CN103194414A - 来自海洋的卵链菌dp03及其产右旋糖苷酶的方法 - Google Patents

Abstract

本发明是一种来自海洋的卵链菌DP03（ Catenovulumsp. ）CGMCCN0.7386。该菌株为革兰氏阴性短杆菌；在含有蓝色葡聚糖的固体培养基上的菌落特征：白色不透明菌落，边缘整齐、表面光滑、湿润；该菌株接触酶、氧化酶、甲基红反应呈阳性，鸟氨酸脱羧酶、赖氨酸脱羧酶、精氨酸双水解酶、尿激酶、V-P、吲哚实验呈阴性,能水解淀粉和油脂，能液化明胶、能利用葡萄糖、纤维二糖、麦芽糖、阿拉伯糖和蔗糖。该菌株低于4℃不能生长，最适生长温度为30℃；生长pH范围为6-11，最适生长pH为8.0；生长的NaCl浓度为1%-10%，最适生长的NaCl浓度为2%。本发明还公开了一种利用菌株DP03产右旋糖苷酶的方法。

Description

来自海洋的卵链菌DP03及其产右旋糖苷酶的方法

技术领域

本发明涉及一种微生物，特别是一种分离自中国江苏省连云港海域海水的卵链菌DP03（Catenovulum sp.）CGMCC N0. 7386；本发明还涉及该菌株产右旋糖苷酶的方法。

背景技术

右旋糖苷酶(EC3.2.1.11)是一种可以水解右旋糖苷链内及链端α-1,6糖苷键的糖苷水解酶, 因而常被应用于制糖工业、血浆代用品的生产及牙菌斑的预防及治疗等方面。目前研究发现的产右旋糖苷酶的真菌包括青霉属、拟青霉属、曲霉属、镰孢属、穗霉属、轮枝孢属、长蠕孢属、毛壳属及斯氏油脂酵母, 细菌包括乳杆菌属、链球菌属、纤维弧菌属、噬细胞菌属、短杆菌属、假单胞菌属、棒杆菌属、节杆菌属、黄杆菌属, 这些产生菌主要为陆源微生物。 与陆源酶相比, 来自海洋微生物产生的酶，在耐盐、耐碱、耐低温等特性更利于工业化应用, 目前已从海洋微生物中筛选到产右旋糖苷酶的菌株主要为交替交替假单胞菌属和弧菌属（吕明生，王淑军，房耀维，刘姝，陈丽，朱广超，海洋细菌交替假单胞菌LP621右旋糖苷酶的方法及产品，发明专利，ZL200910029584.4 ；王淑军，吕明生，房耀维，焦豫良，刘姝，曹茜，李瑛，王东，海洋低温右旋糖酐酶与产酶方法及其产生菌S6-2，发明专利ZL 201010534675.6），因此从海洋环境出发，筛选高产右旋糖苷酶的菌株, 是今后研究和开发右旋糖苷酶的关键。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种新的能产右旋糖苷酶的来自海洋的卵链菌DP03。

本发明所要解决的另一个技术问题是提供上述来自海洋的卵链菌DP03产右旋糖苷酶的方法。

本发明的特征包括卵链菌DP03（Catenovulum sp.）菌株本身（以下称菌株DP03），以及利用该菌株发酵生产右旋糖苷酶的方法。

本发明所涉及的菌株DP03是在中国江苏省连云港海域的海水中分离到的卵链菌DP03（Catenovulum sp.），该菌株已于2013年3月29日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏编号为CGMCC N0. 7386。保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，联系电话：010—64807355。

以下对本发明进行详细的阐述。

一、本发明菌株DP03的形态特征与生理生化特征。

1.1形态特征：

菌株DP03为革兰氏阴性杆菌, 0.3–0.5 μm× 0.7–1.0 μm（见图1），菌株DP03无芽孢，能运动，在2216E固体培养基中培养48h后，菌落呈浅白湿润状、边缘整齐光滑、易挑取。在含有蓝色葡聚糖的初筛培养基, 能够产生透明圈(见图2)。

