CN115385975B - 一种天然芸苔素类似物hobr的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及植物生理活性物质制备技术领域，公开了一种天然芸苔素类似物HOBR的制备方法，该方法包括步骤：(a)切碎薄叶碎米蕨以形成薄叶碎米蕨碎料；(b)将薄叶碎米蕨碎料辐照处理，辐照剂量为0.01～0.3kGy；(c)将经过辐照的薄叶碎米蕨碎料加浸提剂浸提，得到含有HOBR的浸提液；(d)将HOBR浸提液经纯化精制，很容易获得HOBR纯品。本发明的原材料来源广泛，取材与种植都十分方便，从而降低了提取芸苔素类似物HOBR原料成本，且薄叶碎米蕨仅含HOBR一种芸苔素，而不含有其它芸苔素类似活性物质，降低了后期纯化处理的成本，并便于实现制造过程的工业化，本技术方案属于清洁、安全、环保的天然产物开发技术方案。

Description

一种天然芸苔素类似物HOBR的制备方法
技术领域
本发明涉及天然植物生理活性物质制备技术领域，本发明涉及一种天然芸苔素类似物HOBR的制备方法。
背景技术
芸苔素内酯(Brassinolide，BL)是20世纪70年代从自然界分离鉴定的一系列内源性植物生长调节剂的总称。1970年美国科学家Mitchell等人首次从芸苔属植物油菜花粉中提取出了一种生物活性极高的物质，同时发现该物质能够促进豆苗的生长。1978年英国科学家Mandava等人精制油菜素后，同样也得到这种具有高生物活性的物质。1979年Grove等人从40kg油菜花粉中提取到4mg结晶，经过分离提纯并鉴定其分子结构后将其命名为芸苔素内酯。
自1979年Grove等从油菜花粉提取物中鉴定出芸苔素内酯(Brassinolide，BL)化学结构以来，近43年科学家们先后从植物材料中检测或分离到60余种具有与芸苔素内酯结构相关的类似化合物以及大约15种相关的生物合成前体，这些物质统称为芸苔素甾醇类物质(Brassinosteroids，BRs)，它们存在于6科26种藻类中，2科2种苔藓植物中，8科15种蕨类植物中，4科6种裸子植物中，被子植物35科74种。研究表明芸苔素甾醇类物质有些具有与芸苔素内酯(Brassinolide，BL)相似的生物活性或其它生理活性作用。概括起来主要包括以下几方面的生理效应：①调节维管组织分化，促进茎部生长，促进叶片发育，增强光合效率；②促进侧根和根毛的发育；③可提高植物雄性器官育性，促进种子灌浆和果实成熟，促进种子萌发；④调节植物体内氧化代谢，提高植物对水分、温度、盐分、重金属等多种非生物胁迫的适应性；⑤促进植物对矿质养分的吸收，提高植物营养物质利用效率；因此，芸苔素甾醇参与调节植物生长多个生理过程，对植物生长发育具有重要作用。
(20R,22R)-2β,3β,14,20,22,25-hexahydroxy-5β-cholestan-6-one，中文化学名称为(20R,22R)-2β,3β,14,20,22,25-六羟基-5β-胆甾-6-酮(14-羟基芸苔素甾醇，如图18所示)，化学通用名称为14-hydroxylatedbrassinosteroid(HOBR)，CASNo.为457603-63-3，是较早发现的芸苔素甾醇类似物(芸苔素类似物)，目前，该化合物用于农业大田生产，以促进作物生长，提高产量。
HOBR于2002年首次通过化学合成获得，但收率较低，分离纯化较困难。中国专利CN103214546B公开了从油菜花粉中分离含有该化合物的多种芸苔素类似物混合物的提取技术方案，但该方案制备的不是HOBR工业纯品，且油菜花粉数量有限，采集成本高。
薄叶碎米蕨(Cheilanthestenuifolia(Burm.f.)Sw.是中国蕨科、碎米蕨属蕨类植物。广泛分布于中国广东、海南、广西、云南、湖南南部、江西、福建。也广布于热带亚洲其他各地，以及波利尼西亚、澳大利亚等地。生长在海拔50-1000米的溪旁、田边或林下石上。薄叶碎米蕨分布广泛，生长快速，生物量较大，人工种植容易，因此具有广泛的应用价值。
因此，针对上述现有技术的缺点，现提出一种天然芸苔素类似物HOBR工业纯品的制备方法，能提取出薄叶碎米蕨(如图17所示)中的芸苔素类似物HOBR工业纯品，无需以粮油作物为原材料，经济价值更高，且本方法操作简便，环境污染小，有利于实现清洁、安全的产业化制备。
发明内容
鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明所要解决的技术问题是克服现有HOBR(14-羟基芸苔素甾醇)制备技术方案的原材料不足和难以标准化大量生产的瓶颈问题，提供一种原材料易得，操作简便，环境污染小，有利于实现清洁、安全的产业化制备的技术方案。
为实现上述目的及其他相关目的：
本发明第一方面，提供一种天然芸苔素类似物HOBR的制备方法，包括以下步骤：
(a)切碎薄叶碎米蕨以形成薄叶碎米蕨碎料；
(b)将薄叶碎米蕨碎料辐照处理，辐照剂量为0.01～0.3kGy；
(c)将经过辐照的薄叶碎米蕨碎料加浸提剂浸提，得到含有天然芸苔素类似物HOBR的浸提液。
在本发明一种实施方案中，所述步骤(b)中的辐照为60Co所产生的γ射线，辐照时间为1～48h。
在本发明一种实施方案中，所述步骤(c)中浸提剂包括柠檬酸盐缓冲溶液和有机溶剂；
所述有机溶剂为甲醇、乙醇、乙酸、丙酮、乙腈、乙酸乙酯、石油醚中的一种或多种。在本发明一种实施方案中，一种天然芸苔素类似物HOBR的制备方法，还包括如下步骤：
(d)：步骤(c)中得到的浸提液经负压回收有机溶剂后得到浓缩液，再加入萃取剂萃取，重复萃取3-4次，收集有机相；
(e)：步骤(d)得到的有机相，经负压浓缩回收萃取剂后得到混合物，再加入无水硅胶，得到硅胶混合料；
(f)：将步骤(e)得到的硅胶混合料，采用硅胶层析柱过柱，梯度洗脱分离杂质，得到含有HOBR的洗脱液，再经负压浓缩，回收全部有机溶剂，得到HOBR固体粗品。
在本发明一种实施方案中，步骤(d)中所述萃取剂为二氯甲烷、乙酸乙酯中的至少一种。
在本发明一种实施方案中，步骤(f)中所述梯度洗脱采用的溶剂为乙酸乙酯、石油醚、甲醇、乙醇中的至少一种。
