃、200rpm下培养12小时后加入30％甘油，分装50管并冻存于-70℃冰箱，得到工作种子库；每支工作种子库中的菌种限传5代用于权利要求9黑色素瘤治疗性质粒DNA疫苗pSVK-CAVA的生产。

以上构建得到的包括原始种子、主种子以及工作种子在内的种子库及各种子均为本发明内容。

质粒DNA的稳定性和工程菌发酵培养基是影响质粒产量的重要因素，本发明为了能提供一个稳定性高、能多次传代的用于制备黑色素瘤治疗性质粒DNA疫苗pSVK-CAVA的工程菌以满足中试工艺的需求，首先通过实验对宿主菌进行了优化筛选，最终发现大肠杆菌XL10-Gold是一个更利于该质粒DNA扩增的宿主菌，将携带质粒pSVK-CAVA的工程菌命名为E.coli XL10-Gold/CAVA，质粒pSVK-CAVA以大肠杆菌XL10-Gold为宿主菌时，表现出了同常规质粒DNA类似的稳定性，能转接传代30次也未发生重组或片段丢失，这可能与大肠杆菌XL10-Gold的特性有关系，因为该菌具有一个大分子量质粒高效转化基因；除了保持质粒DNA在宿主菌中的稳定传代以外，质粒DNA生产工艺中极为重要的一个方面是质粒DNA的高产量问题，想要得到较高的产品量，必须使携带质粒的工程菌具有较高的菌体量，一般要经过优化培养基的成分和特殊的发酵（补料分批发酵）策略来实现，而理想的发酵培养基是获得高产量的首要条件，因此，分别用单次单因子法和响应面法对其最适培养基进行了筛选和优化，单次单因子法优化结果显示，TB培养基是其最适基础培养基，质粒的容积产率为9.9mg/L，明显高于LB和M9培养基；最适碳源和氮源分别是甘油和酪蛋白胨；PB实验结果表明，影响质粒产量的3个主要影响因子为酵母提取物、甘油、MgSO₄，最后经过最陡爬坡和CCD优化后，确定了工程菌E.coli XL10-Gold/CAVA发酵培养基ITB的成份和水平，在500mL摇瓶的发酵规模下，质粒的容积产率达到12.38mg/L，是基础培养基LB发酵产量的2倍以上。综上所述，本发明的工程菌及培养基将在黑色素瘤治疗性质粒DNA疫苗pSVK-CAVA的发酵生产中发挥重要作用，应用前景广阔。

下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。

附图说明

图1为工程菌E.coli XL10-Gold/CAVA连续传代30代，每隔5代抽提质粒，用PVUⅠ进行单酶切，用PVUⅠ和SpeⅠ进行双酶切的酶切鉴定结果

图2为工程菌E.coli XL10-Gold/CAVA连续传代30代，每隔5代抽提质粒，质粒的1％琼脂糖凝胶电泳图谱

图3为工程菌E.coli XL10-Gold/CAVA的平板点种结果

图4为工程菌E.coli XL10-Gold/CAVA的革兰氏染色镜检结果

图5为工程菌E.coli XL10-Gold/CAVA在生化检测培养基中的生长情况

图6A为工程菌E.coli XL10-Gold/CAVA在4种培养基中随培养时间菌密度的变化情况

图6B为工程菌E.coli XL10-Gold/CAVA在4种培养基生长的工程菌中质粒的结构1％琼脂糖凝胶电泳检测结果

图7为不同碳源对工程菌E.coli XL10-Gold/CAVA质粒产量（容积产率）影响的柱状图

图8为不同氮源对工程菌E.coli XL10-Gold/CAVA质粒产量（容积产率）影响的柱状图

图9为三个显著影响因子交互作用对质粒产量（容积产率）影响的曲面图和等值线图

具体实施方式

本发明的发明人前期经研究获得了具有突出原创性的基于甲病毒复制子载体的新型黑色素瘤治疗性质粒DNA疫苗pSVK-CAVA（参见文献：张亮，阎瑾琦，王越，等.可复制型抗肿瘤DNA疫苗PSCK-2PFcGB的构建及体内外表达[J].南方医科大学学报，2011,3(6):937-942.该文献中命名“PSCK-2PFcGB”的可复制型抗肿瘤DNA疫苗即为本发明黑色素瘤治疗性质粒DNA疫苗pSVK-CAVA，发明人为商业推广在本发明中对该疫苗进行了重新命名），初步药效学研究显示，该疫苗可以有效地诱导小鼠体内特异的细胞免疫及体液免疫应答，能够有效地抑制移植瘤的生长。目前正在进行该疫苗的中试工艺及质量控制体系的建立，以促进该新型黑色素瘤治疗性疫苗的进一步发展。基于甲病毒复制子载体的质粒DNA疫苗一般分子量都较大，能达到14kb以上，而黑色素瘤治疗性质粒DNA疫苗pSVK-CAVA分子量接近15kb，分子量如此大的质粒DNA（命名为“pSVK-CAVA质粒DNA”或“质粒DNA pSVK-CAVA”）无论是在上游的设计和构建，还是到下游的提取和工艺研究，都具有较大的挑战性。前期的实验发现：在以大肠杆菌DH5α为宿主菌时，随着传代次数的增加，该质粒DNA疫苗会发生分子量变小的情况，代数越多变小的情况越严重，到最后提取的质粒已经不是所需要的目的质粒，这对于后续的中试工艺研究以及产品的发展极为不利。发明人进一步分析研究，由于质粒在宿主菌里发生了重组或丢失，造成这种现象的原因可能是由于宿主菌本身负荷过大的问题，也可能是质粒分子量过大或由于其源于甲病毒，易发生重组或片段丢失等自身原因造成的。造成宿主菌里质粒发生重组或片段丢失与质粒本身的特性以及宿主菌等都有一定的关联，首先黑色素瘤治疗性质粒DNA疫苗pSVK-CAVA是一种基于病毒的载体，比常规的质粒DNA更易发生重组或片段丢失；另外，由于该质粒pSVK-CAVA自身相对分子质量将近15kb,在宿主菌里复制时会给菌体造成严重的负荷，从而引发质粒的不稳定性增加，产生上述截短质粒的情况。

