CN103214546A - 天然芸苔素内酯类似物的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了提取自植物的芸苔素内酯类似物的提取及其应用，包括促进植物生长、抗低温和耐高盐等方面的应用。另外，本发明还提供了包含该芸苔素内酯类似物的农用组合物。

Description

天然芸苔素内酯类似物的应用

技术领域

本发明属于农用化学技术领域，具体而言，本发明涉及提取自植物的芸苔素内酯类似物及其应用，包括促进植物生长、抗低温和耐高盐等方面的应用。

背景技术

芸苔素内酯是国际上公认为活性最高的高效、广谱、无毒的植物生长调节剂，生理效益比已经发现的另外五大类植物激素高，而被称为世界第六大类植物激素。芸苔素内酯广泛存在于被子植物、裸子植物和某些低等植物中，从在植物体内的分布来看，存在于根、茎、叶、花粉、雌蕊、果实和种子中，如油菜花粉中含有较丰富的芸苔素内酯。

化学合成的芸苔素内酯，如中国专利申请CN1217337A、CN1217338A等所述的，虽然产品较为均一，但是活性成分单一，长期施用效果通常不如天然芸苔素内酯好，这在中国国内已经广泛使用的28-表高芸苔素内酯上表现得尤为突出。

从植物(如，花粉)或其他天然来源(如，蜂蜡)中提取的芸苔素内酯，其中通常含有多种芸苔素内酯结构类似物，其作为一种绿色的生产资料，其推广使用更容易为国内外用户所推崇，但是由于提取中工艺的限制，容易产生产品质量不稳定的情况；如果进一步提纯，则制备成本上升较大，不利于产业化实施，因而阻碍了人们进一步大量纯化，并阻碍了人们去研究其中各芸苔素内酯类似物是否具有芸苔素内酯的活性。例如，Zhu，W.M.等(Synthetic Communications，32(9)，1385-1391)和Suksamararn，A.等(Tetrahedron，58，6033-6037)合成了一些化合物，但仅仅被当成昆虫的蜕皮激素类似物而只启示其的昆虫激素应用。

本发明人通过长期而艰苦的努力，摸索出了从植物中提取(纯化)芸苔素内酯类似物的稳定流程，精心研究了其中的各种提取溶剂，尽管其中需要一定的提纯过程，但是只需要一次提取过程，最终可以收集到多种分离的高纯度的天然芸苔素内酯类似物，因而摊薄了提纯的成本，有利于产业化推广实施；这些分离的天然芸苔素内酯类似物可以单独施用，也可以配比混和施用，因而产品质量稳定而容易控制。在获得了大量分离的高纯度的天然芸苔素内酯类似物的基础上，本发明人进一步研究，令人意外地发现了，这些天然芸苔素内酯类似物在植物生物活性增加、抗低温和耐高盐等方面均有效用，甚至在一定条件下效果、活性高于现有化学合成的芸苔素内酯类产品。

发明内容

本发明要解决的技术问题在于提供了新的天然芸苔素内酯类似物的提取方法和应用，包括促进植物发育、提高植物发芽率、增加植物抗低温性和/或增加植物耐高盐性的应用。另外，本发明还提供了配比稳定的农用组合物，其中包含天然芸苔素内酯类似物。

具体而言，在第一方面，本发明提供了天然芸苔素内酯类似物的提取方法，其包括，

(1)用80～100％(V/V)乙醇水溶液提取破碎的油菜花粉，固液分离后保留滤液(任选其中滤液进一步浓缩)，获得醇溶性提取液；

(2)将醇溶性提取液与0～60％(V/V)乙醇水溶液混合，然后加入乙酸乙酯萃取，保留乙酸乙酯层并加入酯酶进行不完全反应，然后干燥，获得酯溶性提取物；

(3)酯溶性提取物上样于硅胶色谱柱，用甲醇和乙酸乙酯的混和液洗脱，收集含有天然芸苔素内酯类似物的洗脱液，干燥并溶解于甲醇中，获得硅胶柱纯化液；和

(4)将硅胶柱纯化液上样于C18反相色谱柱，用乙腈和水的混和液洗脱，分别收集含有如式BR6、BR1、BR2、BR3、BR4和/或BR5所示的天然芸苔素内酯类似物的洗脱液。

