CN103209970A - 原位化学发光底物和测定 - Google Patents

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Abstract

在水性条件或其它测定条件中原位产生化学发光的酶底物的方法。也公开了使用所述底物产生光、检测和/或量化酶、抗原和/或核酸的方法。还公开了与这些方法有关的试剂盒。

Description

原位化学发光底物和测定
发明领域
本发明一般地涉及诊断测定，且更具体地涉及化学发光底物。公开了可用于产生原位化学发光底物的方法和将它们用于诊断测定中的方法。
发明背景
临床诊断测定现在使用化学发光作为优选的技术发展水平的检测技术。含有化学发光读出的测定具有最灵敏的检测限和最宽的分析物定量动态范围。日益需要设计简化的、小型化的、自主式的和/或稳健的诊断平台，用于这样的场合或发展中国家：其中标准的实验室设备、受控的环境和技术支持较少。目前商购可得的二氧杂环丁烷底物没有取得良好进展，其中受控的储存条件不可容易地得到。因而，需要使用具有更好热稳定性的前体制备原位二氧杂环丁烷底物的方法。
发明概述
在第一个方面，本发明提供了产生光的方法，所述方法包括下述步骤：(a) 提供氧化剂；(b) 提供具有下述结构的烯醇醚：
Figure 398419DEST_PATH_IMAGE001
(c) 组合水性溶液、所述氧化剂和所述烯醇醚，以形成包含1,2-二氧杂环丁烷酶底物的水性溶液；(d) 提供酶复合物，所述酶复合物包含能够切割1,2-二氧杂环丁烷酶底物的酶部分；(e) 使所述酶复合物与包含1,2-二氧杂环丁烷酶底物的水性溶液接触，以形成反应混合物；和(f) 使所述反应混合物产生光。
所述氧化剂可以选自：过氧化氢、钼酸钠、过氧化氢和钼酸钠、次氯酸盐、次氯酸盐和过氧化氢、芳基内过氧化物、过氧化钙过氧水合物、以及它们的组合。在有些实施方案中，所述氧化剂可以是过氧化氢、或过氧化氢和钼酸钠。
在所述烯醇醚[1]中，A和B可以独立地选自：含有1-20个碳原子的直链烷基、含有2-20个碳原子的直链烯基、含有3-20个碳原子的支链烷基、含有3-20个碳原子的支链烯基、含有3-20个碳原子的环烷基、含有3-20个碳原子的环烯基、含有3-20个碳原子的环杂烷基、含有3-20个碳原子的环杂烯基、含有4-60个碳原子的聚环烷基、含有4-60个碳原子的聚环烯基、含有4-60个碳原子的聚环杂烷基和含有4-60个碳原子的聚环杂烯基，它们中的任一个可以是未被取代的，或被一个或多个电子活性基团、增溶基团或光增强基团取代，且其中A和B一起形成所述环烷基、环烯基、聚环烷基或聚环烯基，所述环烷基、环烯基、聚环烷基或聚环烯基的碳原子之一是形成所述烯醇醚的双键的2个碳原子中的一个，
R1可以是含有1-20个碳原子的烷基、含有6-14个碳原子的芳基、含有7-15个碳原子的芳烷基、含有4-20个碳原子的杂芳基、或含有5-20个碳的杂芳烷基，
T可以是能够发射光的芳基或杂芳基环，且
R2可以是酶可切割的基团，其含有可被酶部分切割以在T上产生氧阴离子的键。
在有些实施方案中，所述烯醇醚可以具有至少一个是
Figure 315559DEST_PATH_IMAGE002
的A或B，而在其它实施方案中，A和B一起是
Figure 95296DEST_PATH_IMAGE003
在有些实施方案中，R1可以是含有1-2个碳原子的烷基或含有1-2个碳原子的三氟烷基。
在有些实施方案中，T可以是
Figure 552822DEST_PATH_IMAGE004
其中R3、R4和R5独立地选自：H、F、Cl、Br、I、氰基、硝基、磺酸盐、硫酸盐、三氟甲基、三氟乙基、含有1-20个碳原子的直链烷基、含有3-20个碳原子的支链烷基、含有2-20个碳原子的直链烯基、含有3-20个碳原子的支链烯基、含有3-20个碳原子的环烷基、含有3-20个碳原子的环烯基、含有3-20个碳原子的环杂烷基、含有3-20个碳原子的环杂烯基、含有4-60个碳原子的聚环烷基、含有4-60个碳原子的聚环烯基、含有4-60个碳原子的聚环杂烷基、含有4-60个碳原子的聚环杂烯基、含有1-20个碳原子的烷氧基、含有6-14个碳原子的芳基、含有6-14个碳原子的芳氧基、含有2-21个碳原子的酯、含有3-30个碳原子的三烷基铵、含有3-30个碳原子的三烷基鏻、含有2-21个碳原子的烷基酰氨基、含有7-15个碳原子的芳基酰氨基、含有2-21个碳原子的烷基氨甲酰基、含有7-15个碳原子的芳基氨甲酰基、含有1-20个碳原子的烷基亚磺酰氨基、含有6-14个碳原子的芳基亚磺酰氨基、含有3-60个碳原子的三烷基甲硅烷基、含有18-42个碳原子的三芳基甲硅烷基、含有7-32个碳原子的烷基芳基甲硅烷基、含有1-20个碳原子的烷基酰氨基磺酰基、含有6-14个碳原子的芳基酰氨基磺酰基、含有1-20个碳原子的烷基磺酰基、含有6-14个碳原子的芳基磺酰基、含有2-20个碳原子的烷硫基和含有6-14个碳原子的芳硫基，且X是硫原子、氧原子或氮原子。
在有些实施方案中，OR2可以是磷酸酯、乙酸酯、1-磷酸-2,3-二酰基甘油酯、三磷酸腺苷、二磷酸腺苷、单磷酸腺苷、腺苷、α-D-半乳糖苷、β-D-半乳糖苷、α-D-葡萄糖苷、β-D-葡萄糖苷、α-D-甘露糖苷、β-D-甘露糖苷、β-呋喃果糖苷、β-D-葡糖苷酸或
Figure 367195DEST_PATH_IMAGE005
，其中，B1、B2和B3各自独立地是H或1-4个碳原子的烷基(支链或直链)。
在有些实施方案中，R2可以是
在有些实施方案中，R2可以是E-L-Nuc-Z，其中R2是E-L-Nuc-Z，其中E是包含亲电子原子的基团，所述原子在Z基团的酶切割以后被Nuc基团的电子对攻击，并通过邻助作用释放出1,2-二氧杂环丁烷酶底物阴离子；L是连接基团；Nuc是亲核原子；且Z是酶可切割的基团；其中E是羧基、羰基、被离去基团取代的亚甲基、磷酸盐、碳酸盐、黄原酸盐、亚硫酸盐、磺酸盐、亚硫酸氢盐或二硫化物；L选自：含有1-4个碳原子的亚甲基或聚亚甲基、-(CH2)m-O-(CH2)n、-(CH2)m-S-(CH2)n-或–(CH2)m-NR6-(CH2)n-，其中m和n是0-3，且m+n是2或3，其中R6是含有1-10个碳原子的烷基，且所述连接基团可以被含有1-24个碳原子的烷基、含有2-24个碳原子的烯基、含有1-24个碳原子的烷基取代，和被含有1-24个碳原子的酰氧基、含有2-24个碳原子的烯基单取代或二取代，和被含有1-24个碳原子的酰氧基、含有6-10个碳的芳基、含有1-24个碳原子的烷基单取代或二取代，和被苯基、羟苯基、吲哚基、巯基、含有1-4个碳原子的烷硫基、羟基、羧基、氨基、胍基、咪唑或氨基甲酰基或含有2-24个碳原子的烯基取代，和被苯基、羟苯基、吲哚基、巯基、含有1-4个碳原子的烷硫基、羟基、羧基、氨基、胍基、咪唑或氨基甲酰基取代；Nuc是氧原子或硫原子；且Z是磷酰基、乙酰基、1-磷酸-2,3-二酰基甘油酰基(diacylglycerosyl)、腺苷三磷酰基、腺苷二磷酰基、腺苷单磷酰基、腺苷基、α-D-半乳糖基、β-D-半乳糖基、α-D-葡萄糖基、β-D-葡萄糖基、α-D-甘露糖基、β-D-甘露糖基、β-呋喃果糖基、β-D-glucosiduransyl或
Figure 768275DEST_PATH_IMAGE007
，其中，B1、B2和B3各自独立地是H或1-4个碳原子的烷基(支链或直链)。在这些中的一些中，Z是
所述酶部分可以包含水解酶。在有些实施方案中，所述水解酶可以是碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、β-葡萄糖苷酶、β-葡糖苷酸酶或神经氨酸酶。
在有些实施方案中，所述酶部分可以是酶。
在有些实施方案中，所述方法可以另外包括下述步骤：检测在加入1,2-二氧杂环丁烷酶底物的水性溶液以后从所述反应混合物发射的任何光，其中光的发射指示酶的存在，并且发射的光的量可以与样品中存在的酶的量相关联。
在有些实施方案中，所述酶部分可以是酶连接的抗体，其包含能够与抗原结合的第一抗体和酶，所述酶能够切割1,2-二氧杂环丁烷酶底物，使得所述底物分解并产生光。
在有些实施方案中，所述第一抗体可以与所述酶共价地或非共价地连接。在这些中的一些中，所述第一抗体可以与标记共价地连接，且所述酶可以与这样的分子共价地连接：所述分子能够非共价地结合所述标记。在这些中的一些中，所述标记可以是生物素或生物素衍生物，且所述分子可以是抗生物素蛋白或抗生蛋白链菌素。在其它实施方案中，所述标记可以是半抗原，且所述分子可以是能够结合所述半抗原的抗体。
在有些实施方案中，所述方法可以另外包括下述步骤：(a) 提供疑似包含抗原的样品；(b) 提供包含第二抗体的固相，所述第二抗体能够结合所述抗原；(c) 使所述样品和酶连接的抗体与所述固相接触，以形成酶复合物；和，(d) 在加入1,2-二氧杂环丁烷酶底物的水性溶液以后，检测从所述反应混合物发射出的光，其中光的发射指示抗原的存在，并且发射的光的量可以与样品中存在的抗原的量相关联。
在有些实施方案中，所述方法可以另外包括下述步骤：从所述酶复合物除去任何未结合的酶连接的抗体。
在有些实施方案中，所述酶部分可以是酶连接的抗原，其包含抗原和酶，所述酶能够切割1,2-二氧杂环丁烷酶底物，使得所述底物分解并产生光。
在有些实施方案中，所述抗原可以与所述酶共价地或非共价地连接。
在有些实施方案中，所述抗原可以与标记共价地连接，且所述酶可以可以与这样的分子共价地连接：所述分子能够非共价地结合所述标记。在这些中的一些中，所述标记可以是生物素或生物素衍生物，且所述分子可以是抗生物素蛋白或抗生蛋白链菌素。在其它实施方案中，所述标记可以是半抗原，且所述分子可以是能够结合所述半抗原的抗体。
在有些实施方案中，所述方法可以另外包括下述步骤：(a) 提供疑似包含抗原的样品；(b)提供包含抗体的固相，所述抗体能够结合所述抗原；(c) 使所述样品和酶连接的抗原与所述固相接触，以形成酶复合物；和，(d) 在加入1,2-二氧杂环丁烷酶底物的水性溶液以后，检测从所述反应混合物发射出的光，其中发射的光的量可以与样品中存在的抗原的量相关联。
在有些实施方案中，所述方法可以另外包括下述步骤：从所述酶复合物除去任何未结合的酶连接的抗原。
在有些实施方案中，所述酶部分可以是酶连接的寡核苷酸，其包含能够与核酸杂交的寡核苷酸和酶，所述酶能够切割1,2-二氧杂环丁烷酶底物，使得所述底物分解并产生光。
在有些实施方案中，所述寡核苷酸可以与所述酶共价地或非共价地连接。
在有些实施方案中，所述寡核苷酸可以与标记共价地连接，且所述酶可以可以与这样的分子共价地连接：所述分子能够非共价地结合所述标记。在这些中的一些中，所述标记可以是生物素或生物素衍生物，且所述分子可以是抗生物素蛋白或抗生蛋白链菌素。在其它实施方案中，所述标记可以是半抗原，且所述分子可以是能够结合所述半抗原的抗体。
在有些实施方案中，所述方法可以另外包括下述步骤：(a) 提供疑似包含核酸的样品；(b) 将所述核酸固定化在固相上，(c) 使所述固定化的核酸和所述酶连接的寡核苷酸接触，以形成酶复合物；和(d) 在加入1,2-二氧杂环丁烷酶底物的水性溶液以后，检测从所述反应混合物发射出的光，其中光的发射指示所述核酸的存在，并且发射的光的量可以与样品中存在的核酸的量相关联。
在有些实施方案中，所述方法可以另外包括下述步骤：从所述酶复合物除去任何未结合的酶连接的寡核苷酸。
在有些实施方案中，所述反应混合物可以另外包含促进剂。
在有些实施方案中，所述促进剂可以包含聚合物型的季铵盐、聚合物型的季鏻盐或它们的组合。在这些中的一些中，所述促进剂可以另外包含受体染料。在这些中的一些中，所述受体染料可以是荧光素。
在有些实施方案中，所述聚合物型的季铵盐可以是聚(乙烯基苄基三甲基氯化铵)、聚[乙烯基苄基(苄基二甲基氯化铵)]、聚[乙烯基(苄基三丁基氯化铵)]、聚[乙烯基(苄基三戊基氯化铵)]或它们的组合。
在其它实施方案中，所述聚合物型的季鏻盐可以是聚(乙烯基苄基三甲基氯化鏻)、聚(乙烯基苄基三丁基氯化鏻)、聚(乙烯基苄基三辛基氯化鏻)、包含聚(乙烯基苄基三丁基氯化鏻)和聚(乙烯基苄基三辛基氯化鏻)的共聚物或它们的组合。
在有些实施方案中，所述烯醇醚[1]可以是
Figure 698371DEST_PATH_IMAGE009
Figure 504784DEST_PATH_IMAGE010
Figure 259113DEST_PATH_IMAGE011
在另一个方面，本发明提供了用于确定样品中酶的存在或量的测定方法，所述方法包括下述步骤：(a) 提供氧化剂；(b) 提供烯醇醚，所述烯醇醚具有结构[1]且具有如上所述的取代基；(c) 组合水性溶液、所述氧化剂和所述烯醇醚，以形成包含1,2-二氧杂环丁烷酶底物的水性溶液；(d) 提供疑似包含酶的样品，所述酶能够切割1,2-二氧杂环丁烷酶底物，使得所述底物分解并产生光；(e) 使所述样品与包含1,2-二氧杂环丁烷酶底物的水性溶液接触，以形成反应混合物；和，(f) 在加入1,2-二氧杂环丁烷酶底物的水性溶液以后，检测从所述反应混合物发射出的光，其中光的发射指示酶的存在，并且发射的光的量可以与样品中存在的酶的量相关联。
在另一个方面，本发明提供了用于确定样品中抗原的存在或量的测定方法，所述方法包括下述步骤：(a) 提供氧化剂；(b) 提供烯醇醚，所述烯醇醚具有结构[1]且具有如上所述的取代基；(c) 组合水性溶液、所述氧化剂和所述烯醇醚，以形成包含1,2-二氧杂环丁烷酶底物的水性溶液；(d) 提供疑似包含抗原的样品；(e) 提供酶连接的抗体，其包含能够与抗原结合的第一抗体和酶，所述酶能够切割1,2-二氧杂环丁烷酶底物，使得所述底物分解并产生光；(f) 提供包含第二抗体的固相，所述第二抗体能够结合所述抗原；(g) 使所述样品和酶连接的抗体与所述固相接触，以形成酶复合物；(h) 使所述酶复合物与包含1,2-二氧杂环丁烷酶底物的水性溶液接触，以形成反应混合物；和，(i) 在加入1,2-二氧杂环丁烷酶底物的水性溶液以后，检测从所述反应混合物发射出的光，其中光的发射指示抗原的存在，并且发射的光的量可以与样品中存在的抗原的量相关联。
在另一个方面，本发明提供了用于确定样品中抗原的存在或量的测定方法，所述方法包括下述步骤：(a) 提供氧化剂；(b) 提供烯醇醚，所述烯醇醚具有结构[1]且具有如上所述的取代基；(c) 组合水性溶液、所述氧化剂和所述烯醇醚，以形成包含1,2-二氧杂环丁烷酶底物的水性溶液；(d) 提供疑似包含抗原的样品；(e) 提供酶连接的抗原，其包含抗原和酶，所述酶能够切割1,2-二氧杂环丁烷酶底物，使得所述底物分解并产生光；(f)提供包含抗体的固相，所述抗体能够结合所述抗原；(g) 使所述样品和酶连接的抗原与所述固相接触，以形成酶复合物；(h) 使所述酶复合物与包含1,2-二氧杂环丁烷酶底物的水性溶液接触，以形成反应混合物；和，(i) 在加入1,2-二氧杂环丁烷酶底物的水性溶液以后，检测从所述反应混合物发射出的光，其中发射的光的量可以与样品中存在的抗原的量相关联。