在本发明一种实施方案中，一种天然芸苔素类似物HOBR的制备方法，还包括步骤(g)；
(g)：将步骤(f)得到的HOBR固体粗品，重结晶，得到HOBR纯品。
在本发明一种实施方案中，所述重结晶溶剂选自甲醇、乙醇、乙酸乙酯或石油醚中的至少一种。
在本发明一种实施方案中，所述重结晶溶剂选自体积比为5-15:1的甲醇与乙酸乙酯混合溶液；或
所述重结晶溶剂选自体积比为5-20:1的乙醇与乙酸乙酯混合溶液；或
所述重结晶溶剂选自体积比为1:0.5-5的甲醇与乙醇混合溶液。
本发明提供一种制备目标物HOBR的方法，包括以下步骤：
步骤(1)，将含有HOBR的植物碎料进行辐照处理，辐照剂量为0.01～0.3kGy；
步骤(2)，将辐照后的植物碎料加浸提剂浸提，得到含有目标物HOBR的浸提液；
所述浸提剂包括柠檬酸盐缓冲溶液和有机溶剂。
在本发明一种实施方案中，
所述有机溶剂为甲醇、乙醇、乙酸、丙酮、乙腈、乙酸乙酯、石油醚中的一种或多种。
更进一步地，所述的植物碎料为薄叶碎米蕨碎料。
本发明提供一种天然芸苔素类似物HOBR的制备方法，包括以下步骤：
(S1)切碎薄叶碎米蕨以形成薄叶碎米蕨碎料；
(S2)将薄叶碎米蕨碎料辐照处理，辐照剂量为0.01～0.3kGy；
(S3)将经过辐照的薄叶碎米蕨碎料置于浸提罐中，加浸提剂浸提，得到含有HOBR的浸提液。
在本发明一种实施方案中，所述步骤(S3)中浸提剂包括柠檬酸盐缓冲溶液和有机溶剂的混合溶剂；
所述有机溶剂为甲醇、乙醇、乙酸、丙酮、乙腈、乙酸乙酯、石油醚中的一种或多种。
在本发明一种实施方案中，所述步骤(S2)中的辐照为60Co所产生的γ射线，辐照时间为1～48h。
在本发明一种实施方案中，一种天然芸苔素类似物HOBR的制备方法，还包括如下步骤：
(S4)：将步骤(S3)中收集到的浸提液置于旋转蒸发仪内，负压回收步骤(S3)中得到的浸提液中的浸提剂，回收浸提液总量80％-90％的浸提剂后得到浓缩液，然后加入萃取剂萃取，收集有机相；重复萃取3-4次，合并全部有机相；
(S5)：将步骤(S4)收集得到的有机相置于旋转蒸发仪内，负压旋蒸浓缩，回收总萃取剂的80-90％后，加入无水硅胶，继续在负压状态下，回收全部萃取剂，得到含有HOBR的硅胶固体混合料；
(S6)将步骤(S5)得到的硅胶混合料采用硅胶层析柱过柱，选择适宜的洗脱液，收集含有HOBR的洗脱液，经负压回收全部洗脱液，得到HOBR固体粗品。
可选的，步骤(S4)中所述萃取剂为二氯甲烷、乙酸乙酯中的至少一种。
在本发明一种实施方案中，步骤(S6)中所述适宜的洗脱液，所采用的洗脱液为乙酸乙酯、石油醚、甲醇、乙醇中的至少一种。
其中，采用硅胶层析柱过柱、梯度洗脱的具体步骤为先用石油醚洗脱部分非目标物，再用1:8的乙酸乙酯和石油醚混合洗脱液进一步洗出非目标物，再用1:5的乙酸乙酯和乙醇混合洗脱液洗出非目标物，经TLC检测洗脱液有HOBR被洗出时，先后采用1:2的乙酸乙酯与甲醇混合洗脱液和1:1的乙酸乙酯与甲醇混合洗脱液洗出全部HOBR，直至洗脱液中不再检出HOBR目标物，收集含有HOBR全部洗脱液，负压回收全部洗脱液，得HOBR固体粗品。
在本发明一种实施方案中，一种天然芸苔素类似物HOBR的制备方法，还包括步骤(S7)；
(S7)：重结晶溶剂加热条件下，分次加入步骤(S5)获得的HOBR固体粗品至饱和，常温冷却过夜，有白色晶体析出，收集晶体，然后重复上述步骤将析出晶体二次结晶，最后经2次结晶获得的白色晶体为芸苔素类似物(20R,22R)-2β,3β,14,20,22,25-hexahydroxy-5β-cholestan-6-one(14-羟基芸苔素甾醇)工业纯品。
可选的，所述重结晶溶剂包括但不限于甲醇、乙醇、乙酸乙酯中至少一种。
在本发明一种实施方案中，所述重结晶溶剂为甲醇、乙酸乙酯的混合溶剂；
所述甲醇与乙酸乙酯的体积比为5-15:1。
在本发明一种实施方案中，所述重结晶溶剂为乙醇、乙酸乙酯的混合溶剂；
所述乙醇与乙酸乙酯的体积比为5-20:1。
在本发明一种实施方案中，所述重结晶溶剂为甲醇、乙醇的混合溶剂；
所述甲醇与乙醇的体积比为1:0.5-5。
植物体内主要包含有淀粉、蛋白质、脂类、纤维等各种复杂的有机物和无机物以及其他小分子化合物，采用常规浸提方式时，会因这些复杂的有机物的干扰及致密的植物组织结构而难以直接浸提出目标活性物HOBR；尽管酶解法等现有技术可以在特定的植物器官中提取芸苔素类似物，但也不可避免的存在着纯化复杂，难以标准化生产，以及提取量低等问题。
辐射(辐照)，是指60Co-产生的γ射线照射，使被辐照物质的物理性能和化学组成发生变化，达到人们所需要的目标。
发明人在研究中发现采用适宜的剂量60Coγ射线辐射处理薄叶碎米蕨后，再通过筛选特种浸提剂能够在不增加特殊设施设备条件下高效浸提目标物质HOBR，而且受色素、酚类、肽类、糖、脂类等的杂质干扰较小，纯化操作简便。其主要原理是小剂量的60Coγ射线照射处理原材料生物骨架结构变得松散，尤其是被生物受体束缚的HOBR活性物在60Coγ射线照射能够得到游离释放，从而使浸提过程变得更容易，更高效。同时，更重要的是由于在60Coγ射线照射处理时，筛选适宜的剂量，在不破坏原材料的大分子生物结构的情况下，明显减少游离状态的色素、酚类、肽类、糖、脂类等干扰物的影响，从而使浸提物组分相对较简单，再配合特定混合浸提溶剂处理，即可大大缩短浸提处理时间，提高后期分离纯化效率，并降低了技术操作难度。
现有技术通常是从油菜花粉中分离出芸苔素类似物，而油菜作为粮油作物，其花粉本身来源少，制造成本高；本发明以薄叶碎米蕨为原材料提取HOBR，原料分布广泛，生长快速，生物量大，且可采用人工种植，最重要的是以薄叶碎米蕨为原材料，其芸苔素类似物仅有HOBR，而不含其它的苔素类似物，因此以薄叶碎米蕨为原材料，制备HOBR、提高产品纯度具有十分优越的的工业化价值，也因此大大提高了天然芸苔素类似物HOBR的制备水平，提升了经济效益，且就国家粮食作物方面而言，本方案更具有重要的社会意义。