在本文中，“天然”指的是从所限定的物质是从天然来源(如花粉、蜂蜡等)中提取的。在本发明的具体实施方式中，所提供的芸苔素内酯类似物是从油菜花粉中。当然，由于已经解析了这些天然芸苔素内酯类似物，因此它们不限于从天然来源(如花粉、蜂蜡等)中提取，也可以是化学合成的。

在本文中，如式BR6、BR1、BR2、BR3、BR4和BR5所示的天然芸苔素内酯类似物的结构式如下：

以上天然芸苔素内酯类似物可以通过本发明的具体实施方式所述的提取方法依次洗脱，其鉴定图谱分别如图2A～图2F所示。在本发明的具体实施方式中，BR1、BR5和/或BR6是更优选的。

在本发明第一方面的提取方法中，在步骤(1)中，可以使用100％(V/V)乙醇水溶液(即，纯乙醇)，但优选乙醇水溶液的浓度为85～98％(V/V)，优选为90～97％(V/V)，更优选为93～96％(V/V)，最优选为95％(V/V)。

在本发明第一方面的提取方法中，在步骤(1)中，破碎油菜花粉的方式一般是用物理破碎方式，包括超声破碎、碾磨破碎等。

在本发明第一方面的提取方法中，在步骤(1)中，油菜花粉和乙醇水溶液的比例可以优化，比例过低，将使用过量乙醇，需要更高成本的浓缩；比例过高，则提取不充分。经本发明人研究，优选在步骤(1)中，油菜花粉∶乙醇水溶液的重量体积比为50～200克∶200～500mL，优选为80～150克∶250～450mL，更优选为90～120克∶280～350mL，最优选为100克∶300mL。

在步骤(1)中，为了提取完全，可以对提取后的滤渣进一步提取，并如此反复提取滤渣，合并滤液。因此优选在本发明第一方面的提取方法中，步骤(1)进一步包括，固液分离后得到的滤渣用80～100％(V/V)乙醇水溶液提取，然后进行固液分离，保留滤液并与步骤(1)中获得的滤液合并。该步骤可以步骤(1)的其他提取步骤采用相同的条件，而且该步骤固液分离后得到的滤渣可以进一步采用与该步骤相同的步骤提取0～5次，只要最后将所有滤液合并即可。

在步骤(1)中，滤液或者合并的滤液，体积过大，则不利于以后步骤的萃取效率。因此优选在本发明第一方面的提取方法中，在步骤(1)中，滤液进一步浓缩。浓缩是减压干燥浓缩，优选为以65～80℃和0.08～0.09Mpa的真空度干燥浓缩，最优选为以75℃和0.085Mpa的真空度干燥浓缩。浓缩后，优选醇溶性提取液：步骤(2)中的乙醇水溶液的体积比为0.5～2∶1～3，优选为0.8～1.5∶1.5～2.5，最优选为1∶2。

在本发明第一方面的提取方法中，在步骤(2)中，可以使用0％(V/V)乙醇水溶液(即，纯水)，但优选乙醇水溶液的浓度为30～55％(V/V)，优选为40～53％(V/V)，更优选为45～52％(V/V)，最优选为50％(V/V)。

在本发明第一方面的提取方法中，在步骤(2)中，加入的乙酸乙酯的量可以优化。经本发明人研究，优选在步骤(2)中，乙醇水溶液∶乙酸乙酯的体积比为1～3∶3～8，优选为1.5～2.5∶4～6，最优选为2∶5。