在另一个方面，本发明提供了用于确定样品中的核酸的存在或量的测定方法，所述方法包括下述步骤：(a) 提供氧化剂；(b) 提供烯醇醚，所述烯醇醚具有结构[1]且具有如上所述的取代基；(c) 组合水性溶液、所述氧化剂和所述烯醇醚，以形成包含1,2-二氧杂环丁烷酶底物的水性溶液；(d) 提供疑似包含核酸的样品; (e) 将所述核酸固定化到固相上; (f) 提供酶连接的寡核苷酸，其包含能够与所述核酸杂交的寡核苷酸和酶，所述酶能够切割1,2-二氧杂环丁烷酶底物，使得所述底物分解并产生光；(g) 使所述固定化的和酶连接的寡核苷酸接触，以形成酶复合物；(h) 使所述酶复合物与包含1,2-二氧杂环丁烷酶底物的水性溶液接触，以形成反应混合物；和，(i) 在加入1,2-二氧杂环丁烷酶底物的水性溶液以后，检测从所述反应混合物发射出的光，其中光的发射指示所述核酸的存在，并且发射的光的量可以与样品中存在的核酸的量相关联。
在另一个方面，本发明提供了用于检测样品中分析物的存在和/或量的试剂盒。所述试剂盒包括氧化剂和烯醇醚，所述烯醇醚具有结构[1]且具有如上所述的取代基。所述烯醇醚的各个实施方案具有结构[1]和它的取代基，和也如所述所述的氧化剂，同样适用于本发明的试剂盒和方法。
在有些实施方案中，所述试剂盒可以另外包含促进剂。
在有些实施方案中，所述促进剂可以包含聚合物型的季铵盐、聚合物型的季鏻盐或它们的组合。在这些中的一些中，所述促进剂可以另外包含受体染料。在这些中的一些中，所述受体染料可以是荧光素。
在有些实施方案中，所述聚合物型的季铵盐可以是聚(乙烯基苄基三甲基氯化铵)、聚[乙烯基苄基(苄基二甲基氯化铵)]、聚[乙烯基(苄基三丁基氯化铵)]、聚[乙烯基(苄基三戊基氯化铵)]或它们的组合。
在其它实施方案中，所述聚合物型的季鏻盐可以是聚(乙烯基苄基三甲基氯化鏻)、聚(乙烯基苄基三丁基氯化鏻)、聚(乙烯基苄基三辛基氯化鏻)、包含聚(乙烯基苄基三丁基氯化鏻)和聚(乙烯基苄基三辛基氯化鏻)的共聚物或它们的组合。
在有些实施方案中，所述具有结构[1]的烯醇醚可以是如上所示的烯醇醚[2]至[18]中的任一种。
在另一个方面，本发明提供了一种用于制备1,2-二氧杂环丁烷酶底物的方法，所述方法包括下述步骤：(a) 提供氧化剂；(b) 提供具有下述结构的烯醇醚：
Figure 58442DEST_PATH_IMAGE012
和
(c) 组合水性溶液、所述氧化剂和所述烯醇醚，以形成包含1,2-二氧杂环丁烷酶底物的水性溶液。
附图说明
图1显示了使用Na2MoO4/H2O2氧化系统在碱性pH的水性溶液中将AMPPD烯醇醚磷酸盐(AMPPD-EE) 转化成二氧杂环丁烷底物AMPPD®的反应路线图。
图2的HPLC迹线显示了原料AMPPD烯醇醚磷酸盐(AMPPD-EE)对照的洗脱峰。
图3的HPLC迹线显示了期望的二氧杂环丁烷AMPPD®对照的洗脱峰。
图4的HPLC迹线显示了混合对照AMPPD烯醇醚磷酸盐(AMPPD-EE)和AMPPD®的洗脱峰。
图5的HPLC迹线显示了AMPPD烯醇醚磷酸盐(AMPPD-EE)完全氧化成AMPPD®。
图6显示了使用Na2MoO4/H2O2氧化系统在碱性pH的水性溶液中将ADP-Star烯醇醚磷酸盐(ADP*-EE) 转化成ADP-Star ®(ADP*-EE-O)、随后用碱性磷酸酶活化二氧杂环丁烷的反应路线图。
图7显示了碱性磷酸酶对ADP-Star ®(ADP*)二氧杂环丁烷对照的活化、2种ADP-Star烯醇醚(ADP*-EE-O1和ADP*-EE-O2) 氧化和商购可得的CDP-Star®(CDP*)二氧杂环丁烷对照的ADP-Star®发射曲线。
图8显示了AMPPD®在55℃的热稳定性图。
图9显示了AMPPD烯醇醚磷酸盐(AMPPD-EE)在55℃的热稳定性图。
图10显示了单独的AMPPD烯醇醚磷酸盐(AMPPD-EE) (左图)和AMPPD®和AMPPD烯醇醚磷酸盐(AMPPD-EE) 的混合物(右图)在40℃的热稳定性。在右图中，在左侧的条是与AMPPD®有关的数据，而在右侧的对应条是与AMPPD-EE有关的数据。
图11显示了在有钼酸钠存在下AMPPD烯醇醚磷酸盐(AMPPD-EE) 在40℃的热稳定性。
图12显示了方法A：酶将磷酸盐烯醇醚(AMPPD-EE)去磷酸化，随后水性氧化成二氧杂环丁烷。
图13显示了碱性磷酸酶稀释曲线的信号(以相对发光单位RLU表示)：发光(通过方法A制备的原位AMPPD)相对于在方法A中的对照(AMPPD®)。
图14显示了碱性磷酸酶稀释曲线的信噪比(S/N)：发光(通过方法A制备的原位AMPPD)相对于在方法A中的对照(AMPPD®)。
图15显示了过氧化氢和钼酸钠对酶活性的影响。
图16表明，降低钼酸钠浓度会恢复酶活性。
图17显示了方法B：将AMPPD烯醇醚磷酸盐(AMPPD-EE)水性氧化为二氧杂环丁烷(原位AMPPD)，随后酶促去磷酸化。
图18显示了碱性磷酸酶稀释曲线的信号(以RLU为单位)：通过方法B制备的原位AMPPD相对于对照AMPPD®。
图19显示了碱性磷酸酶稀释曲线的信噪比(S/N)：通过方法B制备的原位AMPPD相对于对照AMPPD®。
图20显示了碱性磷酸酶稀释曲线的信号(以RLU为单位)：通过方法B制备的原位ADP-Star (ADP-Star-EE)相对于CSPD®、ADP-Star ®和CDP-Star ®对照。
图21显示了碱性磷酸酶稀释曲线的信噪比(S/N)：通过方法B制备的原位ADP-Star (ADP-Star-EE)相对于CSPD®、ADP-Star ®和CDP-Star ®对照。
图22显示了30-分钟IL-6 ELISA灵敏度曲线：原位AMPPD相对于对照AMPPD®。
图23显示了通过IL-6 ELISA评价的原位AMPPD生产的时程。
图24显示了在有化学发光促进剂Sapphire II™存在下，原位ADP-Star (ADP Star EE)相对于对照ADP-Star ®、CDP-Star ®和CSPD®的光发射曲线。
图25显示了在有化学发光促进剂Sapphire II™存在下，原位ADP-Star (ADP Star EE)相对于对照二氧杂环丁烷、CSPD®、ADP-Star ®和CDP-Star ®的随时间的最大光信号曲线(%)。
图26显示了rhIL-6 ELISA检测曲线：在有化学发光促进剂Sapphire II™存在下，原位ADP-Star (ADP-Star EE)相对于对照二氧杂环丁烷、CSPD®、ADP-Star ®和CDP-Star ®。
图27显示了在有TBQ促进剂(聚[乙烯基(苄基三丁基氯化铵)])存在下，原位产生的ADP-Star (ADP*)的信号与背景之比(S/B)动力学。
图28显示了在有TBQ促进剂存在下，原位产生的ADP-Star (ADP*)在30-分钟时间点时的IL-6 ELISA灵敏度对比。
图29. 显示了在有TBQ促进剂存在下，原位产生的ADP-Star (ADP*)在60-分钟时间点时的IL-6 ELISA灵敏度对比。
发明详述
在详细描述本发明之前，应当理解，本发明不限于本文公开的实施方案。此外，当以“包含”(解释为是指，“包括、但不限于”)各个步骤或组分的方式描述方法和试剂盒时，所述方法和试剂盒还可以“基本上由各个步骤和组分组成”或“由各个步骤和组分组成”，这样的术语应当解释为，限定基本上封闭成员的集合。最后，应当指出，如在本说明书中和所附权利要求书中使用的，单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括复数指示物，除非上下文另外清楚地指明。
定义：
受体染料表示这样的分子：其可以接受来自其它光发射分子的能量、特别是光，并转而发射可检测的能量，也优选地是光。
分析物表示，在分析操作中测定的物质或化学组分。本文使用的该术语包括、但不限于抗原或抗体。
抗原表示抗体可以结合的物质。
抗体表示这样的γ球蛋白蛋白质：其存在于脊椎动物的血液或其它体液中，且被免疫系统用于识别和中和外来物。本文使用的该术语包括、但不限于：可以结合抗原的然后多克隆的、单克隆的、重组的抗体或其片段。
促进剂表示这样的水溶性物质：其增加由1,2-二氧杂环丁烷酶底物的酶切割和它的随后分解导致的特定光能生成，其中观察到的该光生成高于在没有所述促进剂存在下观察到的生成。
酶表示催化化学反应的蛋白质。
半抗原表示，只有与大载体(诸如蛋白)连接时才可以引起免疫应答的小分子。
水解酶(Hydrolytic enzyme或hydrolase)表示这样的酶：其催化化学键的水解，且在酶的EC编号分类中可以归类为EC 3。
核酸是指DNA、RNA或其片段。
寡核苷酸表示短核酸聚合物。本文使用的该术语包括、但不限于含有2-1000个核酸的核酸聚合物。
氧化剂(Oxidant)是，可容易地转移氧原子的化学化合物，或在氧化还原化学反应中获得电子的物质。本文使用的该术语与术语氧化剂(oxidizing agent或oxidizer)互换使用。
本发明提供了在水性条件或其它条件下原位制备化学发光的酶底物的方法，和/或使用该底物产生光的方法。光的产生可以用于确定酶、抗原或核酸在样品中的存在。这些方法涉及稳定化的烯醇醚和氧化剂，它们当在水性溶液中组合时形成1,2-二氧杂环丁烷酶底物。本发明也提供了用于检测样品中分析物的存在和/或量的试剂盒。所述试剂盒包括稳定化的烯醇醚和氧化剂，它们当在水性溶液中组合时形成1,2-二氧杂环丁烷酶底物。这些方法、以及试剂盒可以用于本领域公知的测定中。
从一个方面看，本发明提供了产生光的方法。所述方法包括下述步骤：提供氧化剂；提供具有下面所示的结构的烯醇醚：
Figure 581827DEST_PATH_IMAGE013
　　[1]；
组合水性溶液、所述氧化剂和所述烯醇醚，以形成包含1,2-二氧杂环丁烷酶底物的水性溶液；提供酶复合物，所述酶复合物包含能够切割1,2-二氧杂环丁烷酶底物的酶部分；使所述酶复合物与包含1,2-二氧杂环丁烷酶底物的水性溶液接触，以形成反应混合物；和使所述反应混合物产生光。
在这些方法的一个步骤中，提供氧化剂。该氧化剂是可以将烯醇醚[1]转化成它的对应的1,2-二氧杂环丁烷酶底物的氧化剂。
在有些实施方案中，所述氧化剂可以选自：过氧化氢、钼酸钠、过氧化氢和钼酸钠、次氯酸盐、次氯酸盐和过氧化氢、芳基内过氧化物、过氧化钙过氧水合物、以及它们的组合。在这些实施方案中的一些中，所述氧化剂可以是过氧化氢、或过氧化氢和钼酸钠。
所述氧化剂可以作为溶液或作为粉末提供。在所述氧化剂包含多种组分的情况下，这些组分中的一种或多种(但并非全部)可以与或不与烯醇醚化合。
在这些方法的另一个步骤中，提供烯醇醚[1]。
在有些实施方案中，所述烯醇醚[1]可以具有A和B，所述A和B独立地选自：直链烷基、直链烯基、支链烷基、支链烯基、环烷基、环烯基、环杂烷基、环杂烯基、聚环烷基、聚环烯基、聚环杂烷基和聚环杂烯基，它们中的任一个可以是未被取代的，或被一个或多个电子活性基团、增溶基团或光增强基团取代，且其中A和B一起形成所述环烷基、环烯基、聚环烷基或聚环烯基，所述环烷基、环烯基、聚环烷基或聚环烯基的碳原子之一是形成所述烯醇醚的双键的2个碳原子中的一个。
电子活性基团的实例包括：F、Cl、Br、I、氰基、硝基、磺酸盐、硫酸盐、三氟甲基、三氟乙基、含有1-20个碳原子的直链烷基、含有3-20个碳原子的支链烷基、含有2-20个碳原子的直链烯基、含有3-20个碳原子的支链烯基、含有3-20个碳原子的环烷基、含有3-20个碳原子的环烯基、含有3-20个碳原子的环杂烷基、含有3-20个碳原子的环杂烯基、含有4-60个碳原子的聚环烷基、含有4-60个碳原子的聚环烯基、含有4-60个碳原子的聚环杂烷基、含有4-60个碳原子的聚环杂烯基、含有1-20个碳原子的烷氧基、含有6-14个碳原子的芳基、含有6-14个碳原子的芳氧基、含有2-21个碳原子的酯、含有3-30个碳原子的三烷基铵、含有3-30个碳原子的三烷基鏻、含有2-21个碳原子的烷基酰氨基、含有7-15个碳原子的芳基酰氨基、含有2-21个碳原子的烷基氨甲酰基、含有7-15个碳原子的芳基氨甲酰基、含有1-20个碳原子的烷基亚磺酰氨基、含有6-14个碳原子的芳基亚磺酰氨基、含有3-60个碳原子的三烷基甲硅烷基、含有18-42个碳原子的三芳基甲硅烷基、含有7-32个碳原子的烷基芳基甲硅烷基、含有1-20个碳的烷基酰氨基磺酰基、含有6-14个碳原子的芳基酰氨基磺酰基、含有1-20个碳原子的烷基磺酰基、含有6-14个碳原子的芳基磺酰基、含有2-20个碳原子的烷硫基和含有6-14个碳原子的芳硫基。
增溶基团的实例包括：羧酸、丙二酸、羟基、硫酸盐、磺酸盐、磷酸盐和铵基团；聚(乙氧基)n基团[-(O-CH2-CH2-)n]，其中n = 1-30，以羧酸、丙二酸、羟基、硫酸盐、磺酸盐、磷酸盐和铵基团封端；聚[-O-(CH2-)n]，其中n=1-30，以羧酸、丙二酸、羟基、硫酸盐、磺酸盐、磷酸盐和铵基团封端。
光增强基团的实例包括：阳离子的或聚阳离子的部分诸如烷基铵、烷基鏻、烷基锍基团；烷基芳基铵、烷基芳基鏻和烷基芳基锍基团；或芳基铵、芳基鏻和芳基锍基团；和聚(烷基铵)、聚(烷基鏻)、聚(烷基锍)基团；聚(烷基芳基铵)、聚(烷基芳基鏻)和聚烷基芳基锍基团；或聚(芳基铵)、聚(芳基鏻)和聚(芳基锍)基团。
在有些实施方案中，A和B可以独立地选自：含有1-20个碳原子的直链烷基、含有2-20个碳原子的直链烯基、含有3-20个碳原子的支链烷基、含有3-20个碳原子的支链烯基、含有3-20个碳原子的环烷基、含有3-20个碳原子的环烯基、含有3-20个碳原子的环杂烷基、含有3-20个碳原子的环杂烯基、含有4-60个碳原子的聚环烷基、含有4-60个碳原子的聚环烯基、含有4-60个碳原子的聚环杂烷基和含有4-60个碳原子的聚环杂烯基，它们中的任一个可以是未被取代的，或被一个或多个电子活性基团、增溶基团或光增强基团取代，且其中A和B一起形成所述环烷基、环烯基、聚环烷基或聚环烯基，所述环烷基、环烯基、聚环烷基或聚环烯基的碳原子之一是形成所述烯醇醚的双键的2个碳原子中的一个。
在有些实施方案中，A或B中的至少一个可以是
Figure 346693DEST_PATH_IMAGE014
。
在其它实施方案中，A和B一起可以是
Figure 588319DEST_PATH_IMAGE015
Figure 925759DEST_PATH_IMAGE016
。
在有些实施方案中，所述烯醇醚[1]具有R1，所述R1可以是烷基、芳基、芳烷基、杂芳基或杂芳烷基。在这些中的一些中，R1可以是含有1-20个碳原子的烷基、含有6-14个碳原子的芳基、含有7-15个碳原子的芳烷基、含有4-20个碳原子的杂芳基、或含有5-20个碳的杂芳烷基。在这些中的一些中，R1可以是含有1-2个碳原子的烷基或含有1-2个碳原子的三氟烷基。
在有些实施方案中，所述烯醇醚[1]具有T，所述T可以是芳基或稠合多环化合物，所述化合物包括、但不限于能够发射光的杂芳基环。选择T，使得它不会干扰光的生成，且满足它所连接的二氧杂环丁烷环的4-碳原子的化合价。T代表许多形成光发射荧光团的荧光生色团基团中的任一种，所述荧光生色团基团允许对应的二氧杂环丁烷分解片段以吸收能量并形成激发态，它们从所述激发态发射光学可检测的能量以恢复至它们的基态。T也被酶可切割的基团取代，所述基团含有这样的键：所述键可被酶切割，以直接地产生或通过随后调节pH而产生与二氧杂环丁烷环连接的富含电子的部分，例如，氧阴离子、硫阴离子或氮阴离子。