1.2生理生化特征:

该菌株接触酶、氧化酶、甲基红反应呈阳性, 鸟氨酸脱羧酶、赖氨酸脱羧酶、精氨酸双水解酶、尿激酶、V-P、吲哚实验呈阴性，能水解淀粉和油脂，能液化明胶、能利用葡萄糖、纤维二糖、麦芽糖、阿拉伯糖和蔗糖，部分生理生化结果见表1。

表1 菌株DP03的生理生化特征

实验项目	结果	实验项目	结果
				甲基红实验	+	尿激酶	−
V-P实验	−	甘露醇	-
				吲哚实验	−	葡萄糖	+
接触酶	+	海藻糖	−
				氧化酶	+	纤维二糖	+
淀粉水解实验	+	麦芽糖	+
				油脂水解实验	+	阿拉伯糖	+
明胶液化实验	+	蔗糖	+
				鸟氨酸脱羧酶	−	阿拉伯糖醇	−
赖氨酸脱羧酶	−	半乳糖醛	−
				精氨酸双水解酶	−	ß-葡萄糖苷酶	+

注: +: 阳性; −: 阴性

1.3菌株DP03的序列的扩增和分析：

用Axygen试剂盒提取得到DP03的基因组，选用扩增原核微生物16S rDNA序列的通用引物（27F :5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′和1492R: 5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′）于PCR mix体系中反应。反应体系：PCR mix（46μL），上下游引物（各1μL），DNA模板（2μL）。反应程序：94 ℃变性5 min； 94 ℃变性30 S，54 ℃退火30 S，72 ℃延伸90 S，32个循环；72 ℃ 10 min。将PCR电泳纯化回收并构建克隆载体，选阳性克隆子提取质粒送至上海生工测序，将测得序列互补反相拼接后，获得1451bp的碱基片段序列提交GenBank，获得登录号为JX276658，用MEGA5软件进行16S rDNA序列的比对分析，并构建系统发育树（如图3），将该序列与GenBank数据库中的序列进行同源性比对，结果发现与卵链菌属（Catenovulum）最接近，但同源性不足96%，不能直接判定为卵链菌属（Catenovulum）。

1.4 细胞脂肪酸的测定

配制以下溶液：溶液a：45g氢氧化钠溶于150 mL甲醇和150 mL蒸馏水；溶液b：190 mL浓盐酸和275 mL甲醇溶于135 mL蒸馏水；溶液c：200 mL正己烷与200 mL甲基叔丁醚混合均匀；溶液d：10.8 g氢氧化钠溶于900 mL蒸馏水；溶液e：饱和氯化钠溶液。

用接种环刮取适量细菌纯培养物于8 mL螺口玻璃瓶，加入1 mL溶液a后拧紧螺盖，沸水浴5 min，去除震荡10 s，再拧紧螺盖继续沸水浴25 min。待样品冷却后加入2 mL溶液b，盖严振荡，随后精确控制80℃水域10 min，冰浴冷却。于冷却管中加入1.25 mL溶液c，快速振荡10 min，弃水相并在有机相中加入3 mL溶液d和几滴溶液e，快速振荡5 min，去三分之二上层有机相置气相色谱样品瓶备用。采用HP6890气相色谱仪，配备分流/不分流进样口，氢火焰离子化检测器及色谱工作站；色谱柱为Ultra-2，长25cm，内径0.2 mm，液膜厚度0.33 um，炉温为二阶程序升温，起始温度170℃，5 ℃/min升至260℃，随后以40 ℃/min升至310℃，维持1.5 min；进样口温度250℃，载气为氢气，流速0.5 mL/min，分流进样模式，分流比100:1，进样量2 uL；检测器温度300℃。表2列出了菌株DP03各类脂肪酸的百分含量，其中十六碳饱和脂肪酸和肪酸/ w6c-十六碳单不饱和脂肪酸的含量最高，分别是34.65%和27.90%，w9c－十八碳单不饱和脂肪酸的含量最低，仅有1.26%。