现有技术采用酶解法从油菜花粉中提取天然芸苔素类似物，而酶解法需要先制酶，制酶过程复杂，每一批次的酶活性难以严格控制；这就造成了后续酶解过程中所提取的天然芸苔素类似物的不稳定性；本方案则是通过特定剂量的辐照进行物理处理，然后通过浸提剂浸提萃取制备目标物，其制备过程清洁、环保、便于稳定控制；进而本发明能实现从植物中稳定的产业化的制备天然芸苔素类似物HOBR。
本发明的有益效果是：
(1)本发明技术方案浸提技术采用辐照处理，选择适宜的辐射强度，一方面通过辐射达到松弛目标物质的物理束缚目的，使目标物尽可能处于游离状态，从而实现快速提取；另一方面，更重要的是选择适宜的辐射强度，在不破坏植物组织中蛋白质、核酸、糖类、纤维等大分子生物结构的情况下，将一些游离的蛋白质、色素、酚类等干扰物质极性基团进行破坏处理，增加干扰物质与目标物极性差异，最大限度减少非目标物的干扰，以便于后续分离，从而大大降低了后期纯化处理的成本；
(2)本发明技术方案提取后的料渣，因经过辐照辐射处理，植株原含有的蛋白质、核酸、糖类、纤维等物质被固定在浸提渣料中，这些化合物通常具有独特的生理活性，因此渣料可制成肥料用于薄叶碎米蕨原材料种植，使天然资源得到最大价值循环利用；
(3)本发明技术方案原材料为薄叶碎米蕨，仅含有目标物HOBR一种天然芸苔素组分，而不含其它芸苔素类似物，有利于分离纯化，降低高纯度产品制备成本；同时，薄叶碎米蕨原材料来源广泛，取材与种植都十分方便，能实现观赏与产业化开发兼顾发展，大大降低该物质制造难度；本方案制备过程中所使用溶剂可实现无损耗回收，可重复利用，并无“三废”排放，属于清洁、安全、环保天然产物开发技术方案，且本方案改变现有技术通过酶解法从油菜花花粉提取天然芸苔素的现状，具有显著的经济价值和重要的社会价值。
附图说明
图1为施例1制备的HOBR产品的紫外光谱图；
图2为标准品紫外光谱图；
图3为施例1制备HOBR产品的HPLC色谱图；
图4为标准品HPLC色谱图如图；
图5为实施例1步骤(4)收集的有机相色谱图；
图6为实施例1步骤(4)收集的有机相色谱图其目标峰处的放大图；
图7为未经辐照处理有柠檬酸盐缓冲溶液浸提萃取有机相色谱图；
图8为未经辐照处理有柠檬酸盐缓冲溶液浸提萃取有机相色谱图其目标峰处的放大图；
图9为经辐照处理无缓冲体系浸提液萃取有机相色谱图；
图10为经辐照处理无缓冲体系浸提液萃取有机相色谱图其目标峰处的放大图；
图11为大剂量辐照处理后经缓冲体系浸提液萃取得到的有机相色谱图；
图12为大剂量辐照处理后经缓冲体系浸提液萃取得到的有机相色谱图其目标峰处的放大图；
图13为水稻倾斜角度示意图；
图14为水培实验对比图；
图15为水稻叶片对比图；
图16为水稻植株对比图；
图17为薄叶碎米蕨植株图；
图18为HOBR结构式。
具体实施方式
下面结合具体实施例进一步详细描述本发明的技术方案，但本发明的保护范围不局限于以下所述。
实施例1：
一种芸苔素类似物HOBR的提取与制备方法，其具体分离纯化包括如下步骤：
(1)、选取1年生薄叶碎米蕨植株50kg，包括根、茎、叶，在去除可见机械杂质后切成小于3cm的碎段；
然后将碎段打包成10kg的小捆置于60Co辐照室，利用60Co产生的γ射线在0.01kGy的射线强度下先辐照2h，调整角度再辐照2h，使物料被均匀辐照后取出；
(2)、将经过60Co辐照后的薄叶碎米蕨碎料置于浸提罐中，加入150kg乙醇，25kg柠檬酸盐缓冲溶液(pH＝2)，室温条件下，30r/min转速缓慢搅拌2h，静置1h，继续搅拌4h静置1h，再继续搅拌48h，静置2h，滤出清夜；再加入100kg乙醇和25kg柠檬酸盐缓冲溶液重复上述操作，滤出清夜；
(3)、合并(2)中取得的两次清液，用负压旋蒸回收多余的乙醇，剩余浓缩物约100kg；
(4)、将50kg萃取剂二氯甲烷加入步骤(3)所获得浓缩物中，大于200r/min转速条件下充分搅拌10min，静置直至清晰分层，收集下层有机相；上层水相中加入25kg萃取剂二氯甲烷重复搅拌分层收集操作，收集下层有机相；继续上述操作，再重复1次；合并3次收集的有机相；
(5)、将步骤(4)获得的有机相，采用负压旋蒸浓缩回收90％的二氯甲烷溶剂后，再向浓缩物中加入约10kg100号无水硅胶，继续负压回收剩余的二氯甲烷溶剂，直到二氯甲烷溶剂回收完全，然后取出旋转蒸发仪中硅胶固体混合料备用；
(6)、将步骤(5)获得的硅胶固体混合料，按硅胶固体混合料与硅胶质量比1:3的量上硅胶层析柱，先用石油醚洗脱部分非目标物，再用1:8的乙酸乙酯和石油醚混合洗脱液进一步洗出非目标物，再用1:5的乙酸乙酯和乙醇混合洗脱液洗出非目标物，经TLC检测洗脱液有HOBR被洗出时，先后采用1:2的乙酸乙酯与甲醇混合洗脱液和1:1的乙酸乙酯与甲醇混合洗脱液洗出全部HOBR，直至洗脱液中不再检出HOBR目标物，收集含有HOBR全部洗脱液，负压回收全部洗脱液，得HOBR固体粗品；
(7)、将步骤(6)获得的固体粗品，经2次重结晶得10.16g白色晶体为芸苔素类似物，经与标准品对比为(20R,22R)-2β,3β,14,20,22,25-hexahydroxy-5β-cholestan-6-one(14-羟基芸苔素甾醇，HOBR)，经HPLC检测纯度为93.32％的HOBR(14-羟基芸苔素甾醇)。
进一步地，本实施例中，步骤(3)中回收的乙醇，以及步骤(5)中回收的二氯甲烷溶剂均可重复使用；步骤(6)中使用的洗脱液可通过负压回收后再利用。
进一步地，本实施例中，将步骤(4)中水相收集，调pH之后可重复利用也可以与料渣混合制成肥料使用。
进一步地，步骤(7)中重结晶的具体操作为：加热条件下，将步骤(6)得到的固体粗品溶于乙醇至饱和，常温冷却静置过夜，会有白色晶体析出，过滤，收集析出晶体，再次结晶后所得的白色晶体为芸苔素类似物(20R,22R)-2β,3β,14,20,22,25-hexahydroxy-5β-cholestan-6-one(14-羟基芸苔素甾醇)。
本实施例步骤(7)所得产品与标准品的比较：
本实施例制得产品紫外光谱图如图1所示，标准品紫外光谱图如图2所示；本实施例制得产品HPLC色谱图如图3所示，标准品HPLC色谱图如图4所示；