在步骤(1)中，为了萃取完全，可以对萃取后的非乙酸乙酯层(即，分离了乙酸乙酯层后剩余的层)进一步提取，并如此反复萃取非乙酸乙酯层，合并乙酸乙酯层。因此优选在本发明第一方面的提取方法中，步骤(2)进一步包括，萃取后得到的非乙酸乙酯层加入乙酸乙酯萃取，保留乙酸乙酯层并与步骤(2)中获得的乙酸乙酯层合并。萃取可以进行1～8次，优选为2～5次。

优选在本发明第一方面的提取方法中，在步骤(2)中，酯酶，也称脂肪酶，能水解甘油三酯或脂肪酸脂产生单或双甘油酯和游离脂肪酸。这样的酶本身已经在食品领域广泛应用。脂肪酶优选是提取自细菌的酯酶，如可以是能够从市场购买获取的脂肪酶，也可以是直接从细菌(如，荧光假单胞菌，优选是CGMCC No.1.867(即AS 1.967)菌株)中提取的酯酶(如参见中国专利申请200810046182.0)。

优选在本发明第一方面的提取方法中，在步骤(2)中，糖化酶，也称葡萄糖淀粉酶，能将淀粉链转化为葡萄糖。这样的酶本身已经在酿造领域广泛应用。糖化酶优选是提取自真菌的糖化酶，如可以是能够从市场购买获取的糖化酶，也可以是直接从真菌(如黑曲霉)中提取的糖化酶。

在本文中，“不完全反应”指的是使酶反应的底物在全部转化前终止反应，由此保持天然芸苔素内酯类似物的多样性。通常完全反应要进行3小时以上，因此优选在本发明第一方面的提取方法中，在步骤(2)中，不完全反应是在35～42℃反应0.5～2小时，优选是在37～41℃反应0.75～1.5小时，最优选在40℃反应1小时。

优选在本发明第一方面的提取方法中，在步骤(2)中，干燥是减压干燥，优选为以65～80℃和0.08～0.09Mpa的真空度干燥，最优选为以75℃和0.085Mpa的真空度干燥。

本发明人发现，初步的提纯以硅胶色谱柱为宜，只需要根据洗脱速度来设置收集的起始和终止时间即可全面收集多种天然芸苔素内酯类似物，简便易行。优选在本发明第一方面的提取方法中，在步骤(3)中，硅胶色谱柱中的填料是200～300目硅胶，最优选是300目硅胶。

在步骤(3)中，潜在可以选择的洗脱液种类繁多，经本发明人研究，发现用甲醇和乙酸乙酯的混和液洗脱，产物较稳定。优选在本发明第一方面的提取方法中，在步骤(3)中，混和液中甲醇∶乙酸乙酯的体积比为3～8∶0.5～1.5，优选为4～7∶0.8～1.3，最优选为5∶1。

优选在本发明第一方面的提取方法中，在步骤(3)中，干燥是减压干燥，优选为以65～80℃和0.08～0.09Mpa的真空度干燥，最优选为以75℃和0.085Mpa的真空度干燥。

在步骤(4)中，潜在可以选择的洗脱液种类繁多，经本发明人研究，发现用乙腈和水的混和液洗脱，可以有效分离各种天然芸苔素内酯类似物。优选在本发明第一方面的提取方法中，在步骤(4)中，混和液中乙腈∶水的体积比为60～90∶10～40，优选为70～80∶20～30，最优选为75∶25。

用本发明第一方面的提取方法提取的天然芸苔素内酯类似物是高纯度的。优选在本发明第一方面的提取方法中，在步骤(4)中，如式BR6、BR1、BR2、BR3、BR4和/或BR5所示的天然芸苔素内酯类似物的纯度大于90％，优选大于95％，更优选大于98％，最优选大于99％。

在第二方面，本发明提供了农用组合物，其是用分离的如式BR6、BR1、BR2、BR3、BR4和/或BR5所示的天然芸苔素内酯类似物同农学上可接受的辅料混合而成的。

在本文中，“农学上可接受的辅料”指的是不干扰、甚至能增强天然芸苔素内酯类似物起效的农用辅料，包括赋形剂、稀释剂、乳化剂、pH调节剂等。在本发明的具体实施方式中，农学上可接受的辅料是水。