想要解决上述问题，发明人提出：筛选质粒DNA疫苗pSVK-CAVA的最适宜宿主菌，并进行培养基成分的优化。

因此，第一方面，本发明提供一种用于制备黑色素瘤治疗性质粒DNA疫苗pSVK-CAVA的工程菌，其是转化有黑色素瘤治疗性质粒DNA pSVK-CAVA的大肠杆菌XL10-Gold，命名为E.coli XL10-Gold/CAVA。

可用本领域技术人员熟知的常规技术，将黑色素瘤治疗性质粒DNA pSVK-CAVA转化大肠杆菌XL10-Gold，转化方法包括但不限于Hananhan法（分子克隆实验指南（第三版）87-92页）、Inoue法（分子克隆实验指南（第三版）93-96页）、氯化钙法（分子克隆实验指南（第三版）96-99页）、电击转化法（分子克隆实验指南（第三版）99-102页）。

另一方面，本发明还提供一种用于制备黑色素瘤治疗性质粒DNA疫苗pSVK-CAVA的高产发酵培养基（ITB）。每1L该培养基中含：酪蛋白胨12g，酵母提取物16.61g，甘油3.05mL，NH₄Cl 1g，0.17mol/L KH₂PO₄和0.72mol/L K₂HPO₄混合溶液100mL，Mg₂SO₄0.185g，微量元素1mL，微量元素包括FeCl₃·6H₂O 27g/L、ZnCl₂ 2g/L、CoCl₂·6H₂O2g/L、Na₂MoO₄·2H₂O 2g/L、CaCl₂·2H₂O 1g/L或无水CaCl₂ 0.76g/L、CuCl₂·2H₂O 1.27g/L、H₃BO₃ 0.5g/L，溶于1.2mol/L HCl；所述K₂HPO₄和KH₂PO₄混合溶液的配制方法是：用90mL去离子水溶解2.31g KH₂PO₄和12.54g K₂HPO₄，完全溶解后，用去离子水定容至100mL。

还一方面，本发明还提供一种用上述工程菌和高产发酵培养基生产黑色素瘤治疗性质粒DNA疫苗pSVK-CAVA的方法。该方法是：

1）种子液的制备：从-70℃复苏一支E.coli XL10-Gold/CAVA工作种子，按1:100接种于5mL的LB液体培养基中，37℃、200rpm培养12小时。按照1:100再转接于100mL的LB液体培养基中，37℃、200rpm培养12小时左右，此时得到种子液；

2）发酵培养：将种子液按照1:100的量种于5L发酵罐（中试生产）内进行发酵培养，发酵罐内含有高产发酵培养基ITB的量为3L，pH值控制在7.0±0.1（通过发酵罐自动补入H₂SO₄和NH₃.H₂0来调节培养基的pH值），培养温度为37℃，溶解氧控制在30%左右（当溶解氧降低到该值时，通过补充纯氧和提高搅拌速度来调节）。发酵培养6h后，按照1mL/min的流速补加高产发酵培养基ITB，总共补加500mL。发酵15小时后，结束发酵，收菌，提取质粒，得到黑色素瘤治疗性质粒DNA疫苗pSVK-CAVA。

本发明还构建多级种子库，所述E.coli XL10-Gold/CAVA工作种子来源于该种子库。种子库的构建过程包括：

1）制备原始种子库：将E.coli XL10-Gold/CAVA工程菌菌液0.5mL扩大至100mLLB液体培养基中，在37℃、200rpm下培养12小时，加入30％甘油，分装50管并冻存于-70℃冰箱，得到原始种子库；

3）制备工作种子库：从主种子库中取1管菌种，接种于12管LB液体培养基中，2次传代后小提质粒，选取质粒含量最高的菌液扩大至100mL LB培养基中，在37℃、200rpm下培养12小时后加入30％甘油，分装50管并冻存于-70℃冰箱，得到工作种子库，每支工作种子库中的菌种限传5代，用于黑色素瘤治疗性质粒DNA疫苗pSVK-CAVA的生产。

下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，具体步骤可参见：《Molecular Cloning:A Laboratory Manual》（Sambrook，J.，Russell，David W.，Molecular Cloning:A Laboratory Manual，3rd edition，2001，NY，Cold Spring Harbor）。

所述百分比浓度如无特别说明均为质量/体积(mg/100ml)百分比浓度或体积/体积(V/V)百分比浓度。

实施例中描述到的的各种生物材料的取得途径仅是提供一种实验获取的途径以达到具体公开的目的，不应成为对本发明生物材料来源的限制。事实上，所用到的生物材料的来源是广泛的，任何不违反法律和道德伦理能够获取的生物材料都可以按照实施例中的提示替换使用。

实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，实施例将有助于理解本发明，但是本发明的保护范围不限于下述的实施例。

实施例1、黑色素瘤治疗性质粒DNA疫苗pSVK-CAVA的高稳定性宿主菌的筛选及稳定性检测

将黑色素瘤治疗性质粒DNA疫苗pSVK-CAVA质粒DNA分别转化不同基因型的大肠杆菌感受态细胞DH5α、DH10β、Top10和XL10-Gold，转化方法为Hananhan法（分子克隆实验指南（第三版）87-92页）、Inoue法（分子克隆实验指南（第三版）93-96页）、氯化钙法（分子克隆实验指南（第三版）96-99页）、电击转化法（分子克隆实验指南（第三版）99-102页）。