在有些实施方案中，T可以是芳基，诸如苯基，其可以被电子活性基团、增溶基团或光增强基团取代。
在有些实施方案中，T可以是含有稠合的多环的荧光团部分，其具有酶可切割的不稳定的环取代基，所述取代基含有这样的键：所述键当被酶切割时，提供富含电子的稠合多环部分，以进一步提供可分解以发射光的二氧杂环丁烷化合物。
在稠合多环化合物(其残基可以用于形成这种荧光团部分)内包括，含有9至约30(包括端值)个环碳原子的稠合多环芳烃环荧光团化合物，诸如萘：
Figure 569230DEST_PATH_IMAGE017
，
并环戊二烯、甘菊环烃、庚间三烯并庚间三烯、不对称引达省(asindacene)、对称引达省(s-indacene)、亚联苯、二萘嵌苯、苊、菲、蒽、醋菲烯(acephenanthrylene)、苯并苊(aceanthrylene)、苯并菲、芘、
Figure 717446DEST_PATH_IMAGE018
(chrysene)、萘并萘等，以及它们被一个或多个稳定取代基取代的衍生物，所述取代基为例如具有1-20(包括端值)个碳原子的支链或直链烷基，例如，甲基、正丁基或癸基，具有1-7(包括端值)个碳原子的支链或直链杂烷基，例如，甲氧基、羟乙基或羟基丙基；具有1或2个环的芳基，例如，苯基；具有1或2个环的杂芳基，例如，吡咯基或吡唑基；在环中具有3-7(包括端值)个碳原子的环烷基，例如，环己基；在环中具有3-6(包括端值)个碳原子的杂环烷基，例如，二噁烷；具有1或2个环的芳烷基，例如，苄基；具有1或2个环的烷芳基，例如，甲苯基；吸电子基团，诸如具有1-7(包括端值)个碳原子的全氟烷基，例如，三氟甲基；卤素；CO2H、ZCO2H、SO3H、NO2、ZNO2、CN或ZCN，其中Z是具有1-7(包括端值)个碳原子的支链或直链烷基，例如，甲基，或具有1或2个环的芳基，例如，苯基；供电子基团，例如，支链或直链C1-C7烷氧基，例如，甲氧基或乙氧基：具有1或2个环的芳烷氧基，例如，苯氧基；支链或直链C1-C7烷氧基，例如，甲氧基或乙氧基；具有1或2个环的芳烷氧基，例如，苯氧基；支链或直链C1-C7羟烷基，例如，羟甲基或羟乙基；具有1或2个环的羟基芳基，例如，羟苯基；支链或直链C1-C7烷基酯基团，例如，乙酸酯；具有1或2个环的芳基酯基团，例如，苯甲酸酯；或具有1或2个环的杂芳基，例如，苯并噁唑、苯并噻唑、苯并咪唑或苯并三唑。
此外，用T表示的荧光团部分的稠合多环部分还可以是稠合多环芳族杂环荧光团化合物的残基，所述化合物有例如苯并[b]噻吩、萘并[2,3-b]噻吩、噻蒽、苯并呋喃、异苯并呋喃、色烯、呫吨(xanthene)、酚黄素(phenoxathine)、喹啉、异喹啉、菲啶、吩嗪、吩噁嗪、吩噻嗪、菲咯啉、嘌呤、4H-喹嗪、酞嗪、萘啶、吲哚、吲嗪、色满、异色满、吲哚啉、异吲哚啉等，其未被取代或被一个或多个前述稳定取代基取代，且含有9至约30(包括端值)个环原子，其中大部分是碳原子。
在有些实施方案中，T可以是
Figure 446368DEST_PATH_IMAGE019
其中R3、R4和R5独立地选自：H、F、Cl、Br、I、氰基、硝基、磺酸盐、硫酸盐、三氟甲基、三氟乙基、直链烷基、支链烷基、直链烯基、支链烯基、环烷基、环烯基、环杂烷基、环杂烯基、聚环烷基、聚环烯基、聚环杂烷基、聚环杂烯基、烷氧基、芳基、芳氧基、酯、三烷基铵、三烷基鏻、烷基酰氨基、芳基酰氨基、烷基氨甲酰基、芳基氨甲酰基、烷基亚磺酰氨基、芳基亚磺酰氨基、三烷基甲硅烷基、三芳基甲硅烷基、烷基芳基甲硅烷基、烷基酰氨基磺酰基、芳基酰氨基磺酰基、烷基磺酰基、芳基磺酰基、烷硫基和芳硫基。在这些中的一些中，R3、R4和R5可以独立地选自：H、F、Cl、Br、I、氰基、硝基、磺酸盐、硫酸盐、三氟甲基、三氟乙基、含有1-20个碳原子的直链烷基、含有3-20个碳原子的支链烷基、含有2-20个碳原子的直链烯基、含有3-20个碳原子的支链烯基、含有3-20个碳原子的环烷基、含有3-20个碳原子的环烯基、含有3-20个碳原子的环杂烷基、含有3-20个碳原子的环杂烯基、含有4-60个碳原子的聚环烷基、含有4-60个碳原子的聚环烯基、含有4-60个碳原子的聚环杂烷基、含有4-60个碳原子的聚环杂烯基、含有1-20个碳原子的烷氧基、含有6-14个碳原子的芳基、含有6-14个碳原子的芳氧基、含有2-21个碳原子的酯、含有3-30个碳原子的三烷基铵、含有3-30个碳原子的三烷基鏻、含有2-21个碳原子的烷基酰氨基、含有7-15个碳原子的芳基酰氨基、含有2-21个碳原子的烷基氨甲酰基、含有7-15个碳原子的芳基氨甲酰基、含有1-20个碳原子的烷基亚磺酰氨基、含有6-14个碳原子的芳基亚磺酰氨基、含有3-60个碳原子的三烷基甲硅烷基、含有18-42个碳原子的三芳基甲硅烷基、含有7-32个碳原子的烷基芳基甲硅烷基、含有1-20个碳原子的烷基酰氨基磺酰基、含有6-14个碳原子的芳基酰氨基磺酰基、含有1-20个碳原子的烷基磺酰基、含有6-14个碳原子的芳基磺酰基、含有2-20个碳原子的烷硫基和含有6-14个碳原子的芳硫基。
在有些实施方案中，所述烯醇醚[1] 可以具有OR2，所述OR2是磷酸酯、乙酸酯、1-磷酸-2,3-二酰基甘油酯、三磷酸腺苷、二磷酸腺苷、单磷酸腺苷、腺苷、α-D-半乳糖苷、β-D-半乳糖苷、α-D-葡萄糖苷、β-D-葡萄糖苷、α-D-甘露糖苷、β-D-甘露糖苷、β-呋喃果糖苷、β-D-葡糖苷酸或
Figure 587499DEST_PATH_IMAGE020
，其中，B1、B2和B3各自独立地是H或1-4个碳原子的烷基(支链或直链)。在这些中的一些中，R2是
Figure 85476DEST_PATH_IMAGE021
Figure 168708DEST_PATH_IMAGE022
。
R2(即酶可切割的取代基)可以包括由下述通式代表的磷酸酯基团：
Figure 119346DEST_PATH_IMAGE023
其中M+ 代表阳离子诸如碱金属，例如，钠或钾、铵或C1-7烷基、芳烷基或芳族季铵阳离子、N(DR3)4 + ，其中每个D3可以是烷基，例如，甲基或乙基、芳烷基(例如，苄基)，或形成杂环系(例如，吡啶鎓，具体地，二钠盐)的一部分。即，这样的季铵阳离子还可以通过它们的季铵化基团之一与聚合主链相连。
Figure 64168DEST_PATH_IMAGE024
其中n大于1，或可以是聚季铵盐(即，紫罗烯聚合物)的一部分。
在有些实施方案中，R2可以是E-L-Nuc-Z，其中E是包含亲电子原子的基团，所述原子在Z基团的酶切割以后被Nuc基团的电子对攻击，并通过邻助作用释放出1,2-二氧杂环丁烷酶底物阴离子；L是连接基团；Nuc是亲核原子；且Z是酶可切割的基团；其中
E可以是羧基、羰基、被离去基团取代的亚甲基、磷酸盐、碳酸盐、黄原酸盐、亚硫酸盐、磺酸盐、亚硫酸氢盐或二硫化物；
L可以选自：含有1-4个碳原子的亚甲基或聚亚甲基、-(CH2)m-O-(CH2)n、-(CH2)m-S-(CH2)n-或–(CH2)m-NR6-(CH2)n-，其中m和n是0-3，且m+n是2或3，其中R6是含有1-10个碳原子的烷基，且所述连接基团可以被含有1-24个碳原子的烷基、含有2-24个碳原子的烯基、含有1-24个碳原子的烷基取代，和被含有1-24个碳原子的酰氧基、含有2-24个碳原子的烯基单取代或二取代，和被含有1-24个碳原子的酰氧基、含有6-10个碳的芳基、含有1-24个碳原子的烷基单取代或二取代，和被苯基、羟苯基、吲哚基、巯基、含有1-4个碳原子的烷硫基、羟基、羧基、氨基、胍基、咪唑或氨基甲酰基或含有2-24个碳原子的烯基取代，和被苯基、羟苯基、吲哚基、巯基、含有1-4个碳原子的烷硫基、羟基、羧基、氨基、胍基、咪唑或氨基甲酰基取代；
Nuc可以是氧原子或硫原子；且
Z可以是磷酰基、乙酰基、1-磷酸-2,3-二酰基甘油酰基、腺苷三磷酰基、腺苷二磷酰基、腺苷单磷酰基、腺苷基、α-D-半乳糖基、β-D-半乳糖基、α-D-葡萄糖基、β-D-葡萄糖基、α-D-甘露糖基、β-D-甘露糖基、β-呋喃果糖基、β-D-glucosiduransyl或
Figure 416652DEST_PATH_IMAGE025
，其中，B1、B2和B3各自独立地是H或1-4个碳原子的烷基(支链或直链)。
在有些实施方案中，Z可以是
Figure 172250DEST_PATH_IMAGE026
在有些实施方案中，所述烯醇醚[1] 可以是
Figure 610184DEST_PATH_IMAGE028
Figure 93118DEST_PATH_IMAGE029
在这些方法的另一个步骤中，组合水性溶液、所述氧化剂和所述烯醇醚，以形成包含1,2-二氧杂环丁烷酶底物的水性溶液。所述水性溶液可以包含水、一种或多种缓冲剂组分、一种或多种有机溶剂、一种或多种着色剂、一种或多种防腐剂或它们的组合。提供1,2-二氧杂环丁烷酶底物所需的水性溶液中的氧化剂和烯醇醚的浓度的确定，属于诊断学领域的普通技术人员的技能范围内。
在这些方法的另一个步骤中，提供酶复合物，其包含能够切割1,2-二氧杂环丁烷酶底物的酶部分。所述酶部分可以是酶、酶连接的抗体、酶连接的抗原或酶连接的寡核苷酸。
所述酶部分包含能够切割1,2-二氧杂环丁烷酶底物的酶。在有些实施方案中，所述酶可以是水解酶。水解酶包括这样的酶：其切割酯键且被归类为EC 3.1，或切割糖键且被归类为EC 3.2，其包括、但不限于碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、β-葡萄糖苷酶、β-葡糖苷酸酶或神经氨酸酶。
将要测定的样品疑似包含酶、抗原或核酸。所述样品可以具有生物的或非生物的起源。在样品具有生物起源的情况下，它可以是血液、血清、血浆、尿、粪便、唾液、粘液、精液、组织、组织提取物、细胞培养基、细胞、细胞提取物等。
在有些实施方案中，所述酶部分可以是酶。在这些实施方案中，样品中的酶将构成酶复合物。使所述酶复合物与1,2-二氧杂环丁烷酶底物接触，以形成反应混合物，并使所述反应混合物产生光。
在有些实施方案中，可以检测光的发射，并且这样的发射将指示酶的存在，并且发射的光的量可以与样品中存在的酶的量相关联。
在有些实施方案中，所述酶部分可以是酶连接的抗体。所述酶连接的抗体包含能够结合抗原的第一抗体和酶，所述酶能够切割1,2-二氧杂环丁烷酶底物，使得所述底物分解并产生光。在这些实施方案中，所述酶连接的抗体、抗原和第二抗体(其能够结合所述抗原且固定化在固相上)构成酶复合物。使所述酶复合物与1,2-二氧杂环丁烷酶底物接触，以形成反应混合物，并使所述反应混合物产生光。
在有些实施方案中，可以使疑似包含抗原的样品与酶连接的抗体(其包含第一抗体和酶)和固相(其包含第二抗体)接触，其中两种抗体都能够结合抗原以提供酶复合物，所述酶复合物能够切割1,2-二氧杂环丁烷酶底物，使得所述底物分解并产生光。所述样品、酶连接的抗体和固相可以以任意次序组合。
在有些实施方案中，所述方法可以另外包括下述步骤：通过洗涤所述酶复合物，从所述酶复合物除去任何未结合的酶连接的抗体。这可以通过加入和除去与所述酶复合物的组分相容的缓冲液来实现。这样的缓冲液是诊断学领域众所周知的。可以进行固相的其它洗涤步骤。
所述第一抗体、第二抗体或二者可以是多克隆的、单克隆的或重组的抗体。
所述固相可以是珠子、试管、多孔板、微阵列、凝胶、膜、微粒、纳米晶体、量子点等。用于制备这些固相的材料是诊断学领域已知的。
通过诊断学领域已知的技术，通过第二抗体与固相的非共价或共价连接，可以将所述第二抗体固定化在所述固相上。
所述第一抗体可以与所述酶共价地或非共价地连接。当非共价地连接时，第一抗体与标记共价地连接，且所述酶与这样的分子共价地连接：所述分子能够非共价地结合所述标记。
在有些实施方案中，所述标记可以是生物素或生物素衍生物，且所述分子可以是抗生物素蛋白或抗生蛋白链菌素。生物素衍生物是具有取代的生物素分子。其中缺失生物素结构的一部分的生物素分子，也被视作生物素衍生物。生物素衍生物包括被取代的天然存在的生物素以及合成的生物素。
在有些实施方案中，所述标记可以是半抗原，且所述分子可以是能够结合所述半抗原的抗体。地高辛配基(digoxigenin)作为半抗原的用途，和抗-地高辛配基作为分子的用途，是诊断学领域已知的。
在有些实施方案中，所述酶部分可以是酶连接的抗原。所述酶连接的抗原包含抗原和酶，所述酶能够切割1,2-二氧杂环丁烷酶底物。在这些实施方案中，所述酶复合物包含与固相结合的酶连接的抗原，所述固相包含能够结合所述抗原的抗体。使所述酶复合物与1,2-二氧杂环丁烷酶底物接触，以形成反应混合物，并使所述反应混合物产生光。
在有些实施方案中，可以使疑似包含抗原的样品与酶连接的抗原和固相(其包含能够结合所述抗原的抗体)接触。所述样品、酶连接的抗原和固相可以以任意次序组合。
在有些实施方案中，所述方法可以另外包括下述步骤：通过洗涤所述酶复合物，从所述酶复合物除去任何未结合的酶连接的抗原。这可以通过加入和除去与所述酶复合物的组分相容的缓冲液来实现。这样的缓冲液是诊断学领域众所周知的。可以进行固相的其它洗涤步骤。
所述抗体可以是多克隆的、单克隆的或重组的抗体。
所述固相可以是珠子、试管、多孔板、微阵列、凝胶、膜、微粒、纳米晶体、量子点等。用于制备这些固相的材料是诊断学领域已知的。
通过抗体与固相的非共价或共价连接，可以将所述抗体固定化在所述固相上。
所述抗原可以与所述酶共价地或非共价地连接。当非共价地连接时，所述抗原可以与标记共价地连接，且所述酶可以可以与这样的分子共价地连接：所述分子能够非共价地结合所述标记。
在有些实施方案中，所述标记可以是如上所述的生物素或生物素衍生物，且所述分子可以是抗生物素蛋白或抗生蛋白链菌素。
在有些实施方案中，所述标记可以是半抗原，且所述分子可以是能够结合所述半抗原的抗体。地高辛配基作为半抗原的用途，和抗-地高辛配基作为分子的用途，是诊断学领域已知的。
在有些实施方案中，所述酶部分是酶连接的寡核苷酸。所述酶连接的寡核苷酸包含：能够与某种核酸杂交的寡核苷酸，和能够切割1,2-二氧杂环丁烷酶底物的酶。在这些实施方案中，所述酶复合物包含酶连接的寡核苷酸，所述寡核苷酸与包含核酸的固相杂交。使所述酶复合物与1,2-二氧杂环丁烷酶底物接触，以形成反应混合物，并使所述反应混合物产生光。
在有些实施方案中，所述方法可以另外包括下述步骤：提供疑似包含核酸的样品；将所述核酸固定化在固相上；使所述固定化的核酸和所述酶连接的寡核苷酸接触，以形成酶复合物；和，在加入1,2-二氧杂环丁烷酶底物的水性溶液以后，检测从所述反应混合物发射出的光，其中光的发射指示所述核酸的存在，并且发射的光的量可以与样品中存在的核酸的量相关联。
在有些实施方案中，所述方法可以另外包括下述步骤：通过洗涤所述酶复合物，从所述酶复合物除去任何未结合的酶连接的寡核苷酸。这可以通过加入和除去与所述酶复合物的组分相容的缓冲液来实现。这样的缓冲液是诊断学领域众所周知的。可以进行所述固相的其它洗涤。
所述固相可以是珠子、试管、多孔板、微阵列、凝胶、膜、微粒、纳米晶体、量子点等。用于制备这些固相的材料是诊断学领域已知的。
所述寡核苷酸可以与酶共价地或非共价地连接。当非共价地连接时，所述寡核苷酸可以与标记共价地连接，且所述酶可以可以与这样的分子共价地连接：所述分子能够非共价地结合所述标记。