从图1、图2的紫外可见光谱图中可看出本方案制备的产品与市售标准品的特征吸收峰一致；如图3和图4所示，本实施例制得产品检测的HPLC色谱图与标准品一致，可见，本发明方法成功的制备出芸苔素类似物(20R,22R)-2β,3β,14,20,22,25-hexahydroxy-5β-cholestan-6-one(14-羟基芸苔素甾醇)。
实施例2：
一种芸苔素类似物HOBR的提取与制备方法，其具体分离纯化包括如下步骤：
(1)、选取2年生薄叶碎米蕨植株10kg，包括根、茎、叶，在去除可见机械杂质后切成小于3cm的碎段，置于60Co辐照室，利用60Co产生的γ射线在0.3kGy的射线强度下辐照0.5h，调整角度再辐照0.5h，使物料被均匀辐照后取出；
(2)、将经过60Co辐照后的薄叶碎米蕨碎料置于浸提罐中，加入10kg甲醇，pH3的柠檬酸盐缓冲溶液5kg；室温条件下，150kHz超声振荡作用下浸提1h，静置1h，继续超声震荡2h，静置1h，再搅拌24h，静置2h，滤掉机械杂质，收集含有HOBR浸提液；再加入10kg甲醇和柠檬酸盐缓冲溶液2kg重复上述操作，滤出清夜；
(3)、合并(2)中取得的两次清液，用负压旋蒸回收多余的甲醇，剩余浓缩物约10kg，回收的甲醇可重复使用；
(4)、将10kg萃取剂二氯甲烷加入步骤(2)所获得浓缩物中，大于200r/min转速条件下充分搅拌10min，静置直至清晰分层，收集下层有机相；上层水相中加入5kg二氯甲烷重复搅拌分层收集操作，收集下层有机相；继续上述操作，再重复1次；合并3次收集的有机相；
(5)、将步骤(4)获得的有机相，采用负压旋蒸浓缩回收90％的二氯甲烷溶剂后，再向浓缩物中加入约3kg200号无水硅胶，继续负压回收剩余的二氯甲烷溶剂，直到二氯甲烷溶剂回收完全，然后取出旋转蒸发仪中硅胶固体混合料备用；
(6)、将步骤(5)获得的硅胶固体混合料，按硅胶固体混合料与硅胶质量比1:3的量上硅胶层析柱，先用石油醚洗脱部分非目标物，再用1:8的乙酸乙酯和石油醚混合洗脱液进一步洗出非目标物，再用1:5的乙酸乙酯和乙醇混合洗脱液洗出非目标物，经TLC检测洗脱液有HOBR被洗出时，先后采用1:2的乙酸乙酯与甲醇混合洗脱液和1:1的乙酸乙酯与甲醇混合洗脱液洗出全部HOBR，直至洗脱液中不再检出HOBR目标物，收集含有HOBR全部洗脱液，负压回收全部洗脱液，得HOBR固体粗品；
(7)、将步骤(6)获得的固体粗品，经2次重结晶得白色晶体为芸苔素类似物，经与标准品对比为(20R,22R)-2β,3β,14,20,22,25-hexahydroxy-5β-cholestan-6-one(14-羟基芸苔素甾醇，HOBR)，经HPLC检测纯度为94.12％的HOBR(14-羟基芸苔素甾醇)。
进一步地，步骤(7)中重结晶的具体操作为：加热条件下，将步骤(6)得到的固体粗品溶于重结晶溶剂至饱和，常温冷却静置过夜，会有白色晶体析出，过滤，收集析出晶体，再次结晶后所得的1.36g白色晶体为芸苔素类似物(20R,22R)-2β,3β,14,20,22,25-hexahydroxy-5β-cholestan-6-one(14-羟基芸苔素甾醇)。
进一步地，本实施例的步骤(7)中，重结晶溶剂为乙酸乙酯、甲醇的混合溶剂；且该混合溶剂中甲醇与乙酸乙酯的体积比为7:1。
本实施中，将步骤(4)中水相收集调pH之后可重复利用，步骤(6)的洗脱液通过负压回收后重复利用。
进一步地，本实施例中，步骤(5)中回收的萃取剂二氯甲烷可重复利用。
实施例3：
一种芸苔素类似物HOBR的提取与制备方法，其具体分离纯化包括如下步骤：
(1)、选取1.5年生薄叶碎米蕨植株50kg，包括根、茎、叶，在去除可见机械杂质后切成小于3cm的碎段，然后将碎段打包成10kg的小捆置于60Co辐照室，利用60Co产生的γ射线在0.03kGy的射线强度下先辐照1h，调整角度再辐照1h，使物料被均匀辐照后取出；
(2)、将经过60Co辐照后的薄叶碎米蕨碎料置于浸提罐中，加入150kg乙醇，25kg柠檬酸盐缓冲溶液(pH＝2)，室温条件下，30r/min转速缓慢搅拌2h，静置1h，继续搅拌4h静置1h，再继续搅拌48h，静置2h，滤出清夜；再加入100kg乙醇和25kg柠檬酸盐缓冲溶液重复上述操作，滤出清夜；
(3)、合并(2)中取得的两次清液，用负压旋蒸回收多余的乙醇，剩余浓缩物约100kg；
(4)、将50kg萃取剂二氯甲烷加入步骤(3)所获得浓缩物中，大于200r/min转速条件下充分搅拌10min，静置直至清晰分层，收集下层有机相；上层水相中加入25kg二氯甲烷重复搅拌分层收集操作，收集下层有机相；继续上述操作，再重复1次；合并3次收集的有机相；
(5)、将步骤(4)获得的有机相，采用负压旋蒸浓缩回收90％的二氯甲烷溶剂后，再向浓缩物中加入约10kg100号无水硅胶，继续负压回收剩余的二氯甲烷溶剂，直到二氯甲烷溶剂回收完全，然后取出旋转蒸发仪中硅胶固体混合料备用；
(6)、将步骤(5)获得的硅胶固体混合料，按硅胶固体混合料与硅胶质量比1:3的量上硅胶层析柱，先用石油醚洗脱部分非目标物，再用1:8的乙酸乙酯和石油醚混合洗脱液进一步洗出非目标物，再用1:5的乙酸乙酯和乙醇混合洗脱液洗出非目标物，经TLC检测洗脱液有HOBR被洗出时，先后采用1:2的乙酸乙酯与甲醇混合洗脱液和1:1的乙酸乙酯与甲醇混合洗脱液洗出全部HOBR，直至洗脱液中不再检出HOBR目标物，收集含有HOBR全部洗脱液，负压回收全部洗脱液，得HOBR固体粗品。；
(7)、将步骤(6)获得的固体粗品，经2次重结晶得9.10g白色晶体为芸苔素类似物，经与标准品对比为芸苔素类似物(20R,22R)-2β,3β,14,20,22,25-hexahydroxy-5β-cholestan-6-one(14-羟基芸苔素甾醇)，经HPLC检测纯度为92.2％的HOBR(14-羟基芸苔素甾醇)工业纯品。
进一步地，本实施例步骤(7)中，重结晶溶剂为甲醇、乙醇的混合溶剂；且甲醇与乙醇的体积比为1:1。
实施例4：
一种天然芸苔素类似物HOBR的制备方法，其具体分离纯化包括如下步骤：
(1)、选取1年生薄叶碎米蕨植株50kg，包括根、茎、叶，在去除可见机械杂质后切成小于3cm的碎段，然后将碎段打包成10kg的小捆置于60Co辐照室，在0.15kGy的射线强度下先辐照5h，调整角度再辐照5h，使物料被均匀辐照后取出；