表2 菌株DP03 的细胞脂肪酸成分

脂肪酸名称	百分含量（%）
		3-羟基十碳饱和脂肪酸	6.48
十二碳饱和脂肪酸	3.56
		十三碳饱和脂肪酸	1.55
十四碳饱和脂肪酸	2.20
		w7c-十六碳单不饱和脂肪酸/ w6c-十六碳单不饱和脂肪酸	27.90
十六碳饱和脂肪酸	34.56
		十七碳饱和脂肪酸	6.45
w9c－十八碳单不饱和脂肪酸	1.26
		w7c－十八碳单不饱和脂肪酸	11.56
饱和十八碳脂肪酸	2.04

1.5 菌株G+C mol%含量测定

菌株基因组DNA的G＋C mol％含量测定使用熔解温度（Tm）法，以大肠埃希氏（E. coli K12，AS 1.365）为参比对照，所用仪器为Perkin/Elmer 公司Lambda35 UV/VIS Spectrometer; 用PTP-1数字温度控制仪控温。步骤如下：

（1）将待测DNA样品用0.1×SSC稀释至OD260 nm值于0.3－0.4之间；

（2）在波长260 nm首先记录25℃的OD值，然后设定升温程序，从65℃开始到95℃，其间每分钟升高1℃；

（3）OD值上升表示变性开始，记录比色皿温度和OD值，直至OD值不变表示变性完毕；

（4）根据热变性曲线，得出熔链温度（Tm），计算G＋C mol％含量。

在0.1×SSC溶液中计算公式为：

G＋C mol％ ＝ G＋C mol％AS1.365 ＋ 2.08（Tm未知 － TmAS1.365）

实验以E. coli K12作为对照菌株，它的Tm为76.585℃, 待测菌株DP03的Tm值为70.976℃，根据公式G＋C mol％ ＝ G＋C mol％AS1.365 ＋ 2.08（Tm未知 － TmAS1.365）可求出菌株DP03的G+C mol%是39.53 mol%。

1.6 菌株DP03的核酸杂交实验

菌株DP03的16S rDNA序列与仅有的两株Catenovulum菌聚集在同一支，而GenBank里收录的卵链菌（Catenovulum）的16S rRNA基因序也只有这2株菌，一株是中国海洋大学Yan等人分离筛选的一株嗜琼胶卵链菌Catenovulum agarivorans CGMCC 1.10245），一株是谢伟等分离的Catenovulum sp. X3 。

嗜琼胶卵链菌Catenovulum agarivorans（CGMCC 1.10245）的G+C mol%是44.8 mol%，菌株DP03的G+C mol%是39.53 mol%，二者相差在5%以上，可认为二者不是同一个种。将菌株DP03与嗜琼胶卵链菌Catenovulum agarivorans（CGMCC 1.10245）进行核酸杂交实验。采用液相复性率方法，所用仪器为Perkin Elmer Lambda35 UV/VIS Spectrophotometer。主要步骤如下：

（1）DNA样品处理：提取的DNA样品，实验前需先置冰浴中用超声波40W打24分钟（设定为：打3秒/停3秒；DNA样品浓度为2.0），将DNA样品剪切为2-5x105道尔顿的片段。

（2）将待测DNA样品（A、B）分别用0.1×SSC精确配制成为OD260 nm 1.8－2.0，且两者OD260 nm值一致（精确到0.001）；

（3）进入UV Winlab程序，出现其方法窗口，在方法窗口中选择时间驱动TD方法，通过Timed. Inst. Sample.设置页来设定合适的测定参数。测定波长为260 nm，总测定时间设定为30 分钟。按照已经测定的G+C mol%计算最适复性温度（optimal renaturation temperature，TOR），将比色杯的温度稳定在最适复性温度。在2 × SSC反应液中，最适复性温度按公式：TOR = 0.51 ×（G+C）mol% + 47计算。

