CN103205448A - 一种裂解时自动降解核酸的大肠杆菌制备的方法 - Google Patents

Abstract

本发明适用于生物技术领域，提供了一种裂解时自动降解核酸的大肠杆菌制备方法，包括：将pelB信号肽序列与SNase序列连接，得第一组合序列，将该第一组合序列与Km基因序列连接，得到第二组合序列；用该第二组合序列替换大肠杆菌的ptsG基因序列，获得ptsG基因缺失的大肠杆菌；将该ptsG基因缺失的大肠杆菌中的第二组合序列中的Km基因敲除。本发明的大肠杆菌制备方法具有同源重组效率高的优点，且制得的大肠杆菌表达的SNase可分泌至周质空间，且SNase基因表达的产物不会影响其它目的蛋白的表达，能降低发酵过程中乙酸的积累，促进菌体生长。

Description

一种裂解时自动降解核酸的大肠杆菌制备的方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种裂解时自动降解核酸的大肠杆菌制备方法。

背景技术

以大肠杆菌为宿主菌大规模胞内表达重组蛋白过程中，在纯化目的重组蛋白前，需破碎菌体以释放目的蛋白，破菌后高分子量的宿主菌染色体核酸释放至裂解液中，导致裂解液黏度显著增加，给后续纯化工作带来困难。FDA对药用重组蛋白的核酸污染限度要求严格(每剂量应低于100pg)，因此去除核酸污染也是非常必要的。

非特异性水解磷酸二酯键的酶为磷酸二酯酶（phosphodiesterase）,专一性水解核酸的磷酸二酯酶为核酸酶。利用核酸酶降解核酸可降低破菌液的粘度。目前使破菌液中核酸降解以降低粘度的方法有两种：一种为添加外源核酸酶，如来自Serratia marcescens的Benzonase，其为经基因工程改进的核酸内切酶。其缺点在于费用过高不适宜于大规模生产。另一种替代方案是改造基因工程菌，使之能自动降解宿主染色体核酸。但是采用一般的重组方法改造菌株，效率很低。

金黄色葡萄球菌核酸酶(Staphylococcus nuclease,简称SNase)是金黄色葡萄球菌分泌到胞外的一种核酸非专一性磷酸二酯酶，分子量16807道尔顿。该酶结构简单，为含有149个氨基酸残基的单链球蛋白，它不含半胱氨酸和二硫键，能够可逆地去折叠和重折叠，是研究蛋白质结构与功能之间的关系、蛋白质折叠动力学的重要模型。在Ca²⁺存在下，SNase可将DNA和RNA水解生成3'-单核苷酸和3'-二核苷酸，并表现出一定程度的序列特异性，倾向于作用AT富集区，能水解包括DNA、RNA，单链、双链、环形、线形的核酸。因此可在利用大肠杆菌表达重组蛋白时裂解宿主菌的核酸以降低破菌液的粘度，从而提高纯化效率。但在大肠杆菌中表达SNase时，也存在着表达量低，酶活不高，降解宿主染色体核酸的效果不明显的缺点。因此需要提供一种既可高效表达SNase且能快速生长的大肠杆菌以提高重组蛋白的纯化效率。

发明内容

本发明实施例的目的在于提供一种裂解时自动降解核酸的大肠杆菌制备方法，旨在解决现有技术中利用大肠杆菌表达重组蛋白时裂解液粘度过高影响纯化的问题。

本发明实施例是这样实现的，一种裂解时自动降解核酸的大肠杆菌制备方法，该方法包括以下步骤：

将pelB信号肽编码序列与金黄色葡萄球菌核酸酶基因序列连接，得第一组合序列，其中该pelB信号肽编码序列在该金黄色葡萄球菌核酸酶基因序列上游；

将该第一组合序列与卡那霉素抗性基因序列连接，得到第二组合序列，其中第一组合序列在卡那霉素抗性基因序列上游；

用上述第二组合序列替换大肠杆菌JM109的ptsG基因序列，获得ptsG基因缺失的大肠杆菌JM109；

将上述ptsG基因缺失的大肠杆菌JM109中的第二组合序列中的卡那霉素抗性基因敲除。

本发明的裂解时自动降解核酸的大肠杆菌制备方法具有如下优点：1、同源重组效率高；2、所得菌株能在37°C无抗性培养基条件下快速生长；3、制得的大肠杆菌表达的金黄色葡萄球菌核酸酶（SNase）可分泌至周质空间，直接发挥作用，简化纯化步骤；4、SNase基因表达的产物不会影响其它目的蛋白的表达，不会给宿主菌增加生长负荷；5、ptsG基因的敲除能降低发酵过程中乙酸的积累，减少细胞毒性，促进菌体生长。