在有些实施方案中，所述标记可以是如上所述的生物素或生物素衍生物，且所述分子可以是抗生物素蛋白或抗生蛋白链菌素。
在有些实施方案中，所述标记可以是半抗原，且所述分子可以是能够结合所述半抗原的抗体。地高辛配基作为半抗原的用途，和抗-地高辛配基作为分子的用途，是诊断学领域已知的。
在该方法的另一个步骤中，使所述样品与包含1,2-二氧杂环丁烷酶底物的水性溶液接触，以形成反应混合物。
在有些实施方案中，可以将样品加入包含1,2-二氧杂环丁烷酶底物的水性溶液中，而在其它实施方案中，可以将包含1,2-二氧杂环丁烷酶底物的水性溶液加入所述样品中。
在有些实施方案中，所述反应混合物可以另外包含促进剂。所述促进剂可以包含CTAB (鲸蜡基三甲溴化铵)和其它胶束形成物质。所述促进剂可以包含聚合物型的季铵盐、聚合物型的季鏻盐或它们的组合。所述聚合物型的季铵盐可以是聚(乙烯基苄基三甲基氯化铵)、聚[乙烯基苄基(苄基二甲基氯化铵)]、聚[乙烯基(苄基三丁基氯化铵)]、聚[乙烯基(苄基三戊基氯化铵)]或它们的组合。所述聚合物型的季鏻盐可以是聚(乙烯基苄基三甲基氯化鏻)、聚(乙烯基苄基三丁基氯化鏻)、聚(乙烯基苄基三辛基氯化鏻)、包含聚(乙烯基苄基三丁基氯化鏻)和聚(乙烯基苄基三辛基氯化鏻)的共聚物或它们的组合。
在有些实施方案中，所述促进剂可以另外包含受体染料。在这些实施方案中，所述受体染料可以是荧光染料。在这些实施方案中的一些中，所述荧光染料可以是荧光素。
在这些方法的另一个步骤中，使所述反应混合物产生光。
在有些实施方案中，可以用眼观察所述光，或可以使用X-射线胶片或能够检测和测量产生的光的仪器测量所述光。能够检测和测量产生的光的仪器包括，但不限于、光度计、带有胶片的照相机或电荷耦合的照相机。
从另一个方面看，本发明提供了用于检测样品中分析物的存在或量的试剂盒，所述试剂盒包含氧化剂和具有结构[1]的烯醇醚，二者都如上所定义。
在有些实施方案中，所述氧化剂可以选自：过氧化氢、钼酸钠、过氧化氢和钼酸钠、次氯酸盐、次氯酸盐和过氧化氢、芳基内过氧化物、过氧化钙过氧水合物、以及它们的组合。在这些实施方案中的一些中，所述氧化剂可以是过氧化氢或过氧化氢和钼酸钠。
在有些实施方案中，所述试剂盒可以另外包含如上所述的促进剂。在有些实施方案中，所述试剂盒可以另外包含如上所述的受体染料。
在有些实施方案中，所述试剂盒可以另外包含关于使用它的组分的说明书。
下述实施例意图例证而不是限制本发明。
实施例1
烯醇醚磷酸盐的一般合成。
a. 烯醇醚磷酸三酯的合成
Figure 990722DEST_PATH_IMAGE031
A、B、R1和R6如在发明详述中所定义。
在氩气氛下在0℃将磷酰氯(1.5当量)缓慢地加入吡啶(0.7 ml/mmol苯酚烯醇醚，在碱性氧化铝上干燥过夜)中。观察到一点白烟，但是没有形成沉淀物。向该POCl3溶液中，通过滴液漏斗历时90分钟加入苯酚烯醇醚(30 mmol, 1当量)在无水THF (3 ml/mmol苯酚烯醇醚) 中的溶液。在加入过程中，形成白色吡啶盐酸盐沉淀物。使用额外体积的THF冲洗储存瓶和滴液漏斗，并加入所述反应混合物中。将悬浮液在0℃搅拌15分钟，并在室温搅拌3小时。然后将所述反应混合物冷却回0℃，并通过注射器以细流形式缓慢地加入3-羟基丙腈(3.95当量)。在0℃搅拌5分钟以后，将所述混合物在室温搅拌过夜，同时形成更多的白色沉淀物。通过过滤除去所述沉淀物，并用EtOAc在己烷中的溶液冲洗。在减压下浓缩合并的滤液，得到浅黄色油。
向该粗产物中加入饱和的NaHCO3溶液(13 ml/mmol苯酚烯醇醚)，然后加入足量的水，以溶解存在的任何盐。用60% EtOAc在己烷中的溶液萃取该水性溶液3次。用水和盐水顺序地洗涤合并的有机溶液，在无水Na2SO4上干燥，并通过旋转蒸发器浓缩。与5% EtOAc在己烷中的溶液一起研磨树胶状粗产物3次(加热，冷却至室温，然后0℃)。TLC表明，通过研磨除去了大部分残余的吡啶、和痕量的未反应的起始苯酚烯醇醚、和少量二芳基单氰乙基磷酸三酯副产物。然后在真空下抽吸产物至恒重的树胶状物。
b. 烯醇醚磷酸盐的合成
A、B、R1和R6如在发明详述中所定义。
在氩气氛下在0℃，向磷酸三酯烯醇醚(28 mmol, 1当量)在无水MeOH (3 ml/mmol磷酸三酯)中的溶液中，通过注射器以细流形式加入4.37 M NaOMe在MeOH中的溶液(2当量)。将该混合物在0℃搅拌几分钟，然后温热至室温。在搅拌下在室温形成大量沉淀物。不时地轻敲烧瓶，以将沉积的固体敲回搅拌的溶液中。将该浓悬浮液搅拌过夜。将反应混合物放在旋转蒸发器上，以除去大约一半的MeOH体积，并向剩余的悬浮液中加入1.5% 水/丙酮(7 ml/mmol磷酸三酯)。加入额外体积的丙酮(7 ml/mmol磷酸三酯)，以将大部分粉末转移至过滤器。用冷丙酮(2 ml/mmol磷酸三酯)冲洗滤饼，并在真空干燥器中抽吸至干燥，得到白色粉末。
如下进一步纯化所述粗粉末：将它溶解在水(0.35 ml/mmol磷酸三酯)中，并在布氏漏斗上过滤该溶液。使用额外体积的水(0.35 ml/mmol磷酸三酯) 冲洗储存容器和过滤漏斗，并过滤。然后将合并的滤液转移至冰箱瓶子，并使用额外体积的水(0.35 ml/mmol磷酸三酯)冲洗抽滤瓶，并加入所述溶液中。当将合并的水性溶液加入丙酮(13 ml/mmol磷酸三酯)中时，从所述溶液中析出大量沉淀物。加入额外体积的丙酮(1.4 ml/mmol磷酸三酯)以稀释该悬浮液，以便于更容易过滤。将所述悬浮液在实验台上静置30分钟，然后通过过滤来收集白色沉淀物。用丙酮洗涤滤饼多次，并在真空干燥器中干燥至恒重的白色粉末。
实施例2
AMPPD烯醇醚磷酸盐的合成。
AMPPD烯醇醚苯酚的合成在美国专利号5,177,241中报道。
Figure 202578DEST_PATH_IMAGE033
b. AMPPD烯醇醚磷酸三酯的合成。
Figure 264075DEST_PATH_IMAGE034
在氩气氛下在0℃将磷酰氯(1.5当量)缓慢地加入吡啶(0.7 ml/mmol苯酚烯醇醚，在碱性氧化铝上干燥过夜)中。没有形成沉淀物。向该POCl3溶液中，通过滴液漏斗历时90分钟加入AMPDD烯醇醚苯酚(30 mmol, 1当量)在无水THF (3 ml/mmol苯酚烯醇醚)中的溶液。在加入过程中形成白色吡啶盐酸盐沉淀物。使用额外体积的THF冲洗储存瓶和滴液漏斗，并加入所述反应混合物中。将所述悬浮液在0℃搅拌15分钟，并在室温搅拌3小时。然后将所述反应混合物冷却回0℃，通过注射器以细流形式缓慢地加入3-羟基丙腈(3.95当量)。在0℃搅拌5分钟以后，将所述混合物在室温搅拌过夜，同时形成更多的白色沉淀物。通过过滤除去所述沉淀物，并用EtOAc在己烷中的溶液冲洗。在减压下浓缩合并的滤液，得到浅黄色油。向该粗产物中加入饱和的NaHCO3溶液(13 ml/mmol苯酚烯醇醚)，然后加入足量的水，以溶解存在的任何盐。用60% EtOAc在己烷中的溶液萃取该水性溶液3次。用水和盐水顺序地洗涤合并的有机溶液，在无水Na2SO4上干燥，并通过旋转蒸发器浓缩。与5% EtOAc在己烷中的溶液一起研磨树胶状粗产物3次(加热，冷却至室温，然后0℃)。TLC表明，通过研磨除去了大部分残余的吡啶、和痕量的未反应的起始烯醇醚苯酚、和少量二芳基单氰乙基磷酸三酯副产物。然后在真空下抽吸产物至恒重的树胶状物。
c. AMPPD烯醇醚磷酸盐的合成。
Figure 361475DEST_PATH_IMAGE035
在氩气氛下在0℃，向AMPPD烯醇醚磷酸三酯(28 mmol, 1当量)在无水MeOH (3 ml/mmol磷酸三酯)中的溶液中，通过注射器以细流形式加入4.37 M NaOMe在MeOH中的溶液(2当量)。将该混合物在0℃搅拌几分钟，然后温热至室温。在搅拌下在室温形成大量沉淀物。不时地轻敲烧瓶，以将沉积的固体敲回搅拌的溶液中。将该浓悬浮液搅拌过夜。将反应混合物放在旋转蒸发器上，以除去大约一半的MeOH体积，并向剩余的悬浮液中加入1.5%水/丙酮(7 ml/mmol磷酸三酯)。加入额外体积的丙酮(7 ml/mmol磷酸三酯)，以将大部分粉末转移至过滤器。用冷丙酮(2 ml/mmol磷酸三酯)冲洗滤饼，并在真空干燥器中抽吸至干燥，得到白色粉末。
如下进一步纯化所述粗粉末：将它溶解在水(0.35 ml/mmol磷酸三酯)中，并在布氏漏斗上过滤该溶液。使用额外体积的水(0.35 ml/mmol磷酸三酯)冲洗储存容器和过滤漏斗，并过滤。然后将合并的滤液转移至冰箱瓶子，并使用额外体积的水(0.35 ml/mmol磷酸三酯)冲洗抽滤瓶，并加入所述溶液中。当将合并的水性溶液加入丙酮(13 ml/mmol磷酸三酯)中时，从所述溶液中析出大量沉淀物。加入额外体积的丙酮(1.4 ml/mmol磷酸三酯)以稀释该悬浮液，以便于更容易过滤。将所述悬浮液在实验台上静置30分钟，然后通过过滤来收集白色沉淀物。用丙酮洗涤滤饼多次，并在真空干燥器中干燥至恒重的白色粉末。
实施例3
ADP-Star烯醇醚磷酸盐和ADP-Star ®的合成
膦酸酯合成报道于美国专利号5,582,980第5列第18-62行。
Figure 774001DEST_PATH_IMAGE036
c. ADP-Star甲氧基烯醇醚的合成。
Figure 802000DEST_PATH_IMAGE037
在氩气氛下，将1-甲氧基-1-(4-氯-3-甲氧基苯基)甲烷膦酸二乙酯(21.1 g, 65.4 mmol, 1.1当量)在140 ml无水THF中的溶液冷却至-78℃，并通过滴液漏斗历时20分钟用41 ml (1.6 M, 65.4 mmol, 1.1当量) 正丁基锂在己烷中的溶液处理。将得到的橙色反应混合物在-78℃搅拌15分钟，然后一次性加入2-金刚烷酮粉末(8.93 g, 59.5 mmol)。将所述反应混合物在-78℃搅拌40分钟，然后温热至室温，最后加热至回流保持1.5小时，并注意任何剧烈的丁烷演化。将所述反应混合物冷却回室温，并保持在该温度过夜。次日早晨，通过旋转蒸发，除去所述反应混合物中的挥发物。然后在饱和的NaHCO3溶液和5% EtOAc在己烷中的溶液之间分配残余物。用5% EtOAc在己烷中的溶液(共300 ml)萃取所述水性溶液3次。用盐水洗涤合并的有机溶液，在无水Na2SO4上干燥，并穿过硅胶塞。浓缩滤液以后，得到黄色油。在30 ml MeOH中结晶所述粗产物。在20 ml MeOH中第二次重结晶以后，得到11.99 g (63.2%)浅黄色固体。通过硅胶色谱法(0-4% EtOAc在己烷中的溶液)进一步纯化合并的母液，并在8 ml MeOH中结晶2次，得到1.74 g (9.2%)第二批产物，为浅黄色固体。
Figure 45900DEST_PATH_IMAGE038
。
d. ADP-Star烯醇醚苯酚的合成。
Figure 235573DEST_PATH_IMAGE039
用己烷类(3x15 ml)冲洗NaH (60%在矿物油中，1.63 g，40.8 mmol，1.3当量) 3次，用氩气流吹得到的湿NaH粉末至干燥，并在真空下简单地抽吸5分钟。在氩气氛下在0℃，向NaH粉末在无水DMF (35 ml)中的悬浮液中，通过注射器历时10分钟逐滴加入EtSH (3.1 ml, 42.3 mmol, 1.35当量)。在加入过程中，立即发生剧烈的气体演化；将得到的澄清乙基硫醇钠溶液在0℃搅拌5分钟，并在室温搅拌25分钟。将该溶液冷却回0℃，并用固体ADP-Star甲氧基烯醇醚(10 g, 31.4 mmol)一次性地处理所述乙基硫醇钠溶液。将所述悬浮液加热至120~125℃回流；在加热过程中得到均匀的混合物，且在以后的回流过程中变浑浊。回流2小时以后，TLC表明反应结束。将所述反应混合物冷却回室温，并用饱和的NaHCO3溶液淬灭。用20% EtOAc在己烷中的溶液(共150 ml)萃取水性溶液3次。用盐水洗涤合并的有机溶液，在无水Na2SO4上干燥，并穿过粗硅胶(40-140目)塞。通过旋转蒸发浓缩滤液，得到白色粉末，其具有轻微的臭气。通过研磨，纯化粗产物。在与30 ml己烷类一起加热以后，然后冷却并在冰箱中储存过夜，过滤后得到8.78 g (91.8%)产物，为白色固体。
。
e. ADP-Star烯醇醚磷酸三酯的合成。
Figure 13091DEST_PATH_IMAGE041
在氩气氛下在0℃将磷酰氯(4.2 ml, 46.3 mmol, 1.5当量) 缓慢地加入吡啶(22 ml，在碱性氧化铝上干燥过夜)中。观察到一点白烟，但是没有形成沉淀物。向该POCl3溶液中，通过滴液漏斗历时90分钟加入ADP-Star烯醇酯苯酚(9.41 g, 30.87 mmol)在94 ml无水THF中的溶液。在加入过程中，形成白色吡啶盐酸盐沉淀物。使用额外10 ml THF冲洗储存瓶和滴液漏斗，并加入所述反应混合物中。将悬浮液在0℃搅拌15分钟，并在室温搅拌2小时40分钟。然后将所述反应混合物冷却回0℃，并通过注射器以细流形式缓慢地加入3-羟基丙腈(8.3 ml, 122 mmol, 基于苯酚为3.95当量)。在0℃搅拌5分钟以后，将所述混合物在室温搅拌过夜(约15.5小时)，同时形成更多的白色沉淀物。通过过滤除去所述沉淀物，并用60 ml EtOAc在己烷中的溶液冲洗。在减压下浓缩合并的滤液，得到浅黄色油。
将该粗产物中加入400 ml饱和的NaHCO3溶液中，然后加入足量的水，以溶解存在的任何盐。用60% EtOAc在己烷中的溶液(共400 ml)萃取该水性溶液3次。用水和盐水(各150 ml)洗涤合并的有机溶液，在无水Na2SO4上干燥，并通过旋转蒸发进行浓缩。每次与40 ml的5% EtOAc在己烷中的溶液一起研磨树胶状粗产物3次(加热，冷却至室温，然后0℃)。TLC表明，通过这些研磨除去了大部分残余的吡啶、痕量的未反应的原料ADP-Star烯醇醚苯酚、和少量二芳基单氰乙基磷酸三酯副产物。然后在真空下抽吸产物至恒重；得到13.4 g (92%)，为浅黄色树胶状物。
Figure 377076DEST_PATH_IMAGE042
。
f. ADP-Star烯醇醚磷酸盐的合成。
Figure 737650DEST_PATH_IMAGE043
在氩气氛下在0℃，向ADP-Star烯醇醚磷酸三酯(13.83 g, 28.2 mmol)在85 ml无水MeOH中的溶液中，通过注射器以细流形式加入4.37 M NaOMe在MeOH中的溶液(12.9 ml, 56.3 mmol, 2当量)。将该混合物在0℃搅拌2分钟，然后温热至室温。在搅拌下在室温形成大量沉淀物。不时地轻敲烧瓶，以将沉积的固体敲回搅拌的溶液中。将该浓悬浮液搅拌过夜17.5小时。使用乙腈/NaHCO3梯度进行分析型HPLC监测，表明期望的产物在8.3分钟；不完全反应中间体单氰乙基单芳基磷酸二酯在13.6 min；副产物二芳基磷酸二酯在16.9 min，且ADP-Star苯酚烯醇醚在19.6 min。将反应混合物放在旋转蒸发器上，以除去大约45 ml MeOH，并向剩余的悬浮液中加入3 ml水，然后加入200 ml丙酮。在布氏漏斗过滤该溶液。使用额外10 ml水冲洗储存容器和过滤漏斗，并加入滤液中。然后将合并的滤液转移至1升冷冻干燥器瓶子，并使用额外10 ml水冲洗抽滤瓶，并加入所述溶液中。当将合并的水性溶液加入360 ml丙酮中时，从所述溶液中析出大量沉淀物。加入额外40 ml丙酮以稀释该悬浮液，以便于以后更容易过滤。将所述悬浮液在实验台上静置30分钟，然后通过过滤来收集白色沉淀物。用丙酮洗涤滤饼多次(共200 ml)，并在真空干燥器中干燥至恒重，得到10.07 g (83.9%)白色粉末，作为第一批产物。