优选在本发明第二方面的农用组合物中，天然芸苔素内酯类似物是由本发明第一方面的提取方法提取的，更优选天然芸苔素内酯类似物的纯度大于90％，优选大于95％，更优选大于98％，最优选大于99％。

在本文中，“分离的”指的是天然芸苔素内酯类似物脱离了或者曾经脱离了天然存在的环境而以高于50％的纯度存在或者存在过。尽管天然芸苔素内酯类似物可以重新混合入混合物中从而降低了它本身的纯度，但是曾经的高纯度，便于使得各批次产品稳定。优选本发明第二方面的农用组合物是成分配比稳定的农用组合物。在本文中，“配比稳定”指的是不同批次产品中天然芸苔素内酯类似物的组成和含量是相同的。由于本发明第一方面的提取方法能够将天然芸苔素内酯类似物分离，因此可以单独使用或者重新配比使用，完全能够做到配比稳定。在本发明的具体实施方式中，天然芸苔素内酯类似物的含量介于0.0001-0.1ppm，优选介于0.0005-0.05ppm，如为0.005ppm。如式BR6、BR1、BR2、BR3、BR4和BR5所示的天然芸苔素内酯类似物可以单独使用，也可以混合使用，混合使用时，BR1∶BR2∶BR3∶BR4∶BR5和BR6的重量比可以为0.01～100∶0.01～100∶0.01～100∶0.01～100∶0.01～100∶0.01～100，在本发明的具体实施方式中，BR1∶BR2∶BR3∶BR4∶BR5和BR6的重量比为0.4∶0.4∶0.4∶0.4∶0.4∶98。

在第三方面，本发明提供了分离的如式BR6、BR1、BR2、BR3、BR4和/或BR5所示的天然芸苔素内酯类似物在促进植物生长和/或增强植物抗逆性中的应用；另外，本发明也提供了分离的如式BR6、BR1、BR2、BR3、BR4和/或BR5所示的天然芸苔素内酯类似物在制备促进植物生长和/或增强植物抗逆性的农用组合物中的应用。

优选在本发明第三方面的应用中，植物生长选自植物发育和植物发芽；和/或，植物抗逆性选自植物抗低温性和植物抗高盐性。根据本发明的具体实施方式，这些优异性质在双子叶植物和/或单子叶植物上得到了体现。

优选在本发明第三方面的应用中，植物选自双子叶植物和单子叶植物，优选选自水稻、小麦、玉米、大豆和棉花，更优选选自水稻、玉米和大豆。

本发明取得的优异效果在于，提取(纯化)流程稳定；一次提取，最终可以收集到多种分离的高纯度的天然芸苔素内酯类似物，因而摊薄了成本；多种分离的天然芸苔素内酯类似物可以单独施用，也可以配比混和施用，产品质量稳定而容易控制；多种芸苔素内酯类似物在植物生物活性增加、抗低温和耐高盐等方面均有效用，甚至在一定条件下效果、活性高于现有化学合成的芸苔素内酯类产品。

为了便于理解，以下将通过具体的附图和实施例对本发明进行详细地描述。需要特别指出的是，具体实例和附图仅是为了说明，并不构成对本发明范围的限制。显然本领域的普通技术人员可以根据本文说明，在本发明的范围内对本发明做出各种各样的修正和改变，这些修正和改变也纳入本发明的范围内。另外，本发明引用了公开文献，这些文献也是为了更清楚地描述本发明，它们的全文内容均纳入本发明进行参考，就好像它们的全文已经在本发明说明书中重复叙述过一样。

附图说明

图1显示了天然芸苔素内酯类似物的纯化图谱。

图2显示了各天然芸苔素内酯类似物的质谱鉴定图谱。

具体实施方式

实施例1天然芸苔素内酯类似物的提取和鉴定

取油菜花粉100克，加入95％(V/V)乙醇300mL，超声破碎，过滤，保留滤液；滤渣加入95％(V/V)乙醇300mL，超声破碎，过滤，保留滤液。合并滤液，于75℃、0.085Mpa的真空度干燥浓缩至体积为100mL，得花粉醇提液。