（4）取两株菌种DNA样品各400 µl分别装在两个离心管中，再取两株菌种DNA样品各200 µl装在同一个离心管中为混合样品；

（5）单一DNA样品和混合DNA样品测试前分别通过PTP-1控温系统设置100°C变性15 min，然后降温至最适复性温度。记录OD₂₆₀ nm值，待反应进行到30 min时，停止读数，全部过程样品的温度都不得低于TOR，最终得到一条随时间延长，光吸收值逐渐减小的直线；

（6）根据软件UV Winlab，在其中的Algorithm栏中选择Slope, 得出复性数率（V），即斜率（通常V表示为每分钟吸光值的减少值）；

（7）根据公式计算同源杂交率。

同源杂交率（H）％ ＝ 4 Vm －（Va ＋ Vb）/ 2

× 100%

菌株DP03与嗜琼胶卵链菌（Catenovulum agarivorans）核酸分子杂交实验进行了两次重复，根据公式同源杂交率（H）％ ＝ 4 Vm －（Va ＋ Vb）/ 2

× 100%计算出两次重复的同源杂交率分别为17.24%和21.43%。一般认为，核酸杂交同源性超过60%的菌株可以是同种，同源性超过70%者是同一亚种，而同源性在20-60%范围内时，则属于同一个属。结合G+C mol%及核酸杂交等结果，菌株DP03是卵链菌属的一个新种。

二、本发明菌株DP03的生长特性

本发明提供的菌株DP03，对其生长特性进行了细致的研究，基本摸清不同条件下该菌的生长情况。

2.1本发明中涉及的培养基：

2216E培养基：蛋白胨0.5%，酵母粉0.1%，琼脂2%，陈海水配制，pH8。

初筛培养基：酵母粉0.1%，蛋白胨0.5%，蓝色葡聚糖2000 0.2%，右旋糖酐T20 0.8%，琼脂2%，陈海水配制，pH 7.8；

复筛培养基：酵母膏0.5%，蛋白胨0.5%，右旋糖酐T 20 1%，陈海水配制，pH 7.8；

种子培养基：酵母粉0.1%，蛋白胨0.5%，陈海水配制，pH 7.8；

发酵培养基：马铃薯淀粉0.5%，豆粕粉0.5%，右旋糖酐T 20 1%，陈海水配制，pH 8.0。

产酶培养基：马铃薯淀粉0.5%，豆粕粉0.5%，右旋糖酐T20 1%，NaCl 2%， pH 8.0。

2.2种子液的制备：将菌株DP03斜面种子接种到2216E培养基中, 30 °C, 180 r/min, 装液量25%, 培养12 h。

2.3温度对菌株DP03生长的影响：

将种子液以1%接种量于2216E培养基，pH 7.5，转速180r/min，装液量25%，分别在不同温度下培养24 h，选择在600nm波长下测定OD值，该菌株在0℃下不生长，该菌株生长温度范围为15-35℃，最适生长温度为30℃，见图4。

2.4 初始pH对菌株DP03生长的影响 ：

初始pH范围4.0−11.0, 最适温度培养, 其余条件同2.3。生长pH范围为6-11，最适生长pH为8.0，见图5。

2.5 NaCl对菌株DP03生长的影响：

培养基用自来水配制, NaCl范围0%-11%, 在最适温度和pH下培养, 其余条件同2.3，菌株在NaCl浓度为1%-10%范围内能生长，最适生长的NaCl浓度为2%，见图6。