附图说明

图1为本发明实施例的裂解时自动降解核酸的大肠杆菌制备方法操作流程；

图2为本发明实施例的裂解时自动降解核酸的大肠杆菌制备方法获得的第二组合序列的酶切检验电泳图；

图3为本发明实施例的裂解时自动降解核酸的大肠杆菌制备方法获得的ptsG::SNase重组大肠杆菌PCR鉴定图；

图4为本发明实施例1制备的目的重组大肠杆菌的SDS-PAGE电泳验证图；

图5为本发明实施例1制备的目的重组大肠杆菌表达的重组蛋白降解染色体DNA的电泳图。

具体实施方式

为了使本发明要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明所用术语“敲除”为分子生物学常用术语，通常是指将某段特定基因或序列从宿主中完全地去掉。

本发明实施例提供一种裂解时自动降解核酸的大肠杆菌制备方法，包括以下步骤：

S01将pelB信号肽编码序列与金黄色葡萄球菌核酸酶基因序列连接，得第一组合序列，其中该pelB信号肽编码序列在所述金黄色葡萄球菌核酸酶基因序列上游，然后将该第一组合序列与卡那霉素抗性基因序列连接，得到第二组合序列，其中该第一组合序列在所述卡那霉素抗性基因序列上游；

S02用步骤S01制得的第二组合序列替换大肠杆菌JM109的ptsG基因序列，获得ptsG基因缺失的大肠杆菌JM109；

S03将上述ptsG基因缺失的大肠杆菌JM109内的第二组合序列中的卡那霉素抗性基因敲除。

本发明实施例通过两次同源重组获得表达SNase的大肠杆菌，操作流程见图1，图1中的第一步利用同源重组将第二组合序列（即pelB信号肽-SNase-Km抗性基因编码序列）与ptsG基因替换，该步骤利用质粒pKOBEG或pKD46进行；第二步将pelB信号肽-SNase-Km抗性编码序列中的Km抗性基因（即图1中的Kan）敲除，该步骤通过质粒pCP20进行。

具体地，本发明实施例中pelB信号肽编码序列与金黄色葡萄球菌核酸酶基因序列的连接通过将金黄色葡萄球菌核酸酶基因序列插入至载体pET获得，即所述pelB信号肽编码序列来自于pET载体。

在本发明实施例中，将金黄色葡萄球菌核酸酶基因序列插入至载体pET后，通过PCR扩增获得同时含有T7启动子、终止子、信号肽pelB及SNase基因片段的连接序列。

具体地，本发明实施例中使用的pelB信号肽编码序列为SEQ ID NO:1，如下所示：

ATGAAAAAGACAGCTATCGCGATTGCAGTGGCACTGGCTGGTTTCGCTACCGTAGCGCAGGCC    SEQ ID NO:1。

本发明实施例中使用的金黄色葡萄球菌核酸酶（SNase）基因序列为其完整序列（NC_009641.1,534bp），具体为SEQ ID NO:2，如下所示：

ATGAAGTCAA ATAAATCGCT TGCTATGATT GTGGTAGCCA TCATTATTGT AGGTGTATTAGCATTTCAAT TTATGAATCA TACGGGTCCT TTCAAAAAGG GGACGAATCA TGAAACTGTACAAGATTTAA ATGGTAAAGA TAAAGTACAT GTTCAAAGAG TTGTGGATGG TGATACATTTATTGCAAATC AAAATGGTAA AGAAATTAAA GTTAGGC TTA TAGGGGTTGA TACGCCAGAAACGGTGAAAC CGAATACGCC TGTACAACCA TTTGGCAAAG AAGCATCAAA TTATAGTAAGAAGACATTAA CAAATCAAGA TGTTTATTTA GAATATGATA AAGAAAAACA AGATCGCTATGGTAGAACAT TGGCGTATGT ATGGATAAGT AAAGATCGTA TGTACAATAA GGAATTAGTGGAAAAGGGAC TTGCTAGAGA GAAGTATTTT TCACCAAATG GCAAATATAG AAATGTATTTATAGAAGCAC AAAATAAAGC TAAACAACAG AAATTAAATA TTTGGAGTAA ATAA

该金黄色葡萄球菌核酸酶基因序列可通过人工合成获得，也可以金黄色葡萄球菌基因组为模板，用PCR克隆获得。本发明实施例中利用PCR克隆SNase基因序列时，所使用的引物对为

P1：GGGGGATCCATGAAGTCAAATAAATCGCT      SEQ ID NO:3

P2：GGGCTCGAGTTATTTACTCCAAATATTTA      SEQ ID NO:4。

在上述引物P1中插入BamHI酶切位点（即下划线部分），引物P2中插入XhoI酶切位点（上述下划线部分），以便利用双酶切法与载体pET-22b连接。

分别用BamHI和XhoI双酶切克隆获得的SNase基因片段和载体pET-22b，用DNA连接酶将两者连接起来以获得质粒pEY-SNase，即得到位于载体上的信号肽pelB与SNase连接的第一组合序列，且该序列还含有T7启动子和终止子。使用引物对P3和P4获得该信号肽pelB与SNase连接的编码序列，P3和P4序列为：

