CN103194514A

CN103194514A - 一种双酶分步水解制备甜高粱籽蛋白ace抑制肽的方法及其产品和应用

Info

Publication number: CN103194514A
Application number: CN2013101123625A
Authority: CN
Inventors: 吴琼英; 贾俊强; 颜辉
Original assignee: Jiangsu University of Science and Technology
Current assignee: Jiangsu University of Science and Technology
Priority date: 2013-04-02
Filing date: 2013-04-02
Publication date: 2013-07-10
Anticipated expiration: 2033-04-02
Also published as: CN103194514B

Abstract

本发明涉及一种双酶分步水解制备甜高粱籽蛋白ACE抑制肽，其制备方法为：将甜高粱籽粉碎后配制成悬浮液，利用淀粉酶辅助提取甜高粱籽蛋白，然后将甜高粱籽蛋白配成溶液，调其pH后依次分别用α-胰凝乳蛋白酶和中性蛋白酶进行酶解，酶解产物经浓缩和喷雾干燥后，即得到粉末状甜高粱籽蛋白ACE抑制肽产品。本发明具有生产时间短、操作方便、原料来源广泛及价格低廉、甜高粱籽蛋白ACE抑制肽抑制活性高等优点，产品符合功能食品要求。

Description

一种双酶分步水解制备甜高粱籽蛋白ACE抑制肽的方法及其产品和应用

技术领域

本发明涉及生物工程领域，可用于功能性食品添加剂的开发，具体涉及一种双酶分步水解制备甜高粱籽蛋白ACE抑制肽的方法及其产品和应用。

背景技术

甜高粱是高粱的一个变种，它起源于非洲，具有抗旱、耐涝、耐盐碱、耐瘠薄等特性，因此在我国各地都有种植。中国甜高粱分布较广泛，主要分布在西北、华北、东北、东南、华东和华中地区，从云南到黑龙江，从上海到新疆都有栽培。甜高粱秸秆含有大量糖类物质，主要用于制备生物能源—酒精，该生产过程中的副产物甜高粱穗没有得到有效利用（专利“用甜高粱秸杆制取乙醇的方法，公开号CN101024848A”和“一种用甜高粱秸杆制备乙醇的方法，公开号CN101343647A”）。甜高粱穗中的籽粒含有较高的蛋白质，蛋白质含量约为13%（w/w），必需氨基酸在总氨基酸含量中约占41%（w/w），蛋白营养价值较高，另外，甜高粱籽蛋白中脯氨酸、芳香族氨基酸和疏水性氨基酸含量高，分别占到总氨基酸约4.4％（w/w）、9.0％（w/w）和39.2％（w/w）左右，根据ACE抑制肽的构效关系，这些氨基酸在ACE抑制肽活性方面起到重要作用。由此可知，甜高粱籽蛋白能被用于生产高活性ACE抑制肽。

ACE是血管紧张素转化酶，ACE抑制肽是一种生物活性肽，能够调节高血压病人的血压，且无毒副作用，是近年来天然药物研究领域的热点之一，现已有大量的食源ACE抑制肽被发现，如：草鱼蛋白ACE抑制肽（Chen J, Wang Y, Zhong Q, et al. Purification and characterization of a novel angiotensin-I converting enzyme (ACE) inhibitory peptide derived from enzymatic hydrolysate of grass carp protein[J]. Peptides, 2012, 33(1): 52-58.）、鱿鱼明胶ACE抑制肽（Alemán A, Giménez B, Pérez-Santin E, et al. Contribution of Leu and Hyp residues to antioxidant and ACE-inhibitory activities of peptide sequences isolated from squid gelatin hydrolysate[J]. Food Chemistry, 2011, 125(2): 334-341.）和乳清蛋白ACE抑制肽（Pan D, Cao J, Guo H, et al. Studies on purification and the molecular mechanism of a novel ACE inhibitory peptide from whey protein hydrolysate[J]. Food Chemistry, 2012, 130(1): 121-126.）等。而利用甜高粱籽蛋白制备ACE抑制肽的鲜见报道，特别是利用双酶分步水解制备甜高粱籽蛋白ACE抑制肽的研究未见报道。

发明内容

发明目的：本发明的目的是提供一种双酶分步水解制备甜高粱籽蛋白ACE抑制肽的方法，本发明能够克服单酶水解位点不足，混合酶水解相互干扰以及ACE抑制肽不能有效释放等缺点，而该方法国内外尚无报道。

技术方案：为了实现上述目的，本发明的一种双酶分步水解制备甜高粱籽蛋白ACE抑制肽的方法，其特征在于包括以下步骤：

1）将甜高粱籽进行粉碎，然后用蒸馏水配制成甜高粱籽粉的质量百分数为5％～10％的悬浮液；

2）将5000～10000U/g淀粉酶加入悬浮液中50℃～70℃酶解3h～4h，酶解结束后，将悬浮液的pH调至8.0～9.5，搅拌30min后离心，取上清液，调其pH至4.0～4.5，静置30min后离心，收集沉淀，将沉淀溶于蒸馏水中，调pH至中性后经真空浓缩装置浓缩和喷雾干燥得到甜高粱籽蛋白粉；