将50％(V/V)乙醇200mL加到花粉醇提液中，混合均匀，然后加入500mL乙酸乙酯萃取，保留上层(乙酸乙酯层)；下层继续加入500mL乙酸乙酯萃取，保留上层(乙酸乙酯层)。合并乙酸乙酯层，加入300mL酶液(即，脂肪酶与糖化酶的混合酶液，其中脂肪酶(购自济宁和美生物工程有限公司)2500U/L，糖化酶(购自济宁和美生物工程有限公司)2000U/L)于40℃搅拌(45rpm)处理1小时，然后于75℃、0.085Mpa的真空度干燥，得酯溶性提取物。

取酯溶性提取物上样于硅胶色谱柱(2.6cm×40cm，300目硅胶)，加流动相(即，甲醇和乙酸乙酯的混和液，甲醇∶乙酸乙酯的体积比为5∶1)洗脱，控制流速为4ml/分钟，收集第40分钟至第150分钟流出的洗脱液，合并后于75℃、0.085Mpa的真空度干燥完全，溶解于10mL甲醇中，得硅胶柱纯化液。

然后，将硅胶柱纯化液上样于C18反相色谱柱(柱参数为50mm×25cm，5μm)，加流动相(即，乙腈和水的混和液，乙腈∶水的体积比为75∶25)洗脱，控制流速为10ml/min，洗脱图谱如图1所示，其中标明了各天然芸苔素内酯类似物的峰及其洗脱时间，可以在各洗脱时间分别收集相应的天然芸苔素内酯类似物(BR6、BR1、BR2、BR3、BR4、BR5)。上述提取流程的稳定性好，综合效率高，能够一次获得上述6种天然芸苔素内酯类似物。

收集天然芸苔素内酯类似物BR1、BR2、BR3、BR4、BR5和BR6，用高分辨率质谱验证(BR1的质谱图谱如图2A所示，BR2的如图2B所示，BR3的如图2C所示，BR4的如图2D所示，BR5的如图2E所示，BR6的如图2F所示)正确，各类似物纯度均高于99％，然后委托四川大学分析测试中心根据标准方法(质谱分析(GB/T 6041-2002)、红外光谱分析(GB/T6040-2002)、超导脉冲傅里叶变换核磁共振谱(JY/T 007-1996)和分子吸收分光光度分析(GB/T 9721-2006))进行测试，解析出各天然芸苔素内酯类似物的如下化学结构：

BR1：

BR2：

BR3：

BR4：

BR5：

BR6：

实施例2天然芸苔素内酯类似物的增强植物发育的测定

我们通过水稻叶片弯曲试验，测量水稻叶片倾斜角来测定天然芸苔素内酯类似物对植物发育的增强作用。水稻叶片倾斜角越大，发育的作用越强。具体试验过程如下：

分别取实施例1制备的天然芸苔素内酯类似物BR1、BR2、BR3、BR4、BR5和BR6，另外将BR1、BR2、BR3、BR4、BR5和BR6混和成混和芸苔素类似物(简称为“BR混”；其中BR1∶BR2∶BR3∶BR4∶BR5和BR6的重量比为0.4∶0.4∶0.4∶0.4∶0.4∶98)，分别溶于95％(V/V)乙醇中，然后用大量的纯水梯度稀释至1mg/L、0.1mg/L、0.01mg/L、0.001mg/L和0.0001mg/L；同时用纯水作为对照。