Figure 937818DEST_PATH_IMAGE044
。
当在冰箱中冷却滤液时，从该溶液中析出更多的沉淀物。通过过滤，得到1.388 g (11.6%)额外的第二批产物。它的质子NMR谱与第一批产物的质子NMR谱相同。两批产物的分析型HPLC峰积分大于99.4%。
g. ADP-Star ®的合成。
按照在美国专利号5,582,980中报道的CDP-Star ®的合成，在第5-6列的化合物5的操作中用2-金刚烷酮替代5-氯-2-金刚烷酮，合成ADP-Star ®。所有其它步骤与关于CDP-Star ®所报道的那些步骤相同。
可以用作底物的烯醇醚磷酸盐的其它实例包括，但不限于：
在美国专利号6,355,441中引用的苯并噻唑烯醇醚磷酸盐和类似物。
(3-磷酰基氧基苯基)甲氧基亚甲基三环[7.3.1.02,7]三癸-2,7-烯二钠盐。美国专利号6,461,876
[(3-磷酰基氧基苯基)(2,2,2-三氟乙氧基)亚甲基]三环[7.3.1.02,7]三癸-2,7-烯二钠盐。美国专利号6,461,876。
(3-磷酰基氧基-4-氯苯基)甲氧基亚甲基三环[7.3.1.02,7]三癸-2,7-烯二钠盐。美国专利号6,461,876。
[(4-甲氧基)-4-(3-磷酰基氧基苯基)]螺[1,2-二氧杂环丁烷-3,13'-(8-正丙基)三环[7.3.1.02,7]三癸-2,7-烯]二钠盐。美国专利号6,461,876。
(3-磷酰基氧基苯基)甲氧基亚甲基金刚烷-4,5-烯二钠盐。美国专利号6,461,876。
实施例4
烯醇醚糖苷的通过相转移催化的一般合成
Figure 307620DEST_PATH_IMAGE045
在室温，向剧烈搅拌的苯酚烯醇醚(1当量)和PTC催化剂、Bu4NBr (1.05当量)在1N NaOH溶液和CH2Cl2的混合物中的两相混合物中，以细流形式加入过酰基糖基溴* (1.5当量)在CH2Cl2中的溶液。将所述混合物搅拌60分钟。将饱和的NaHCO3溶液加入该反应物中，并用CH2Cl2萃取该溶液3次。用水洗涤合并的CH2Cl2溶液，在无水Na2SO4上干燥，浓缩，并通过硅胶色谱法纯化，得到受保护的糖基烯醇醚。
将所述过酰基糖基烯醇醚(1当量)溶解在1:1 THF/MeOH中，在0℃通过加入1N NaOH进行去保护，然后将反应物温热至室温。在完全去保护以后，用固体NaHCO3中和反应物，通过旋转蒸发除去溶剂，并通过反相色谱法进行纯化。
*过酰基溴代糖苷的实例是：α-D-吡喃葡萄糖基溴，2,3,4,6-四乙酸酯(CAS# 572-09-8)；α-D-吡喃半乳糖基溴，2,3,4,6-四乙酸酯(CAS# 3068-32-4)；α-D-吡喃葡萄糖醛酸-1-溴-1-脱氧-甲酯，2,3,4-三乙酸酯(CAS# 21085-72-3)。
实施例5
Glucon-Star烯醇醚四乙酸酯的通过相转移催化的合成
a. Glucon-Star烯醇醚四乙酸酯的合成。
Figure 260532DEST_PATH_IMAGE046
向在室温剧烈搅拌的CDP-Star烯醇醚苯酚(1.02 g, 3 mmol)和PTC催化剂、四丁基溴化铵(1.02 g, 3.15 mmol)在1N NaOH (20 ml)和14 ml CH2Cl2中的混合物中，加入在6 ml CH2Cl2中的α-D-吡喃葡萄糖基溴，2,3,4,6-四乙酸酯(2.47 g, 6 mmol)。将反应物搅拌30分钟，直到TLC表明剩下非常少的原料。用饱和的NaHCO3溶液淬灭反应。用CH2Cl2萃取水层3次，并用盐水洗涤合并的有机层，并在无水Na2SO4上干燥。将4滴三乙胺加入该溶液中，使该溶液穿过短硅胶柱，用100 ml 40% EtOAc/己烷类洗脱，得到橙色树胶状物。
在4℃过夜储存以后，将所述粗产物溶解在少量CH2Cl2中，并用硅胶色谱分离，用20%-50% EtOAC/己烷类洗脱。收集含有偶联产物的级分，并浓缩，得到浅黄色树胶状物(2.31 g, >100%)。
b. Glucon-Star烯醇醚的合成。
Figure 369172DEST_PATH_IMAGE047
在室温，向粗Glucon-Star烯醇醚四乙酸酯(1.5 g理论收率, 3 mmol)的溶液中，通过移液器加入15滴4.37M NaOMe在MeOH中的溶液。将该混合物搅拌过夜，发生小量乙酸酯水解。加入另外30滴4.37M NaOMe在MeOH中的溶液，该混合物从黄色变成橙色，通过TLC证实，4小时以后水解结束。加入氯化铵(1 g)以淬灭反应，并将该溶液搅拌1小时。加入二氯甲烷以沉淀产物，并加入5% MeOH/CH2Cl2，直到没有更多的沉淀物析出。通过过滤收集沉淀物，并用5% MeOH/CH2Cl2洗涤。通过硅胶色谱法纯化粗树胶状物，首先用30% EtOAc/己烷类洗脱以回收CDP-Star烯醇醚苯酚，然后用5-10% MeOH/CH2Cl2冲洗柱以得到Glucon-Star烯醇醚，为浅黄色泡沫(1.18 g, 79%)。
实施例6
烯醇醚糖苷的通过Schmidt糖苷化的一般合成
在室温在氩气氛下，向搅拌的过酰基糖基三氯乙酰亚氨酸酯* (1.2-1.5当量)在CH2Cl2 (6 ml/当量苯酚)中的溶液中，一次性加入固体苯酚烯醇醚(1当量)。将该混合物冷却至-23℃，并历时10分钟用BF3•OEt2 (0.2当量)在CH2Cl2 (0.6 ml/当量苯酚)中的溶液缓慢地处理。在BF3•OEt2加入过程中，反应混合物变混浊，并历时1.5小时缓慢地温热至0℃。用Et3N (5当量的BF3•OEt2)淬灭反应，并在0℃搅拌10分钟。在饱和的NaHCO3溶液和CH2Cl2之间分配所述反应混合物，通过硅胶色谱法进行纯化，并收集过酰化的糖基烯醇醚，为泡沫。
将所述过酰基糖基烯醇醚(1当量)溶解在1:1 THF/MeOH中，在0℃通过加入1N NaOH进行去保护，然后将反应物温热至室温。在完全去保护以后，用固体NaHCO3中和反应物，通过旋转蒸发除去溶剂，并通过反相色谱法进行纯化。
* 过酰基糖基三氯乙酰亚氨酸酯合成报道于R. R. Schmidt, Adv. Carbohydr. Chem. Biochem., 1994, 50:21的综述和其中引用的参考文献中。
实施例7
葡糖醛酸基烯醇醚的通过Schmidt糖苷化的合成
a. 过酰基葡糖醛酸基AMPPD烯醇醚的合成。
Figure 213817DEST_PATH_IMAGE049
在室温在氩气氛下，向过酰基葡糖醛酸基三氯乙酰亚氨酸酯(1.2当量)在CH2Cl2 (24 ml/当量)中的溶液中，加入固体苯酚烯醇醚(1当量)。将该混合物冷却至–25℃，并用历时10 min缓慢加入的三氟化硼乙醚络合物(0.2当量)的CH2Cl2溶液处理。将得到的混浊混合物在下述温度梯度搅拌：在-23℃至-20℃搅拌1小时，在-20℃至-10℃搅拌30分钟，在-10℃至+5℃搅拌30分钟。在+5℃用Et3N淬灭反应15分钟，随后加入饱和的NaHCO3溶液。用CH2Cl2萃取所述混合物，用水洗涤，在无水Na2SO4上干燥，并将少量Et3N加入该有机溶液中。在旋转蒸发和硅胶色谱法以后，得到粗产物。
b. 葡糖醛酸基AMPPD烯醇醚的合成。
Figure 411449DEST_PATH_IMAGE050
将所述过酰基葡糖醛酸基AMPPD烯醇醚(1当量)溶解在1:1 THF/MeOH中，在0℃通过加入1N NaOH进行去保护，然后温热至室温。在完全去保护以后，用固体NaHCO3中和反应物，通过旋转蒸发除去溶剂，并通过反相色谱法进行纯化。
实施例8
在水性溶液中将烯醇醚转化为二氧杂环丁烷
通过在水性碱性条件中的氧化，将2种烯醇醚磷酸盐成功地转化成它们的对应的1,2-二氧杂环丁烷碱性磷酸酶底物。从烯醇醚前体制备1,2-二氧杂环丁烷、AMPPD®和ADP-Star，随后用于碱性磷酸酶检测测定和IL-6 ELISA (酶联免疫吸附测定)中。下面详述了模型氧化条件和二氧杂环丁烷形成的证实。
a. AMPPD烯醇醚磷酸盐氧化为AMPPD®。
如在图1描绘的反应路线中所示，使用Na2MoO4/H2O2氧化系统，在碱性pH的水溶液中，有效地将AMPPD烯醇醚磷酸盐(AMPPD-EE) 氧化成1,2-二氧杂环丁烷底物AMPPD®。用于该目的的试剂是：
AMP缓冲液：0.1M氨基甲基丙醇缓冲液, pH 9.5。
AMPPD®(Life Technologies), 1mg/mL在AMP缓冲液中
AMPPD-EE, 1mg/mL (2.3mM)在AMP缓冲液(2.5mM)中。
H2O2储备物：10% (3M)水溶液(得自50%溶液, Aldrich)。
Na2MoO4储备物：4.8mg/mL (Aldrich)，约20mM。
合并10µL AMPPD-EE (0.23 mM)、40µL AMP缓冲液、40µL H2O2储备物(1M)和20µL Na2MoO4储备物(3.6mM)，并使其在37℃反应1小时，然后在55℃反应10分钟。通过HPLC监测该反应的进程。原料(AMPPD-EE)的洗脱峰的HPLC迹线显示在图2中，作为对照迹线。期望的1,2-二氧杂环丁烷(AMPPD®) 的洗脱峰的HPLC迹线显示在图3中。图4和图5的HPLC迹线显示了AMPPD-EE (8.1 min)氧化成期望的二氧杂环丁烷底物AMPPD®(7.3 min)的进展。所述反应清楚地生成在1小时10分钟的一种产物(AMPPD®)。
b. ADP-Star烯醇醚磷酸盐氧化成ADP-Star ®。
根据图6所示的反应路线，在碱性pH，用Na2MoO4/H2O2将ADP-Star烯醇醚磷酸盐(ADP*-EE)氧化成ADP-Star ®(ADP*)。使用的试剂是：
AMP缓冲液：0.1M氨基甲基丙醇缓冲液, pH 9.5。
0.1M Na2MoO4 (Aldrich)。
ADP*-EE-O储备物：在2mL AMP缓冲液中的10mg ADP*-EE + 50 μL 0.1M Na2MoO4储备物(11.7 mM ADP*-EE和2.5 mM Na2MoO4)。
H2O2储备物：10% (3M)水溶液(得自50%溶液, Aldrich)。
将100µL ADP*-EE-O储备物与40µL H2O2储备物相组合，使该混合物在55℃反应1小时。该时间以后，用0.5mL AMP缓冲液稀释所述反应混合物，得到含有1 mg/mL (2.3mM)的得到的1,2-二氧杂环丁烷和0.5mM Na2MoO4的溶液。该溶液称作ADP*-EE氧化混合物。如下证实ADP* EE向ADP-Star ®的氧化：用碱性磷酸酶活化得到的二氧杂环丁烷，并在Turner光度计上测量光发射。为此使用下述试剂：
0.1M氨基甲基丙醇缓冲液, pH 9.5 (AMP缓冲液)，
CDP-Star ®(CDP*, Life Technologies): 6.2mg/mL (12.5mM)在AMP缓冲液中，
ADP-Star ®(ADP*, Life Technologies): 1mg/mL (2.2mM)在0.1M AMP缓冲液中，
ADP*-EE氧化混合物: 1mg/mL (2.3mM)在0.1M AMP缓冲液中，
TBQ: 10X Sapphire II™化学发光促进剂(Life Technologies)，和
碱性磷酸酶储备物(AP): 8ng/mL (得自17.4mg/mL浓缩物)。
合并10µL ADP*或ADP*-EE氧化混合物(分别0.22或0.23mM)、10µL TBQ、80µL AMP缓冲液和10µL AP，并在37℃连续测量得自该混合物的发光25分钟。合并1.6µL CDP* (0.2mM)、10µL TBQ、80µL AMP缓冲液和10µL AP，并在37℃连续测量得自该混合物的发光25分钟。
图7表明，ADP-Star光发射曲线(关于ADP-Star二氧杂环丁烷对照和ADP-Star烯醇醚磷酸盐氧化的2种产物)表现出比商购可得的CDP-Star ®二氧杂环丁烷对照更高的光发射。
实施例9
试剂的热稳定性
检查了AMPPD®、AMPPD烯醇醚磷酸盐(AMPPD-EE)和AMPPD-EE水溶液在有Na2MoO4存在下的热稳定性。AMPPD®在40℃的热半衰期是~40天，在55℃的半衰期减少至~10天，如图8和图10所示。与此相比，AMPPD烯醇醚磷酸盐在超过4个月内几乎没有表现出在40℃的热分解，在超过5个月内表现出在55℃的微小热分解，如图9和图10所示。还检查了AMPPD-EE在有Na2MoO4存在下在40℃的热稳定性，没有观察到AMPPD烯醇醚磷酸盐在有Na2MoO4存在下的热分解，如图11所示。
除了烯醇醚磷酸盐热稳定性评价以外，还检查了Na2MoO4、H2O2和尿素H2O2 (在商业应用中常见的H2O2替代物)的报道的热稳定性。钼酸钠和过氧化氢没有表现出任何显著热分解，如表A所示。
表A. 氧化试剂热稳定性的评价
预期原位制备的二氧杂环丁烷(诸如AMPPD®和ADP-Star ®)的稳定性具有与生产的二氧杂环丁烷类似的稳定性。所述原位制备的二氧杂环丁烷可以在通常的限制下储存用于将来使用，例如，在4℃储存6个月。
实施例10
使用烯醇醚底物的化学发光测定设计–方法A
为了使原位1,2-二氧杂环丁烷底物形成适应测定设计，可能以几种方式整合原位底物形成。例如，可以进行这样的测定，其中酶活性或酶标记产生1,2-二氧杂环丁烷底物前体(烯醇醚酚盐) 作为第一步，然后在第二步中原位氧化成1,2-二氧杂环丁烷，其在形成以后分解产生化学发光的信号读出，从而产生检测信号(方法A)。在该方法中，所述氧化步骤可以视作“停止”方案。可替换地，可以运行这样的测定，其中1,2-二氧杂环丁烷前体原位氧化成1,2-二氧杂环丁烷是第一步，且其中酶活性或酶标记产生1,2-二氧杂环丁烷酚盐作为第二步(方法B)。在部分IV (Na2MoO4和H2O2对碱性磷酸酶活性的潜在淬灭效应)中描述了所述第二种测定方法，即方法B，其中第一步是氧化，随后进行酶检测。
方法A (酶活化，随后氧化)：
1) 1,2-二氧杂环丁烷底物的烯醇醚前体的酶活化(例如，通过在AMP缓冲液中的碱性磷酸酶，得到烯醇醚酚盐)。
2) 烯醇醚酚盐的氧化(例如，通过在缓冲液pH 10中的H2O2/Na2MoO4)。
方法A显示在图12中。在该方法中，在酶活化之后原位氧化成底物，所述底物可以适用于终点测定读出，其中在酶活性以后测量累积信号。氧化成底物的步骤也起测定停止方案的功能。
使用的试剂：
AMP缓冲液: 0.1M氨基甲基丙醇缓冲液, pH 9.8。
TBQ: 10X Sapphire II™化学发光促进剂(Life Technologies)，
AP: 碱性磷酸酶储备物，在8、1.6、0.32、0.064ng/mL (得自17.4mg/mL浓缩物)，
AMPPD-EE: 1mg/mL (2.5mM)在AMP缓冲液中，
