CN103200949B - 用于治疗神经变性疾病或神经病理性病症的组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及传统中草药高良姜(Alpinia officinarum，AO)或其组成的提取物、精制部位及其成分，以及这样的化合物和组合物治疗神经变性或神经病理性病症或抑制α‑突触核蛋白聚集的用途。

Description

用于治疗神经变性疾病或神经病理性病症的组合物
背景技术
帕金森病(PD)是第二最常见的渐进性神经变性病症。PD的临床表现包括休息性震颤、僵硬、运动徐缓和姿势不稳定及认知障碍和情绪障碍。PD病理的主要特征为黑质密部中多巴胺能神经元的损失和被称为Lewy体的胞浆内包含体的存在。PD的病因和发病机制尚未完全清楚，但是最近的证据表明环境因素和遗传因素可能与该疾病的形成有关(Schapira，Lancet Neurol.，7:97-109(2008))。PD被认为是散发病，但是最近已经鉴定了一些与伴随家族形式的PD有关的易感基因。有报道表明α-突触核蛋白(synuclein)基因的三个错义点突变(A53T、A30P和E46K)与基因组复制或三倍体是家族性PD形成的原因之一(Lee和Trojanowski，Neuron，52:33-38(2006))。
α-突触核蛋白是一种主要在神经元(特别是在突触末端)中表达的蛋白。α-突触核蛋白的功能没有明确定义，但据报道其在突触功能和神经可塑性方面具有具有潜在的作用。基因敲除的动物模型用于检查α-突触核蛋白的作用是可行的且具有正常突触结构和脑形态学。这些研究表明α-突触核蛋白可以调控多巴胺的释放、合成或贮存，也可作为突触可塑性的调节剂(Lotharius和Brundin，Hum.Mol.Genet.，11:2395-407(2002))。
除了PD之外，α-突触核蛋白也被鉴定为路易体痴呆(DLB)、阿尔茨海默病(AD)、单纯性自主神经衰竭(PAF)、多系统萎缩症(MSA)及其它神经变性病症中路易体和路易轴突的主要成分(Lippa等，Am.J.Pathol.，153:1365-70(1998)，Marti等，Mov.Dis.，18:S21-S27(2003)，Norris等，Curr.Top.Dev.Biol.，60:17-54(2004))。在Lewy体和Lewy轴突中，病理性α-突触核蛋白以不溶性、细丝状聚集体的形式存在，并伴随有异常性的硝酸化、磷酸化和泛素残基。这一新发现已确定α-突触核蛋白病为神经变性疾病的主要病原性特征。已经表明α-突触核蛋白具有采用各种构型和自我聚集成低聚物的高倾向，其进一步聚集成呈路易体及其它类似病理学沉积的原纤维。突变形式的α-突触核蛋白更易于聚集，正如在体外和在动物模型实验中证实的(Conway等，Nat.Med.，4:1318-1320(1998);Giasson等，Neuron，34:521-233(2002))。
另外，据认为在人体的黑质中α-突触核蛋白蛋白水平随着年龄增长而增加(Li等，J.Neurosci.，24:9400-9409(2004))。人患者和动物模型中α-突触核蛋白和神经变性表型之间的联系突出地表明在PD发病机理中该蛋白表达水平显著性和异常聚集的意义。在小鼠朊蛋白-相关蛋白启动因子控制下，A53Tα-突触核蛋白转基因小鼠显示出随年龄增长而显著和最终致命的运动麻痹。它们的运动神经元显示出接近原纤维α-突触核蛋白包含物的轴索变性，其仍然是Lewy体结构的一部分(Giasson等，Neuron，34:521-233(2002))。大量的证据表明聚集的不溶性α-突触核蛋白低聚物(原纤维)在PD的发病机理中起重要作用。低聚物形式的错折叠蛋白的组装导致突触功能障碍、神经元细胞凋亡和脑损伤，并且是PD发病机理的基础。Lansbury和合作者证实α-突触核蛋白原纤维形成椭圆形或圆形淀粉状蛋白孔，其可以刺穿细胞膜，导致释放出细胞内含物和细胞死亡(Lashuel等，Nature，418:291(2002))。
目前，没有任何中止或逆转PD进展的特定疗法。市售可获得的药物仅仅缓解疾病的症状，以改善PD患者的生活质量。由于PD患者有大量的症状和并发症，个体之间药物的选择有相当大地变化。用于治疗PD的最常用处方药物为提高脑中多巴胺生成的药物。被脑中的酶修饰以产生多巴胺的左旋多巴是用于PD的最常见的药物。近年来，研究人员已经研究了包括多巴胺激动剂在内的大量药物。然而，在治疗一段时期之后，药物的功效会降低。此外，也有副作用被报道，比如胃肠疾病、心理学和认知问题(例如意识错乱、幻觉、精神病等)等。
对PD患者脑的最新研究表明，线粒体复合物I的功能丧失和氧化应激的产生(Schapira，Lancet Neurol.，7:97-109(2008))在PD中选择性黑质多巴胺能退化的发展中起作用。PD患者的生物化学缺陷与在MPTP(1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶)的动物模型中的发现类似。MPP+(1-甲基-4-苯基吡啶鎓)，MPTP的活性代谢产物，是一种神经毒素，被广泛地用于体外试验以引起帕金森综合征。其通过多巴胺转运蛋白吸收，并堆积在多巴胺神经元中。吸收的MPP+在线粒体中浓缩，并抑制电子传递链的复合物I的活性，导致ATP生成减少和活性氧簇(ROS)产生，因此引起选择性多巴胺能神经元死亡，导致PD样症状。
一些研究报道使用MPP+在人SH-SY5Y细胞系中获得帕金森综合征，形成PD模型用于新治疗化合物的最初评价(例如Kim等，Br.J.Nutr.，104:8-16(2010);Sun等，Eur.J.Pharmacol.，660:283-90(2011))。一种简单的基于细胞的PD模型更适用于在预防和治疗PD的哺乳动物临床试验之前初步筛选潜在的治疗候选物。
除了MPTP/MPP+之外，6-羟基多巴胺(6-OHDA)是另一种已经广泛地用于实验动物中诱导帕金森综合征的化学物质(Betarbet等，Bioessays，24:308-18(2002);Lane和Dunnett，Psychopharmacology(Berl)，199:303-12(2008))。其经由多巴胺和去甲肾上腺素重吸收转运蛋白进入神经元，因此通常用于与选择性去甲肾上腺素重吸收抑制剂(比如地昔帕明)一起选择性地杀死多巴胺能神经元。其被认为是一种内源毒素，因为它是在PD患者的尿中发现的(Andrew等，Neurochem.Res.，18:1175-7(1993))，并且在体外多巴胺氧化可以导致6-OHDA的产生(Napolitano等，Chem.Res.Toxicol.，12:1090-1097(1999))。大量的证据表明6-OHDA产生活性氧簇，并降低谷胱甘肽和过氧化物歧化酶的活性。在脑内注射6-OHDA之后，纹状体的神经元在24小时之内开始退化，并且纹状体的多巴胺在2-3天内耗尽。
