CN103193800A - 一种从头孢克洛酶促反应液中分离纯化各组分的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种从头孢克洛酶促反应液中分离纯化各组分的方法，本发明的方法包括以下步骤：（1）采用酸沉淀法从头孢克洛酶促反应液中回收未反应的母核7-ACCA；（2）采用大孔吸附树脂分离纯化头孢克洛；（3）采用阳离子交换树脂分离纯化D-苯甘氨酸。该发明能够从酶促合成头孢克洛的反应液中分离纯化出未反应的母核（7-ACCA）、产物头孢克洛、副产物D-苯甘氨酸，充分利用了原料，降低了生产成本，且采用本发明的方法获得的各物收率高，且纯度高，适于推广使用。

Description

一种从头孢克洛酶促反应液中分离纯化各组分的方法

技术领域

 本发明属于生物技术领域，本发明涉及一种从头孢克洛酶促反应液中分离纯化各组分的方法。

背景技术

头孢克洛（Cefaclor）是一种半合成的第二代头孢类抗生素，对于革兰氏阳性菌具有较好的抗菌活性，具有高效、广谱、较好的化学稳定性，是目前临床上治疗细菌感染的主要药物之一。头孢克洛自从上世纪70年代上市以来，作为高效、广谱和良好的临床安全性的抗生素，一直受到人们的推崇，其化学结构式如下：

；

工业上主要通过缩合7-氨基-3-氯-去乙酰氧基-头孢烷酸（7-ACCA）及活化的D-苯甘氨酸来制备头孢克洛，有化学缩合和酶法缩合两种工艺。专利WO2006/069984公开了一种酶法缩合头孢克洛的方法，其方法是活性形式D-苯甘氨酸与7-氨基-3-氯-去乙酰氧基-头孢烷酸(7-ACCA)酰化缩合得到头孢克洛。反应生成的水性混合物中包含＞10（w/w）%的量的头孢克洛、＜2（w/w）%的量的7-ACCA以及＜2（w/w）%的量的D-苯甘氨酸，该专利还公开了头孢克洛的分离纯化方法，该专利的不足之处是对于未反应的7-ACCA和副产物D-苯甘氨酸的分离未进行研究。专利CN 200810038896.7公开了一种从头孢克洛萘酚复合物中提纯头孢克洛的方法，其方法主要是采用有机溶剂选择性萃取头孢克洛和萘酚的复合物中的萘酚后，收集得到的水相采用大孔吸附树脂吸附，用于分离纯化头孢克洛，该专利的不足之处是酶促反应液中加入了络合剂萘酚，然后得到头孢克洛和萘酚的复合物后，再用于进一步的分离纯化，这个工艺增加了分离纯化的步骤，此外，该工艺所用的洗脱剂为甲醇-水、异丙醇-水等混合液，这些洗脱剂污染环境且对操作人员的健康构成了威胁。专利US 6503727B1公开了一种回收酶法合成β-内酰胺类抗生素过程中未反应的母核的策略，该策略是先采用酸沉淀分离部分已合成的β-内酰胺类抗生素，然后将过滤后所得母液进行酶解反应，没有沉淀的β-内酰胺类抗生素被酶解生成了母核和副产物，再进一步分离纯化。该工艺的不足之处在于需要酶解已经合成的抗生素，使得抗生素单批次的实际收率降低，母核的回收再利用工艺复杂。目前，对于酶促缩合头孢克洛的反应液中D-苯甘氨酸的分离纯化并未见报道，而D-苯甘氨酸在酶促反应液中含量大，如果能够将其进行回收再利用，定能够进一步降低酶法合成头孢克洛的成本。

发明内容

本发明的目的在于解决上述问题，提供一种不仅能够分离目标产物头孢克洛，还能分离副产物D-苯甘氨酸和回收未反应的7-ACCA，从而降低了酶法合成头孢克洛的成本。

本发明通过下述技术方案实现：

一种从头孢克洛酶促反应液中分离纯化各组分的方法，包括以下步骤：

（1）采用酸沉淀法从头孢克洛酶促反应液中回收未反应的母核7-ACCA；

（2）采用大孔吸附树脂分离纯化头孢克洛；

（3）采用阳离子交换树脂分离纯化D-苯甘氨酸。

进一步地，所述步骤（1）具体方法如下：将酶促反应液过滤除去固定化酶，调节酶促反应液的pH值至1～2，搅拌30min，然后进行过滤，洗涤干燥滤饼即得7-ACCA，收集所得滤液和水洗涤液备用。