(2)、将经辐照后的薄叶碎米蕨碎料置于浸提罐中，加入150kg丙酮，25kg柠檬酸盐缓冲溶液(pH＝2)，室温条件下，30r/min转速缓慢搅拌2h，静置1h，继续搅拌4h静置1h，再继续搅拌48h，静置2h，滤出清夜；再加入100kg丙酮和25kg柠檬酸盐缓冲溶液重复上述操作，滤出清夜；
(3)、合并(2)中取得的两次清液，用负压旋蒸回收多余的丙酮，剩余浓缩物约100kg；
(4)、将50kg萃取剂二氯甲烷加入步骤(3)所获得浓缩物中，大于200r/min转速条件下充分搅拌10min，静置直至清晰分层，收集下层有机相；上层水相中加入25kg二氯甲烷重复搅拌分层收集操作，收集下层有机相；继续上述操作，再重复1次；合并3次收集的有机相；
(5)、将步骤(4)获得的有机相，采用负压旋蒸浓缩回收90％的二氯甲烷溶剂后，再向浓缩物中加入约10kg100号无水硅胶，继续负压回收剩余的二氯甲烷溶剂，直到二氯甲烷溶剂回收完全，然后取出旋转蒸发仪中硅胶固体混合料备用；
(6)、将步骤(5)获得的硅胶固体混合料，按硅胶固体混合料与硅胶质量比1:3的量上硅胶层析柱，先用石油醚洗脱部分非目标物，再用1:8的乙酸乙酯和石油醚混合洗脱液进一步洗出非目标物，再用1:5的乙酸乙酯和乙醇混合洗脱液洗出非目标物，经TLC检测洗脱液有HOBR被洗出时，先后采用1:2的乙酸乙酯与甲醇混合洗脱液和1:1的乙酸乙酯与甲醇混合洗脱液洗出全部HOBR，直至洗脱液中不再检出HOBR目标物，收集含有HOBR全部洗脱液，负压回收全部洗脱液，得HOBR固体粗品；
(7)、将步骤(6)获得的固体粗品，采用乙醇作溶剂经2次重结晶得8.85g白色晶体为芸苔素类似物，经与标准品对比为芸苔素类似物(20R,22R)-2β,3β,14,20,22,25-hexahydroxy-5β-cholestan-6-one(14-羟基芸苔素甾醇)，经HPLC检测纯度为91.8％的HOBR(14-羟基芸苔素甾醇)工业纯品。
实施例5
一种天然芸苔素类似物HOBR的制备方法，其具体分离纯化包括如下步骤：
(1)、选取1年生薄叶碎米蕨植株50kg，包括根、茎、叶，在去除可见机械杂质后切成小于3cm的碎段，然后将碎段打包成10kg的小捆置于60Co辐照室，在0.2kGy的射线强度下先辐照1h，调整角度再辐照1h，使物料被均匀辐照后取出；
(2)、将经辐照后的薄叶碎米蕨碎料置于浸提罐中，加入50kg甲醇、50kg乙腈、50kg丙酮，以及25kg柠檬酸盐缓冲溶液(pH＝2)，室温条件下，30r/min转速缓慢搅拌2h，静置1h，继续搅拌4h静置1h，再继续搅拌48h，静置2h，滤出清夜；再加入30kg甲醇、30kg乙腈、30kg丙酮和25kg柠檬酸盐缓冲溶液重复上述操作，滤出清夜；
(3)、合并(2)中取得的两次清液，用负压旋蒸回收多余的甲醇、乙腈、丙酮，剩余浓缩物约100kg；
(4)、将50kg萃取剂乙酸乙酯加入步骤(3)所获得浓缩物中，大于200r/min转速条件下充分搅拌10min，静置直至清晰分层，收集下层有机相；上层水相中加入25kg乙酸乙酯重复搅拌分层收集操作，收集下层有机相；继续上述操作，再重复1次；合并3次收集的有机相；
(5)、将步骤(4)获得的有机相，采用负压旋蒸浓缩回收90％的乙酸乙酯溶剂后，再向浓缩物中加入约10kg100号无水硅胶，继续负压回收剩余的乙酸乙酯溶剂，直到乙酸乙酯溶剂回收完全，然后取出旋转蒸发仪中硅胶固体混合料备用；
(6)、将步骤(5)获得的硅胶固体混合料，按硅胶固体混合料与硅胶质量比1:3的量上硅胶层析柱，先用石油醚洗脱部分非目标物，再用1:8的乙酸乙酯和石油醚混合洗脱液进一步洗出非目标物，再用1:5的乙酸乙酯和乙醇混合洗脱液洗出非目标物，经TLC检测洗脱液有HOBR被洗出时，先后采用1:2的乙酸乙酯与甲醇混合洗脱液和1:1的乙酸乙酯与甲醇混合洗脱液洗出全部HOBR，直至洗脱液中不再检出HOBR目标物，收集含有HOBR全部洗脱液，负压回收全部洗脱液，得HOBR固体粗品；
(7)、将步骤(6)获得的固体粗品，采用乙醇作溶剂经2次重结晶得8.26g白色晶体为芸苔素类似物，经与标准品对比为芸苔素类似物(20R,22R)-2β,3β,14,20,22,25-hexahydroxy-5β-cholestan-6-one(14-羟基芸苔素甾醇)，经HPLC检测纯度为92.3％的HOBR(14-羟基芸苔素甾醇)工业纯品。
实施例6
一种天然芸苔素类似物HOBR的制备方法，其具体分离纯化包括如下步骤：
(1)、选取1年生薄叶碎米蕨植株50kg，包括根、茎、叶，在去除可见机械杂质后切成小于3cm的碎段，然后将碎段打包成10kg的小捆置于60Co辐照室，在0.25kGy的射线强度下先辐照1h，调整角度再辐照1h，使物料被均匀辐照后取出；
(2)、将经辐照后的薄叶碎米蕨碎料置于浸提罐中，加入50kg丙酮、50kg乙腈、50kg石油醚，以及25kg柠檬酸盐缓冲溶液(pH＝2)，室温条件下，30r/min转速缓慢搅拌2h，静置1h，继续搅拌4h静置1h，再继续搅拌48h，静置2h，滤出清夜；再加入30kg丙酮、30kg乙腈、30kg石油醚和25kg柠檬酸盐缓冲溶液重复上述操作，滤出清夜；
(3)、合并(2)中取得的两次清液，用负压旋蒸回收多余的丙酮、乙腈、石油醚，剩余浓缩物约100kg；
(4)、将50kg萃取剂加入步骤(3)所获得浓缩物中，大于200r/min转速条件下充分搅拌10min，静置直至清晰分层，收集下层有机相；上层水相中加入25kg萃取剂重复搅拌分层收集操作，收集下层有机相；继续上述操作，再重复1次；合并3次收集的有机相；其中，萃取剂为体积比1:1的二氯甲烷与乙酸乙酯混合溶液。
(5)、将步骤(4)获得的有机相，采用负压旋蒸浓缩回收90％的萃取剂后，再向浓缩物中加入约10kg100号无水硅胶，继续负压回收剩余的萃取剂，直到萃取剂回收完全，然后取出旋转蒸发仪中硅胶固体混合料备用；