P3：TTCAGCAAAAAACCCCTCAA      SEQ ID NO:5

P4：CGCGTCGACAATTAATACGACTCACTATA      SEQ ID NO:6，

该P4中加入SalI酶切位点，如下划线所示，使得该第一组合序列3’末端引入SalI酶切位点，同时在卡那霉素抗性基因序列5’端引入SalI酶切位点，便于将两者连接得到第二组合序列。

本发明实施例中使用的卡那霉素（Km）抗性基因序列为SEQ ID NO:7，如下所示：

GTGTAGGCTG GAGCTGCTTC GAAGTTCCTA TACTTTCTAG AGAATAGGAA CTTCGGAATAGGAACTTCAA GATCCCCTTA TTAGAAGAAC TCGTCAAGAA GGCGATAGAA GGCGATGCGCTGCGAATCGG GAGCGGCGAT ACCGTAAAGC ACGAGGAAGC GGTCAGCCCA TTCGCCGCCAAGCTCTTCAG CAATATCACG GGTAGCCAAC GCTATGTCCT GATAGCGGTC CGCCACACCCAGCCGGCCAC AGTCGATGAA TCCAGAAAAG CGGCCATTTT CCACCATGAT ATTCGGCAAGCAGGCATCGC CATGGGTCAC GACGAGATCC TCGCCGTCGG GCATGCGCGC CTTGAGCCTGGCGAACAGTT CGGCTGGCGC GAGCCCCTGA TGCTCTTCGT CCAGATCATC CTGATCGACAAGACCGGCTT CCATCCGAGT ACGTGCTCGC TCGATGCGAT GTTTCGCTTG GTGGTCGAATGGGCAGGTAG CCGGATCAAG CGTATGCAGC CGCCGCATTG CATCAGCCAT GATGGATACTTTCTCGGCAG GAGCAAGGTG AGATGACAGG AGATCCTGCC CCGGCACTTC GCCCAATAGCAGCCAGTCCC TTCCCGCTTC AGTGACAACG TCGAGCACAG CTGCGCAAGG AACGCCCGTCGTGGCCAGCC ACGATAGCCG CGCTGCCTCG TCCTGCAGTT CATTCAGGGC ACCGGACAGGTCGGTCTTGA CAAAAAGAAC CGGGCGCCCC TGCGCTGACA GCCGGAACAC GGCGGCATCAGAGCAGCCGA TTGTCTGTTG TGCCCAGTCA TAGCCGAATA GCCTCTCCAC CCAAGCGGCCGGAGAACCTG CGTGCAATCC ATCTTGTTCA ATCATGCGAA ACGATCCTCA TCCTGTCTCTTGATCAGATC TTGATCCCCT GCGCCATCAG ATCCTTGGCG GCAAGAAAGC CATCCAGTTTACTTTGCAGG GCTTCCCAAC CTTACCAGAG GGCGCCCCAG CTGGCAATTC CGGTTCGCTTGCTGTCCATA AAACCGCCCA GTCTAGCTAT CGCCATGTAA GCCCACTGCA AGCTACCTGCTTTCTCTTTG CGCTTGCGTT TTCCCTTGTC CAGATAGCCC AGTAGCTGAC ATTCATCCGGGGTCAGCACC GTTTCTGCGG ACTGGCTTTC TACGTGTTCC GCTTCCTTTA GCAGCCCTTGCGCCCTGAGT GCTTGCGGCA GCGTGAGCTT CAAAAGCGCT CTGAAGTTCC TATACTTTCTAGAGAATAGG AACTTCGAAC TGCAGGTCGA CGGATCCCCG GAATTAATTC TCATGTTTGACAG。

该Km抗性基因序列以质粒pKD13为模板，利用引物P5和P6通过PCR克隆获得。具体地，该引物P5和P6的序列为：

P5：CGCGTCGACGGACCATGGCTAATTCCCAT SEQ ID NO:8

P6：CGCGATATCCTGTCAAACATGAGAATTAA SEQ ID NO:9

且所得Km抗性基因序列5’端和3’端均包含FRT位点，FRT便于进行DNA序列的同源重组。在引物P5中加入SalI酶切位点，在引物P6中加入EcoRV酶切位点，如下划线所示。将第一组合序列与Km抗性基因序列连接，即获得步骤S01中的第二组合序列，即pelB信号肽-SNase-Km抗性基因编码序列。

具体地，在获得该第二组合序列的连接过程中，通过将第一组合序列与平末端克隆载体pEASY-Blunt连接，通过SalI与EcoRV双酶切，第一组合序列只含有SalI酶切位点，而pEASY-Blunt上含有EcoRV酶切位点，因此将该载体切开，且第一组合序列连接于载体上；将Km抗性基因序列与另一平末端克隆载体pEASY-Blunt连接，通过SalI与EcoRV双酶切，切下Km抗性基因序列，然后将其与上述被切开的载体连接，即得连接至载体pEASY-Blunt的第二组合序列。