N-甲基-d-门冬氨酸(NMDA)受体是主要定位在中枢神经系统(CNS)内的配体门控离子通道。它们属于离子型谷氨酸受体家族，参与神经元通信并在突触可塑性和学习与记忆机制中发挥重要作用。在正常情况下，NMDA受体经由神经递质谷氨酸参与突触传递，谷氨酸能调节和改进突触生长及可塑性。然而，当谷氨酸水平异常高时(即在病理条件下)，NMDA受体被过度活化，导致Ca2+过量流入神经元细胞，其进而导致兴奋毒性以及触发神经元细胞凋亡的一些信号通路的激活。谷氨酸诱导的脑组织凋亡还伴有氧化应激，这会导致ATP流失、线粒体膜电位损失以及释放活性氧簇和活性氮簇(例如H2O2、NO、OONO-、O2-)，造成相关细胞损伤和死亡，最终发生神经细胞功能降低以及神经元细胞死亡。
NMDA受体的过度激活参与神经变性疾病和其它神经相关病症，因为其造成神经元丧失和认知缺损，同时也在导致各种神经变性病症(比如肌萎缩侧索硬化、帕金森病、阿尔茨海默病和亨廷顿病以及比如中风的病症)的神经元损伤的最终通路中起作用。最近的发现显示，NMDA受体涉及许多其它神经性障碍，比如多发性硬化、大脑性瘫痪(脑室周围白质软化)和脊髓损伤，以及慢性和严重性情感障碍(和Herrling，Neurodegener.Dis.，6:37-86(2009))。
具有以下作用的化合物和组合物仍然需要：其可以保护神经元细胞免于MPP+/6-OHDA和NMDA诱导的细胞死亡，和/或抑制α-突触核蛋白的聚集，或者其另外用于治疗神经变性和神经病理性疾病，比如帕金森病或与α-突触核蛋白聚集相关的其它疾病。
发明内容
本发明提供了用于治疗受试者中神经变性疾病或神经病理性病症(包括突触核蛋白病(synucleinopathies))或用于减少α-突触核蛋白聚集的化合物和组合物，特别是药物组合物。本发明还提供了使用所述化合物和组合物治疗这样的疾病或病症的方法。
在一个方面，本发明提供一种用于治疗受试者中神经变性疾病或神经病理性病症或用于减少受试者中α-突触核蛋白聚集的组合物，优选药物组合物，所述组合物包含高良姜(Alpinia officinarum)提取物或其精制组份和任选的可药用载体或赋形剂。
在一个相关的方面，本发明提供一种治疗受试者中神经变性疾病或神经病理性病症、或减少受试者中α-突触核蛋白聚集的方法，所述方法包括向受试者给药有效量的高良姜提取物或其精制部位。
在另一个方面，本发明提供用于治疗神经变性疾病或神经病理性病症或用于减少α-突触核蛋白聚集的式1的化合物：
或其盐，其中R1和R2都为H或一起形成键；并且R3、R4和R5独立地为H、OH或C1-C8烷氧基。还提供包含一种或多种式1的化合物和载体或赋形剂的药物组合物，以及使用这样的化合物或组合物治疗受试者中神经变性疾病或神经病理性病症或减少受试者中α-突触核蛋白聚集的方法。
附图说明
图1A和1B描述用高良姜的总提取物(AOTE，10或50μg)培养7天的α-突触核蛋白(7μg)的蛋白质印迹分析(图1A)和谱带强度定量分析(图1B)的结果。
图2描述用高良姜提取物之三氯甲烷(CF)、丁醇(BU)和水部位(WA)提取物培养的α-突触核蛋白(7μg)的蛋白质印迹分析的结果。
图3A和3B描述用高良姜提取物的丁醇(BU)和水部位(WA)提取物培养的α-突触核蛋白(7μg)的蛋白质印迹分析的结果。
图4A和4B描述用高良姜提取物的丁醇部位(BU)(10-50μg)培养的α-突触核蛋白(7μg)的蛋白质印迹分析的结果。
图5为描述用各种浓度的全部高良姜提取物(TE,μg/mL)预处理2小时，接着与MPP+(50μM)共处理之后的SH-SY5Y细胞的存活率的图。数据以与不用MPP+处理的作为对照(设定为100%存活)的存活百分比表示，并进行与DMSO-处理的对照相比的统计分析(t检验)，其中*=P<0.05，**=P<0.005。
图6为描述用各种浓度的高良姜提取物(μg/mL)的三氯甲烷(CF)、丁醇(BU)和水(WA)部位预处理2hr，接着与MPP+(50μM)共处理的SH-SY5Y细胞的存活的图。数据以与不用MPP+处理的作为对照(设定为100%存活)的存活百分比表示，并进行与DMSO-处理的对照相比的统计分析(t检验)，其中*=P<0.05，**=P<0.005。
图7为描述用高良姜总提取物(TE,μg/mL)预处理2小时，之后与NMDA共处理20分钟的原神经元的细胞死亡的图，使用单向ANOVA将所述细胞死亡表示为赋形剂(DMSO)-处理对照的百分数。***=P<0.005。使用美金刚(10μM)作为阳性对照。
图8为描述用高良姜总提取物(μg/mL)的三氯甲烷(CF)、丁醇(BU)和水部位(WA)预处理2hr，之后与NMDA共处理20分钟的原神经元的细胞死亡的图，使用单向ANOVA将所述细胞死亡表示为赋形剂(DMSO)-处理对照的百分数。***=P<0.005。使用美金刚(10μM)作为阳性对照。
图9为来自用WT-α-类似物或变体α-类似物转染和用100μg/mL的高良姜总提取物(AOTE)、丁醇部位(AOBU)或水部位(AOWA)处理的SH-SY5Y细胞溶胞产物的α-突触核蛋白的蛋白质印迹。
图10为在37℃下，在用6-OHDA(50μg)与或不与高良姜提取物的丁醇部位(AOBU)(320μg)培养之后，α-突触核蛋白(1μg)的蛋白质印迹。
图11描述在用6-OHDA和高良姜提取物的丁醇部位(AOBU)处理的小鼠纹状体内TH水平的蛋白质印迹分析。
图12描述在用6-OHDA和高良姜提取物的水部位(AOWA)处理的小鼠纹状体内TH水平的蛋白质印迹分析。
图13显示高良姜提取物的丁醇部位(AOBU)的HPLC色谱。
图14显示在高良姜提取物的丁醇部位(AOBU)中发现的四种化合物的结构。
具体实施方式
在一个方面，本发明提供一种用于治疗受试者中的神经变性疾病或神经病理性病症、或用于减少受试者中α-突触核蛋白聚集的组合物，优选药物组合物，所述组合物包含高良姜(AO)提取物或其精制部位。高良姜是一种通常在中国南方发现的姜科(Zingiberaceae)良姜属草药种类，并用于传统中药。