(6)、将步骤(5)获得的硅胶固体混合料，按硅胶固体混合料与硅胶质量比1:3的量上硅胶层析柱，先用石油醚洗脱部分非目标物，再用1:8的乙酸乙酯和石油醚混合洗脱液进一步洗出非目标物，再用1:5的乙酸乙酯和乙醇混合洗脱液洗出非目标物，经TLC检测洗脱液有HOBR被洗出时，先后采用1:2的乙酸乙酯与甲醇混合洗脱液和1:1的乙酸乙酯与甲醇混合洗脱液洗出全部HOBR，直至洗脱液中不再检出HOBR目标物，收集含有HOBR全部洗脱液，负压回收全部洗脱液，得HOBR固体粗品；
(7)、将步骤(6)获得的固体粗品，采用乙醇作溶剂经2次重结晶得8.10g白色晶体为芸苔素类似物，经与标准品对比为芸苔素类似物(20R,22R)-2β,3β,14,20,22,25-hexahydroxy-5β-cholestan-6-one(14-羟基芸苔素甾醇)，经HPLC检测纯度为91.9％的HOBR(14-羟基芸苔素甾醇)工业纯品。
实施例7：
一种浸提目标物HOBR的方法，包括以下步骤：
步骤(1)，将植物碎料进行辐照处理，辐照剂量为0.01～0.3kGy；
其中，植物碎料为薄叶碎米蕨碎料；
具体的，步骤(1)是选取1年生薄叶碎米蕨植株50kg，包括根、茎、叶，在去除可见机械杂质后切成小于3cm的碎段，然后将碎段打包成10kg的小捆置于60Co辐照室，利用60Co产生的γ射线在0.1kGy的射线强度下先辐照10h，调整角度再辐照10h，使物料被均匀辐照后取出；
步骤(2)，将辐照后的植物碎料置于浸提罐中，用浸提剂浸提，滤掉机械杂质，收集含有目标物质的浸提液；
所述浸提剂包括柠檬酸盐缓冲溶液和有机溶剂的混合溶剂。
所述有机溶剂为甲醇、乙醇、乙酸、丙酮、乙腈、乙酸乙酯、石油醚中的一种或多种。
本方案中，具体的步骤(2)是将经过60Co辐照后的薄叶碎米蕨碎料置于浸提罐中，加入150kg乙腈，和25kg柠檬酸盐缓冲溶液(pH＝2)，室温条件下，30r/min转速缓慢搅拌2h，静置1h，继续搅拌4h静置1h，再继续搅拌48h，静置2h，滤出清夜；再加入100kg乙腈和25kg柠檬酸盐缓冲溶液重复上述操作，滤出清夜；
进一步地，步骤(3)合并步骤(2)中取得的两次清液，用负压旋蒸回收多余的乙腈，剩余浓缩物约100kg；
步骤(4)将50kg萃取剂二氯甲烷加入步骤(3)所获得浓缩物中，大于200r/min转速条件下充分搅拌10min，静置直至清晰分层，收集下层有机相；上层水相中加入25kg二氯甲烷重复搅拌分层收集操作，收集下层有机相；继续上述操作，再重复1次；合并3次收集的有机相；
步骤(5)将步骤(4)获得的有机相，采用负压旋蒸浓缩回收90％的二氯甲烷溶剂后，再向浓缩物中加入约10kg100号无水硅胶，继续负压回收剩余的二氯甲烷溶剂，直到二氯甲烷溶剂回收完全，然后取出旋转蒸发仪中硅胶固体混合料备用；
步骤(6)将步骤(5)获得的硅胶固体混合料，按硅胶固体混合料与硅胶质量比1:3的量上硅胶层析柱，用体积比1:5的乙酸乙酯与石油醚混合洗脱液洗出大部分色素、脂类等杂质后，再用体积比5:2的乙酸乙酯与石油醚混合洗脱液洗出脂类、酚类、蛋白等杂质后，再用1:1的乙酸乙酯与甲醇混合洗脱液洗出本发明目标产品；
步骤(7)将步骤(6)获得的含有本发明目标产品的洗脱液经负压浓缩后所获得的初品，采用重结晶溶剂重结晶3次获得的9.25g白色晶体为芸苔素类似物(20R,22R)-2β,3β,14,20,22,25-hexahydroxy-5β-cholestan-6-one(14-羟基芸苔素甾醇)，经HPLC检测纯度为93.9％的HOBR(14-羟基芸苔素甾醇)工业纯品。
进一步地，本实施例步骤(7)中，重结晶溶剂为乙醇、石油醚的混合溶剂；且乙醇与石油醚的体积比为1:10。
实施例8：
一种芸苔素类似物HOBR的提取与制备方法，其具体分离纯化包括如下步骤：
(1)、选取1年生薄叶碎米蕨植株50kg，包括根、茎、叶，在去除可见机械杂质后切成小于3cm的碎段；
然后将碎段打包成10kg的小捆置于60Co辐照室，利用60Co产生的γ射线在0.01kGy的射线强度下先辐照24h，调整角度再辐照24h，使物料被均匀辐照后取出；
(2)、将经过60Co辐照后的薄叶碎米蕨碎料置于浸提罐中，加入150kg乙酸乙酯，25kg柠檬酸盐缓冲溶液(pH＝2)，室温条件下，30r/min转速缓慢搅拌2h，静置1h，继续搅拌4h静置1h，再继续搅拌48h，静置2h，滤出清夜；再加入100kg乙酸乙酯和25kg柠檬酸盐缓冲溶液重复上述操作，滤出清夜；
(3)、合并(2)中取得的两次清液，用负压旋蒸回收多余的乙酸乙酯，剩余浓缩物约100kg；
(4)、将50kg萃取剂二氯甲烷加入步骤(3)所获得浓缩物中，大于200r/min转速条件下充分搅拌10min，静置直至清晰分层，收集下层有机相；上层水相中加入25kg萃取剂二氯甲烷重复搅拌分层收集操作，收集下层有机相；继续上述操作，再重复1次；合并3次收集的有机相；
(5)、将步骤(4)获得的有机相，采用负压旋蒸浓缩回收90％的二氯甲烷溶剂后，再向浓缩物中加入约10kg100号无水硅胶，继续负压回收剩余的二氯甲烷溶剂，直到二氯甲烷溶剂回收完全，然后取出旋转蒸发仪中硅胶固体混合料备用；
(6)、将步骤(5)获得的硅胶固体混合料，按硅胶固体混合料与硅胶质量比1:3的量上硅胶层析柱，用体积比1:5的乙酸乙酯与石油醚混合洗脱液洗出大部分色素、脂类等杂质后，再用体积比5:2的乙酸乙酯与石油醚混合洗脱液洗出脂类、酚类、蛋白等杂质后，再用1:1的乙酸乙酯与甲醇混合洗脱液洗出本发明目标产品；
(7)、将步骤(6)获得的含有本发明目标产品的洗脱液经负压浓缩后所获得的固体粗品，采用重结晶溶剂重结晶3次获得的9.85g白色晶体为芸苔素类似物(20R,22R)-2β,3β,14,20,22,25-hexahydroxy-5β-cholestan-6-one(14-羟基芸苔素甾醇)，经HPLC检测纯度为93.8％的HOBR(14-羟基芸苔素甾醇)工业纯品。
进一步地，本实施例步骤(7)中，重结晶溶剂为乙醇、乙酸乙酯的混合溶剂；且乙醇与乙酸乙酯的体积比为10:1。
实验例1：
本实验例主要是对实验例1步骤(4)收集的有机相(即经辐照处理柠檬酸盐缓冲溶液浸提萃取的有机相)，和未经辐照处理有柠檬酸盐缓冲溶液浸提萃取有机相，经辐照处理无缓冲体系浸提液萃取有机相，以及大剂量辐照处理后经缓冲体系浸提液萃取的有机相进行色谱图比较。