本发明实施例中使用JM109菌株作为重组蛋白表达菌株，JM109可作为大多数质粒载体的受体菌，该菌株易于培养，并且可以用较多的转化方法进行有效的转化。

本发明实施例中利用基因重组系统使用上述第二组合序列（即pelB信号肽-SNase-Km抗性基因编码序列）替换大肠杆菌JM109中的ptsG基因序列，即在插入该pelB信号肽-SNase-Km抗性基因编码序列时敲除了ptsG基因序列。大肠杆菌对葡萄糖的摄取主要通过磷酸转移酶系统(PTS)完成，其中由ptsG基因编码的酶ⅡCBGlc在葡萄糖的跨膜转运中具有重要作用。故在大肠杆菌JM109中敲除ptsG基因，能够很大程度地降低葡萄糖的摄取速率，由此可降低乙酸的累积，促进菌体生长。

具体地，在步骤S02中，替换大肠杆菌JM109的ptsG基因序列的步骤即利用基因重组系统替换ptsG基因序列，该操作包括将质粒pKOBEG转化至大肠杆菌JM109感受态细胞中，然后将第二组合序列即pelB信号肽-SNase-Km抗性基因编码序列转化，此时质粒pKOBEG将促使pelB信号肽-SNase-Km抗性基因编码序列与ptsG基因序列替换。所述转化步骤采用电转化进行，电转化具有较高的转化效率。

另一可选方案中，在步骤S02中，可用质粒pKD46代替上述质粒pKOBEG，两者具有相同的性质，均可用于大肠杆菌的基因重组系统。

在步骤S02中，利用第二组合序列替换大肠杆菌JM109的ptsG基因序列完成之后，将用于基因替换的质粒pKOBEG或质粒pKD46去除，以消除该外来质粒对于宿主大肠杆菌的影响。因为这两种质粒均对温度敏感，因此可通过在37℃连续培养来使这两种质粒消失。因为质粒pKOBEG具有氯霉素抗性，因此可以用含氯霉素的培养基检验质粒pKOBEG是否真正被消除；而质粒pKD46具有氨苄青霉素抗性，因此可以用含氨苄青霉素的培养基检验质粒pKD46是否真正被消除。

在步骤S03中，通过基因重组系统将所述第二组合序列中的卡那霉素抗性基因敲除，该敲除过程通过质粒pCP20进行。且将卡那霉素抗性基因敲除后，再将质粒pCP20消除。以消除该外来质粒对于宿主大肠杆菌的影响。

本发明的大肠杆菌制备方法通过两次连接，两次同源重组，制得一种含SNase基因的重组大肠杆菌，该制备方法步骤简便，易于操作；重组的大肠杆菌表达的金黄色葡萄球菌核酸酶（SNase）可分泌至周质空间，直接发挥作用，简化纯化步骤；因为敲除了ptsG基因可降低发酵过程中乙酸的积累，减少细胞毒性，促进菌体生长；且同源重组使用的质粒在宿主菌中均被去除，减少了对于重组蛋白表达的影响，提高了表达效率。

以下结合具体实施例对本发明进行进一步描述。

本发明实施例中使用的核酸内切酶、连接酶、质粒pMD18-Tsimple、PCR反应试剂盒以及DNA片段回收试剂盒等为商业产品，均可从市场购得，具体操作按照说明书进行，在此不再详述。其他未注明的实验操作按照常规分子操作方法进行，且为本领域技术人员所熟知。另外，本发明实施例中涉及的引物、基因合成、测序均由深圳华大基因有限公司合成。质粒pKD46、pKD13、pCP20购自耶鲁大学（CGSC),大肠杆菌JM109购自大连宝生物工程有限公司。

实施例1

1、SNase片段的获得

按如下序列合成正反向引物：

正向引物P1：GGGGGATCCATGAAGTCAAATAAATCGCT      SEQ ID NO:3

反向引物P2：GGGCTCGAGTTATTTACTCCAAATATTTA      SEQ ID NO:4

在P1引物中加入BamHI酶切位点，即下划线部分，在P2中加入XhoI酶切位点，即下划线部分，以P1、P2为引物，以金黄色葡萄球菌基因组为模板，配制50μL的PCR反应体系，具体如下：