用5％次氯酸钠溶液将水稻种子消毒处理后，用蒸馏水漂洗至碱性，置于培养皿中，放在30℃±2℃的恒温箱中黑暗环境下水培9天。然后，取出该9天龄的水稻黄化苗，以第二片叶片基部为中心，切取含叶片及叶鞘长各1cm的切断叶片，漂浮于蒸馏水中，置于黑暗环境中，在30℃±2℃的恒温培养箱中培养24小时，取出用滤纸吸于水分。吸干水分的叶片段分别浸入上述含不同浓度的天然芸苔素内酯类似物的溶液或纯水中，每种溶液或纯水中放入采自20株水稻的切断叶片，在黑暗环境中以30℃±2℃的恒温箱中培育48小时。然后，用量角器对水稻幼苗的切断叶片进行测量，测量第二叶与叶鞘之间的倾斜角度。结果如表2-1所示，各天然芸苔素内酯类似物及其混和物均相对于对照，具有明显的增强水稻叶片倾斜效应的作用，均具有植物生长调节活性；而且该效应的增强与天然芸苔素内酯类似物及其混和物的浓度基本成正相关关系，其中在高浓度下，BR1、BR5、BR6和BR混的活性强于BR2、BR3和BR4的。

表2-1天然芸苔素内酯类似物对水稻叶片倾斜的倾斜效应

实施例3天然芸苔素内酯类似物赋予植物抗低温胁迫活性的测定

我们通过低温胁迫实验，测量水稻苗低温胁迫后的株高、叶数、叶面积、分蘖数、根数等参数，来全面反映天然芸苔素内酯类似物对植物抗低温活性的作用。

分别取实施例1制备的天然芸苔素内酯类似物BR1、BR2、BR3、BR4、BR5和BR6，分别溶于95％(V/V)乙醇中，然后用大量的纯水梯度稀释至1mg/L、0.1mg/L、0.01mg/L、0.001mg/L和0.0001mg/L同时用纯水作为对照。

用5％次氯酸钠溶液将水稻种子消毒处理后，用蒸馏水漂洗至碱性，置于培养皿中，放在30℃±2℃的恒温箱中黑暗水培9天。然后，取出该9天龄的水稻黄化苗，分别在1℃、2℃、3℃、4℃和5℃温度下，用上述含不同浓度的天然芸苔素内酯类似物的溶液或纯水浸泡培养24h，测量第3天、6天、9天和12天的株高、叶面积、根重以及第12天的叶数、分蘖数等参数。结果如表3-0～3-6所示，各天然芸苔素内酯类似物均相对于对照，能够在低温情况下，具有明显的增加水稻株高、叶面积和根重的作用，均具有赋予植物抗低温胁迫的活性；而且该作用的增加与天然芸苔素内酯类似物的浓度基本成正相关关系，其中BR1、BR5和BR6的活性略强于BR2、BR3和BR4。

表3-0纯水对照的试验结果

注：表格中斜线划分的数据依次为第3天、6天、9天和12天测量的数据。

表3-1BR1增强水稻抗低温胁迫性的试验结果

注：表格中斜线划分的数据依次为第3天、6天、9天和12天测量的数据。

表3-2BR2增强水稻抗低温胁迫性的试验结果

注：表格中斜线划分的数据依次为第3天、6天、9天和12天测量的数据。

表3-3BR3增强水稻抗低温胁迫性的试验结果

注：表格中斜线划分的数据依次为第3天、6天、9天和12天测量的数据。

表3-4BR4增强水稻抗低温胁迫性的试验结果

注：表格中斜线划分的数据依次为第3天、6天、9天和12天测量的数据。

表3-5BR5增强水稻抗低温胁迫性的试验结果

注：表格中斜线划分的数据依次为第3天、6天、9天和12天测量的数据。

表3-6BR6增强水稻抗低温胁迫性的试验结果

注：表格中斜线划分的数据依次为第3天、6天、9天和12天测量的数据。

实施例4天然芸苔素内酯类似物赋予植物抗高盐的活性测定

我们通过抗高盐胁迫实验，测量水稻种子在高盐环境下的发芽率，来反映天然芸苔素内酯类似物对植物抗高盐活性的作用。

分别取实施例1制备的天然芸苔素内酯类似物BR1、BR2、BR3、BR4、BR5和BR6，另外将BR1、BR2、BR3、BR4、BR5和BR6混和成混和芸苔素类似物(简称为“BR混”；其中BR1∶BR2∶BR3∶BR4∶BR5和BR6的重量比为0.4∶0.4∶0.4∶0.4∶0.4∶98)，分别溶于95％(V/V)乙醇中，然后用大量的纯水梯度稀释至1mg/L、0.1mg/L、0.01mg/L、0.001mg/L和0.0001mg/L；同时用纯水作为对照。向上述含不同浓度的天然芸苔素内酯类似物的溶液或纯水分别添加NaCl，使盐浓度分别达到300、400、500和600mg/L。