获取未经辐照处理有柠檬酸盐缓冲溶液浸提萃取有机相：
选取1年生薄叶碎米蕨植株50kg，进行如实施例1步骤(1)至步骤(4)的处理，区别在于不进行辐照处理，其余操作步骤均与实施例1相同，然后得到未经辐照处理有柠檬酸盐缓冲溶液浸提萃取有机相。
获取经辐照处理无缓冲体系浸提液萃取有机相：
选取1年生薄叶碎米蕨植株50kg，进行如实施例1中步骤(1)至步骤(4)的处理，区别在于不添加柠檬酸盐缓冲溶液，其余操作步骤同实施例1，然后得到未经辐照处理有柠檬酸盐缓冲溶液浸提萃取有机相。
获取大剂量辐照处理后经缓冲体系浸提液萃取的有机相：
选取1年生薄叶碎米蕨植株50kg，进行如实施例1中步骤(1)至步骤(4)的处理，区别在于其辐照方式是利用60Co产生的γ射线在0.5kGy的射线强度下先辐照2h，调整角度再辐照2h，其余操作步骤同实施例1，最后得到未经辐照处理有柠檬酸盐缓冲溶液浸提萃取有机相。
将本实验例中获取的多种有机相，以及实施例1步骤(4)所收集的有机相(经辐照处理柠檬酸盐缓冲溶液浸提萃取的有机相)分别进行色谱分析；
经辐照处理柠檬酸盐缓冲溶液浸提萃取的有机相色谱图如图5、图6所示，未经辐照处理有柠檬酸盐缓冲溶液浸提萃取有机相色谱图如图7、图8所示，经辐照处理无缓冲体系浸提液萃取有机相色谱图如图9、图10所示，大剂量辐照处理后经缓冲体系浸提液萃取得到的有机相进行色谱图如图11、图12所示；其中，图5、图6目标物质HOBR所对应的目标峰其保留时间为7.205，图7、图8目标峰对应的保留时间为7.265，图9、图10目标峰对应的保留时间为7.164，图11、图12目标峰对应的保留时间为7.164。
从图8中可看出，图8的色谱峰数量较多，而每一个色谱峰代表一个物质，因此其物质成分复杂，除目标物质外还含有大量干扰物，且由峰面积可看出，部分干扰物浓度很高，因此可知，浸提前未经辐照处理的有机相，难以进一步实现目标物质HOBR的分离；
通过图6、图8、图12对比看出，图6中色谱峰数量较少，表明干扰物的种类少，相对图8、图12对应的有机相来说，其杂质干更扰少，从而纯化就更简单，进而更便于分离出目标物质；
图12中，峰面积相对较大的色谱峰数量增多，且对比图6的各色谱峰所出现的保留时间可知，经大剂量辐照后，又出现新的干扰物，且从干扰物峰面积可看出其含量较高，因而经大剂量辐照后采用缓冲体系浸提液萃取分离出的有机物，难以获取较纯的目标物质。
出现上述结果在于，适宜剂量的辐照能最大限度减少非目标物的干扰，而采用大剂量辐照处理后却无法通过无机溶剂和有机溶剂组合的浸提剂浸提萃取出目标物质，其原因是：采用大剂量辐照辐射后，蛋白质(多肽)、脂类等有机物进一步的被破坏分解产生带有-CH3、-CH2-、-CH＝CH-等基团的小分子物质，或是分解的同时又重新结合成新的其他物质，这些物质组成复杂，从而在后续浸提萃取目标物质时会产生干扰。
对比图5、图9，可看出图9中色谱峰杂峰很多，因此经辐照处理无缓冲体系浸提液萃取有机相中除目标物质外还含有大量的干扰物，因此可知，本发明所提出的缓冲体系浸提液，能有效从经小剂量辐照后的植物碎料中提取出目标物质。
本实验例中所称缓冲体系是指含柠檬酸盐缓冲溶液的浸提剂体系。
实验例2
进行不同辐照剂量处理的效果对比实验
本实验例包含G1-G5五个实验组，每个实验均采用与实施例1相同的步骤进行目标物质HOBR的提取，且每个实验组的原料均采用50kg1年生薄叶碎米蕨植株，G1-G5五个实验组的区别仅在于每个实验组所采用的辐照剂量不同，且G1-G5五个实验组的辐照剂量分别为0kGy、0.01kGy、0.3kGy、0.5kGy、1kGy；然后对本试验例获得的晶体分别经HPLC检测目标物HOBR的纯度，得到结果见表1；
表1，不同辐照剂量处理的效果对比
G1、G5实验组，在采用洗脱液洗脱的过程中，无法洗脱出含目标物质的洗脱液，G4实验组所得结晶中杂质含量极高，HOBR纯度仅为0.39％；
因此，综合表1中实验数据可看出，空白对照组，即未进行辐照的G1组，无法将目标物质HOBR从薄叶碎米蕨植株中提取出来，且G4、G5实验组同样无法从薄叶碎米蕨植株中提取出能达到工业纯品级别的目标物质HOBR。
实验例3：
本实验例主要是对实施例1中所制备的芸苔素类似物进行应用。
芸苔素类似物可应用于调节果树、蔬菜和粮食作物的生长发育；本实施例通过芸苔素类似物在水稻上的应用检测产品活性；
对水稻生物活性检定(第二节间倾斜法及扩叶法)，水稻倾斜角度越大，发育作用越强。具体实验过程如下：
取实施例1制备的天然芸苔素类似物HOBR加入清水稀释至0.01mg/l；同时采用标准品稀释至0.01mg/l作为标准品对照组，并以清水为空白对照组。
水稻幼苗消毒发芽后在30℃黑暗条件下进行水培9天，9天后的龄化幼苗作为实验材料，离体水稻叶片切断，切断长1cm，切断部分包括第二叶片，叶耳和叶鞘三部分，叶片切断后飘浮于蒸馏水中，在30℃黑暗条件下保温24h，然后取出吸干，然后取出切断的叶片浸入10ml上述不3个处理组的不同溶液或清水中，每组溶液或清水中放入5片切断叶片，继续保温48h后观察第二叶片与叶鞘之间的角度变化，实验结果如图13所示，可知实施例13所制备的天然芸苔素类似物，以及标准品均具有能明显增强水稻叶片倾斜效应的作用，即均具有植物生长调节活性。
本发明产品水培及大田应用效果实验：
水培实验：
用5％次氯酸钠溶液将水稻种子消毒处理后，用蒸馏水漂洗至碱性，置于培养皿中，放在30℃的恒温箱中，分别以0.01mg/l实施例1所制备的产品和清水进行培养，一段时间后，水培效果如图14所示。采用本产品进行水培的水稻其高度以及根系长势均优于清水水培。
大田应用效果实验：
以实施例1中制备产品施药为实验组1，以标准品施药为实验组2，以清水施药为实验组3；
水稻5月中下旬插秧，分蘖期连续追施尿素2次；使用50％吡蚜酮可湿性粉剂防治稻飞虱1次，30％三唑磷乳油防治水稻二化螟2次，30％苯甲·醚菌酯悬浮剂防治水稻纹枯病1次；使用背负式手动喷雾器对水稻植株茎叶均匀喷雾，分别于水稻拔节期、抽穗期和灌浆期各施药1次。
实验组1、实验组2、实验组3大田培育出的水稻叶片对比图如图15所示；成熟水稻植株对比如图16所示。