以氯化钙法转化XL10-Gold为例进行示例性说明：

pSVK-CAVA质粒DNA的获得参见文献（张亮，阎瑾琦，王越，等.可复制型抗肿瘤DNA疫苗PSCK-2PFcGB的构建及体内外表达[J].南方医科大学学报，2011,3(6):937-942.）。该文献中命名“PSCK-2PFcGB”的可复制型抗肿瘤DNA疫苗即为本发明黑色素瘤治疗性质粒DNA疫苗“pSVK-CAVA”，发明人为商业推广在本发明中对其进行了重新命名。本发明中pSVK-CAVA质粒DNA即为文献中介绍的PSCK-2PFcGB质粒。

从-70℃冰箱中取100μl感受态细胞XL10-Gold,立即于冰浴中解冻10分钟，然后加入pSVK-CAVA质粒DNA25-50ng,轻柔混匀后，置冰浴中30分钟。冰浴结束后，于42℃水浴中热击90秒,后迅速置于冰浴中冷却3-5分钟，向管中加入800μl无抗性的LB液体培养基,混匀后于37℃，200rpm振荡培养1小时,使细菌恢复正常生长状态,并表达质粒编码的抗生素抗性基因，此时得到pSVK-CAVA质粒DNA的转化菌XL10-Gold。

将转化菌XL10-Gold涂布于LB（Luria-bertani Medium）固体平板培养基（LB液体培养基配方：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，加入蒸馏水溶解，5mol/LNaOH调节pH至7.0，定容至1000mL，高压灭菌后4℃保存备用。LB固体平板培养基则是在LB液体培养基中加入琼脂（15g/L），高压灭菌，当温度降至50℃时加入硫酸卡那霉素至终浓度为20μg/mL，以下培养基均为此抗性水平），在37℃、200rpm下培养15小时后挑取单克隆菌落，接种于5mL LB液体培养基中，在37℃、200rpm下培养12小时后按照1:100进行连续传代培养（12小时转接传代1次），传代之前取1mL菌液抽提质粒，通过1％琼脂糖凝胶电泳检测质粒的形态以及超螺旋比例，紫外分光光度计测量质粒浓度，联合连续传代法（每12小时转接1代）对工程菌的稳定性进行检测。

转化有pSVK-CAVA质粒DNA的大肠杆菌XL10-Gold工程菌连续传代30代，每隔5代抽提质粒，用PVUⅠ进行单酶切，用PVUⅠ和SpeⅠ进行双酶切，酶切鉴定结果如图 1所示（M：DL15000Marker；1：质粒pSVK-CAVA；2：PVUⅠ单酶切片段；3：PVUⅠ和SpeⅠ双酶切片段），用PVUⅠ单切得到14748bp线性化质粒片段，用PVUⅠ和SpeⅠ双酶切得到12751bp和1997bp两个DNA片段，与预期结果一致，表明质粒的结构稳定性良好。转化有pSVK-CAVA质粒DNA的大肠杆菌XL10-Gold工程菌连续传代30代，每隔5代抽提质粒，质粒的1％琼脂糖凝胶电泳图谱如图2所示（1：原代；2：5代；3：10代；4：15代；5：20代；6：25代；7：30代；M：DL15000Marker），工程菌表现出良好地遗传稳定性，质粒拷贝数基本保持稳定，同时保持了较高的超螺旋比例。

本实施例用示例的方法对4种备选宿主菌进行筛选，结果都能成功生长单克隆；挑取单克隆进行传代培养，其中大肠杆菌DH5α、DH10β、TOP10在传代2次以后均出现不同程度的质粒重组和丢失，而且往下继续传代，这种重组和丢失情况变得更加严重，传代5次之后就几乎没有原质粒了。但是大肠杆菌XL10-GOLD能够很好的保持质粒进行稳定的拷贝，传代30代后依然很稳定，非常适合作为高达15kb之大的黑色素瘤治疗性质粒DNA疫苗pSVK-CAVA的宿主菌，解决了大质粒容易发生重组和丢失这一难题。

本发明将该转化有pSVK-CAVA质粒DNA的大肠杆菌XL10-Gold，命名为“黑色素瘤治疗性质粒DNA疫苗pSVK-CAVA工程菌E.coli XL10-Gold/CAVA”。经鉴定（参见实施例2），该工程菌表现出良好地遗传稳定性，质粒拷贝数基本保持稳定，同时保持了较高的超螺旋比例。

利用该工程菌建立三级种子库，可将E.coli XL10-Gold/CAVA菌液扩大至100mL LB液体培养基（配方：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，加入蒸馏水溶解，5mol/LNaOH调节pH至7.0，定容至1000mL，高压灭菌后4℃保存备用。）培养，在37℃、200rpm下培养12小时，加入30％甘油，分装50管并冻存于-70℃冰箱，得到原始种子库。复苏一支原始种子接种于12管LB液体培养基中，2次传代后小提质粒，选取质粒含量最高的菌液扩大至100mL LB培养基中，在37℃、200rpm下培养12小时后加入30％甘油，并分装50管作为主种子库，冻存于-70℃冰箱。从主种子库中取1管菌种，按上述方法操作，冻存50管作为工作种子库，用于常规生产。每支工作种子库中的菌种限传5代。

实施例2、黑色素瘤治疗性质粒DNA疫苗pSVK-CAVA工程菌E.coliXL10-Gold/CAVA的鉴定

一、工作种子库遗传稳定性和结构稳定性检测

37℃水浴加热复苏1支工作种子，按接种于5mL LB培养基中，在37℃、200rpm 下培养12小时后1:100传代，以此方法连续传代30代，选原代、5代、10代、15代、20代、25代、30代菌液抽提质粒，经1％琼脂糖凝胶电泳及酶切检测工作种子库的结构稳定性。