高良姜提取物可以包括植物高良姜的任何溶剂可溶性部分、基本上由所述部分组成或由所述部分组成。所述提取物可以包括高良姜的亲水性部分，例如该植物的水溶性部分。作为可供选择的另一种方式，或除此之外，所述提取物可以包括高良姜的亲脂性部分，例如可溶于油或其它非极性有机溶剂（如甲苯或三氯甲烷）的部分。而且，或者作为替代，所述提取物可以包括两亲性部分(例如可溶于极性和非极性溶剂中达到至少某些可测量度的部分)。而且，所述提取物可以包括一种或多种亲水性、亲脂性或两亲性部分的任何精制部位、基本上由所述部位组成、或由所述部位组成。所述提取物可以包括单独的任何前述部分或其任意组合。
根据本发明的一个方面，所述提取物包括高良姜的醇可溶性部分、基本上由所述部分组成、或由所述部分组成，所述部分例如为在100%甲醇中具有约10mg/mL以上的溶解度的部分(例如，约15mg/mL以上、约20mg/mL以上、约25mg/mL以上、约30mg/mL以上、约35mg/mL以上、或者约40mg/mL以上)。作为可供选择的另一种方式，或除此之外，所述提取物包括高良姜的一部分、基本上由所述部分组成、或由所述部分组成，所述部分在70%甲醇/水(v/v)中具有的溶解度为约10mg/mL以上(例如，约15mg/mL以上、约20mg/mL以上、约25mg/mL以上、约30mg/mL以上、约35mg/mL以上、或约40mg/mL以上)。
在一个实施方案中，所述提取物包括高良姜的醇可溶性(例如丁醇-可溶性)部分、基本上由所述部分组成、或由所述部分组成，其中所述部分包括下表1的化合物1.1、1.2、1.3和1.4中的一种或多种、两种或多种、三种以上或所有四种。在一个更具体的实施方案中，以当量比计，所述提取物在每克提取物中含有大约100-200mg(例如约150mg)的化合物1.1、约50-100mg(例如约60mg)的化合物1.2、约1-5mg(例如约2mg)的化合物1.3、和/或约5-20mg(例如约10mg)的化合物1.4或其它量的化合物1.1-1.4。
所述提取物可以通过任何合适的技术制备，例如通过用合适的溶剂提取期望部分的高良姜。合适的溶剂的实例包括水，水可混溶溶剂比如醇类(例如乙醇、甲醇、丁醇等)和极性有机溶剂(例如甲苯、丙酮、氯仿等)。合适的提取技术描述在本文给出的实施例中，但是所描述的技术决不意味着限制本发明的范围。
可以通过任何合适的技术对提取物进行进一步精制，比如通过用相同或不同的溶剂进一步提取，或者通过其它纯化或细分成小部位的分离技术。一些这样的技术描述在实施例中。
如果期望，可以通过蒸发从溶剂中分离出提取物，或者以其它方式分离提取物与溶剂。而且，所述提取物或其精制部位可以单独使用，或者与溶剂或其它载体或赋形剂(优选可药用载体或赋形剂)组合使用。
所述提取物或其精制部分或部位可以以任何浓度用作组合物(例如，包括载体、稀释剂、赋形剂或其它合适的组分)的一部分。期望地，组合物将包含约1μg/ml以上(例如，约5μg/ml以上、约10μg/ml以上、约15μg/ml以上、或约20μg/ml以上)的提取物或其精制部分。在某些实施方案中，组合物将包含较高浓度的所述提取物或其精制部分，比如约25μg/ml以上(例如，约30μg/ml以上、约35μg/ml以上、约40μg/ml以上、或约45μg/ml以上)、约50μg/ml以上(例如约55μg/ml以上、约60μg/ml以上、约65μg/ml以上、或约70μg/ml以上)、或者甚至约75μg/ml以上(例如约80μg/ml以上、约85μg/ml以上、约90μg/ml以上、约95μg/ml以上、或约100μg/ml以上)。
在另一个方面，本发明提供式1的化合物或其盐及其用于治疗受试者中神经变性疾病或神经病理性病症或用于减少受试者中α-突触核蛋白聚集的用途：
其中R1和R2都为H或一起形成键；并且R3、R4和R5独立地为H、OH或C1-C8烷氧基(例如，C1-C6烷氧基或C1-C3烷氧基，比如甲氧基或乙氧基)。在某些实施方案中，R3为H和/或R4为H或C1-C8烷氧基比如C1-C6烷氧基或C1-C3烷氧基(例如甲氧基或乙氧基)。或另外可选地，R5为羟基或C1-C8烷氧基，比如C1-C6烷氧基或C1-C3烷氧基(例如甲氧基或乙氧基)。这样的化合物的实例包括，但不限于化合物1.1至1.4及其盐的任一个：
可以通过任何合适的技术提供式1的化合物。例如，可以使用常规方法合成该化合物，或者可以从天然源比如高良姜提取该化合物，如在本文提供的实施例中示例的。
式1的非盐化合物的盐可以使用相对无毒的酸或碱制备，这取决于具体起始“母体”化合物。具有相对酸性功能性的母体化合物的碱加成盐可以通过用足量的期望碱(纯的或在合适的惰性溶剂中)接触这种化合物的游离酸形式来制备。可药用碱加成盐的实例包括钠盐、钾盐、钙盐、铵盐、有机氨盐、镁盐等。具有相对碱功能性的母体化合物的酸加成盐可以通过用足量的期望酸(纯的或在合适的惰性溶剂中)接触这种化合物的游离碱形式来获得。可药用酸加成盐的实例包括来源于如下无机酸的那些，比如盐酸、氢溴酸、硝酸、碳酸、一氢碳酸、磷酸、一氢磷酸、二氢磷酸、硫酸、一氢硫酸、氢碘酸或亚磷酸等，以及来源于如下相对无毒的有机酸的盐，比如乙酸、丙酸、异丁酸、马来酸、丙二酸、苯甲酸、琥珀酸、软木酸、富马酸、扁桃酸、邻苯二甲酸、苯磺酸、对-甲苯磺酸、柠檬酸、酒石酸、甲磺酸等。
式1的化合物可以是包括一种或多种(例如两种或多种、三种以上、四种以上等)不同的式1化合物的组合物。作为举例，所述组合物可以包含化合物1.1-1.4(表1)的一种或多种、两种或多种、三种以上或全部四种。在一个实施方案中，以当量比计，所述组合物在每克组合物中含有约100-200mg(例如，约150mg)的化合物1.1、约50-100mg(例如约60mg)的化合物1.2、约1-5mg(例如约2mg)的化合物1.3、和/或约5-20mg(例如约10mg)的化合物1.4/、或其它量的化合物1.1-1.4。
尽管一种或多种式1的化合物或包括其的组合物不受特定纯度的限制，但是在某些实施方案中，一种或多种式1的化合物具有相对高水平的纯度。例如，一种或多种式1的化合物可以具有的纯度为约80%或以上、约85%或以上、约90%或以上、约99%或以上。
式1的化合物可以以任何有效量使用。在某些实施方案中，一种或多种式1的化合物(分别或一起)的使用浓度约为0.2μM以上(例如约0.5μM以上或约0.8μM以上)，比如约1μM以上(例如约2μM以上、约5μM以上、或约8μM以上)，或者甚至约10μM以上(例如约12μM以上、约15μM以上或约20μM以上)。