PCR反应条件：

94℃变性5min，

94℃30s，56℃1min，72℃40s，30个循环，

72℃延伸10min。

反应结束后，用含有20μg/mL的溴化乙锭（EB）的1%琼脂糖凝胶电泳进行检测。获得的目的片段长度为552bp，PCR克隆后测序验证。

2、大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备

挑取大肠杆菌DH5α的单菌落于5mL LB培养基中，37°C，200rpm培养过夜；次日吸取lmL菌液于50mL新鲜的LB培养基中，37°C，200rpm振荡培养2-3h，测得A₆₀₀吸光度在0.6-0.8时，取出三角瓶，冰浴10-15分钟；在无菌条件下，将菌液转至一个无菌预冷的50mL离心管中，4°C，4000rpm离心10min，弃上清，倒置离心管，用移液枪吸尽残余上清；加入预冷的100mmol/L CaCl₂溶液10mL悬浮菌体，冰浴10-30min，4°C，4000rpm离心10min收集菌体；加入2mL预冷的100mmol/L CaCl₂溶液重新悬浮菌体，并以每管100μL分装，置4°C冰箱过夜后-70°C保存备用。

3、pelB-SNase基因片段的构建

取载体pET-22b，分别以BamHI和XhoI双酶切上述步骤1获得的SNase基因片段和载体pET-22b，然后进行1%琼脂糖凝胶电泳，切胶回收。T₄DNA连接酶16°C过夜连接，得连接产物。从-70°C冰箱取出一支步骤2制备的DH5α感受态细胞，冰上融化后加入连接产物10μL，轻轻吹打混匀，冰上放置30分钟；将离心管置42°C水浴中热激90秒；快速将离心管转至冰水混合物中放置2分钟，使细胞冷却，加入500μLLB培养基，37°C，160rpm温和振荡培养40-60mim，然后取200μL涂布于含有氨苄青霉素LB平板，于37°C恒温箱中倒置培养16h以上。随机挑选若干克隆，按质粒小量快速提取试剂盒说明书提取质粒，进行质粒PCR鉴定和双酶切鉴定，结果表明连接成功，连接产物为质粒pET-SNase。

按照以下序列合成引物：

P3：TTCAGCAAAAAACCCCTCAA      SEQ ID NO:5

P4：CGCGTCGACAATTAATACGACTCACTATA      SEQIDNO:6

其中P4中加入SalI酶切位点，如下划线部分所示。

以P3、P4为引物，以质粒pET-SNase为模板，配制50μL的PCR反应体系，用P3和P4代替步骤1中的P1和P2，其余与步骤1的PCR反应体系相同，即得本步骤反应体系。PCR反应条件：

94℃变性5min，

94℃30s，56℃1min，72℃1min，30个循环，

72℃延伸10min。

PCR反应得到的DNA片段包含T7启动子、终止子、信号肽pelB及SNase基因片段，这四部分在一起称为pelB-SNase序列，PCR结束后进行1%琼脂糖凝胶电泳，所得序列长度为869bp，切胶回收。回收的目的片段与适量的平末端克隆载体pEASY-Blunt simple在16℃连接30min，用热激法将连接产物转入步骤2制备的大肠杆菌DH5α感受态细胞，将转化后的大肠杆菌置于含有氨苄青霉素（amp）(100μg/mL)的LB固体培养基中，37℃培养过夜，筛选具有抗性的重组大肠杆菌（命名为：pEASY-Blunt-pelB-SNase），挑取若干单菌落接种于5mL含有100μg/mL amp的LB液体培养基中，37℃、200r/min培养12h，测序。结果表明扩增所得的重组片段序列正确。

4、Km抗性基因的获得

按照如下序列合成引物：

P5：CGCGTCGACGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC      SEQ ID NO:8

P6：CGCGATATCCTGTCAAACATGAGAATTAA      SEQ ID NO:9

在引物P5中加入SalI酶切位点，在引物P6中加入EcoRV酶切位点，如下划线所示。以P5、P6为引物，以质粒pKD13为模板，PCR扩增包含FRT位点的Km抗性基因片段，所得目的序列长度为1323bp。PCR反应体系同步骤1，其中用引物P5和P6替换P1和P2。PCR反应条件如下：

94℃变性5min，

94℃30s，56℃1min，72℃1.5min，30个循环，

72℃延伸10min。

PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，所得片段长度为1496bp，切胶回收，测序。与适量的pEASY-Blunt simple在16℃连接30min，用热激法将连接产物转入步骤2制备的大肠杆菌DH5α感受态细胞中，将转化后的大肠杆菌置于含有amp(100μg/mL)的LB固体培养基中，37℃培养过夜，筛选具有抗性的重组子（命名为：pEASY-Km），挑取若干单菌落接种于5mL含有100μg/mL amp的LB液体培养基中，37℃、200r/min培养12h，测序。结果表明扩增所得的重组片段序列正确。