用5％次氯酸钠溶液将水稻种子消毒处理后，用蒸馏水漂洗至碱性，置于培养皿中，放在30℃±2℃的恒温箱中以上述含有高浓度盐的不同浓度的天然芸苔素内酯类似物的溶液或纯水培养，观察发芽情况，计算发芽率。结果如表4-0～4-4所示，各天然芸苔素内酯类似物及其混和物相对于对照，基本都能够在高盐环境下，增加水稻株的发芽率，具有赋予植物抗高盐的活性；而且发芽率的增加与天然芸苔素内酯类似物及其混和物的浓度基本成正相关关系。

表4-0纯水对照的试验结果

表4-1BR1、BR2增强水稻耐高盐性的试验结果

表4-2BR3、BR4增强水稻耐高盐性的试验结果

表4-3BR5、BR6增强水稻耐高盐性的试验结果

表4-4BR混增强水稻耐高盐性的试验结果

实施例5天然芸苔素内酯类似物的混合物与化学合成的芸苔素内酯的田间活性测定

将BR1、BR2、BR3、BR4、BR5和BR6混和成混和芸苔素类似物(简称为“BR混”；其中BR1∶BR2∶BR3∶BR4∶BR5和BR6的重量比为0.4∶0.4∶0.4∶0.4∶0.4∶98)；同时用纯水作为阴性对照，用化学合成的表高芸苔素内酯(购自云大科技股份有限公司)作为阳性对照。将BR混和阳性对照分别稀释至至以下浓度：1ppm、0.5ppm、0.1ppm、0.05ppm、0.01ppm、0.005ppm、0.001ppm、0.0005ppm、0.0001ppm，在实验田中对大豆种子进行活性测定。本次试验于7月月9日播种，7月22日、23日、24日调查出苗情况，9月5日对株高进行调查。

结果如表5-1所示，相对于阴性对照，无论是化学合成的表高芸苔素内酯还是从本发明的天然来源中提取的芸苔素类似物的混合物，对大豆的出苗、株高及鲜重、干重都有促进作用的，但是生物活性有所差异。在低浓度下，本发明的BR混的各方面促进生长的效果大都均优于现有化学合成的产品，例如表5-1所示，本发明的BR混以0.005ppm施用的活性甚至基本上高于现有化学合成的表高芸苔素内酯以0.01ppm施用的活性。

表5-1芸苔素内酯生物活性数据(大豆)

Claims (10)

1.天然芸苔素内酯类似物的提取方法，其包括，

(1)用80～100％(V/V)乙醇水溶液提取破碎的油菜花粉，固液分离后保留滤液(任选其中滤液进一步浓缩)，获得醇溶性提取液；

(2)将醇溶性提取液与0～60％(V/V)乙醇水溶液混合，然后加入乙酸乙酯萃取，保留乙酸乙酯层并加入酯酶和糖化酶进行不完全反应，然后干燥，获得酯溶性提取物；

(3)酯溶性提取物上样于硅胶色谱柱，用甲醇和乙酸乙酯的混和液洗脱，收集含有天然芸苔素内酯类似物的洗脱液，干燥并溶解于甲醇中，获得硅胶柱纯化液；和

(4)将硅胶柱纯化液上样于C18反相色谱柱，用乙腈和水的混和液洗脱，分别收集含有如式BR6、BR1、BR2、BR3、BR4和/或BR5所示的天然芸苔素内酯类似物的洗脱液：