结果工程菌E.coli XL10-Gold/CAVA连续传代30代，每隔5代抽提质粒，质粒的1％琼脂糖凝胶电泳图谱（见图2）表明工程菌表现出良好地遗传稳定性，质粒拷贝数基本保持稳定，同时保持了较高的超螺旋比例；此外，用PVU1单切得到14748bp线性化质粒片段，用PVUⅠ和SpeⅠ双酶切得到12751bp和1997bp两个DNA片段，与预期结果一致，表明质粒的结构稳定性良好。

二、工作种子库的质粒丢失率检测

对第30代菌液检测质粒丢失率，取第30代菌液稀释后铺于不含卡那霉素的LB平板上培养过夜，选取100个单克隆点种于含20μg/mL卡那霉素的LB平板上，在37℃、200rpm下培养15个小时，计数生长的单克隆菌落数，计算质粒丢失率：质粒丢失率=(100-在平板上长出的菌落数)/100×100％。

结果如图3所示，生长了100个点，质粒丢失率为0，表明该质粒在宿主菌中具有良好的分离稳定性，传代30代后依然保持稳定。

二、细菌形态和革兰氏染色特征及其生化特征

工程菌E.coli XL10-Gold/CAVA的革兰氏染色镜检图如图4（放大倍数1000倍）所示，根据镜检显示，工程菌E.coli XL10-Gold/CAVA为杆菌，革兰氏染色为红色（图中显示为深色），说明是革兰氏阴性菌。还考察了工程菌E.coli XL10-Gold/CAVA在含葡萄糖、乳糖、甘露醇三种不同糖类培养基中的生长情况，方法为：将工程菌E.coli XL10-Gold/CAVA以穿刺的方法接种在生化检测培养基[配方:用邓亨氏（Dunham）蛋白胨水溶液（蛋白胨1g，氯化钠0.5g，水100mL，pH7.6），每100mL加入1.2mL的0.2％溴麝香草酚蓝作指示剂。在培养基中加入琼脂达0.5-0.7％，分装于试管，高压灭菌10分钟。0.2％溴麝香草酚蓝溶液配法：溴麝香草酚蓝0.2g，0.1mol/L NaOH5mL，蒸馏水95mL。

在37℃、200rpm下培养24小时，观测其发酵和产气情况，分析生化特征。结果如图5所示，工程菌E.coli XL10-Gold/CAVA在葡萄糖和甘露醇培养基中出现黄色（图中浅色部分），在乳糖培养基中未出现黄色，试管溶液显示为蓝色（图中深色部分），说明工程菌E.coli XL10-Gold/CAVA能够发酵葡萄糖、甘露醇，不能发酵乳糖，两种变黄的培养基中都没有气泡的产生，说明工程菌E.coli XL10-Gold/CAVA发酵过程中不产气。

实施例3、不同基础培养基对工程菌E.coli XL10-Gold/CAVA生长和质粒产量（容积产率）的影响

为了找出适合工程菌E.coli XL10-Gold/CAVA生长和质粒生产的培养基，将工程菌E.coli XL10-Gold/CAVA在四种不同的细菌培养基中进行培养：

LB——配方：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，加入蒸馏水溶解，5N NaOH调节pH至7.0，定容至1000mL，高压灭菌后4℃保存备用。

TB——配方：酪蛋白胨12g，酵母提取物24g，甘油4mL，加入蒸馏水溶解，定容至900mL，高压灭菌后4℃保存备用。当溶液冷却至50℃时加入100mL无菌的0.17mol/L KH₂PO₄，0.72mol/L K₂HPO₄溶液。该溶液的配制方法是：用90mL去离子水溶解2.31g KH₂PO₄和12.54g K₂HPO₄，完全溶解后，用去离子水定容至100mL并高压灭菌20min。

M9（葡萄糖）——配方：5×M9盐溶液200mL，1mol/LMgSO₄ 2mL，20％葡萄糖溶液20mL，1mol/LCaCl₂ 0.1mL，灭菌的蒸馏水定容至1000mL。5×M9盐溶液的配制方法：用蒸馏水溶解下列盐类，终体积为1L：Na₂HPO₄.7H₂O 64g，KHPO₄ 15g，NaCl 2.5g，NH₄Cl 5.0g，高压灭菌后4℃保存备用。

M9（甘油）——配方：5×M9盐溶液200mL，1mol/LMgSO₄ 2mL，20％甘油溶液20mL，1mol/LCaCl₂ 0.1mL，灭菌的蒸馏水定容至1000mL。5×M9盐溶液的配置方法：用蒸馏水溶解下列盐类，终体积为1L：Na₂HPO₄.7H₂O 64g，KHPO₄ 15g，NaCl 2.5g，NH₄Cl 5.0g，高压灭菌后4℃保存备用。

培养方法为：复苏一支E.coli XL10-Gold/CAVA工作种子，按1:100接种于5mLLB培养基中，37℃、200rpm培养12小时，1:100传代一次后接种于100mL上述四种基础培养基中，每隔3h取1mL菌夜，一部分用于测定菌体密度（采用分光光度计测定600nm波长的A值—OD600）监测菌体生长情况，一部分用于小量提取质粒并测定质粒浓度，发酵结束后取10mL菌液离心洗涤后，烘干并测菌体干重。

菌体的干重通过分析天秤进行测定，具体操作：干燥的EP管，准确称重(G1)，取大肠杆菌发酵液5mL，8000rmp离心10min，弃上清，沉淀用PBS洗涤两次，将沉淀连同离心管置于烘箱中，80℃干燥至恒重(约24h)，在干燥器中冷却至室温，准确称重(G2)，菌体干重为G2-G1。最终取每个发酵菌液3次平行样品测量结果的平均值。