组合物包含高良姜提取物、其精制部位、或一种或多种如上所述式1的化合物，也可以进一步包含其它活性组分。例如，组合物可以包括从高良姜中分离的其它活性成分，或者本领域已知用于治疗神经变性或神经病理性病症的其它试剂。
组合物包括高良姜提取物、其精制部位或一种或多种如上所述式1的化合物，也可以包括任何合适的载体或赋形剂，理想的是可药用载体或赋形剂。载体或赋形剂可以是通常使用的那些中的任一种，且仅仅受物理化学考虑事项的限制，比如溶解性和与活性化合物缺乏反应性及给药途径。根据一个实施方案，组合物包括环糊精。
存在多种用于本发明方法的药物组合物的合适制剂，例如口服制剂、气雾剂、或肠胃外(例如皮下、静脉内、动脉内、肌内或腹膜内)制剂。适于口服给药的制剂可以包含(a)液体溶液，比如溶于稀释剂比如水、生理盐水或橙汁中的有效量的抑制剂；(b)胶囊、小药囊、片剂、锭剂和糖锭剂，各自包含预定量的活性成分，呈固体或颗粒；(c)粉剂；(d)在合适的液体中的混悬剂；和(e)合适的乳剂。液体制剂可以包括稀释剂，比如水和醇类，例如乙醇、苯甲醇和聚乙烯醇，有或没有加入可药用表面活性剂。胶囊形式可以是普通硬壳或软壳明胶类型的，包含例如表面活性剂、润滑剂、和惰性填料比如乳糖、蔗糖、磷酸钙和玉米淀粉。片剂形式可以包括乳糖、蔗糖、甘露醇、玉米淀粉、马铃薯淀粉、海藻酸、微晶纤维素、阿拉伯胶、明胶、瓜尔胶、胶态二氧化硅、交联羧甲纤维素钠、滑石粉、硬脂酸镁、硬脂酸钙、硬脂酸锌、硬脂酸及其它赋形剂、着色剂、稀释剂、缓冲剂、崩解剂、润湿剂、防腐剂、调味剂和药理学相容赋形剂的一种或多种。锭剂形式可以包括在调味剂中的活性成分，所述调味剂通常为蔗糖和阿拉伯胶或西黄蓍胶，以及软锭剂包括在惰性基质中的活性成分，所述惰性基质比如明胶和甘油、或蔗糖和阿拉伯胶，乳剂、凝胶剂等除了包括活性成分之外还包括本领域已知的这类赋形剂。
本发明的化合物和组合物单独或与其它合适的组分组合可以配制成经由吸入给药的气雾剂。这些气雾剂可以放入加压可接受的抛射剂中，比如二氯二氟甲烷、丙烷、氮气等。它们也可以配制成用于非加压制剂的药物，比如在喷雾器或喷雾器中。这样的喷雾剂也可以用于喷雾粘膜。
适于非肠道给药的制剂包括含水和非水的等渗无菌注射液，其可包含抗氧剂、缓冲剂、抑菌剂和使所述制剂与预期接受者的血液等渗的溶解物；和含水和非水的无菌混悬剂，其可包含助悬剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂和防腐剂。本发明的化合物和组合物可以以在药物载体中的生理学可接受稀释物中给药，所述载体比如无菌液体或液体混合物，包括水、生理盐水、含水右旋糖和相关糖溶液、醇类(比如乙醇、异丙醇或十六烷醇)、二醇类(比如丙二醇或聚乙二醇)、二甲亚砜、甘油缩酮(比如2,2-二甲基-1,3-二氧戊环-4-甲醇)、醚类比如聚(乙二醇)400、油、脂肪酸、脂肪酸酯或甘油酯或乙酰化脂肪酸甘油酯，其加入或不加入可药用表面活性剂比如肥皂或洗涤剂、助悬剂（比如果胶、卡波姆、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、或羧甲基纤维素）或乳化剂及其它药物助剂。
可用于非肠道制剂的油类包括石油、动物油、植物油或合成油。油类的具体实例包括花生油、大豆油、芝麻油、棉籽油、玉米油、橄榄油、矿脂油和矿物油。用于非肠道制剂的合适的脂肪酸包括油酸、硬脂酸和异硬脂酸。油酸乙酯和肉豆蔻酸异丙酯是合适的脂肪酸酯的实例。
用于非肠道制剂的合适的皂类包括脂肪碱金属、铵和三乙醇胺盐，且合适的清洁剂包括(a)阳离子洗涤剂，例如二甲基二烷基卤化铵和烷基吡啶鎓卤化物；(b)阴离子洗涤剂，例如烷基磺酸酯、芳基磺酸酯和烯烃磺酸酯，烷基硫酸酯、烯烃硫酸酯、醚硫酸酯和单甘油酯硫酸酯，和磺基琥珀酸酯；(c)非离子洗涤剂，例如脂肪胺氧化物、脂肪酸烷醇酰胺和聚氧乙烯聚丙烯共聚物；(d)两性洗涤剂，例如烷基-β-氨基丙酸酯和2-烷基咪唑啉季铵盐；和(e)其混合物。
所述非肠道制剂可存在于单位剂量或多剂量密封容器中，比如安瓿和小瓶，并且可以保存在冷冻干燥(冻干)的条件下，在使用前仅需要立即加入无菌液体赋形剂，例如注射用水。临时注射溶液和混悬剂可以由之前描述类型的无菌粉末、颗粒剂和片剂制备。
可选地，本文描述的化合物和组合物可以经修饰成储库形式，使得其中本发明的化合物释放进入体内，给药方式在体内的时间和位置受到控制。化合物和组合物的储库形式可以为例如包含化合物和多孔材料(比如聚合物)的可植入组合物，其中化合物被多孔材料包封或弥散在多孔材料内。然后，将储库植入到体内预定位置，通过从多孔材料扩散以预定速率从植入物中释放出化合物。
在某些情形中，本发明的化合物和组合物可以有利地经由能够鞘内递送的植入泵给药。当给药的药物以其它方式不能足够地穿透血脑屏障时，这样的递送方法对于将药物递送至中枢神经系统特别有用。
本文描述的化合物和组合物被认为对于治疗受试者中的神经变性疾病或神经病理性病症特别有用。在这方面，本发明提供一种用于治疗这样的疾病的方法，所述方法包括向受试者给药治疗有效量的所述化合物或组合物。
不希望受到任何特定理论或作用机制的束缚，据信本文描述的化合物和组合物至少能够特别地通过抑制细胞或组织(特别是神经、胶质细胞或包含这样的细胞的组织)中α-突触核蛋白的聚集和/或不溶性α-突触核蛋白聚集物的沉积，来对神经变性疾病或神经病理性病症发挥治疗效果。因此，在另一个方面，本发明提供一种抑制α-突触核蛋白的聚集活性的方法，其包括细胞或组织(特别是神经、胶质细胞或包含这样的细胞的组织)中α-突触核蛋白的聚集和/或不溶性α-突触核蛋白聚集物的沉积。所述方法包括本发明描述的化合物或组合物接触α-突触核蛋白蛋白质。可以通过任何合适的方法，比如通过向体外或体内的包含所述蛋白的细胞或组织(例如神经元或胶质细胞)给药所述化合物或组合物，使α-突触核蛋白接触所述化合物或组合物。当细胞或组织在体内时，向所述细胞或组织给药所述化合物或组合物可以通过向包含该细胞或组织的受试者给药所述化合物或组合物来实现。
抑制α-突触核蛋白蛋白质的聚集活性的方法可以采用包含该蛋白质的任何细胞或组织进行，特别是显示出α-突触核蛋白聚集或沉积(即，α-突触核蛋白蚀斑形成)的细胞或组织。这样的细胞和组织包括，例如受到特征为α-突触核蛋白聚集活性异常的病症烦扰的受试者的细胞，所述α-突触核蛋白聚集活性异常比如α-突触核蛋白聚集和/或不溶性α突触核蛋白聚集物沉积通常达到足够引起病理性作用的程度，并且其中抑制α-突触核蛋白聚集活性可以预防、抑制或改善该疾病的病理学或症候学。这样的病症被称为突触核蛋白病。