水稻成熟期，每组实验组调查穗数、穗粒数、千粒重，结果如表2所示；
表2不同处理组的对水稻植株的生长影响
需说明的是，本发明所有HOBR标准品来自德国Dr.Ehrenstorfer GmbH公司(国际检验用标准品专业制造企业)。
本发明中所称“工业纯品”是指制备的目标物质HOBR纯度高于90％，且不含有其他种类芸苔素类似物的产品物质。
本发明中，负压旋蒸、负压浓缩，以及负压回收溶剂均采用旋转蒸发仪，旋转蒸发仪又叫旋转蒸发器，是实验室常用设备，由马达、蒸馏瓶、加热锅、冷凝管等部分组成的，主要用于负压条件下连续蒸馏易挥发性溶剂。本发明中旋转蒸发仪负压旋蒸时的负压状态，根据蒸发物质种类的不同采用的压力值大小不同，本发明中采用的负压条件均为温度25-50℃，压力范围值-0.1MPa至-0.01MPa。
本发明中，上述实施例中，将经过辐照后的薄叶碎米蕨碎料置于浸提罐内后，所加入的浸提剂中的有机溶剂，还可以选择包括甲醇、乙醇、乙酸、丙酮、乙腈、乙酸乙酯、石油醚中的一种或多种所构成的溶剂。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当理解本发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离本发明的精神和范围，则都应在本发明所附权利要求的保护范围内。

Claims (8)

1.一种天然芸苔素类似物HOBR的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(a)切碎薄叶碎米蕨以形成薄叶碎米蕨碎料；
(b)将薄叶碎米蕨碎料辐照处理，辐照剂量为0.01～0.3kGy；
(c)将经过辐照的薄叶碎米蕨碎料加浸提剂浸提，得到含有天然芸苔素类似物HOBR的浸提液；
所述步骤(b)中的辐照为60Co所产生的γ射线，辐照时间为1～48h；
所述HOBR为(20R,22R)-2β,3β,14,20,22,25-六羟基-5β-胆甾-6-酮。
2.根据权利要求1所述一种天然芸苔素类似物HOBR的制备方法，其特征在于，所述步骤(c)中浸提剂包括柠檬酸盐缓冲溶液和有机溶剂；
所述有机溶剂为甲醇、乙醇、乙酸、丙酮、乙腈、乙酸乙酯、石油醚中的一种或多种。
3.根据权利要求1所述一种天然芸苔素类似物HOBR的制备方法，其特征在于，还包括如下步骤：
(d)步骤(c)中得到的浸提液经负压回收有机溶剂后得到浓缩液，再加入萃取剂萃取，重复萃取3-4次，收集有机相；
(e)步骤(d)得到的有机相，经负压浓缩回收萃取剂后得到混合物，再加入无水硅胶，得到硅胶混合料；
(f)将步骤(e)得到的硅胶混合料，采用硅胶层析柱过柱，梯度洗脱分离杂质，得到含有HOBR的洗脱液，再经负压浓缩，回收全部有机溶剂，得到HOBR固体粗品。
4.根据权利要求3所述一种天然芸苔素类似物HOBR的制备方法，其特征在于，步骤(d)中所述萃取剂为二氯甲烷、乙酸乙酯中的至少一种。
5.根据权利要求3所述一种天然芸苔素类似物HOBR的制备方法，其特征在于，步骤(f)中所述梯度洗脱采用的溶剂为乙酸乙酯、石油醚、甲醇、乙醇中的至少一种。
6.根据权利要求3所述的一种天然芸苔素类似物HOBR的制备方法，其特征在于，还包括步骤(g)将步骤(f)得到的HOBR固体粗品，重结晶，得到HOBR纯品。
7.根据权利要求6所述的一种天然芸苔素类似物HOBR的制备方法，其特征在于，所述重结晶溶剂选自甲醇、乙醇、乙酸乙酯或石油醚中的至少一种。
8.根据权利要求7所述的一种天然芸苔素类似物HOBR的制备方法，其特征在于，所述重结晶溶剂选自体积比为5-15:1的甲醇与乙酸乙酯混合溶液；或
所述重结晶溶剂选自体积比为5-20:1的乙醇与乙酸乙酯混合溶液；或
所述重结晶溶剂选自体积比为1:0.5-5的甲醇与乙醇混合溶液。
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Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2010112407A (ru) * 2010-03-30 2011-10-10 Учреждение Российской академии наук ИНСТИТУТ НЕФТЕХИМИИ И КАТАЛИЗА РАН (RU) Способ получения 7,8-дигидроаналогов экдистероидов
CN103214546A (zh) * 2012-01-18 2013-07-24 成都新朝阳作物科学有限公司 天然芸苔素内酯类似物的应用
CN109938055A (zh) * 2019-04-10 2019-06-28 江西鑫邦科技有限责任公司 一种用于防治水稻纹枯病的农药组合物
CN110483605A (zh) * 2019-08-16 2019-11-22 郑州信联生化科技有限公司 一种植物生长调节剂的制备及其应用

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2010112407A (ru) * 2010-03-30 2011-10-10 Учреждение Российской академии наук ИНСТИТУТ НЕФТЕХИМИИ И КАТАЛИЗА РАН (RU) Способ получения 7,8-дигидроаналогов экдистероидов
CN103214546A (zh) * 2012-01-18 2013-07-24 成都新朝阳作物科学有限公司 天然芸苔素内酯类似物的应用
CN109938055A (zh) * 2019-04-10 2019-06-28 江西鑫邦科技有限责任公司 一种用于防治水稻纹枯病的农药组合物
CN110483605A (zh) * 2019-08-16 2019-11-22 郑州信联生化科技有限公司 一种植物生长调节剂的制备及其应用

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