选择菌体生长情况最佳、质粒容积产率最高和质粒特异性产率最好的培养基作为基础发酵培养基。在不同培养基中的菌体密度测定结果如图6A所示，菌体生物量、质粒容积产率和特异性产率如表1所示，可以看到工程菌E.coli XL10-Gold/CAVA在TB培养基体现出了明显的生长优势，特别是容积产率，比LB培养基有了较大的提升。在不同培养基生长的工程菌中质粒的1％琼脂糖凝胶电泳检测结果如图6B（M：DL 15000Marker；1：LB培养基；2：TB培养基；3：M9（甘油）培养基；4：M9（葡萄糖）培养基）所示，2号泳道（TB培养基）的质粒浓度和超螺旋的比例均优于其它泳道的质粒，在质粒抽提过程中，用同样体积的洗脱液进行洗脱，即说明了用TB培养基发酵能够得到更高的质粒产量以及更高的超螺旋比例。因此，选择TB作为基础培养基，进行进一步的研究。

表1菌体生物量、质粒容积产率和特异性产率

培养基	生物量(g/L)	容积产量(mg/L)	特异性产量(mg/g)
				LB	1.1	6.2	5.7
TB	2.2	9.9	4.5
				M9(甘油)	0.4	3.3	8.25
M9（葡萄糖）	0.2	1.4	6.95

实施例4、不同碳源、氮源对工程菌E.coli XL10-Gold/CAVA发酵和质粒产量（容积产率）的影响

为工程菌E.coli XL10-Gold/CAVA生产黑色素瘤治疗性质粒DNA疫苗pSVK-CAVA筛选理想的碳源、氮源，首先利用摇瓶发酵条件，从LB、TB、M9（甘油）、M9（葡萄糖）四种培养基中为工程菌E.coli XL10-Gold/CAVA筛选出最佳的基础培养基—TB培养基。基础培养基筛选出之后，分别比较不同的碳源（如葡萄糖、甘油、甘露醇）和不同氮源（如胰蛋白胨、大豆蛋白胨、酪蛋白胨、眎蛋白胨、氯化铵（NH₄Cl））对工程菌生产pSVK-CAVA质粒DNA的影响，确定最佳碳源和氮源以及它们的工作浓度，以确定其对发酵和质粒产量的影响，单次单因子实验方法如下：

一、不同碳源对工程菌E.coli XL10-Gold/CAVA生长和质粒产量（容积产率）的影响

TB作为基础培养基，其中无碳源成分，而碳源成分对工程菌的生长以及质粒的产量都有重要影响。本实验选择了甘油、葡萄糖和甘露醇作为碳源的候选对象，研究其对工程菌E.coli XL10-Gold/CAVA生长和质粒产量（容积产率）的影响。实验方法为：复苏一支E.coli XL10-Gold/CAVA工作种子，按1:100接种于5mL TB培养基中，37℃、200rpm培养12小时，1:100传代一次后接种于100mL碳源分别为甘油、葡萄糖和甘露醇、浓度为4g/L的TB培养基的500mL三角烧瓶中，37℃、200rpm振荡培养15h，发酵结束后测定质粒浓度。

碳源为工程菌的生长提供能量，是细菌赖以生长的因素，通常也是分批补料发酵培养中的限制性营养素。目前，甘油是最常用的碳源，它不仅便宜而且效果非常好。在其它培养基成分不变的基础上，更换碳源进行培养，15h后抽提质粒，进行分析。结果如图7所示，甘油更利于质粒的拷贝，显著优于其它两种碳源，适合作为工程菌E.coli XL10-Gold/CAVA的发酵培养基碳源。结合实验结果，并从节省成本的角度考虑，确定使用甘油作为最终碳源，工作浓度为4g/L。

二、不同氮源对工程菌E.coli XL10-Gold/CAVA生长和质粒产量（容积产率）的影响

一些无机盐和有机物都可作为细菌培养的氮源，在小量培养中有研究者采用CH₄Cl或者(NH₄)SO₄作为氮源，但是有机物作为氮源往往能够得到更好的质粒产率。TB作为基础培养基，其中无氮源成分，而氮源成分对工程菌的生长以及质粒的产量都有重要影响。本实验选择了胰蛋白胨、大豆蛋白胨、眎蛋白胨、酪蛋白胨、氯化铵（NH₄Cl）作为氮源的候选对象，研究其对工程菌E.coli XL10-Gold/CAVA生长和质粒产量（容积产率）的影响。实验方法为：复苏一支E.coli XL10-Gold/CAVA工作种子，按1:100接种于5mL TB培养基中，37℃、200rpm培养12小时，1:100传代一次后接种于100mL氮源分别为胰蛋白胨、大豆蛋白胨、眎蛋白胨、酪蛋白胨、氯化铵（NH₄Cl），浓度为12g/L的TB培养基的500mL三角烧瓶中，37℃、200rpm振荡培养15h，发酵结束后测定质粒浓度。

实验结果如图8所示，在实验的5个备选氮源中，酪蛋白胨显示出较好的质粒产率，并且酪蛋白胨为国内分析纯，相对成本更低，因此，选择酪蛋白胨作为工程菌E.coli XL10-Gold/CAVA的发酵培养基氮源，工作浓度为12g/L。