作为一种优选，上述pH值1.2～2.0，且调节酶促反应液pH值所用的酸为无机酸，作为优选该无机酸为盐酸。

上述滤饼主要是7-ACCA，其回收率大于80%。

再进一步地，所述步骤（2）具体方法如下：将步骤（1）所得滤液和水洗涤液合并，通过大孔吸附树脂吸附，采用乙醇-水混合液洗脱，然后将洗脱液浓缩并调节pH值结晶即得头孢克洛，收集该过程的滤液和洗脱液备用。

作为一种优选，所述大孔吸附树脂为Hz-816、Hz-818或HP-20。

所述乙醇-水混合液的pH值不超过3，作为优选，pH值为1～2，更优的一种选择，pH值为1.2～1.6；调解乙醇-水混合液pH值所用的酸为无机酸，优选地无机酸为盐酸。

上述洗脱采用梯度洗脱，且乙醇体积分数为20%以下洗脱液弃之，乙醇体积份数≥50%时收集，合并后用于浓缩结晶；所述收集的洗脱液的体积≥4倍柱体积，浓缩倍数≥10；再具体一点，该梯度洗脱具体是：将pH值为1.6的水、pH值为1.6体积比10%的乙醇-水进行洗脱，并将洗脱液弃之；然后采用pH值为1.6体积比50%、60%、70%、80%的乙醇-水进行洗脱并将洗脱液合并。每个浓度的解析液体积为1～2倍柱体积，解析液混合后采用减压旋蒸，温度为30～50℃，优选为40℃，浓缩倍数≥10倍，但不能浓缩至干燥。

另外，所述结晶头孢克洛的条件：往浓缩后的洗脱液中加入其0.5～2倍体积的乙醇，且采用氨水保持pH值为3.0～4.0。

作为一种优选，结晶头孢克洛时，结晶温度为0～10℃，优选为4～6℃；结晶搅拌时间为30min～1h，优选为30～40min，结晶静止时间为4～24h，优选为8～12h。

上述头孢克洛的收率≥65%，而结晶头孢克洛的纯度≥98%。

更进一步地，所述步骤（3）具体方法如下：将步骤（2）所得滤液和水洗脱液合并，经过离子交换树脂吸附，采用解析剂进行解析，将解析液浓缩并调节pH值结晶即得D-苯甘氨酸晶体。

作为一种优选，所述离子交换树脂为JK-006或732阳离子交换树脂；作为更优的选择，所述离子交换树脂为JK-006阳离子交换树脂。

所述分离纯化D-苯甘氨酸上样的流速为0.5～2BV/h，优选为0.5～1BV/h。

作为一种优选，所述解析剂为盐酸，且浓度为0.5～2mol/L；作为更优地选择，浓度为1～2mol/L。

在分离纯化D-苯甘氨酸时，所述收集的解析剂的体积≥4倍柱体积，浓缩倍数≥2，而收集到D-苯甘氨酸的解析液后，浓缩至原来体积的1/2以下。

作为一种优选，分离纯化D-苯甘氨酸时，浓缩D-苯甘氨酸的解析液后，采用氨水调节解析液的PH值至3～9。

另外，在结晶D-苯甘氨酸时，结晶的温度为0～10℃，优选为4～6℃；结晶搅拌的时间为30min～1h，优选为30～40min；结晶静止的时间为4～24h，优选为8～12h。

上述D-苯甘氨酸结晶的收率≥83%；结晶D-苯甘氨酸的纯度≥98%。

本发明与现有技术相比具有以下优点及有益效果：

（1）本发明解决了酶法合成头孢克洛反应液中未反应的7-ACCA的回收难题，采用本发明可将其进行回收，另外本发明还可分离出D-苯甘氨酸，从而充分利用原料，避免浪费，大大地降低了生产成本。

（2）本发明直接从酶法合成头孢克洛的反应液中分离纯化头孢克洛，无需经过络合头孢克洛等步骤，从而简化了分离纯化的步骤，提高了分离纯化的收率。

（3）本发明采用乙醇-水混合液作为大孔吸附树脂的洗脱液，洗脱过程中无污染且对操作人员的身体健康无伤害，安全可靠。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步说明，本发明的实施方式包括但不限于下列实施例。