3）将甜高粱籽蛋白粉配成质量百分数为1％～4％的溶液，调pH至7.0～8.0，加入2000～4000U/gα-胰凝乳蛋白酶，在40℃～50℃下第一次酶解20～30min，第一次酶解结束后沸水浴灭酶得到混合液，将混合液的pH调至6.0～7.0，加入2000～4000U/g中性蛋白酶，在50℃～60℃下第二次酶解40～60min，第二次酶解结束后沸水浴灭酶，离心收集上清液，上清液经真空浓缩装置浓缩至固型物的质量百分数为5%-15％，用喷雾干燥后，得到粉末状甜高粱籽蛋白ACE抑制肽。

所述步骤1）中甜高粱籽粉的质量百分数为8％。

所述步骤2）中将7500U/g淀粉酶加入悬浮液中60℃酶解3.5h，酶解结束后，将悬浮液的pH调至9.0，搅拌30min后离心，取上清液，调其pH至4.2，静置30min后离心，收集沉淀，将沉淀溶于蒸馏水中，调pH至中性后经真空浓缩装置浓缩和喷雾干燥得到甜高粱籽蛋白粉。

所述步骤3）中取20g甜高粱籽蛋白粉，质量百分数为2％的溶液，调pH至7.5，加入3000U/gα-胰凝乳蛋白酶在45℃下第一次酶解25min，第一次酶解结束后沸水浴灭酶得到混合液，将混合液的pH调至6.5，加入3000U/g中性蛋白酶，在55℃下第二次酶解50min，第二次酶解结束后沸水浴灭酶，离心收集上清液，上清液经真空浓缩装置浓缩至固型物质量百分数为10％，用喷雾干燥，得到粉末状甜高粱籽蛋白ACE抑制肽。

所述甜高粱籽蛋白ACE抑制肽的IC₅₀值为0.261～0.552mg/mL。

所述的双酶分步水解制备的甜高粱籽蛋白ACE抑制肽在抑制肽活性研究方面的应用。

采用乙酸乙酯萃取—比色法测定甜高粱籽蛋白ACE抑制肽的抑制活性（Muguerza B, Ramos M, Sánchez E, et al. Antihypertensive activity of milk fermented by Enterococcus faecalis strains isolated from raw milk [J]. International Dairy Journal, 2006, 16(1): 61 -69.），具体方法如下：

将10 μL甜高粱籽蛋白ACE抑制肽溶液与10 μL ACE溶液在37 ℃下预热5 min，加入45 μL 5 mmol/L HHL（马尿酰-组氨酰-亮氨酸）溶液，在37 ℃反应30 min，反应结束后立即加入85 μL 1mol/L HCl溶液终止反应；在反应液中加入1 mL乙酸乙酯，振荡2 min后，4 000 r/min离心10 min，取出800 μL有机相溶液转入玻璃管中，在100 ℃下蒸发30 min，蒸发后的残渣中加入800 μL双蒸水，混匀后在228 nm下测定吸光度，每个样品重复3次。另以双蒸水代替样品作为空白。按下式计算ACE抑制活性：

I＝（A－C）/（A－B）×100%

式中，I—甜高粱籽蛋白ACE抑制肽的抑制率；A—空白组的吸光度；B—反应体系中没有加入甜高粱籽蛋白ACE抑制肽时的吸光度；C—反应体系中有甜高粱籽蛋白ACE抑制肽和样品时的吸光度。

有益效果：与现有技术相比，本发明的优点是：

1）提高了甜高粱秸秆转化乙醇产业中副产物甜高粱穗的利用价值。

2）克服了单酶水解位点不足，单酶水解得到的甜高粱籽蛋白ACE抑制肽抑制的IC₅₀值为1.030～1.475mg/mL，混合酶水解相互干扰的缺点，混合酶水解得到的甜高粱籽蛋白ACE抑制肽抑制的IC₅₀值为0.770～0.993mg/mL，而本方法大大提高了酶解产物甜高粱籽蛋白ACE抑制肽抑制活性，其IC₅₀值为0.261～0.552mg/mL。

3）该方法操作简单，产品性质稳定，适宜规模化生产。

附图说明

图1 利用双酶分步水解技术制备甜高粱籽蛋白ACE抑制肽的工艺流程。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步阐述。

本实验所用的试剂均购自美国Sigma公司。

实施例1

将粉碎后的甜高粱籽粉配成5％（w/v）悬浮液，用淀粉酶在50℃酶解3h，加酶量为5000U/g，酶解结束后，将悬浮液的pH调至8.0，搅拌30min后离心，取上清液，调其pH至4.0，静置30min后离心，收集沉淀，将沉淀溶于蒸馏水中，调pH至中性后喷雾干燥，即得到甜高粱籽蛋白粉。