实施例5、利用Plackett-Burman(PB)设计筛选培养基的显著影响因子

应用PB设计筛选影响工程菌E.coli XL10-Gold/CAVA质粒产量（容积产率）的培养基成分（显著影响因子）。综合单因素试验结果与文献调研，选取了TB培养基（配方：酪蛋白胨12g，酵母提取物24g，甘油4mL，加入蒸馏水溶解，定容至900mL，高压灭菌后4℃保存备用。当溶液冷却至50℃时加入100mL无菌的0.17mol/L KH₂PO₄、0.72mol/L K₂HPO₄溶液。该溶液的配制方法是：用90mL去离子水溶解2.31g KH₂PO₄和12.54g K₂HPO₄，完全溶解后，用去离子水定容至100mL并高压灭菌20min。）中酪蛋白胨、酵母提取物、甘油、NH₄Cl（氯化铵）、K₂HPO₄和KH₂PO₄复合物、微量元素（微量元素对微生物的生长有一定的促进作用，是微生物生长所必需的）、MgSO₄（硫酸镁，添加无机盐能提高质粒产量，硫酸镁作为无机盐添加，以期得到更高质粒产量）7个可能影响质粒发酵产量的因素进行考察。采用n=10（其中3个虚拟因子），仿行数为1，基础次数是13次，总试验数为13，1个中心点。PB试验中因素水平的选取通常是高水平为低水平的1.25-1.5倍，根据试验实际情况调整，表2为本试验的因素编号和水平选择。

PB实验设计是基于如下的一次方程：

Y=β0+ΣβiΧi

其中，Y是预测的响应值，β0是模型的截距，βi是线性系数，Χi是自变量。每组实验中质粒的容积产率进行3次检测，取3次的平均值作为响应值。

表2 Plackett-Burman试验设计因素水平范围

PB试验方案和结果见表3，质粒容积产率为3次的均值，利用Minitab分析数据，结果如表4所示，从该表中可以看出7个待选因素和3个虚拟因素中间，B、D、F、J、K这5个因素的P<0.05，即对质粒产量的影响具有显著性，其中F,J项为虚拟项，剩下的3项B（酵母提取物）、D（甘油）、K（MgSO₄）为要继续优化的因素。

表3 PB试验方案和试验结果

表4 PB结果分析

回归分析：Y与A、B、C、D、E、F、G、H、J、K

回归方程为：

Y=155–3.21A–19.6B+0.05C–17.9D–0.39E+14.7F–1.43G–1.13H+6.56J–20.0K

自变量	系数	系数标准误	T	P
					常量	155.246	1.128	137.59	0.000
A	-3.213	1.174	-2.74	0.112
					B	-19.585	1.174	-16.68	0.004
C	0.050	1.174	0.04	0.970
					D	-17.912	1.174	-15.25	0.004
E	-0.388	1.174	-0.33	0.772
					F	14.708	1.174	12.52	0.006
G	-1.428	1.174	-1.22	0.348
					H	-1.132	1.174	-0.96	0.437
J	6.562	1.174	5.59	0.031
					K	-20.025	1.174	-17.05	0.003

S=4.06830R-Sq=99.8％R-Sq(调整)=98.8％

实施例6、最陡爬坡法确定响应面因素水平的中心点

利用最陡爬坡法逼近显著因素的最佳响应区域，根据Plackett-Burman(PB)试验获得的一次方程确定爬坡方向和步长，如果筛选出的显著因素呈现出正效应，则从往高水平摸索，如果是负效应则是往最低水平摸索，步长由系数决定，系数越大步长越小。PB试验的取值很可能没有涵盖影响因素的最佳取值，从而掩盖了影响因素的真实情形，所以在进一步摸索培养基成分含量之前，有必要对选出的显著因素进行最陡爬坡试验。回归方程显示，具有显著影响的3个因素均为负效应，因此本研究对酵母提取物、甘油、MgSO₄这几个因素进行负向的最陡爬坡法，其它培养基因素选取中心点。

最陡爬坡法实验结果如表5所示，随着浓度的递减，质粒容积产率体现出递增的趋势，在第5组达到极值，但是培养基因素的浓度继续往下降就出现质粒容积产率下降的趋势（第6组）。因此，本实验确定第5组为最佳响应区域，即浓度为酵母提取物16g/L，甘油3.2mL/L，硫酸镁0.192g/L。

表5最陡爬坡法实验结果

分组	酵母提取物（g/L）	甘油(ml/L)	MgSO₄(g/L)	容积产率（mg/L）
					1	20	4.0	0.240	4.5
2	19	3.8	0.228	6.6
					3	18	3.6	0.216	7.6
4	17	3.4	0.204	8.9
					5	16	3.2	0.192	10.1
6	15	3.0	0.180	9.2

实施例7、响应面法确定显著影响因素的最佳取值

经过PB试验和最陡爬坡法，挑选出了影响发酵的显著因素，并摸索出显著因素的最佳响应区域，但是并不能确定显著因素的确切取值。本研究采用响应面法中的中心复合设计（CCD）对显著影响因素进行3因素3水平摸索，得到二次方程，对数据进行二次回归拟合，以获得显著影响因素的最佳取值。回归分析模型如下：

Y=β0+ΣβiΧi+ΣβiiΧi2+ΣβijΧiΧj

其中，Y是预测的响应值，β0是模型的截距，βi是线性系数，βii是2次方系数，βij是交互项系数，Χi和Χj代表自变量。每组实验中质粒的容积产率进行3次检测，取3次的平均值作为响应值。实验设计和数据分析均利用Minitab软件。本发明依据PB实验和最陡爬坡法实验确定的因素和水平采用中心复合设计（CCD）对质粒发酵培养基进行3因素3水平的响应面分析优化，各个因素和水平见表6，CCD试验设计及结果见表7。

表6中心复合设计水平选择

水平	酵母提取物（g/L）	甘油（mL/L）	MgSO₄(g/L)
				1.68	9.28	1.86	0.232
-1	12	2.4	0.216
				0	16	3.2	0.192
1	20	4	0.168
				1.68	22.72	4.54	0.152

表7中心复合设计及其结果

二次回归拟合及方差分析

对表7中的数据进行二次多项式回归拟合，采用t检验确定显著性。通过响应面回归过程数据分析，建立二次响应面回归模型，以寻求最优响应因素水平，结果如表8所示。从表8中可以看出，酵母提取物、甘油、酵母提取物*酵母提取物、甘油*甘油、硫酸镁*硫酸镁、酵母提取物*甘油、酵母提取物*硫酸镁对响应值的影响具有显著性，其中酵母提取物与甘油，酵母提取物与硫酸镁具有显著的交互作用，说明这几个因素都是质粒发酵过程中的关键因素。剔除了不显著项之后，可以得到一个以质粒容积产率为目标函数的回归方程：