因此，在一个相关的方面，本文提供的化合物和组合物可以用于治疗突触核蛋白病的方法中。所述方法包括向受试者给药所述化合物或组合物。
更具体而言，神经变性疾病和神经病理性病症的非限制性实例包括，但不限于急性和慢性CNS病症，从神经病理性病症比如神经性疼痛、中风、脑外伤和癫痫到神经变性疾病比如肌萎缩性侧索硬化、阿尔茨海默病、帕金森病和亨廷顿氏疾病。突触核蛋白病的非限制性实例，其中许多或全部也可以被认为是神经变性疾病或神经病理性病症，包括帕金森症(PD)、路易体痴呆(DLB)、单纯性自主神经衰竭(PAF)、多系统萎缩(MSA)、阿尔茨海默病(AD)的路易体变型、哈勒沃登-施帕茨病、泛酰酸激酶联合的神经变性(PKAN)和神经变性伴脑部铁蓄积1型(NBIA1)。
对于本文描述的目的，α-突触核蛋白聚集的抑制或不溶性α-突触核蛋白聚集物沉积的抑制作用包括以任何程度减少，部分抑制和完全抑制。因此，例如，如果与在不存在本发明化合物或组合物下α-突触核蛋白的聚集或沉积水平相比，则该化合物或组合物的存在下，α-突触核蛋白蛋白质聚集或沉积以任何程度减少，则这样的α-突触核蛋白的聚集或沉积被认为受到抑制。理想地，α-突触核蛋白的聚集或沉积被抑制至足够改善其病理状态或某些症状至任何程度或消除其病理状态或某些症状的程度。
类似地，在本发明的内容中，如果疾病或病症的任何症状或其它特性特征以任何量改善或消除，则认为该疾病或病理学病症被治疗。因此，例如，与没有给药的同一受试者或类似的受试者相比，已经给药本发明的化合物或组合物的受试者中神经变性的程度或速率的降低被认为是该疾病或病症已经治疗达到某些程度的指征。类似地，受试者中疾病的生物标记(例如α-突触核蛋白聚集或蚀斑形成)的任何减少都是该疾病或病症已经治疗达到某些程度的指征。
本文描述的方法可以针对任何类型的宿主，比如动物，优选哺乳动物或人类来进行。例如，宿主可以为受到本文讨论的任何疾病或病症烦扰的人类。
在一个相关的方面，所述化合物和组合物可以用在制备用于治疗任何前述疾病或病症的药物的方法中。
下述实施例进一步阐述本发明，但是其不应当看作以任何方式限制本发明的范围。
实施例
材料和方法∶除非另有说明，在整个实施例中，使用下述材料和方法。
高良姜
第一批高良姜(Alpinia officinarum Hance,姜科)(AO)的根茎是在中国广东省栽培的，并且在2000年8月购自四川省药材公司(中国成都)。第二批高良姜2009年8月采集于中国广东省徐闻县龙塘镇。
总提取物的制备∶
首先，将高良姜(200g)的根茎干燥，并浸泡在1.5L70%乙醇(材料与溶剂的比例为1：5-10)中30分钟。然后，将草药-溶剂混合物回流提取3次，每次2小时。过滤提取物，并将滤液蒸发至干，得到18g的总提取物(TE)。
首先，将风干的高良姜根茎(8.0kg)干燥，并浸泡在40L70%乙醇(材料与溶剂的比例为1：8)中30分钟。然后，将草药-溶剂混合物回流提取3次，每次2小时。过滤提取物，并将滤液蒸发至干，得到700g的总提取物(TE)。
精制部位(CF、BU、WA、BU2、BU3、WA2、BU2-2、BU2-3、BU3-3)的制备：
将总提取物(TE，6.6g)溶解/悬浮在水(材料和水的比例为1:5-10)中，接着用1：1体积比的氯仿(CF)和水饱和的丁醇(BU)分别依次萃取。重复采用每种不同溶剂萃取3次，将溶剂萃取物过滤并干燥，得到部位CF(3.0g)、BU(1.5g)和水(WA，1.9g)。将500mg的BU溶于1mL MeOH中，并滴加至50mL包含1.2g硅胶的烧瓶中。将样品在室温下风干，然后加入到硅胶柱(30g硅胶，柱直径3cm和体积50mL)中。将该柱最初用250mL的5%甲醇和二氯甲烷(MeOH/DCM)洗脱，接着用200mL的15%MeOH/DCM洗脱，最后用200ml的MeOH/DCM/H2O(1:1:0.1)洗脱。收集总共41个洗脱流份，基于TLC检测结果合并，并在真空下干燥得到三个洗脱流份，包括BU1(178mg)、BU2(50mg)和BU3(135mg)。接着，将BU3溶于甲醇中，并与硅胶(Merck70-200目)按样品：硅胶为1:3的比例混合。填装样品5-10倍量的硅胶柱，并使用不同比例的氯仿、甲醇和水的梯度系统(即，CHCl3/MeOH(1:1)，CHCl3/MeOH(3:7)，CHCl3/MeOH/H2O(60:40:0.1))进行柱洗脱。对于每种溶剂条件，使用的体积范围为柱体积的2至5倍。收集洗脱流份，基于TLC检测结果合并，并在真空下干燥，得到BU3-1、BU3-2和BU3-3。将水萃取物(WA，1.9g)溶于6mL水中，然后进行大孔树脂D101柱层析(60g，D101柱直径4cm和体积120mL)，用水、50%乙醇、96%乙醇洗脱。将洗脱的溶剂在真空下浓缩，得到三个洗脱流份，包括WA1(0.80g)、WA2(0.90g)和WA3(0.15g)。
将总提取物(TE，700g)溶解/悬浮在1500mL的水中，接着用1：1体积比的氯仿(CF)和水饱和的丁醇(BU)萃取。每种不同溶剂分别萃取5次，将溶剂提取物过滤，并干燥，得到部位CF(120g)、BU(150g)和水(WA，400g)。
将一部分BU部位(18.0g)溶于18mL甲醇中，并滴加至250mL包含18.0g硅胶的烧瓶中。将样品在室温下风干，接着进行硅胶柱层析(360g硅胶，柱直径5cm和体积800mL)，使用阶式梯度洗脱：比例为19:1:0(2000mL)、17:3:0(1.6L)和10:10:1(1.6L)的二氯甲烷、甲醇和水，得到三个洗脱流份，包括BU1(5.5g)、BU2(3.8g)和BU3(7.3g)。将BU2(2.0g)经硅胶柱进一步层析，使用阶式梯度：比例为20:1(800mL)、10:1(800mL)和5:1(800mL)的氯仿和甲醇洗脱，得到BU2-1(400mg)、BU2-2(1010mg)和BU2-3(500mg)。接着，将一部分BU3(5.0g)溶于8.0mL甲醇中，并与硅胶(Merck70-200目)按照样品：硅胶比例为1:1混合，之后将混合的BU3经硅胶柱(200g硅胶，柱直径5cm和体积400mL)进一步层析，并用不同比例的氯仿、甲醇和水的梯度系统(即，CHCl3/MeOH(1:1，1000mL)、CHCl3/MeOH(3:7，1000mL)、CHCl3/MeOH/H2O(60:40:0.1，1000mL))洗脱。收集洗脱流份，基于TLC检测结果合并，并在真空下干燥，得到BU3-1(1.2g)、BU3-2(2.6g)和BU3-3(1.1g)。.