5、pelB信号肽-SNase-Km抗性基因重组片段的制备

用SalI和EcoRV双酶切步骤3获得的pEASY-Blunt-pelB-SNase，其中EcoRV酶切位点位于pEASY-Blunt载体上，双酶切产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，切胶回收载体，该载体包含pelB-SNase。用SalI和EcoRV双酶切步骤4获得的pEASY-Km，酶切产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，切胶回收Km抗性基因片段。两部分酶切产物通过T₄DNA连接酶16°C连接过夜，连接产物为pelB信号肽-SNase-Km抗性基因。从-70°C冰箱取出一支步骤2制备的DH5α感受态细胞，冰上融化后加入连接产物10μL，轻轻吹打混匀，冰上放置30分钟；将离心管置42°C水浴中热激90秒；快速将离心管转至冰水混合物中放置2分钟，使细胞冷却，加入500μLLB培养基，37°C，160rpm温和振荡培养40-60mim，然后取200μL涂布于含有氨苄青霉素LB平板，于37°C恒温箱中倒置培养16h以上。随机挑选若干克隆，按质粒小量快速提取试剂盒说明书提取质粒，进行质粒PCR鉴定和酶切鉴定。结果如图2所示，其中用两套双酶切体系鉴定：泳道M为λDNA/Hind IIIMarker，泳道1为SalI和EcoRV双酶切条带，泳道2为NcoI和XhoI双酶切条带，NcoI和XhoI酶切位点均位于载体pEASY-Blunt上，图2结果表明已经正确连接。

6、用于同源重组的目的序列片段的制备

按如下序列合成引物：

P7：CTATCGCAGGTATTCTGCTGGGCGTCGGTTCCGCGAATTTCAGCTGGTTCAGCAAAAAACCCCTCAA      SEQ ID NO:10

P8：CCGTCACGCATCCCCAGAAGAATACAGATTGGGAATGCCAGGCCTGCCAGAACTGTCAAACATGAGAATTAAC      SEQ ID NO:11

引物P7中加入ptsG上游同源臂47bp，引物P8中加入ptsG下游同源臂52bp，如下划线所示。以P7、P8为引物，步骤5获得的pelB信号肽-SNase-Km抗性基因重组片段为模板，进行PCR扩增。采用50μLPCR反应体系，如下所示：

（其中所述DNA模板为pelB信号肽-SNase-Km抗性基因重组片段）

PCR反应条件：

94℃变性5min，

94℃30s，56℃1min，72℃2.5min：30个循环，

72℃延伸10min。

反应结束后，PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，回收得到2464bp的重组片段，命名为L-SNase-Km-R，用DpnI酶处理扩增的L-SNase-Km-R,目的在于消化残留质粒，减少假阳性。再次以1%琼脂糖凝胶电泳回收片段，用紫外吸光仪测定浓度和纯度；-20℃冰箱中保存备用。

7、pKOBEG向大肠杆菌JM109感受态细胞转化

制备大肠杆菌JM109感受态细胞，具体操作步骤同步骤2。

将编码Red重组系统的质粒pKOBEG用热激法转化至该大肠杆菌JM109感受态细胞中，具体操作步骤同步骤3；挑取单克隆菌落在含有氯霉素(终浓度34μg/mL)的LB培养基中30℃振荡培养过夜，接lmL菌液于50mL的带有同样浓度氯霉素的LB培养基中，30℃振荡培养，至A₆₀₀为0.2-0.4时，加入L-阿拉伯糖(终浓度为10mM)，继续振荡培养，至A₆₀₀为1.0时；4000g，4℃离心10分钟，弃上清，收集菌体，用去离子水洗3次，最后将菌体重悬于150μL预冷的10％甘油中，取50μL用于电转化。

8、目的基因的电转化

取100-300ng步骤6的L-SNase-Km-R片段与50μL步骤7制备的含有质粒pKOBEG的JM109感受态细胞混合，将混合物吸入0.1cm的Bio-Rad电转杯进行电击，电击条件为1800V、200Ω、25μF。电击后快速加入0.5mL冰冷的LB培养基，37℃振荡培养60min，取100μL菌液涂布于卡那霉素(50μg/m1)平板上，37℃过夜培养，挑选阳性克隆，所得菌株为ptsG::SNase菌株，即用L-SNase-Km-R序列替换ptsG的重组大肠杆菌JM109。

9、PCR鉴定

将步骤8获得的阳性克隆ptsG::SNase菌株转移至装有50μL无菌水的0.5mL管中，振荡使细胞分散；将管置于沸水加热5min使细胞裂解、DNase变性；12000rpm离心lmin以去除细胞碎片，取上清作为菌落PCR模板，用野生型菌株作为对照，重新设计引物：

P9：TCGGTAAATCGCTGATGCTG      SEQ ID NO:12

P10：AATTAATACGACTCACTATA      SEQ ID NO:13

其中，引物P9为与ptsG上游序列同源，引物P10与SNase的一段序列同源。

PCR反应条件：

94℃变性5min，

94℃30s，56℃1min，72℃2.5min：30个循环，

72℃延伸10min。

反应结束后，以加入20μg/mL的溴化乙锭（EB）的1%琼脂糖凝胶电泳检测。

结果如图3所示，其中泳道M为Marker，泳道1和2为重组菌株ptsG::SNase的平行处理样品，两者均扩增出2448bp的条带，泳道3为野生型菌株，泳道3中没有扩增出相应的条带。将PCR产物进行测序，测序结果与预期一致。