H2O2储备物：10% (3M)水溶液(得自50%溶液, Aldrich)，
Na2MoO4储备物：0.5M Na2MoO4 (Aldrich)，
磷酸盐: 2M K2HPO4, pH 9.6，和
对照：
合并10µL AMPPD®(0.21mM)、10µL TBQ、80µL AMP缓冲液和10µL AP (在不同的浓度)，在37℃连续测量得自混合物的发光30分钟。
AMPPD-EE 的原位氧化：
10µL AMPPD-EE (0.21mM) + 10µL TBQ + [10µL AP (在不同的浓度) + 10µL AMP缓冲液, 在37℃, 1小时] + [8.5µL Na2MoO4 (35mM) + 50µL磷酸盐+ 25µL H2O2储备物(0.63M), 超声处理30秒, 在37℃], 90分钟, 读~5分钟(发光)。
使用方法A，将AMPPD烯醇醚磷酸盐(AMPPD-EE)：1) 去磷酸化，其中使用碱性磷酸酶(跨稀释范围) (10µL AMPPD-EE (0.21mM) + 10µL TBQ + [10µL AP (在不同的浓度) + 10µL AMP缓冲液, 在37℃, 1小时])，2) 原位氧化成AMPPD®[8.5µL Na2MoO4 (35mM) + 50µL磷酸盐+ 25µL H2O2储备物(0.63M), 超声处理30秒, 在37℃]，和3) 对比得自原位AMPPD®相对于AMPPD®对照的光发射(历时90分钟，每5分钟读出)。从原位AMPPD®和对照AMPPD®，产生了碱性磷酸酶稀释曲线的非常类似的线性化学发光读出，如图13和图14所示。
实施例11
Na2MoO4和H2O2对碱性磷酸酶活性的潜在淬灭效应
在开发使用方法B原位二氧杂环丁烷产生的测定条件之前，我们研究了得自所述氧化系统的试剂是否会不利地影响碱性磷酸酶活性。实验结果表明，过氧化氢不会影响碱性磷酸酶活性，但是钼酸钠显著地淬灭碱性磷酸酶活性，具有最高达85%的光减少(参见图15)。降低钼酸钠的浓度至<1 mM，会恢复大多数碱性磷酸酶活性(参见图16)。基于这些结果，在氧化系统中使用远远更低的钼酸钠浓度，开发了方法B原位二氧杂环丁烷产生。得自单态氧产生/反应系统的任何淬灭效应可以是酶特异性的，且必须针对任何酶/检测底物对进行评价。例如，Na2MoO4淬灭可以对碱性磷酸酶和/或有关的酶家族是特异性的，且可以不表现出对其它水解酶的淬灭效应。
使用的试剂：
AMP缓冲液：0.1M氨基甲基丙醇缓冲液, pH 9.8，
AMPPD®：1 mg/mL AMPPD (Life Technologies)在AMP缓冲液中
TBQ: 10X Sapphire II™化学发光促进剂(得自Life Technologies)，
AP: 碱性磷酸酶储备物, 40 ng/mL (得自17.4mg/mL浓缩物)，
H2O2储备物：10% (3M)水溶液(得自50%溶液, Aldrich)，
Na2MoO4储备物：0.5M (Aldrich)，
实验条件：
对照：
合并10µL AMPPD®(2.3mM)、10µL TBQ、120µL AMP缓冲液和10µL AP (40ng/mL)，并在37℃连续测量得自该混合物的发光30分钟。
试验：
合并10µL AMPPD®(2.3mM)、10µL TBQ、80µL AMP缓冲液、25µL H2O2储备物(10%) 和10µL AP (40ng/mL)，并在37℃连续测量得自该混合物的发光30分钟。
合并10µL AMPPD®(2.3mM)、10µL TBQ、115µL AMP缓冲液、不同量的Na2MoO4储备物和10µL AP (40ng/mL)，并在37℃连续测量得自该混合物的发光30分钟。
实施例12
使用烯醇醚底物的化学发光测定设计–方法B
将原位二氧杂环丁烷底物产生整合进测定中的一种替代方案在第一步中氧化烯醇醚磷酸盐，该步骤可以在测定孔中或在离散的容器(底物从该容器加入测定孔中)中进行。在该步骤之后进行原位二氧杂环丁烷底物的酶活化(例如，在基于碱性磷酸酶的测定中去磷酸化)和化学发光读出。方法B可以用于动态模式测定，以测量随时产生的测定信号。方法B也允许用户在测定之前进行第一步(原位二氧杂环丁烷产生)，如果需要该工作流灵活性的话。
方法B (氧化之后酶活化)：
1) 1,2-二氧杂环丁烷底物的烯醇醚前体的氧化(例如，通过在缓冲液pH 10中的H2O2/Na2MoO4，得到1,2-二氧杂环丁烷底物)。
2) 原位制备的1,2-二氧杂环丁烷底物的酶活化(例如，通过在AMP缓冲液中的碱性磷酸酶，得到1,2-二氧杂环丁烷酚盐)。
方法B显示在图17中。在该方法中，将AMPPD烯醇醚磷酸盐原位氧化成AMPPD®，用碱性磷酸酶(跨稀释范围)去磷酸化，并对比得自原位AMPPD®相对于AMPPD®对照的光发射。从原位AMPPD®和对照AMPPD®，也产生了碱性磷酸酶稀释曲线的非常类似的线性化学发光读出(参见图18和图19)。使用的实验条件如下所述。
如下将AMPPD烯醇醚氧化成AMPPD®：合并200µL在0.1M氨基甲基丙醇缓冲液pH 9.8 (AMP缓冲液)中的5 mg/ml (9mM) AMPPD-EE + 5µL 0.1M Na2MoO4 (1.8mM) + 75µL 10% H2O2 (0.8M)，并将所述混合物在55℃温育1小时。然后加入AMP缓冲液至1mL的终体积，得到含有浓度为约1mg/mL (2.5mM)的氧化的AMPPD-EE (AMPPD-EE-O) 和0.5mM Na2MoO4的溶液。将AMPP-EE-O的发光性质与AMPPD®的发光性质进行对比。
测定使用的试剂：
AMP缓冲液: 0.1M氨基甲基丙醇缓冲液, pH 9.8，
AMPPD: 1mg/mL (2.3mM) AMPPD (Life Technologies)在AMP缓冲液中，
AMPPD-EE-O：~1mg/mL (2.5mM)在AMP缓冲液中，
TBQ: 10X Sapphire II™化学发光促进剂(Life Technologies)，
AP: 碱性磷酸酶，在40、8、1.6、0.32、0.064ng/mL的浓度(得自17.4mg/mL浓缩物)。
Luminoskan 测量 ( 一式三份地测量 )：
合并20µL (0.46mM) AMPPD、10µL TBQ、60µL AMP缓冲液和10µL AP (4、0.8、0.16、0.032、0.0064ng/mL)，并在室温连续测量得自所述混合物的发光2小时。
合并20µL AMPPD-EE-O (0.5mM)、10µL TBQ、60µL AMP缓冲液和10µL AP (4、0.8、0.16、0.032、0.0064ng/mL)，并在室温连续测量得自所述混合物的发光2小时。
还如前面所讨论的，使用方法B评价ADP-Star ®从ADP-Star烯醇醚磷酸盐的原位产生。如图7所示，得自原位ADP-Star ®和对照ADP-Star的光发射曲线是重叠的。如下面所述，改进方法B以适应ADP-Star烯醇醚磷酸盐溶解度。
使用的试剂：
溶液A：23.3 mM ADP-Star-EE在30%乙腈/70%碳酸钠溶液中*，含有12.5 mM Na2MoO4。
溶液B：10% H2O2。
*碳酸钠溶液：32克碳酸氢钠+ 12克碳酸钠，在10升水中
合并1mL溶液A和0.7ml溶液B，并在55℃加热15分钟(直到颜色消失)，得到13.7 mM原位ADP-Star储备溶液。
试验：
将1.7mL原位ADP-Star储备溶液与56.3mL 0.1M氨基甲基丙醇缓冲液pH 9.5和1 mg/mL Sapphire II™化学发光促进剂(Life Technologies)合并，以得到含有0.4 mM原位ADP-Star和1 mg/ml Sapphire II™的溶液。在碱性磷酸酶稀释曲线中原位产生的ADP-Star的性能与二氧杂环丁烷对照CSPD、ADP-Star和CDP-Star的对比，类似于对照二氧杂环丁烷(参见图20和图21)。
使用2种不同的测定/底物产生方法(方法A和方法B)使用原位产生的AMPPD和对照AMPPD产生的类似酶稀释曲线证实，原位二氧杂环丁烷底物产生的原理可以容易地适合酶测定用途。就原位ADP-Star和对照二氧杂环丁烷CSPD®(Life Technologies)、ADP-Star ®和CDP-Star ®而言，使用方法B得到了相当的结果。使用碱性磷酸酶底物和测定证实了这些底物产生和测定设计原理，但是可以普遍地适用于二氧杂环丁烷底物和其它水解酶(诸如β-半乳糖苷酶、β-葡糖苷酸酶、β-葡萄糖苷酶和神经氨酸酶)的测定。
实施例13
使用烯醇醚底物的模型重组人白介素6 (rhIL-6) ELISA
1. 使用原位AMPPD检测的rhIL-6 ELISA。
与原位AMPPD和对照AMPPD®并行地运行模型重组rhIL-6检测ELISA，以评价原位AMPPD在免疫测定中的性能。实验表明，使用“等”摩尔量的底物，假定烯醇醚磷酸盐的100%转化率，原位产生的AMPPD在所述测定中表现得象对照AMPPD®一样好(参见图22)。所述原位AMPPD可以在ELISA温育步骤中制备，不会给测定增加额外的时间，且与ELISA测定本身相比没有任何更多的不便。总测定灵敏度和动态范围与使用CDP-Star ®(CDP*)检测的内部rhIL-6 ELISA非常相当。
rhIL-6 ELISA 平板准备 (96- 孔微量滴定板 ) ：
1. 用捕获抗体(2mg/mL抗-人IL-6)包被ELISA平板过夜(w/)。
2. 洗涤平板孔。
3. 用300 μL/孔的封闭缓冲液(1x PBS/0.02% 吐温20/1% BSA)封闭平板。
4. 洗涤平板孔。
rhIL-6 测定：
1. 将100 μL样品或标准品(3000 pg/ μL-0.0003 pg/mL rhIL-6，w/1:6稀释度)加入孔中，并在室温温育30分钟。
2. 洗涤平板孔
3. 加入100 μL 12.5 ng/ml生物素化的检测抗-IL6抗体(R&D Systems)，并在室温温育15分钟，洗涤平板孔。
4. 加入1:40,000稀释度的100 μL碱性磷酸酶-缀合的抗生蛋白链菌素(Jackson Laboratories)。
5. 洗涤平板孔。
6. 将100ul底物溶液加入每个孔中，并在室温温育30 min。
7. 使用光度计，在25℃的温度，测量每个孔的RLU 30分钟。
AMPPD 的原位二氧杂环丁烷制备：
通过合并下述溶液，得到12.7 mM的AMPPD烯醇醚磷酸盐储备溶液，从而制备溶液A。
5 mg/mL AMPPD烯醇醚磷酸盐(得自实施例2；分子量394)。
2 mL 0.1M氨基甲基丙醇缓冲液, pH 9.8 (AMP缓冲液)。
50 μL 0.1M Na2MoO4 。
步骤1–制备溶液B。
100 μL溶液A
38 μL 10% H2O2 (制备9.2 mM AMPPD®，分子量426)
在55℃加热溶液1小时(脱去O2气泡，颜色变成澄清)
这是溶液B。在该步骤中，还可以加入化学发光促进剂。
步骤2 (2.54 mM) –制备含有2.54 mM AMPPD的溶液C。
138 μL溶液B (具有9.2 mM原位产生的AMPPD®)
362 μL 0.1M AMP缓冲液, pH 9.8
这是含有2.54 mM AMPPD®的溶液C。
步骤2 (4 mM) –制备含有4 mM AMPPD的溶液C。
138 μL溶液B (具有9.2 mM原位产生的AMPPD®)
149.4 μL 0.1M AMP缓冲液, pH 9.8
这是含有4 mM AMPPD®的溶液C。
步骤3 (0.25 mM) –制备含有0.25 mM AMPPD的溶液D。
1 mL溶液C (2.54 mM AMPPD®)
1 mL10X Sapphire II (Life Technologies)
8 mL 0.1M AMP缓冲液, pH 9.8
这是含有0.25 mM AMPPD®的溶液D。
将100 μL溶液D加入每个孔中。
*步骤3 (0.4 mM) –制备含有0.4 mM AMPPD的溶液D。
1 ml溶液C (4 mM AMPPD®)
1 ml 10X Sapphire II (Life Technologies)
8 ml 0.1M AMP缓冲液, pH 9.8
这是含有0.4 mM AMPPD®的溶液D
将100 μL溶液D加入每个孔中。
*这建立对比测定条件，因为标准的测定检测是使用0.4 mM 1,2-二氧杂环丁烷和1 mg/ml促进剂。
在另一组实验中，改变产生原位AMPPD的氧化时间，然后使用对照AMPPD®，通过rhIL-6 ELISA评价底物性能。时程实验表明，在30分钟之前，大多数AMPPD烯醇醚磷酸盐似乎被转化成原位AMPPD。使用15分钟原位产生的AMPPD相对于60分钟原位产生的AMPPD，对免疫测定性能(灵敏度和动态范围)具有非常微小的影响。使用30分钟原位产生的AMPPD相对于60 min原位产生的AMPPD，检测信号(RLU)也存在非常微小的差异。如To结果所指示的，在测定过程中可能发生AMPPD烯醇醚磷酸盐向原位AMPPD的一些转化(参见图23)。
2. 使用原位ADP-Star检测的rhIL-6检测ELISA
基准检测实验对比了原位ADP-Star相对于对照二氧杂环丁烷CSPD®、ADP-Star ®和CDP-Star ®的光发射(以RLU为单位)和信噪比(S:N)。最大光发射随二氧杂环丁烷底物而变化，其中CSPD®在30分钟达到发光，CDP-Star ®在45分钟达到发光，ADP-Star ®在60分钟达到发光(参见图24和图25)。
进行与原位ADP-Star和对照二氧杂环丁烷CSPD®、ADP-Star ®和CDP-Star ®并行地模型rhIL-6 ELISA，以评价原位ADP-Star在免疫测定中的性能。实验表明，原位产生的ADP-Star的性能与对照二氧杂环丁烷底物相当。包括原位制备的ADP-Star在内的所有底物的测定灵敏度(IL-6的检测下限)、S/N和动态范围是类似的(参见图26)。
在应用开发中，可能希望消除上述的溶液制备步骤A-D中的一个或多个。在某些应用中，还可能希望修改溶液组分。修改溶液组分的一个实例是，制备这样的检测溶液，其中促进剂存在于氧化步骤中，然后用缓冲液稀释至测定条件。使用改进的原位二氧杂环丁烷制备，与ADP-Star ®对照(红色和浅蓝色发射曲线)相比，碱性磷酸酶检测曲线表现出与原位ADP-Star(深蓝色和黄色光发射曲线)类似的灵敏度(参见图27)。实际上，与所述对照相比，原位ADP-Star检测溶液在达到发射最大值以后产生更稳定的光发射。另外，就IL-6 ELISA而言，改进的原位ADP-Star二氧杂环丁烷制备会产生与对照二氧杂环丁烷相当的免疫测定检测灵敏度(参见图28和图29)。
在促进剂溶液中原位产生的 ADP-Star ：
a) 使用在AMP缓冲液中的11.7 mM ADP-Star烯醇醚磷酸盐(得自实施例3)和10 mg/ml Sapphire II (Life Technologies) + Na2MoO4，进行氧化。氧化以后，用AMP缓冲液稀释该溶液至1x。最终的溶液浓度：0.58mM原位产生的ADP-Star/0.5mg/ml Sapphire II。