Y=12.3205+0.2690A-0.3755B-1.1938A²-1.1779B²-1.3069C²-0.6250AB-0.7200AC

对该模型进行可信度分析，R²=0.981，说明该模型可以解释响应值变化的98.1％，模型拟合程度好。对模型进行方差分析，该模型的线性项、平方项以及交互作用项均具有显著性，而失拟项p=0.959，不具有显著性，也就证明的本研究所用模型的拟合是很合理的。

表8回归模型的回归分析

表9回归方程方差分析

显著因素水平的优化

利用Minitab软件绘制响应面和等值图，结果如图9所示，每个响应面图（A1-A3图）及其对应的等值线图（B1-B3图）分别代表着两个独立变量之间的相互作用，而此时的第3个变量保持在最佳水平。从图中可以看出，响应变量Y有最大值，因此可以推断出A、B、C存在极值点。分别对回归方程的自变量求一阶偏导数，并令其等于0，能够得到一个三元一次方程组，从而求出A(酵母提取物)、B(甘油)、C(MgSO₄)三个因素的最佳浓度。通过解这个方程组可以得出模型的极值点为：A=16.61g/L、B=3.05mL/L、C=0.185g/L，质粒容积产率的理论最大值为12.38mg/L。综合前面的优化过程，得到了最终最优的培养基成分和含量，结果如表10所示，每1L培养基（ITB）含：酪蛋白胨12g，酵母提取物16.61g，甘油3.05mL，NH₄Cl 1g，0.17mol/L KH₂PO₄和0.72mol/L K₂HPO₄混合溶液100mL，Mg₂SO₄ 0.185g，微量元素1mL，微量元素包括FeCl₃·6H₂O 27g/L、ZnCl₂ 2g/L、CoCl₂·6H₂O 2g/L、Na₂MoO₄·2H₂O 2g/L、CaCl₂·2H₂O1g/L或无水CaCl₂ 0.76g/L、CuCl₂·2H₂O 1.27g/L、H₃BO₃ 0.5g/L溶于1.2mol/L HCl。所述K₂HPO₄和KH₂PO₄混合溶液的配制方法是：用90mL去离子水溶解2.31g KH₂PO₄和12.54g K₂HPO₄，完全溶解后，用去离子水定容至100mL并高压灭菌20min。为了验证优化后的培养基与预期值是否一致，按照表10配制了培养基，进行了3组重复验证试验，得到质粒容积产率分别为：12.45mg/L、12.51mg/L、11.88mg/L，与预期的最大值基本吻合。

表10优化后的培养基成分和含量

实施例8、用工程菌E.coli XL10-Gold/CAVA和高产发酵培养基制备黑色素瘤治疗性质粒DNA疫苗pSVK-CAVA及质粒产量（容积产率）比较

用工程菌E.coli XL10-Gold/CAVA和高产发酵培养基（ITB）制备黑色素瘤治疗性质粒DNA疫苗pSVK-CAVA，以TB、LB、M9（甘油）、和M9（葡萄糖）培养基作为对照，包括以下步骤；

2)制备主种子库：复苏一支原始种子接种于12管LB液体培养基中，2次传代后小提质粒，选取质粒含量最高的菌液扩大至100mL LB培养基中，在37℃、200rpm下培养12小时后加入30％甘油，并分装50管得到主种子库，冻存于-70℃冰箱；

3）制备工作种子库：从主种子库中取1管菌种，接种于12管LB液体培养基中，2次传代后小提质粒，选取质粒含量最高的菌液扩大至100mL LB培养基中，在37℃、200rpm下培养12小时后加入30％甘油，分装50管并冻存于-70℃冰箱，得到工作种子库，用于常规生产，每支工作种子库中的菌种限传5代；

4）复苏一支E.coli XL10-Gold/CAVA工作种子，按1:100接种于5mL高产发酵培养基ITB或TB、LB、M9（甘油）、和M9（葡萄糖）培养基中，37℃、200rpm培养12小时，1:100传代一次后接种于含100mL高产发酵培养基的500mL三角烧瓶中，在37℃、200rpm下振荡培养15h，培养结束后，提质粒，测定质粒浓度。

质粒浓度检测结果如表11所示，结果显示，TB培养基的质粒产量（容积产率）能达到9.9mg/L，比LB培养基提高了60％，也显著的优于M9（甘油）培养基和M9（葡萄糖）培养基；通过以上统计学方法优化出的ITB培养基质粒产量（容积产率）能达到12.38mg/L，比TB培养基提高25％，2倍于LB培养基，说明最终优化得到的ITB培养基能够显著的提高质粒产量（容积产率），表明ITB为高产发酵培养基。

表11用工程菌E.coli XL10-Gold/CAVA和不同发酵培养基制备黑色素瘤治疗性质粒DNA疫苗pSVK-CAVA的质粒产量（容积产率）比较结果

培养基名称	质粒产量（容积产率）（mg/L）
		ITB	12.38
TB	9.9
		LB	6.2
M9（甘油）	3.3
		M9（葡萄糖）	1.1

实施例9：用工程菌E.coli XL10-Gold/CAVA和高产发酵培养基进行黑色素瘤治疗性质粒DNA疫苗pSVK-CAVA的中试生产

种子液的制备：从-70℃复苏一支E.coli XL10-Gold/CAVA工作种子，按1:100接种于5mL的LB液体培养基中，37℃、200rpm培养12小时。按照1:100再转接于100mL的LB液体培养基中，37℃、200rpm培养12小时左右，此时得到种子液。