三、菌株DP03发酵生产右旋糖苷酶的方法

发明人对菌株DP03发酵生产右旋糖苷酶的方法进行了研究。

3.1碳氮源：0.5%的碳源（糊精、纤维素、马铃薯淀粉、玉米淀粉、木薯淀粉、乳糖、葡萄糖和淀粉糖）和氮源（硫酸铵、硝酸铵、豆粕粉、玉米浆和酪蛋白）用于替换发酵培养基中的酵母膏和蛋白胨，接种后在30℃摇床培养28h后分别测酶液的活力。结果发现，马铃薯淀粉和木薯淀粉作为培养基碳源可促进产右旋糖苷酶，而蛋白胨和酵母粉作为氮源时对产酶的促进也较为可观，其次，硫酸铵和豆粕粉也有利于产酶，见表1，考虑到成本，选用0.5%马铃薯淀粉和0.5%豆粕粉作为产酶培养基的碳氮源。

表1 培养基中碳氮源对产酶的影响

3.2发酵温度对菌株DP03产酶影响：将接种培养12h的种子培养基以1%接种量接种至发酵培养基，于15-40℃培养28h后分别测酶液的活力，结果见图7。DP03最佳产酶温度为30℃，并在25-35℃范围内发酵达到90%以上相对酶活力，低于25℃或高于35℃，产酶量均有大幅度下降。

3.3培养基pH对菌株DP03产酶的影响：以1%接种量接种至不同初始pH的发酵培养基，于30℃培养28h后分别测酶液的活力。初始pH调节范围为4-10。培养基初始pH对产酶的研究结果表明，培养28h，该菌株产酶的最适初始pH为8，且在6-9范围内能维持60%以上相对酶活力。随着pH的升高和下降，菌株的产酶均受到较大影响，当pH低于5时，由于菌株DP03几乎不生长，其发酵液测不到明显酶活力，见图8。

3.4发酵时间对菌株DP03产酶的影响： 将菌株DP03发酵48h且每隔2h取样测酶活力，结果表明28h为产酶高峰，在28h之前菌株随着发酵时间延长产酶逐渐升高，而继续监控酶活力发现开始逐渐下降，结果如图9所示。

3.4装液量对菌株DP03产酶的影响：

以1%接种量分别接种至装液量为15%-45%的发酵培养基，于30℃ 180rpm摇床中培养28h后分别测酶液的活力。通过控制锥形瓶中培养基的体积来控制发酵液的溶氧，进而研究其对菌株产酶的影响，图10显示最适装液量为25%，而装液量的增加对产酶影响较大，特别是当250mL锥形瓶中装入超过100mL培养基时，相对酶活力仅有30%。

3.5不同右旋糖酐及浓度对产酶的影响

将不同分子量右旋糖酐（T20，T40，T70和T500）以0-1.4%的浓度加入发酵培养基中，接种培养后分别测酶液的活力。不同分子量的右旋糖酐对产酶影响不大，相同浓度下，低分子量右旋糖酐对产酶更有优势，且随着浓度增大产酶逐渐增加，到达最佳浓度后缓慢下降。如图11所示，1%右旋糖酐T20为最佳产右旋糖苷酶诱导剂，高于1%右旋糖酐T40，1%右旋糖酐T70和1.2%右旋糖酐T500时酶活力下降，不添加右旋糖酐检测不到酶活力。

3.6 右旋糖苷酶活测定：将50μL酶液加入到150 μL 3%的右旋糖酐T70 Tris-HCl缓冲液(0.1mol/L，pH8.0)中，在37℃水浴中反应20 min，用DNS法测定还原糖量。酶活力单位定义(U/mL)：在一定温度和pH下，每分钟催化产1umoL还原糖的酶量为一个活力单位。