b) 使用在AMP缓冲液中的4 mM ADP-Star烯醇醚磷酸盐(得自实施例3)和10 mg/ml Sapphire + Na2MoO4，进行氧化。氧化以后，用AMP缓冲液稀释该溶液至1x。最终：0.4mM原位产生的ADP-Star/1mg/ml Sapphire II。
已经参照附图描述了本发明的具体实施方案，应当理解，本发明不限于那些精确的实施方案，并且本领域普通技术人员可以在其中做出各种变化和修改，而不脱离所附权利要求书限定的本发明的范围或精神。

Claims (66)

1.一种用于产生光的方法，所述方法包括下述步骤：
(a) 提供氧化剂；
(b) 提供具有下述结构的烯醇醚：
Figure DEST_PATH_IMAGE001
其中，
A和B独立地选自：含有1-20个碳原子的直链烷基、含有2-20个碳原子的直链烯基、含有3-20个碳原子的支链烷基、含有3-20个碳原子的支链烯基、含有3-20个碳原子的环烷基、含有3-20个碳原子的环烯基、含有3-20个碳原子的环杂烷基、含有3-20个碳原子的环杂烯基、含有4-60个碳原子的聚环烷基、含有4-60个碳原子的聚环烯基、含有4-60个碳原子的聚环杂烷基和含有4-60个碳原子的聚环杂烯基，它们中的任一个可以是未被取代的，或被一个或多个电子活性基团、增溶基团或光增强基团取代，且其中A和B一起形成所述环烷基、环烯基、聚环烷基或聚环烯基，所述环烷基、环烯基、聚环烷基或聚环烯基的碳原子之一是形成所述烯醇醚的双键的2个碳原子中的一个，
R1是含有1-20个碳原子的烷基、含有6-14个碳原子的芳基、含有7-15个碳原子的芳烷基、含有4-20个碳原子的杂芳基或含有5-20个碳的杂芳烷基，
T是能够发射光的芳基或杂芳基环，且
R2是酶可切割的基团，其含有可被酶部分切割以在T上产生氧阴离子的键；
(c) 组合水性溶液、所述氧化剂和所述烯醇醚，以形成包含1,2-二氧杂环丁烷酶底物的水性溶液；
(d) 提供酶复合物，所述酶复合物包含能够切割所述1,2-二氧杂环丁烷酶底物的酶部分；
(e) 使所述酶复合物与所述包含1,2-二氧杂环丁烷酶底物的水性溶液接触，以形成反应混合物；和，
(f) 使所述反应混合物产生光。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述氧化剂选自：过氧化氢、钼酸钠、过氧化氢和钼酸钠、次氯酸盐、次氯酸盐和过氧化氢、芳基内过氧化物、过氧化钙过氧水合物以及它们的组合。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述氧化剂是过氧化氢、和过氧化氢和钼酸钠。
4.根据权利要求1所述的方法，其中A或B中的至少一个是
Figure 718487DEST_PATH_IMAGE002
。
5.根据权利要求1所述的方法，其中A和B一起是
Figure 2011800433591100001DEST_PATH_IMAGE003
Figure 697944DEST_PATH_IMAGE004
。
6.根据权利要求1所述的方法，其中R1是含有1-2个碳原子的烷基或含有1-2个碳原子的三氟烷基。
7.根据权利要求1所述的方法，其中T是
Figure 2011800433591100001DEST_PATH_IMAGE005
其中，
R3、R4和R5独立地选自：H、F、Cl、Br、I、氰基、硝基、磺酸盐、硫酸盐、三氟甲基、三氟乙基、含有1-20个碳原子的直链烷基、含有3-20个碳原子的支链烷基、含有2-20个碳原子的直链烯基、含有3-20个碳原子的支链烯基、含有3-20个碳原子的环烷基、含有3-20个碳原子的环烯基、含有3-20个碳原子的环杂烷基、含有3-20个碳原子的环杂烯基、含有4-60个碳原子的聚环烷基、含有4-60个碳原子的聚环烯基、含有4-60个碳原子的聚环杂烷基、含有4-60个碳原子的聚环杂烯基、含有1-20个碳原子的烷氧基、含有6-14个碳原子的芳基、含有6-14个碳原子的芳氧基、含有2-21个碳原子的酯、含有3-30个碳原子的三烷基铵、含有3-30个碳原子的三烷基鏻、含有2-21个碳原子的烷基酰氨基、含有7-15个碳原子的芳基酰氨基、含有2-21个碳原子的烷基氨甲酰基、含有7-15个碳原子的芳基氨甲酰基、含有1-20个碳原子的烷基亚磺酰氨基、含有6-14个碳原子的芳基亚磺酰氨基、含有3-60个碳原子的三烷基甲硅烷基、含有18-42个碳原子的三芳基甲硅烷基、含有7-32个碳原子的烷基芳基甲硅烷基、含有1-20个碳原子的烷基酰氨基磺酰基、含有6-14个碳原子的芳基酰氨基磺酰基、含有1-20个碳原子的烷基磺酰基、含有6-14个碳原子的芳基磺酰基、含有2-20个碳原子的烷硫基和含有6-14个碳原子的芳硫基，且
X是硫原子、氧原子或氮原子。
8.根据权利要求1所述的方法，其中OR2是磷酸酯、乙酸酯、1-磷酸-2,3-二酰基甘油酯、三磷酸腺苷、二磷酸腺苷、单磷酸腺苷、腺苷、α-D-半乳糖苷、β-D-半乳糖苷、α-D-葡萄糖苷、β-D-葡萄糖苷、α-D-甘露糖苷、β-D-甘露糖苷、β-呋喃果糖苷、β-D-葡糖苷酸或，其中，B1、B2和B3各自独立地是H或1-4个碳原子的烷基(支链或直链)。
9.根据权利要求8所述的方法，其中R2是
Figure 2011800433591100001DEST_PATH_IMAGE007
。
10.根据权利要求1所述的方法，其中R2是E-L-Nuc-Z，其中E是包含亲电子原子的基团，所述原子在Z基团的酶切割以后被Nuc基团的电子对攻击，并通过邻助作用释放出1,2-二氧杂环丁烷酶底物阴离子；L是连接基团；Nuc是亲核原子；且Z是酶可切割的基团；其中
E是羧基、羰基、被离去基团取代的亚甲基、磷酸盐、碳酸盐、黄原酸盐、亚硫酸盐、磺酸盐、亚硫酸氢盐或二硫化物；
L选自：含有1-4个碳原子的亚甲基或聚亚甲基、-(CH2)m-O-(CH2)n、-(CH2)m-S-(CH2)n-、或–(CH2)m-NR6-(CH2)n-，其中m和n是0-3，且m+n是2或3，其中
R6是含有1-10个碳原子的烷基，且所述连接基团可以被含有1-24个碳原子的烷基、含有2-24个碳原子的烯基、含有1-24个碳原子的烷基取代，和被含有1-24个碳原子的酰氧基、含有2-24个碳原子的烯基单取代或二取代，和被含有1-24个碳原子的酰氧基、含有6-10个碳的芳基、含有1-24个碳原子的烷基单取代或二取代，和被苯基、羟苯基、吲哚基、巯基、含有1-4个碳原子的烷硫基、羟基、羧基、氨基、胍基、咪唑或氨基甲酰基或含有2-24个碳原子的烯基取代，和被苯基、羟苯基、吲哚基、巯基、含有1-4个碳原子的烷硫基、羟基、羧基、氨基、胍基、咪唑或氨基甲酰基取代；
Nuc是氧原子或硫原子；且
Z是磷酰基、乙酰基、1-磷酸-2,3-二酰基甘油酰基、腺苷三磷酰基、腺苷二磷酰基、腺苷单磷酰基、腺苷基、α-D-半乳糖基、β-D-半乳糖基、α-D-葡萄糖基、β-D-葡萄糖基、α-D-甘露糖基、β-D-甘露糖基、β-呋喃果糖基、β-D-glucosiduransyl或
Figure 2011800433591100001DEST_PATH_IMAGE009
，其中，B1、B2和B3各自独立地是H或1-4个碳原子的烷基(支链或直链)。
11.根据权利要求10所述的方法，其中Z是
Figure 936531DEST_PATH_IMAGE010
Figure 2011800433591100001DEST_PATH_IMAGE011
。
12.根据权利要求1所述的方法，其中所述酶部分包含水解酶。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述水解酶是碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、β-葡萄糖苷酶、β-葡糖苷酸酶或神经氨酸酶。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述酶部分是酶。
15.根据权利要求14所述的方法，其另外包括下述步骤：在加入所述1,2-二氧杂环丁烷酶底物的水性溶液以后，检测从所述反应混合物发射出的光，其中光的发射指示所述酶的存在，并且发射的光的量可以与样品中存在的所述酶的量相关联。
16.根据权利要求13所述的方法，其中所述酶部分是酶连接的抗体，所述酶连接的抗体包含能够与抗原结合的第一抗体和酶，所述酶能够切割所述1,2-二氧杂环丁烷酶底物，使得所述底物分解并产生光。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述第一抗体与所述酶共价地或非共价地连接。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述第一抗体与标记共价地连接，且所述酶与这样的分子共价地连接：所述分子能够非共价地结合所述标记。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述标记是生物素或生物素衍生物，且所述分子是抗生物素蛋白或抗生蛋白链菌素。
20.根据权利要求18所述的方法，其中所述标记是半抗原，且所述分子是能够结合所述半抗原的抗体。
21.根据权利要求16所述的方法，其另外包括下述步骤：
(a) 提供疑似包含抗原的样品；
(b) 提供包含第二抗体的固相，所述第二抗体能够结合所述抗原；
(c) 使所述样品和酶连接的抗体与所述固相接触，以形成所述酶复合物；和，
(d) 在加入所述1,2-二氧杂环丁烷酶底物的水性溶液以后，检测从所述反应混合物发射出的光，其中光的发射指示所述抗原的存在，并且发射的光的量可以与所述样品中存在的所述抗原的量相关联。
22.根据权利要求21所述的方法，其另外包括下述步骤：从所述酶复合物除去任何未结合的酶连接的抗体。
23.根据权利要求13所述的方法，其中所述酶部分是包含抗原和酶的酶连接的抗原，所述酶能够切割所述1,2-二氧杂环丁烷酶底物，使得所述底物分解并产生光。
24.根据权利要求23所述的方法，其中所述抗原与所述酶共价地或非共价地连接。
25.根据权利要求24所述的方法，其中抗原与标记共价地连接，且所述酶与这样的分子共价地连接：所述分子能够非共价地结合所述标记。
26.根据权利要求25所述的方法，其中所述标记是生物素或生物素衍生物，且所述分子是抗生物素蛋白或抗生蛋白链菌素。
27.根据权利要求25所述的方法，其中所述标记是半抗原，且所述分子是能够结合所述半抗原的抗体。
28.根据权利要求23所述的方法，其另外包括下述步骤：
(a) 提供疑似包含抗原的样品；
(b) 提供固相，所述固相包含能够结合所述抗原的抗体；
(c) 使所述样品和酶连接的抗原与所述固相接触，以形成所述酶复合物；和，
(d) 在加入所述1,2-二氧杂环丁烷酶底物的水性溶液以后，检测从所述反应混合物发射出的光，其中发射的光的量可以与所述样品中存在的所述抗原的量相关联。
29.根据权利要求28所述的方法，其另外包括下述步骤：从所述酶复合物除去任何未结合的酶连接的抗原。
30.根据权利要求13所述的方法，其中所述酶部分是酶连接的寡核苷酸，所述酶连接的寡核苷酸包含能够与核酸杂交的寡核苷酸和酶，所述酶能够切割所述1,2-二氧杂环丁烷酶底物，使得所述底物分解并产生光。
31.根据权利要求30所述的方法，其中所述寡核苷酸与所述酶共价地或非共价地连接。
32.根据权利要求31所述的方法，其中寡核苷酸与标记共价地连接，且所述酶与这样的分子共价地连接：所述分子能够非共价地结合所述标记。
33.根据权利要求32所述的方法，其中所述标记是生物素或生物素衍生物，且所述分子是抗生物素蛋白或抗生蛋白链菌素。
34.根据权利要求32所述的方法，其中所述标记是半抗原，且所述分子是能够结合所述半抗原的抗体。
35.根据权利要求30所述的方法，其另外包括下述步骤：
(a) 提供疑似包含核酸的样品；
(b) 将所述核酸固定化在固相上，
(c) 使所述固定化的核酸和所述酶连接的寡核苷酸接触，以形成酶复合物；和，
(d) 在加入所述1,2-二氧杂环丁烷酶底物的水性溶液以后，检测从所述反应混合物发射出的光，其中光的发射指示所述核酸的存在，并且发射的光的量可以与所述样品中存在的所述核酸的量相关联。
36.根据权利要求35所述的方法，其另外包括下述步骤：从所述酶复合物除去任何未结合的酶连接的寡核苷酸。
37.根据权利要求1所述的方法，其中所述反应混合物另外包含促进剂。
38.根据权利要求37所述的方法，其中所述促进剂包括聚合物型的季铵盐、聚合物型的季鏻盐或它们的组合。
39.根据权利要求38所述的方法，其中所述促进剂另外包含受体染料。
40.根据权利要求39所述的方法，其中所述受体染料是荧光素。
41.根据权利要求38所述的方法，其中所述聚合物型的季铵盐是聚(乙烯基苄基三甲基氯化铵), 聚[乙烯基苄基(苄基二甲基氯化铵)]、聚[乙烯基(苄基三丁基氯化铵)]、聚[乙烯基(苄基三戊基氯化铵)]或它们的组合。
42.根据权利要求38所述的方法，其中所述聚合物型的季鏻盐是聚(乙烯基苄基三甲基氯化鏻)、聚(乙烯基苄基三丁基氯化鏻)、聚(乙烯基苄基三辛基氯化鏻)、包含聚(乙烯基苄基三丁基氯化鏻)和聚(乙烯基苄基三辛基氯化鏻)的共聚物或它们的组合。
43.根据权利要求1所述的方法，其中所述烯醇醚是
Figure DEST_PATH_IMAGE013
Figure 337611DEST_PATH_IMAGE014
Figure DEST_PATH_IMAGE015
。
44.一种用于确定样品中酶的存在或量的测定方法，所述方法包括下述步骤：
(a) 提供氧化剂；
(b) 提供具有下述结构的烯醇醚：
Figure 598828DEST_PATH_IMAGE016
其中，
A和B独立地选自：含有1-20个碳原子的直链烷基、含有2-20个碳原子的直链烯基、含有3-20个碳原子的支链烷基、含有3-20个碳原子的支链烯基、含有3-20个碳原子的环烷基、含有3-20个碳原子的环烯基、含有3-20个碳原子的环杂烷基、含有3-20个碳原子的环杂烯基、含有4-60个碳原子的聚环烷基、含有4-60个碳原子的聚环烯基、含有4-60个碳原子的聚环杂烷基和含有4-60个碳原子的聚环杂烯基，它们中的任一个可以是未被取代的，或被一个或多个电子活性基团、增溶基团或光增强基团取代，且其中A和B一起形成所述环烷基、环烯基、聚环烷基或聚环烯基，所述环烷基、环烯基、聚环烷基或聚环烯基的碳原子之一是形成所述烯醇醚的双键的2个碳原子中的一个，
R1是含有1-20个碳原子的烷基、含有6-14个碳原子的芳基、含有7-15个碳原子的芳烷基、含有4-20个碳原子的杂芳基或含有5-20个碳的杂芳烷基，
T是能够发射光的芳基或杂芳基环，且
R2是酶可切割的基团，其含有可被酶部分切割以在T上产生氧阴离子的键；
(c) 组合水性溶液、所述氧化剂和所述烯醇醚，以形成包含1,2-二氧杂环丁烷酶底物的水性溶液；
(d) 提供疑似包含酶的样品，所述酶能够切割所述1,2-二氧杂环丁烷酶底物，使得所述底物分解并产生光；
(e) 使所述样品与所述包含1,2-二氧杂环丁烷酶底物的水性溶液接触，以形成反应混合物；和，
(f) 在加入所述1,2-二氧杂环丁烷酶底物的水性溶液以后，检测从所述反应混合物发射出的光，其中光的发射指示所述酶的存在，并且发射的光的量可以与所述样品中存在的所述酶的量相关联。