将WA提取物(250g)进一步进行大孔树脂D101柱(2.5Kg)层析，用水(52L)、50%乙醇(18L)和95%乙醇(11L)洗脱进行进一步分离，得到来自WA萃取物的三个流份：WA1(水洗脱，100g)，WA2(50%乙醇洗脱，120g)和WA3(95%乙醇洗脱，11.5g)。
α-突触核蛋白聚集测定：
在室温下，在1x Tris-缓冲生理盐水(1x TBS:20mM Tris，pH7.5；500mM NaCl，采用HCl调节pH7.5)中，将重组α-突触核蛋白(7μg)与样品培养7天。在培养之后，根据制造商的说明，采用Bio-DotSF Microfiltration Apparatus(Bio Rad)过滤样品。在过滤之后，通过采用抗-α-突触核蛋白抗体的蛋白质印迹分析测定俘获的α-突触核蛋白的量。
在6-OHDA的存在下重组α-突触核蛋白聚集测定：
在37℃下，在有或没有AOBU(320μg)下，将重组人α-突触核蛋白(1μg)与6-OHDA(50μg)培养1-4hr，不需要振摇。然后，将样品与1XSDS缓冲液混合，并在100℃下煮沸5分钟。将蛋白质样品溶解在8%聚丙烯酰胺凝胶中，并转移到硝基纤维素膜上。采用抗-α-突触核蛋白单克隆抗体(BD转导)进行蛋白质印迹分析。将等量的蛋白质填充到每个泳道中。
SH-SY5Y培养物和抗MPP+(1-甲基-4-苯基吡啶鎓)的存活测定：
SH-SY5Y细胞系是一种表达酪氨酸羟化酶和多巴胺转运蛋白活性的人成神经瘤细胞系(从ATCC获得)，将其保持在包含10%胎牛血清的MEM中。将细胞以1x105细胞/孔的密度铺在48-孔板(NUNC)上过夜。将SH-SY5Y细胞用AO总提取物和不同部位萃取物预处理2小时，之后进行MPP+处理。使用30μM表没食子儿茶精没食子酸盐(EGCG；Sigma)作为阳性对照。在2小时预处理之后，将细胞与AO样品和50μM MPP+共同处理72小时。测定细胞存活率，并使用MTT(3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑溴化物，USBCorporation)比色法测定定量。
神经元培养物和抗NMDA(N-甲基-D-天冬氨酸)的神经元存活测定：
由18天(E18)的胚胎Sprague-Dawley大鼠制备原代皮层神经元。使用补充有2%B27(Invitrogen)的Neurobasal培养基(Invitrogen)，将神经元以1.1x105细胞/孔的密度铺在48-孔板(NUNC)上。在体外用AO萃取物和组份预处理11-12天的神经元2hr，之后进行NMDA处理。使用10μM美金刚(Sigma)作为阳性对照。在药物处理之后，用洛克溶液(5mM氯化钾、128mM氯化钠、2.7mM氯化钙、1mM正磷酸氢二钠、5mM HEPES和10mM葡萄糖的Milli-Q水溶液)洗涤神经元，并用洛克溶液加甘氨酸(10μM)再培养15分钟。在培养之后，将神经元与AO提取物或不同部位提取物(溶于洛克溶液加甘氨酸溶液中)和NMDA(20μM；Sigma)共同处理20分钟。测定神经元损伤的量，并使用乳酸脱氢酶释放测定(Roche)进行定量。
注射6-OHDA的小鼠PD模型
将6-OHDA(50μg，Sigma)或相同量的溶媒(L-抗坏血酸，Sigma)注射到雄性C57B/6小鼠(10-12周龄)的脑室中。注射6-OHDA之前1小时，腹腔给药地昔帕明(25mg/kg)阻断去甲肾上腺素重吸收，，来保护非多巴胺能神经元的神经元。用水合氯醛(400mg/kg，i.p.)麻醉小鼠，并将小鼠置于立体定位框架控制器中。将6-OHDA以10μg/μL的浓度溶解在包含0.2%抗坏血酸的生理盐水中，并按照0.5μL/分钟的速率注射。在注射之后，将针(Hamilton)留在原位7分钟，之后抽出。使用下述坐标进行注射：距前囟前后方向0.5mm和中侧1.0mm，距头盖骨背腹侧2.0mm。
动物脑组织的生物化学组份
解剖脑组织的不同部分，称重，并在3mL/g的氚核X-100缓冲液(10mM Tris-HCl[pH7.6]、150mM NaCl、1%Triton X-100和蛋白酶抑制剂)中匀浆化。在4℃以15,000×g离心0.5小时之后，将上清液标记为“Triton可溶组份”。用1mL/g的0.1%SDS缓冲液(10mMTris-HCl[pH8.0]、150mM NaCl、1%Triton X-100、0.5%脱氧胆酸钠和0.1%SDS)再萃取沉淀物，在4℃以15,000×g离心0.5小时分馏，并将上清液标记为“SDS-可溶组份”。将沉淀物在含有5%β-巯基乙醇的3%SDS中(1mL/g沉淀物)再悬浮、溶解和煮沸，将溶解产物称为“SDS-不溶组份”。将与原始脑重量成比例的量装入到单独的道中，并转移到硝基纤维素膜。将该膜与酪氨酸羟化酶(TH，1:4000，Millipore)的抗体和β-肌动蛋白(1:2000，Sigma)培养。然后，用HRP-结合的二级抗体(1:4000，Cell signaling technology)培养印迹，接着进行化学发光检测(ECL；Amsersham)。
部位AOBU中的化合物组合物的测定
HPLC条件：采用HPLC-DAD方法分析和质量控制AOBU部位和标准化合物。所有的分析在600泵、717自动进样器和UV/VIS光电二极管阵列2996检测器组成的Waters HPLC系统下进行。在室温下，在SunFire C18柱(粒径5μm，4.6mm×150.0mm)上进行色谱分离，流动相为乙腈(溶剂A)和水(溶剂B)，流速1.0mL/min。采用梯度洗脱，从0到48分钟使用10%至85%溶剂A(0-40分钟，10%～85%ACN；40-45分钟，85%ACN；45-48分钟，85%～10%ACN)。将样品溶于MeOH中，用0.45μm Millipore滤过，注入20微升的样品进行HPLC分析。
实施例1
下述实施例举例说明了高良姜提取物抑制α-突触核蛋白聚集的用途。
如在材料和方法中描述的制备高良姜(AO)的总提取物(TE)。然后，在室温下，用该提取物(10或50μg)培养在TBS中的纯GST-α突触核蛋白7天。在培养之后，根据制造商的说明，采用Bio-Dot SF Microfiltration Apparatus(Bio Rad)过滤样品。在过滤之后，通过蛋白质印迹分析测定俘获的α-突触核蛋白的量，一式三份，结果显示在图1中。
如图1所示，当与溶媒处理的对照相比，高良姜总提取物(AOTE)具有强的抑制α-突触核蛋白聚集活性。而且，高良姜总提取物(AOTE)的抗聚集活性是剂量依赖性的，比公认的抗聚集化合物刚果红更有效(图1)。
实施例2
下述实施例举例说明了高良姜的丁醇和水部位抑制α-突触核蛋白聚集的用途。
为了鉴定AO中的抗聚集活性组分，使用氯仿(CF)、丁醇(BU)和水(WA)进一步细分AO的总提取物。采用α-突触核蛋白(7μg)重组蛋白质培养每个部位(50μg)7天。进行测定，一式三份，并重复至少2次。如实施例1描述的检测蛋白质，结果显示在图2中。
如结果所示，发现活性组分大多存在于BU部位中，且在WA部位中存在的较少.发现CF部位对于抗聚集活性没有影响。
实施例3
下述实施例举例说明AO提取物的其它流份对α-突触核蛋白聚集活性的影响.