中试发酵：将种子液按照体积比1:100的量种于5L发酵罐内进行发酵培养（发酵罐内含有高产发酵培养基ITB的量为3L），pH值控制在7.0±0.1，通过发酵罐自动补入H₂SO₄和NH₃.H₂0来调节培养基的pH值。培养温度为37℃，溶解氧控制在30%左右，当溶解氧降低到该值时，通过补充纯氧和提高搅拌速度来调节。发酵培养6h后，按照1mL/min的流速补加高产发酵培养基ITB，总共补加500mL。发酵15小时后，结束发酵，收菌，提取质粒，测定质粒浓度。

对中试产品进行鉴定：用工程菌E.coli XL10-Gold/CAVA和高产发酵培养基ITB进行中试发酵制备黑色素瘤治疗性质粒DNA疫苗pSVK-CAVA，质粒产量能达到150mg/L-200mg/L(容积产率)。

而使用相同的种子液在LB液体培养基中发酵的质粒产量（容积产率）仅为80mg/L-110mg/L左右，表明本发明确定的ITB为高产发酵培养基。

Claims

1.用于制备黑色素瘤治疗性质粒DNA疫苗pSVK-CAVA的工程菌，是转化有黑色素瘤治疗性质粒DNA pSVK-CAVA（或称PSCK-2PFcGB）的大肠杆菌XL10-Gold，命名为E.coli XL10-Gold/CAVA。

2.根据权利要求1所述的工程菌，其特征在于：是将黑色素瘤治疗性pSVK-CAVA质粒DNA转化大肠杆菌XL10-Gold得到，包括但不限于使用Hananhan法、Inoue法、氯化钙法和电击转化法得到转化菌XL10-Gold；再将转化菌XL10-Gold涂布于LB固体平板培养基，在37℃、200rpm下培养15小时后挑取单克隆菌落；将单克隆菌落接种于5mL LB液体培养基中，在37℃、200rpm下培养12小时后按照1:100进行连续传代培养，12小时转接传代1次，可连续传代30代；单克隆菌株以及传代30代以内历次传代菌株均为转化大肠杆菌XL10-Gold的工程菌。

3.根据权利要求1所述的工程菌，其特征在于：为用氯化钙法转化大肠杆菌XL10-Gold的工程菌，转化方法包括：将-70℃保存的100μl感受态细胞XL10-Gold于冰浴中解冻10分钟，然后加入pSVK-CAVA质粒DNA25-50ng,轻柔混匀后，置冰浴中30分钟；冰浴结束后，于42℃水浴中热击90秒,后迅速置于冰浴中冷却3-5分钟，加入800μl无抗性的LB液体培养基,混匀后于37℃，200rpm振荡培养1小时,得到pSVK-CAVA质粒DNA的转化菌XL10-Gold。

4.一种用于制备黑色素瘤治疗性质粒DNA疫苗pSVK-CAVA的发酵培养基ITB，每1L培养基含：酪蛋白胨10-14g，酵母提取物16-20g，甘油2.4-4mL，NH₄Cl 0.75-1g，0.17mol/L KH₂PO₄和0.72mol/L K₂HPO₄混合溶液75-100mL，MgSO₄ 0.168-0.216g，微量元素0.75-1mL。

5.根据权利要求4所述的发酵培养基ITB，其特征在于，每1L培养基含：酪蛋白胨12g，酵母提取物16.61g，甘油3.05mL，NH₄Cl 1g，0.17mol/L KH₂PO₄和0.72mol/LK₂HPO₄混合溶液100mL，MgSO₄ 0.185g，微量元素1mL。

6.根据权利要求4或5所述发酵培养基ITB，其特征在于，微量元素包括：FeCl₃·6H₂O 27g/L、ZnCl₂ 2g/L、CoCl₂·6H₂O 2g/L、Na₂MoO₄·2H₂O 2g/L、CaCl₂·2H₂O1g/L，或无水CaCl₂ 0.76g/L、CuCl₂·2H₂O 1.27g/L、H₃BO₃ 0.5g/L，溶于1.2mol/LHCl。

7.根据权利要求4或5或6所述的发酵培养基ITB，其特征在于：K₂HPO₄和KH₂PO₄混合溶液的配制方法为：用90mL去离子水溶解2.31g KH₂PO₄和12.54g K₂HPO₄，完全溶解后，用去离子水定容至100mL。

8.一种黑色素瘤治疗性质粒DNA疫苗pSVK-CAVA的生产方法，是复苏一支权利要求1或2或3所述工程菌E.coli XL10-Gold/CAVA工作种子，按体积比1:100比例接种于5mL LB液体培养基中，在37℃、200rpm下培养12小时，按照1:100再转接于100mL的LB液体培养基中，37℃、200rpm培养12小时左右，得到种子液；

将种子液按体积比1:100的量接种于含3L权利要求4或5或6或7所述发酵培养基ITB的5L发酵罐内，pH值控制在7.0±0.1，培养温度为37℃，溶解氧控制在30%左右，发酵培养6h；之后按照1mL/min的流速补加发酵培养基ITB，总共补加500mL，发酵15小时后，结束发酵，收菌，提取质粒，得到黑色素瘤治疗性质粒DNA疫苗pSVK-CAVA。

9.工程菌E.coli XL10-Gold/CAVA种子库的构建方法，包括：

1）制备原始种子库：将权利要求1或2或3所述工程菌E.coli XL10-Gold/CAVA菌液0.5mL扩大至100mL LB液体培养基中，在37℃、200rpm下培养12小时，加入30％甘油，分装50管并冻存于-70℃冰箱，得到原始种子库；

10.权利要求9所述方法构建得到的工程菌E.coli XL10-Gold/CAVA种子库，包括原始种子、主种子及工作种子。