45.一种用于确定样品中抗原的存在或量的测定方法，所述方法包括下述步骤：
(a) 提供氧化剂；
(b) 提供具有下述结构的烯醇醚：
其中，
A和B独立地选自：含有1-20个碳原子的直链烷基、含有2-20个碳原子的直链烯基、含有3-20个碳原子的支链烷基、含有3-20个碳原子的支链烯基、含有3-20个碳原子的环烷基、含有3-20个碳原子的环烯基、含有3-20个碳原子的环杂烷基、含有3-20个碳原子的环杂烯基、含有4-60个碳原子的聚环烷基、含有4-60个碳原子的聚环烯基、含有4-60个碳原子的聚环杂烷基和含有4-60个碳原子的聚环杂烯基，它们中的任一个可以是未被取代的，或被一个或多个电子活性基团、增溶基团或光增强基团取代，且其中A和B一起形成所述环烷基、环烯基、聚环烷基或聚环烯基，所述环烷基、环烯基、聚环烷基或聚环烯基的碳原子之一是形成所述烯醇醚的双键的2个碳原子中的一个，
R1是含有1-20个碳原子的烷基、含有6-14个碳原子的芳基、含有7-15个碳原子的芳烷基、含有4-20个碳原子的杂芳基或含有5-20个碳的杂芳烷基，
T是能够发射光的芳基或杂芳基环，且
R2是酶可切割的基团，其含有可被酶部分切割以在T上产生氧阴离子的键；
(c) 组合水性溶液、所述氧化剂和所述烯醇醚，以形成包含1,2-二氧杂环丁烷酶底物的水性溶液；
(d) 提供疑似包含所述抗原的样品；
(e) 提供酶连接的抗体，其包含能够与所述抗原结合的第一抗体和酶，所述酶能够切割所述1,2-二氧杂环丁烷酶底物，使得所述底物分解并产生光；
(f) 提供包含第二抗体的固相，所述第二抗体能够结合所述抗原；
(g) 使所述样品和酶连接的抗体与所述固相接触，以形成酶复合物；
(h) 使所述酶复合物与所述包含1,2-二氧杂环丁烷酶底物的水性溶液接触，以形成反应混合物；和，
(i) 在加入所述1,2-二氧杂环丁烷酶底物的水性溶液以后，检测从所述反应混合物发射出的光，其中光的发射指示所述抗原的存在，并且发射的光的量可以与所述样品中存在的所述抗原的量相关联。
46.一种用于确定样品中抗原的存在或量的测定方法，所述方法包括下述步骤：
(a) 提供氧化剂；
(b) 提供具有下述结构的烯醇醚：
Figure 454657DEST_PATH_IMAGE018
其中，
A和B独立地选自：含有1-20个碳原子的直链烷基、含有2-20个碳原子的直链烯基、含有3-20个碳原子的支链烷基、含有3-20个碳原子的支链烯基、含有3-20个碳原子的环烷基、含有3-20个碳原子的环烯基、含有3-20个碳原子的环杂烷基、含有3-20个碳原子的环杂烯基、含有4-60个碳原子的聚环烷基、含有4-60个碳原子的聚环烯基、含有4-60个碳原子的聚环杂烷基和含有4-60个碳原子的聚环杂烯基，它们中的任一个可以是未被取代的，或被一个或多个电子活性基团、增溶基团或光增强基团取代，且其中A和B一起形成所述环烷基、环烯基、聚环烷基或聚环烯基，所述环烷基、环烯基、聚环烷基或聚环烯基的碳原子之一是形成所述烯醇醚的双键的2个碳原子中的一个，
R1是含有1-20个碳原子的烷基、含有6-14个碳原子的芳基、含有7-15个碳原子的芳烷基、含有4-20个碳原子的杂芳基或含有5-20个碳的杂芳烷基，
T是能够发射光的芳基或杂芳基环，且
R2是酶可切割的基团，其含有可被酶部分切割以在T上产生氧阴离子的键；
(c) 组合水性溶液、所述氧化剂和所述烯醇醚，以形成包含1,2-二氧杂环丁烷酶底物的水性溶液；
(d) 提供疑似包含所述抗原的样品；
(e) 提供酶连接的抗原，其包含抗原和酶，所述酶能够切割所述1,2-二氧杂环丁烷酶底物，使得所述底物分解并产生光；
(f) 提供固相，所述固相包含能够结合所述抗原的抗体；
(g) 使所述样品和酶连接的抗原与所述固相接触，以形成酶复合物；
(h) 使所述酶复合物与所述包含1,2-二氧杂环丁烷酶底物的水性溶液接触，以形成反应混合物；和，
(i) 在加入所述1,2-二氧杂环丁烷酶底物的水性溶液以后，检测从所述反应混合物发射出的光，其中发射的光的量可以与所述样品中存在的所述抗原的量相关联。
47.一种用于确定样品中核酸的存在和/或量的测定方法，所述方法包括下述步骤：
(a) 提供氧化剂；
(b) 提供具有下述结构的烯醇醚：
Figure DEST_PATH_IMAGE019
其中，
A和B独立地选自：含有1-20个碳原子的直链烷基、含有2-20个碳原子的直链烯基、含有3-20个碳原子的支链烷基、含有3-20个碳原子的支链烯基、含有3-20个碳原子的环烷基、含有3-20个碳原子的环烯基、含有3-20个碳原子的环杂烷基、含有3-20个碳原子的环杂烯基、含有4-60个碳原子的聚环烷基、含有4-60个碳原子的聚环烯基、含有4-60个碳原子的聚环杂烷基和含有4-60个碳原子的聚环杂烯基，它们中的任一个可以是未被取代的，或被一个或多个电子活性基团、增溶基团或光增强基团取代，且其中A和B一起形成所述环烷基、环烯基、聚环烷基或聚环烯基，所述环烷基、环烯基、聚环烷基或聚环烯基的碳原子之一是形成所述烯醇醚的双键的2个碳原子中的一个，
R1是含有1-20个碳原子的烷基、含有6-14个碳原子的芳基、含有7-15个碳原子的芳烷基、含有4-20个碳原子的杂芳基或含有5-20个碳的杂芳烷基，
T是能够发射光的芳基或杂芳基环，且
R2是酶可切割的基团，其含有可被酶部分切割以在T上产生氧阴离子的键；
(c) 组合水性溶液、所述氧化剂和所述烯醇醚，以形成包含1,2-二氧杂环丁烷酶底物的水性溶液；
(d) 提供疑似包含所述核酸的样品；
(e) 将所述核酸固定化到固相上；
(f) 提供酶连接的寡核苷酸，其包含能够与所述核酸杂交的寡核苷酸和酶，所述酶能够切割所述1,2-二氧杂环丁烷酶底物，使得所述底物分解并产生光；
(g) 使所述固定化的和酶连接的寡核苷酸接触，以形成酶复合物；
(h) 使所述酶复合物与所述包含1,2-二氧杂环丁烷酶底物的水性溶液接触，以形成反应混合物；和，
(i) 在加入所述1,2-二氧杂环丁烷酶底物的水性溶液以后，检测从所述反应混合物发射出的光，其中光的发射指示所述核酸的存在，并且发射的光的量可以与所述样品中存在的所述核酸的量相关联。
48.一种用于检测样品中分析物的存在或量的试剂盒，所述试剂盒包括：
(a) 氧化剂，和
(b) 具有下述结构的烯醇醚：
Figure 510338DEST_PATH_IMAGE020
其中，
A和B独立地选自：含有1-20个碳原子的直链烷基、含有2-20个碳原子的直链烯基、含有3-20个碳原子的支链烷基、含有3-20个碳原子的支链烯基、含有3-20个碳原子的环烷基、含有3-20个碳原子的环烯基、含有3-20个碳原子的环杂烷基、含有3-20个碳原子的环杂烯基、含有4-60个碳原子的聚环烷基、含有4-60个碳原子的聚环烯基、含有4-60个碳原子的聚环杂烷基和含有4-60个碳原子的聚环杂烯基，它们中的任一个可以是未被取代的，或被一个或多个电子活性基团、增溶基团或光增强基团取代，且其中A和B一起形成所述环烷基、环烯基、聚环烷基或聚环烯基，所述环烷基、环烯基、聚环烷基或聚环烯基的碳原子之一是形成所述烯醇醚的双键的2个碳原子中的一个，
R1是含有1-20个碳原子的烷基、含有6-14个碳原子的芳基、含有7-15个碳原子的芳烷基、含有4-20个碳原子的杂芳基或含有5-20个碳的杂芳烷基，
T是能够发射光的芳基或杂芳基环，且
R2是酶可切割的基团，其含有可被酶部分切割以在T上产生氧阴离子的键。
49.根据权利要求48所述的试剂盒，其中所述氧化剂选自：过氧化氢、钼酸钠、过氧化氢和钼酸钠、次氯酸盐、次氯酸盐和过氧化氢、芳基内过氧化物、过氧化钙过氧水合物以及它们的组合。
50.根据权利要求49所述的试剂盒，其中所述氧化剂是过氧化氢、或过氧化氢和钼酸钠。
51.根据权利要求48所述的试剂盒，其中A或B中的至少一个是
Figure DEST_PATH_IMAGE021
。
52.根据权利要求48所述的试剂盒，其中A和B一起是
Figure 77717DEST_PATH_IMAGE022
Figure DEST_PATH_IMAGE023
。
53.根据权利要求48所述的试剂盒，其中R1是含有1-2个碳原子的烷基或含有1-2个碳原子的三氟烷基。
54.根据权利要求48所述的试剂盒，其中T是
Figure 814728DEST_PATH_IMAGE024
其中，
R3、R4和R5独立地选自：H、F、Cl、Br、I、氰基、硝基、磺酸盐、硫酸盐、三氟甲基、三氟乙基、含有1-20个碳原子的直链烷基、含有3-20个碳原子的支链烷基、含有2-20个碳原子的直链烯基、含有3-20个碳原子的支链烯基、含有3-20个碳原子的环烷基、含有3-20个碳原子的环烯基、含有3-20个碳原子的环杂烷基、含有3-20个碳原子的环杂烯基、含有4-60个碳原子的聚环烷基、含有4-60个碳原子的聚环烯基、含有4-60个碳原子的聚环杂烷基、含有4-60个碳原子的聚环杂烯基、含有1-20个碳原子的烷氧基、含有6-14个碳原子的芳基、含有6-14个碳原子的芳氧基、含有2-21个碳原子的酯、含有3-30个碳原子的三烷基铵、含有3-30个碳原子的三烷基鏻、含有2-21个碳原子的烷基酰氨基、含有7-15个碳原子的芳基酰氨基、含有2-21个碳原子的烷基氨甲酰基、含有7-15个碳原子的芳基氨甲酰基、含有1-20个碳原子的烷基亚磺酰氨基、含有6-14个碳原子的芳基亚磺酰氨基、含有3-60个碳原子的三烷基甲硅烷基、含有18-42个碳原子的三芳基甲硅烷基、含有7-32个碳原子的烷基芳基甲硅烷基、含有1-20个碳原子的烷基酰氨基磺酰基、含有6-14个碳原子的芳基酰氨基磺酰基、含有1-20个碳原子的烷基磺酰基、含有6-14个碳原子的芳基磺酰基、含有2-20个碳原子的烷硫基和含有6-14个碳原子的芳硫基，且
X是硫原子、氧原子或氮原子。
55.根据权利要求48所述的试剂盒，其中OR2是磷酸酯、乙酸酯、1-磷酸-2,3-二酰基甘油酯、三磷酸腺苷、二磷酸腺苷、单磷酸腺苷、腺苷、α-D-半乳糖苷、β-D-半乳糖苷、α-D-葡萄糖苷、β-D-葡萄糖苷、α-D-甘露糖苷、β-D-甘露糖苷、β-呋喃果糖苷、β-D-葡糖苷酸或
Figure DEST_PATH_IMAGE025
，其中，B1、B2和B3各自独立地是H或1-4个碳原子的烷基(支链或直链)。
56.根据权利要求55所述的试剂盒，其中R2是
Figure 712015DEST_PATH_IMAGE026
Figure DEST_PATH_IMAGE027
。
57.根据权利要求48所述的试剂盒，其中R2是E-L-Nuc-Z，其中E是包含亲电子原子的基团，所述原子在Z基团的酶切割以后被Nuc基团的电子对攻击，并通过邻助作用释放出1,2-二氧杂环丁烷酶底物阴离子；L是连接基团；Nuc是亲核原子；且Z是酶可切割的基团；其中
E是羧基、羰基、被离去基团取代的亚甲基、磷酸盐、碳酸盐、黄原酸盐、亚硫酸盐、磺酸盐、亚硫酸氢盐或二硫化物；
L选自：含有1-4个碳原子的亚甲基或聚亚甲基、-(CH2)m-O-(CH2)n、-(CH2)m-S-(CH2)n-、或–(CH2)m-NR6-(CH2)n-，其中m和n是0-3，且m+n是2或3，其中
R6是含有1-10个碳原子的烷基，且所述连接基团可以被含有1-24个碳原子的烷基、含有2-24个碳原子的烯基、含有1-24个碳原子的烷基取代，和被含有1-24个碳原子的酰氧基、含有2-24个碳原子的烯基单取代或二取代，和被含有1-24个碳原子的酰氧基、含有6-10个碳的芳基、含有1-24个碳原子的烷基单取代或二取代，和被苯基、羟苯基、吲哚基、巯基、含有1-4个碳原子的烷硫基、羟基、羧基、氨基、胍基、咪唑或氨基甲酰基或含有2-24个碳原子的烯基取代，和被苯基、羟苯基、吲哚基、巯基、含有1-4个碳原子的烷硫基、羟基、羧基、氨基、胍基、咪唑或氨基甲酰基取代；
Nuc是氧原子或硫原子；且
Z是磷酰基、乙酰基、1-磷酸-2,3-二酰基甘油酰基、腺苷三磷酰基、腺苷二磷酰基、腺苷单磷酰基、腺苷基、α-D-半乳糖基、β-D-半乳糖基、α-D-葡萄糖基、β-D-葡萄糖基、α-D-甘露糖基、β-D-甘露糖基、β-呋喃果糖基、β-D-glucosiduransyl或
Figure 204176DEST_PATH_IMAGE028
，其中，B1、B2和B3各自独立地是H或1-4个碳原子的烷基(支链或直链)。
58.根据权利要求57所述的试剂盒，其中Z是
Figure DEST_PATH_IMAGE029
Figure 258851DEST_PATH_IMAGE030
。
59.根据权利要求48所述的试剂盒，其另外包括促进剂。
60.根据权利要求59所述的试剂盒，其中所述促进剂包括聚合物型的季铵盐、聚合物型的季鏻盐或它们的组合。
61.根据权利要求60所述的试剂盒，其中所述促进剂另外包含受体染料。
62.根据权利要求61所述的试剂盒，其中所述受体染料是荧光素。
63.根据权利要求60所述的试剂盒，其中所述聚合物型的季铵盐是聚(乙烯基苄基三甲基氯化铵)、聚[乙烯基苄基(苄基二甲基氯化铵)]、聚[乙烯基(苄基三丁基氯化铵)]、聚[乙烯基(苄基三戊基氯化铵)]或它们的组合。
64.根据权利要求60所述的试剂盒，其中所述聚合物型的季鏻盐是聚(乙烯基苄基三甲基氯化鏻)、聚(乙烯基苄基三丁基氯化鏻)、聚(乙烯基苄基三辛基氯化鏻)、包含聚(乙烯基苄基三丁基氯化鏻)和聚(乙烯基苄基三辛基氯化鏻)的共聚物；或它们的组合。
65.根据权利要求48所述的试剂盒，其中所述烯醇醚是
Figure DEST_PATH_IMAGE031
Figure DEST_PATH_IMAGE033
Figure 907876DEST_PATH_IMAGE034
。
66.一种用于制备1,2-二氧杂环丁烷酶底物的方法，所述方法包括下述步骤：
(a) 提供氧化剂；
(b) 提供具有下述结构的烯醇醚：
Figure 426713DEST_PATH_IMAGE036
其中，
A和B独立地选自：含有1-20个碳原子的直链烷基、含有2-20个碳原子的直链烯基、含有3-20个碳原子的支链烷基、含有3-20个碳原子的支链烯基、含有3-20个碳原子的环烷基、含有3-20个碳原子的环烯基、含有3-20个碳原子的环杂烷基、含有3-20个碳原子的环杂烯基、含有4-60个碳原子的聚环烷基、含有4-60个碳原子的聚环烯基、含有4-60个碳原子的聚环杂烷基和含有4-60个碳原子的聚环杂烯基，它们中的任一个可以是未被取代的，或被一个或多个电子活性基团、增溶基团或光增强基团取代，且其中A和B一起形成所述环烷基、环烯基、聚环烷基或聚环烯基，所述环烷基、环烯基、聚环烷基或聚环烯基的碳原子之一是形成所述烯醇醚的双键的2个碳原子中的一个，
R1是含有1-20个碳原子的烷基、含有6-14个碳原子的芳基、含有7-15个碳原子的芳烷基、含有4-20个碳原子的杂芳基或含有5-20个碳的杂芳烷基，
T是能够发射光的芳基或杂芳基环，且
R2是酶可切割的基团，其含有可被酶部分切割以在T上产生氧阴离子的键；和
(c) 组合水性溶液、所述氧化剂和所述烯醇醚，以形成包含1,2-二氧杂环丁烷酶底物的水性溶液。
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