采用连续的不同浓度乙醇洗脱的柱层析，将来自实施例2的AO的丁醇(BU)和水(WA)部位进一步细分成3个流份。采用α-突触核蛋白(7μg)重组蛋白质培养每种流份(10-50μg)7天。进行测定，一式三份，并重复至少2次。如实施例1描述的检测蛋白质，结果显示在图3中。
如结果所示，在BU2、BU3、WA2和WA3中发现了AO的活性组分。发现的活性组分为BU2和BU3(丁醇流份2和3)、WA2和WA3(水流份2和3)。当在相同剂量下比较时，BU2和WA2显示出比TE更好的抗聚集作用。
实施例4
下述实施例举例说明AO总提物之丁醇萃取物的其它精制流份对α-突触核蛋白聚集活性的影响。
通过使用柱层析，将来自实施例3的AO提取物的BU2和BU3流份进一步分成3个流份。采用α-突触核蛋白(7μg)重组蛋白质将流份BU2-1、BU2-2、BU2-3(10或50μg)、BU3-1、BU3-2和BU3-3(20μg)分别培养7天。进行蛋白质印迹分析，以检测聚集的α-突触核蛋白，一式三份，并重复至少2次。结果显示在图4中。
如结果所示，在AO的BU2-2、BU2-3和BU3-3中发现了活性组分。
实施例5
下述实施例举例说明了高良姜的总提取物保护SH-SY5Y细胞抗MPP+兴奋毒性的用途。
通用的PD细胞模型包括使用带正电荷的分子1-甲基-4-苯基吡啶鎓(MPP+)，其具有化学式C12H12N+，其为神经毒素1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢-吡啶(MPTP)在脑内被胶质细胞的酶MAO-B转化的产物。MPTP在灵长类中引起帕金森样症状，并诱导黑质中多巴胺产生神经元的细胞死亡。向SH-SY5Y细胞中加入MPP+会导致细胞死亡。因此，其为一种用于证实药物候选物对于PD治疗功效的有用的模型。
将SH-SY5Y细胞用各种浓度的总提取物(TE,μg/mL)预处理2小时，接着与MPP+(50μM)共同处理。在培养3天之后，进行MTT测定。进行测定，一式两份，并重复至少2次。结果呈现在图5中，以与没有MPP+处理(设定为100%存活率)下的对照百分比来表示结果。进行与DMSO处理的对照相比较的统计分析(t检验)，其中*=P<0.05，**=P<0.005。
如结果所示，30和50μg/mL的AO总提取物保护SH-SY5Y细胞免于MPP+兴奋毒性。
实施例6
下述实施例举例说明了AO的丁醇和水部位保护SH-SY5Y细胞抗MPP+兴奋毒性的用途。
将SH-SY5Y细胞用各种浓度的氯仿(CF)、丁醇(BU)和水(WA)部位(参见其它实施例)预处理2小时，接着与MPP+(50μM)共同处理。使用30μM的表没食子儿茶精3-没食子酸盐(EGCG)作为阳性对照。在培养3天之后，进行MTT测定。进行测定，一式两份，并重复至少2次。以与没有MPP+处理(设定为100%存活率)的对照百分比来显示结果。进行与DMSO处理的对照的统计分析(t检验)。*=P<0.05，**=P<0.005。
如图6所示，10μg/mL的丁醇部位(BU)和10-50μg/mL的水部位(WA)保护SH-SY5Y细胞抗MPP+兴奋毒性。虽然AO的总提取物(TE)在10μg/mL下没有任何抗MPP+兴奋毒性的细胞保护作用，但是WA和BU在10μg/mL下显示出显著的保护作用，表明所述部位比总提取物(TE，图5)更有效。
实施例7
下述实施例举例说明了高良姜的总提取物保护原代皮层神经元抗NMDA兴奋毒性的用途。
谷氨酸毒性代表PD中继发性显著的神经元细胞死亡。向原代皮层神经元中加入NMDA，通过激活NMDA亚型谷氨酸受体导致细胞凋亡。因此，其为一种证实靶向谷氨酸毒性以治疗PD的候选药物功效的有用的模型。
将大鼠原代神经元用总提取物(TE,μg/mL)预处理2小时，之后与NMDA共同处理20分钟。24小时之后，测量细胞死亡，并采用LDH测定检测。进行测定，一式两份，并重复至少2次。使用单向ANOVA，与溶媒(DMSO)处理的对照相比较的细胞死亡百分比表示结果，如图7所示。***=P<0.005。使用10μM的美金刚作为阳性对照。
如结果所示，AO的总提取物(TE，10μg/mL)显著地保护原代大鼠皮层神经元免于NMDA-诱导的细胞死亡。
实施例8
下述实施例举例说明了总高良姜提取物的不同部位保护原代皮层神经元抗NMDA兴奋毒性的用途。
将AO的总提取物进一步分成3个部位，氯仿(CF)、丁醇(BU)和水(WA)(之前的实施例)。将大鼠原代神经元用氯仿部位(CF,μg/mL)、丁醇部位(BU,μg/mL)和水部位(WA,μg/mL)预处理2小时，之后与NMDA共同处理20分钟。然后，在24小时之后测量细胞死亡，并通过LDH测定检测。进行测定，一式两份，并重复3次。结果以与溶媒(DMSO)-处理的对照相比较的细胞死亡百分比表示。使用单向ANOVA，进行统计分析。**=P<0.01，***=P<0.005。
如结果所示，1和10μg/mL的CF部位及10μg/mL的BU部位保护原发性皮层神经元抗NMDA-诱导的细胞死亡。
实施例9
下述实施例举例说明在α-突触核蛋白过度表达的SH-SY5Y细胞中，高良姜提取物的丁醇和水部位抑制α-突触核蛋白聚集的用途。
采用WT-α-类似物或突变体α类似构建物瞬间转染SH-SY5Y细胞48小时。然后，用100μg/mL的总AO提取物(AOTE)、丁醇部位(AOBU)或水部位(AOWA)处理细胞(参见其它实施例)。将细胞溶解产物负载在过滤器俘获测定元件上，并通过蛋白质印迹分析检测α-突触核蛋白聚集。结果显示在图9中。
如图9所示，与对照相比，用100μg/mL的AOTE、AOBU和AOWA处理减少了聚集的α-突触核蛋白。
实施例10
下述实施例举例说明使用高良姜提取物的丁醇部位(AOBU)减少了6-羟基多巴胺(6-OHDA)诱导的α-突触核蛋白的低聚体。
6-OHDA是一种引起黑质中多巴胺能神经元退化且损害纹状体神经末梢的有效神经毒素(Breese和Traylor，J.Pharmacol.Exp.Ther.，174:413-420(1970))。已经在帕金森病疾病患者的尿中发现了6-OHDA(Andrew等，Neurochem.Res.，18:1175-1177(1993))。6-OHDA的毒性包括产生活性氧簇，因为它可以自氧化形成半醌和过氧化物阴离子。然而，不局限于ROS理论，有报道表明在体外6-OHDA促进α-突触核蛋白的聚集(Alves da Costa等，J.Biol.Chem.，281:9824-9831(2006))。