10、质粒的消除

将步骤9的检验正确的ptsG::SNase重组菌株在含50μg/ml卡那霉素的LB液体培养基中37℃培养三代，菌体稀释后涂布在含50μg/mL卡那霉素的LB固体培养基上。随机挑取100个菌落，分别影印至含有50μg/ml卡那青霉素和34μg/ml氯霉素的LB固体培养基上,分别在37℃和30℃培养，结果表明菌落在含有50μg/ml卡那青霉素的平板上生长良好，而在含34μg/ml氯霉素的平板上不生长。表明菌株中不再含有pKOBEG质粒。验证质粒pKOBEG不再存在至关重要，因为残留的质粒会表现出重组酶的活性，对目的菌株造成干扰。

为进一步确认质粒pKOBEG的丢失，取上述验证正确的4个菌株，在含34μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中培养后，提取质粒，电泳后发现菌株不含质粒pKOBEG。

经抗性验证，质粒提取综合鉴定，可确认已获得不含质粒pKOBEG的重组菌株ptsG::SNase。

11、Km抗性基因的敲除

将质粒pCP20转化至步骤10获得的不含质粒pKOBEG的重组菌株ptsG::SNase中，于含氨苄青霉素的LB平板上筛选重组子，然后转接至无抗性的LB培养基中，42℃培养5h，在无抗性平板上划线，随机挑取100个所得的菌落，分别影印至含有50μg/mL卡那霉素和100μg/mL氨苄青霉素的LB固体培养基上，进行卡那霉素和氨苄青霉素敏感检测，对两者均敏感的克隆为去除卡那霉素抗性基因和pCP20质粒的菌株，即为E.coli JM109ptsG缺失突变菌株。

用P9、P10为引物进行菌落PCR，扩增得到987bp的片段，即为去除Km抗性基因的片段。证明所得菌株为目的重组大肠杆菌。

实施例2

步骤1-6同实施例1。

7、pKD46向大肠杆菌JM109感受态细胞转化

制备大肠杆菌JM109感受态细胞。

将质粒pKD46用热激法转化至该大肠杆菌JM109感受态细胞中。然后挑取单克隆菌落在含有氨苄青霉素(终浓度34μg/mL)的LB培养基中30℃振荡培养过夜，接lmL菌液于50mL的带有同样浓度氨苄青霉素的LB培养基中，30℃振荡培养，至A₆₀₀为0.2-0.4时，加入L-阿拉伯糖(终浓度为10mM)，继续振荡培养，至A₆₀₀为1.0时；4000g，4℃离心10分钟，弃上清，收集菌体，用去离子水洗3次，最后将菌体重悬于150μL预冷的10％甘油中，取50μL用于电转化。

8、目的基因的电转化

同实施例1。

9、PCR验证

同实施例1。

10、pKD46质粒的消除

将步骤9的检验正确的ptsG::SNase重组菌株在含50μg/ml卡那霉素的LB液体培养基中37℃培养三代，菌体稀释后涂布在含50μg/mL卡那霉素的LB固体培养基上。随机挑取100个菌落，分别影印至含有50μg/ml卡那青霉素和100μg/ml氨苄青霉素的LB固体培养基上,分别在37℃和30℃培养，结果表明菌落在含有50μg/ml卡那青霉素的平板上生长良好，而在含100μg/ml氨苄青霉素的平板上不生长。表明菌株中不再含有pKD46质粒。

为进一步确认质粒pKD46的丢失，取上述验证正确的4个菌株，在含50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中培养后，提取质粒，电泳后发现菌株不含质粒pKD46。

11、特异性基因检验

取步骤10中检验正确的菌株做菌落PCR，设计扩增存在于质粒pKD46上gam蛋白基因的引物如下：

P11：CTCTAAGGAGGTTATAAAAA      SEQ ID NO:14

P12：TTATACCTCTGAATCAATAT      SEQ ID NO:15

用50μL的PCR反应体系进行检测。PCR反应条件：

94℃变性5min，

94℃30s，56℃1min，72℃30s，30个循环，

72℃延伸10min。反应结束后，以加入20μg/mL的溴化乙锭（EB）的1%琼脂糖凝胶电泳检测。

以大肠杆菌JM109/pKD46的菌落PCR为对照，对照可扩增出437bp的gam蛋白基因，而所选择的4个菌株均未扩增出片段。

实施例3

1、目的蛋白的表达

将实施例1制备的重组大肠杆菌和野生型菌株JM109分别挑单菌落接种于5mL无抗性的LB培养基中，37℃，180rpm培养12h。接500μL菌液于50mL LB液体培养基中，37℃培养至A₆₀₀为0.4-0.7时加入IPTG(终浓度为1mM)进行表达诱导，继续培养4-5小时，5000g，4℃离心5min收集菌体。