附图说明

图1为菌株DP03扫描电镜照片形态(×20 000)图；

图2为菌株DP03在初筛平板上形成的透明圈图；

图3为菌株DP03系统进化树；

图4为温度对菌株DP03生长的影响 ◆ 15°C, ● 20°C, ▲ 25°C, ■ 30°C, × 35°C

图5为pH对菌株DP03生长的影响力图；

图6为NaCl浓度对菌株DP03生长的影响图；

图7为温度对菌株DP03发酵产酶的影响图；

图8为pH对菌株DP03发酵产酶的影响图；

图9为时间对菌株DP03发酵产酶的影响图；

图10为装液量对菌株DP03发酵产酶的影响图；

图11为右旋糖酐浓度和种类对菌株DP03发酵产酶的影响图；图中： ■ 右旋糖酐T20, ◆右旋糖酐 T40, ▲右旋糖酐 T70, ●右旋糖酐 T500。

具体实施方式

以下进一步描述本发明的具体技术方案，以便于本领域的技术人员进一步地理解本发明，而不构成对其权利的限制。

实施例1，一种来自海洋的卵链菌DP03（Catenovulum sp.）CGMCC N0. 7386。该菌株具有以下特征：菌株DP03为革兰氏阴性菌, 白色不透明菌落, 边缘整齐、表面光滑、湿润。该菌株接触酶、氧化酶、甲基红反应呈阳性, 鸟氨酸脱羧酶、赖氨酸脱羧酶、精氨酸双水解酶、尿激酶、V-P、吲哚实验呈阴性，能水解淀粉和油脂，能液化明胶、能利用葡萄糖、纤维二糖、麦芽糖、阿拉伯糖和蔗糖。菌株DP03生长特性为：该菌株生长温度范围为15-35℃，最适生长温度为30℃；生长pH范围为6-11，最适生长pH为8.0；菌株在NaCl浓度为1%-10%范围内能生长，最适生长的NaCl浓度为2%。

实施例2，一种如实施例1所述来自海洋的卵链菌DP03产右旋糖苷酶的方法，其步骤如下：将卵链菌DP03接种到2216E培养基中，转速180r/min，装液量25%，30℃培养12h，得种子液；将种子液以1%的接种量接种于产酶培养基中，180r/min，30℃培养28h，10000r/min离心5min，取上清液即为右旋糖苷酶粗酶；所述的产酶培养基的组成为：马铃薯淀粉0.5%，豆粕粉0.5%，右旋糖酐T20 1%，NaCl 2%，pH 8.0。

Claims (5)

1.一种来自海洋的卵链菌DP03（Catenovulum sp.）CGMCC N0. 7386。

2.根据权利要求1所述来自海洋的卵链菌DP03（Catenovulum sp.），其特征在于，该菌株具有以下特征：卵链菌DP03为革兰氏阴性短杆菌，大小为0.3–0.5 μm× 0.7–1.0 μm；在含有蓝色葡聚糖的固体培养基上的菌落特征：白色不透明菌落，边缘整齐、表面光滑、湿润；该菌株接触酶、氧化酶、甲基红反应呈阳性，鸟氨酸脱羧酶、赖氨酸脱羧酶、精氨酸双水解酶、尿激酶、V-P、吲哚实验呈阴性,能水解淀粉和油脂，能液化明胶、能利用葡萄糖、纤维二糖、麦芽糖、阿拉伯糖和蔗糖。

3.根据权利要求1所述来自海洋的卵链菌DP03（Catenovulum sp.），其特征在于，其生长特性为：卵链菌DP03生长温度范围为15-35℃，生长pH范围为6-11，适宜生长的NaCl浓度为1%-10%。

4.根据权利要求1所述来自海洋的卵链菌DP03（Catenovulum sp.），其特征在于，其生长特性为：卵链菌DP03最适生长温度为30℃，最适生长pH为8.0，最适生长的NaCl浓度为2%。

5.一种如权利要求1-4中任何一项所述来自海洋的卵链菌DP03产右旋糖[w1] 酶的方法，其特征在于，其步骤如下：将卵链菌DP03接种到2216E培养基中，转速180r/min，装液量25%，30℃培养12h，得种子液；将种子液以1%的接种量接种于产酶培养基中，180r/min，30℃培养28h，10000r/min离心5min，取上清液即为右旋糖苷酶粗酶；所述的产酶培养基的组成为：马铃薯淀粉0.5%，豆粕粉0.5%，右旋糖酐T20 1%，NaCl 2%， pH 8.0。

Images