取20g甜高粱籽蛋白粉配制成质量百分数为1％（w/v）的溶液，调pH至7.0，用α-胰凝乳蛋白酶在40℃酶解20min，加酶量为2000U/g，酶解结束后，沸水浴灭酶，将反应混合液的pH调至6.0，用中性蛋白酶在50℃酶解40min，加酶量为2000U/g，酶解结束后沸水浴灭酶，离心收集上清液，上清液用真空浓缩装置浓缩至固型物含量10％（w/v）左右，用喷雾干燥设备进行干燥，得到粉状甜高粱籽蛋白ACE抑制肽，其IC₅₀值为0.552mg/mL。

实施例2

将粉碎后的甜高粱籽粉配成8％（w/v）悬浮液，用淀粉酶在60℃酶解3.5h，加酶量为7500U/g，酶解结束后，将悬浮液的pH调至9.0，搅拌30min后离心，取上清液，调其pH至4.2，静置30min后离心，收集沉淀，将沉淀溶于蒸馏水中，调pH至中性后喷雾干燥。

取20g甜高粱籽蛋白粉配制成质量百分数为2％（w/v）的溶液，调pH至7.5，用α-胰凝乳蛋白酶在45℃酶解25min，加酶量为3000U/g，酶解结束后，沸水浴灭酶，将反应混合液的pH调至6.5，用中性蛋白酶在55℃酶解50min，加酶量为3000U/g，酶解结束后沸水浴灭酶，离心收集上清液，上清液用真空浓缩装置浓缩至固型物含量10％（w/v）左右，用喷雾干燥设备进行干燥，得到粉状甜高粱籽蛋白ACE抑制肽，其IC₅₀值为0.261mg/mL。

实施例3

将粉碎后的甜高粱籽粉配成10％（w/v）悬浮液，用淀粉酶在70℃酶解4h，加酶量为10000U/g，酶解结束后，将悬浮液的pH调至9.5，搅拌30min后离心，取上清液，调其pH至4.5，静置30min后离心，收集沉淀，将沉淀溶于蒸馏水中，调pH至中性后喷雾干燥。

取20g甜高粱籽蛋白粉配制成高粱籽蛋白粉质量百分数为4％（w/v）的溶液，调pH至8.0，用α-胰凝乳蛋白酶在50℃酶解30min，加酶量为4000U/g，酶解结束后，沸水浴灭酶，将反应混合液的pH调至7.0，用中性蛋白酶在60℃酶解60min，加酶量为4000U/g，酶解结束后沸水浴灭酶，离心收集上清液，上清液用真空浓缩装置浓缩至固型物含量10％（w/v）左右，用喷雾干燥设备进行干燥，得到粉状甜高粱籽蛋白ACE抑制肽，其IC₅₀值为0.359mg/mL。

Claims

1.一种双酶分步水解制备甜高粱籽蛋白ACE抑制肽的方法，其特征在于包括以下步骤：

3）将甜高粱籽蛋白粉配成质量百分数为1％～4％的溶液，调pH至7.0～8.0，加入2000～4000U/g的α-胰凝乳蛋白酶，在40℃～50℃下第一次酶解20～30min，第一次酶解结束后沸水浴灭酶得到混合液，将混合液的pH调至6.0～7.0，加入2000～4000U/g中性蛋白酶，在50℃～60℃下第二次酶解40～60min，第二次酶解结束后沸水浴灭酶，离心收集上清液，上清液经真空浓缩装置浓缩至固型物的质量百分数为5%-15％，用喷雾干燥后，得到粉末状甜高粱籽蛋白ACE抑制肽。

2.根据权利要求1所述的一种双酶分步水解制备甜高粱籽蛋白ACE抑制肽的方法，其特征在于：所述步骤1）中甜高粱籽粉的质量百分数为8％。

3.根据权利要求1所述的双酶分步水解制备甜高粱籽蛋白ACE抑制肽的方法，其特征在于：所述步骤2）中将7500U/g淀粉酶加入悬浮液中60℃酶解3.5h，酶解结束后，将悬浮液的pH调至9.0，搅拌30min后离心，取上清液，调其pH至4.2，静置30min后离心，收集沉淀，将沉淀溶于蒸馏水中，调pH至中性后经真空浓缩装置浓缩和喷雾干燥得到甜高粱籽蛋白粉。

4.根据权利要求1所述的双酶分步水解制备甜高粱籽蛋白ACE抑制肽的方法，其特征在于：所述步骤3）中取20g甜高粱籽蛋白粉，质量百分数为2％的溶液，调pH至7.5，加入3000U/gα-胰凝乳蛋白酶在45℃下第一次酶解25min，第一次酶解结束后沸水浴灭酶得到混合液，将混合液的pH调至6.5，加入3000U/g中性蛋白酶，在55℃下第二次酶解50min，第二次酶解结束后沸水浴灭酶，离心收集上清液，上清液经真空浓缩装置浓缩至固型物质量百分数为10％，用喷雾干燥，得到粉末状甜高粱籽蛋白ACE抑制肽。

5.权利要求1-5任意一项所述的双酶分步水解制备的甜高粱籽蛋白ACE抑制肽，其特征在于：所述甜高粱籽蛋白ACE抑制肽的IC₅₀值为0.261～0.552mg/mL。

6.权利要求1-5任意一项所述的双酶分步水解制备的甜高粱籽蛋白ACE抑制肽在抑制肽活性研究方面的应用。