取1mL大肠杆菌培养液，经离心收集菌体，用含20%蔗糖的25mmol/L的Tris-Cl(pH7.3)缓冲液50μL充分悬浮，冰浴30min；重新离心收集菌体，再加入100μL的双蒸水悬浮，冰浴30min；10000g，4℃离心10min，上清即大肠杆菌周质蛋白。12%的SDS-PAGE电泳结果如图4所示，其中M为Marker，泳道1为野生型大肠杆菌，泳道2为实施例1制备的目的重组大肠杆菌。如图所示，重组大肠杆菌在20kD处有明显条带，而野生菌株无相应条带。

2、目的菌株裂解后自动降解染色体DNA能力检测

分别将实施例1制备的重组大肠杆菌和野生型大肠杆菌JM109分别按步骤1所述诱导表达，培养至生长饱和，取1.5mL，5000g，离心5min收集菌体；用500μL含0.5％Triton x-100的菌体裂解液重悬菌体，加溶菌酶(终浓度lmg/m1)和RNase(终浓度40μg/m1)，37℃分别水浴10min。加10μL20mg/mL蛋白酶K(Proteinase K)，55℃水浴10min；加100μL5M NaCl，等体积氯仿：苯酚(1：1)，轻柔混合，13000rpm离心5min，取上清；加0.6-0.7体积倍数预冷异丙醇，4℃沉淀DNA，13000rpm离心5min；用70％乙醇洗涤沉淀两次；37℃干燥，加50-100μLTE重溶沉淀。结果如图5所示，其中M为Marker，泳道1为野生型大肠杆菌，其具有基因组条带，泳道2为实施例1制备的重组大肠杆菌，其没有明显的序列条带。结果表明实施例1制备的重组大肠杆菌经本实施例步骤1诱导表达的SNase能在10min内将宿主的基因组DNA降解完全。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种裂解时自动降解核酸的大肠杆菌制备方法，该方法包括以下步骤：

将pelB信号肽编码序列与金黄色葡萄球菌核酸酶基因序列连接，得第一组合序列，其中所述pelB信号肽编码序列在所述金黄色葡萄球菌核酸酶基因序列上游；

将所述第一组合序列与卡那霉素抗性基因序列连接，得到第二组合序列，其中所述第一组合序列在所述卡那霉素抗性基因序列上游；

用所述第二组合序列替换大肠杆菌JM109的ptsG基因序列，获得ptsG基因缺失的大肠杆菌JM109；

将所述ptsG基因缺失的大肠杆菌JM109的第二组合序列中的卡那霉素抗性基因敲除。

2.如权利要求1所述的裂解时自动降解核酸的大肠杆菌制备方法，其特征在于，所述pelB信号肽编码序列为SEQ ID NO:1，所述金黄色葡萄球菌核酸酶基因序列为SEQ ID NO:2，所述卡那霉素抗性基因序列为SEQ ID NO:5。

3.如权利要求1所述的裂解时自动降解核酸的大肠杆菌制备方法，其特征在于，所述金黄色葡萄球菌核酸酶基因利用序列为SEQ ID NO:3和SEQ IDNO:4的引物对克隆获得。

4.如权利要求1所述的裂解时自动降解核酸的大肠杆菌制备方法，其特征在于，所述卡那霉素抗性基因序列以质粒pKD13为模板，利用序列为SEQ IDNO:8和SEQ ID NO:9的引物对克隆获得。

5.如权利要求1所述的裂解时自动降解核酸的大肠杆菌制备方法，其特征在于，所述将pelB信号肽编码序列与金黄色葡萄球菌核酸酶基因序列连接通过将金黄色葡萄球菌核酸酶基因序列插入至载体pET获得。

6.如权利要求1所述的裂解时自动降解核酸的大肠杆菌制备方法，其特征在于，所述卡那霉素抗性基因序列以质粒pKD13为模板克隆获得，且其5’端和3’端均包含FRT位点。

7.如权利要求1所述的裂解时自动降解核酸的大肠杆菌制备方法，其特征在于，所述用第二组合序列替换大肠杆菌JM109的ptsG基因序列的步骤包括将质粒pKOBEG或质粒pKD46转化至大肠杆菌JM109的操作。

8.如权利要求7所述的裂解时自动降解核酸的大肠杆菌制备方法，其特征在于，所述用第二组合序列替换大肠杆菌JM109的ptsG基因序列的步骤还包括将所述质粒pKOBEG或质粒pKD46去除的操作。

9.如权利要求1所述的裂解时自动降解核酸的大肠杆菌制备方法，其特征在于，所述将卡那霉素抗性基因敲除的步骤包括将质粒pCP20转化至所述ptsG基因缺失的大肠杆菌JM109的操作。

10.如权利要求9所述的裂解时自动降解核酸的大肠杆菌制备方法，其特征在于，所述将卡那霉素抗性基因敲除的步骤还包括将所述质粒pCP20去除的操作。

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