2.权利要求1所述的提取方法，其特征在于，在步骤(1)中，

乙醇水溶液的浓度为85～98％(V/V)，优选为90～97％(V/V)，更优选为93～96％(V/V)，最优选为95％(V/V)；

油菜花粉∶乙醇水溶液的重量体积比为50～200克∶200～500mL，优选为80～150克∶250～450mL，更优选为90～120克∶280～350mL，最优选为100克∶300mL；

步骤(1)进一步包括，固液分离后得到的滤渣用80～100％(V/V)乙醇水溶液提取，然后进行固液分离，保留滤液并与步骤(1)中获得的滤液合并；

浓缩是减压干燥浓缩，优选为以65～80℃和0.08～0.09Mpa的真空度干燥浓缩，最优选为以75℃和0.085Mpa的真空度干燥浓缩；和/或

醇溶性提取液：步骤(2)中的乙醇水溶液的体积比为0.5～2∶1～3，优选为0.8～1.5∶1.5～2.5，最优选为1∶2。

3.权利要求1所述的提取方法，其特征在于，在步骤(2)中，

乙醇水溶液的浓度为30～55％(V/V)，优选为40～53％(V/V)，更优选为45～52％(V/V)，最优选为50％(V/V)；

乙醇水溶液∶乙酸乙酯的体积比为1～3∶3～8，优选为1.5～2.5∶4～6，最优选为2∶5；

步骤(2)进一步包括，萃取后得到的非乙酸乙酯层加入乙酸乙酯萃取，保留乙酸乙酯层并与步骤(2)中获得的乙酸乙酯层合并；

酯酶是提取自细菌的酯酶，而且糖化酶是提取自真菌的糖化酶；

不完全反应是在35～42℃反应0.5～2小时，优选是在37～41℃反应0.75～1.5小时，最优选在40℃反应1小时；和/或

干燥是减压干燥，优选为以65～80℃和0.08～0.09Mpa的真空度干燥，最优选为以75℃和0.085Mpa的真空度干燥。

4.权利要求1所述的提取方法，其特征在于，在步骤(3)中，

硅胶色谱柱中的填料是200～300目硅胶，最优选是300目硅胶；

混和液中甲醇∶乙酸乙酯的体积比为3～8∶0.5～1.5，优选为4～7∶0.8～1.3，最优选为5∶1；和/或

干燥是减压干燥，优选为以65～80℃和0.08～0.09Mpa的真空度干燥，最优选为以75℃和0.085Mpa的真空度干燥。

5.权利要求1所述的提取方法，其特征在于，在步骤(4)中，

混和液中乙腈∶水的体积比为60～90∶10～40，优选为70～80∶20～30，最优选为75∶25；和/或

如式BR6、BR1、BR2、BR3、BR4和/或BR5所示的天然芸苔素内酯类似物的纯度大于90％，优选大于95％，更优选大于98％，最优选大于99％。

6.农用组合物，其是用分离的如式BR6、BR1、BR2、BR3、BR4和/或BR5所示的天然芸苔素内酯类似物同农学上可接受的辅料混合而成的：

优选农用组合物是成分配比稳定的农用组合物。

7.权利要求6所述的农用组合物，其中天然芸苔素内酯类似物是由权利要求1～5之任一所述的提取方法提取的，更优选天然芸苔素内酯类似物的纯度大于90％，优选大于95％，更优选大于98％，最优选大于99％。

8.分离的如式BR6、BR1、BR2、BR3、BR4和/或BR5所示的天然芸苔素内酯类似物在促进植物生长和/或增强植物抗逆性中的应用，和/或，在制备促进植物生长和/或增强植物抗逆性的农用组合物中的应用：

9.权利要求8所述的应用，其中，

植物生长选自植物发育和植物发芽；和/或

植物抗逆性选自植物抗低温性和植物抗高盐性。

10.权利要求8所述的应用，其中植物选自双子叶植物和单子叶植物，优选选自水稻、小麦、玉米、大豆和棉花，更优选选自水稻、玉米和大豆。

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