进一步测定AOBU(之前的实施例)对6-OHDA-诱导的α-突触核蛋白聚集的抑制作用。在37℃和没有振摇下，用6-OHDA(50μg)和或不和AOBU(320μg)培养重组人α-突触核蛋白(1μg)。将样品分别装到8%聚丙烯酰胺凝胶的泳道中，接着电泳转移到硝基纤维素膜上，采用抗-α-突触核蛋白单克隆抗体进行蛋白质印迹分析。将等量的蛋白质装到每个泳道中。6-OHDA的使用量相当于施用于老鼠的脑室内(i.c.v.)注射的量。结果呈现在图10中。
如图10所示，6-OHDA逐渐地诱导重组人α-突触核蛋白的低聚化。在用6-OHDA培养4小时之后，形成高分子量α-突触核蛋白聚集物。用AOBU共同处理抑制高分子量α-突触核蛋白聚集物的形成。结果表明在体外AOBU抑制6-OHDA诱导的较高分子量α-突触核蛋白聚集物的形成。
实施例11
下述实施例举例说明高良姜提取物的丁醇部位(AOBU)恢复注射6-OHDA小鼠中TH损失的用途。
6-羟基多巴胺(6-OHDA)是一种天然多巴胺能毒素。在将6-OHDA(50μg)立体定位注射到3月龄C57B/6小鼠的脑室之前5天和之后3天，每天采用AO的丁醇部位(AOBU)(i.p.，10或100mg/kg)处理这些小鼠。在手术之后3天，收集纹状体，并抽出蛋白质进行分析。通过蛋白质印迹分析测定酪氨酸羟化酶(TH)的损失(图11)。
TH是负责催化氨基酸L-酪氨酸转化成多巴胺前体二羟苯丙氨酸和充当多巴胺能神经元的指征的酶。蛋白质印迹分析显示当与注射抗坏血酸的小鼠(作为对照小鼠)相比，来自注射6-OHDA小鼠的纹状体的TH蛋白质表达显著减少。然而，采用10mg/kg或100mg/kg的AOBU处理恢复了这些小鼠的TH水平。
实施例12
下述实施例举例说明高良姜提取物的水部位(AOWA)恢复注射6-OHDA小鼠中TH损失的用途。
使用AO的水部位(AOWA，根据其它实施例制备)代替丁醇部位(AOBU)基本上重复实施例11中描述的实验。特别地，在将6-OHDA(50μg)立体定位注射到3月龄C57B/6小鼠的脑室之前5天和之后3天，每天采用AO的水部位(AOWA)(i.p.，10或100mg/kg)处理这些小鼠。在手术之后3天，收集纹状体。通过蛋白质印迹分析测定TH的损失(图12)。结果表明10mg/kg或100mg/kg的AOWA处理恢复了这些小鼠的TH水平。
实施例13
下述实施例举例说明了高良姜提取物的活性丁醇部位(AOBU)的化学组成。
干燥的高良姜(姜科)根茎2009年8月采收于中国广东省徐闻县龙塘镇。干燥的高良姜根茎(8.0Kg)用70%EtOH水溶液(40L，每次2hr)回流提取三次。将70%乙醇提取物减压浓缩，得到总提物(TE，700g)。将总提物悬浮在H2O(1500mL)中，然后分别用氯仿(1500mL×5)和正丁醇(1500mL×5)连续萃取。蒸发这些溶液，得到总共120g的氯仿萃取物(CF)、150g正丁醇萃取物(BU)和400g的水萃取物(WA)。
一部分BU(60g)进行硅胶柱层析(7×40cm)，使用如下比例的二氯甲烷、甲醇和水的梯度洗脱：100:1:0(2.0L)，50:1:0(4.0L)，20:1:0(4.0L)，10:1:0(4.0L)，5:1:0(4.0L)，3:1:0(2.0L),和10:10:1(2.0L)，得到66个洗脱流份。根据TLC检测结果，将这些流份合并，得到8个次级流份(Fr.A～Fr.H)。使用反复柱层析(硅胶或Sephadex LH-20，最后采用制备HPLC纯化)分离来自流份A的化合物1.1(800mg)、1.2(26mg)和1.3(16mg)，和来自流份D的化合物1.4(12mg)。HPLC层析谱显示在图13中。
根据1H NMR、13C NMR、DEPT和2D NMR分析以及化学试验解析了这些化合物的结构(参见图14)。表2和3显示了化合物1.1-1.4的1H和13C NMR数据在。
表2
表3
本说明书中引用的所有参考文献，包括出版物、专利申请和专利，都以如同每个参考文献分别或特别地指出引入本文并在本文中列出全部内容一样并入作为参考。
在描述本发明的上下文中（特别是在下述权利要求书的内容中）的使用的术语“一个”和“所述的”及类似指示词将被解释为包括单数和复数，除非本文中另有说明或与上下文有明显的矛盾。除非另有说明，术语“包括”和“包含”应当看作是开放式的术语(即意味着“包括，而不限于”）。除非本文另有说明，本文中数值范围的列举仅仅意味着充当分别指出属于所述范围的各个单独值的简写方法，并且将各个单独值如同其分别在本文中列举一样并入说明书中，除非本文另有说明或者与上下文明显相矛盾，本文描述的所有方法都可以以任何合适的顺序进行。除非另有说明，本文提供的任何或所有的实例、或示例性术语(例如“比如”）的使用意味着仅仅为了更好地阐述本发明，而不造成对本发明范围的限制。在说明书中没有术语应当看作是指示任何作为实施本发明所必需的未提出要求的部分。
本文中描述了本发明的优选的实施方案，包括发明人已知用于实施本发明的最佳方式。根据阅读前面的描述，这些优选实施方案的变化对本领域普通技术人员而言变得显而易见。本发明人预期本领域技术人员可酌情实施这样的变化，并且本发明人打算按照除了本文特别地描述的之外的方式实施本发明。因此，如适用法律所允许的那样，本发明包括在所附权利要求书中列举的主题的所有变体和同等物。此外，所有可能变体形式的上述元素的任意组合都被本发明所涵盖，除非本文中另有说明或明显与本文内容矛盾。

Claims (3)

1.药物组合物在制备用于治疗受试者中帕金森病的药物中的应用，所述组合物由高良姜提取物和可药用载体或赋形剂组成，所述高良姜提取物由高良姜的醇可溶性部分组成。
2.权利要求1所述的应用，其中所述组合物由所述高良姜提取物的精制部位和可药用载体或赋形剂组成，所述精制部位为用丁醇对所述高良姜提取物进一步提取得到的丁醇部位或用水对所述高良姜提取物进一步提取得到的水部位。
3.权利要求1所述的应用，其中所述醇可溶性部分包含下表1中的化合物1.1、1.2、1.3和1.4中的一种或多种：
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