实施例1

一种从头孢克洛酶促反应液中分离纯化各组分的方法，包括以下步骤：

（1）7-ACCA的回收：首先量取酶法合成头孢克洛反应液200ml，过滤除去固定化酶后，采用去离子水反复洗涤固定化酶，合并滤液和水洗涤液得到780ml头孢克洛酶促反应液，其中含有1.47g7-ACCA，7.3g头孢克洛，4.13gD-苯甘氨酸，用6mol/L盐酸调节pH值为1.6，维持该过程的温度为20℃，200rpm磁力搅拌30分钟后，将上述头孢克洛反应液通过G4玻砂漏斗过滤，用pH值=1.6的水5ml洗涤，重复三至四次。真空抽滤干燥得到7-ACCA 1.25g，收率85%，HPLC检测纯度为99.62%。合并滤液及洗涤用水混合后，在20℃水浴0、2h、4h、6h后分别取样测定其主要组分的浓度并计算其回收率。HPLC检测结果表明，20℃6h内头孢克洛和D-苯甘氨酸的回收率分别在98.2%以上。

（2）头孢克洛的分离：将过滤7-ACCA后所得滤液及洗涤用水合并液共800ml，以2BV/h流速通经过100ml的Hz-816吸附树脂吸附。吸附完全以后，分别采用200ml pH值=1.6的水、pH值=1.6体积比10%的乙醇-水混合液以2BV/h流速洗脱，洗脱液不合并，接着分别采用100ml pH值=1.6体积比为50%、60%、70%、80%的乙醇-水混合液以2BV/h流速洗脱，合并洗脱液约400ml。将上述洗脱液40℃减压旋蒸至40ml后转移至100ml烧杯中，进行结晶操作：首先向上述液体中加入1倍体积的乙醇，磁力搅拌混合均匀后缓慢滴加6mol/L氨水，调节pH值至3.4，等到晶体析出后在20℃的条件下对悬浮液再搅拌30分钟，然后将其在4℃的条件下静置8h，最后采用G4玻砂漏斗抽滤，所得滤饼采用丙酮5ml洗涤，重复3次，真空抽滤干燥得到头孢克洛5.3g，收率72.6%，HPLC检测纯度为99.62%。

（3）D-苯甘氨酸的分离：将分离头孢克洛所得上柱漏出液和pH值=1.6的水洗脱液合并后所得1000ml溶液，用6mol/L盐酸调节pH值至1.6，然后经过50ml的JK-006阳离子交换树脂交换吸附，上样流速1BV/h。上样结束以后，采用1mol/L的HCl以1BV/h的流速解析。开始流出来的50m解析液弃之，收集后续流出的200ml的解析液。将上述解析液40℃减压旋蒸至70ml后转移至100ml的烧杯中，进行结晶操作。首先向上述液体中缓缓滴加6mol/L的氨水，调节溶液的pH值至3.5，并在20℃的条件下磁力搅拌30分钟，随后将上述溶液在4℃的条件下静置8h，然后采用G4玻砂漏斗抽滤，所得滤饼采用丙酮5ml洗涤，重复3次，真空抽滤干燥得到D-苯甘氨酸3.54g，收率85.6%%，HPLC检测纯度为99.8%。

实施例2

一种从头孢克洛酶促反应液中分离纯化各组分的方法，包括以下步骤：

（1）7-ACCA的回收：首先称取酶法合成头孢克洛反应液200ml，过滤除去固定化酶后，采用去离子水反复洗涤固定化酶，合并滤液和水洗涤液得到780ml头孢克洛酶促反应液，其中含有1.47g7-ACCA，7.3g头孢克洛，4.13gD-苯甘氨酸，用6mol/L盐酸调节pH值为2.0，维持该过程的温度为20℃，200rpm磁力搅拌30分钟后，将上述头孢克洛反应液通过G4玻砂漏斗过滤，用pH值=2.0的水5ml洗涤，重复三至四次。真空抽滤干燥得到7-ACCA 1.22g，收率83%，HPLC检测纯度为99.82%。合并滤液及洗涤用水混合后，在20℃水浴0h、2h、4h、6h后分别取样测定其主要组分的浓度并计算其回收率。HPLC检测结果表明，20℃在6h内头孢克洛和D-苯甘氨酸的回收率分别在97.2%以上。

（2）头孢克洛的分离：将过滤7-ACCA后所得滤液及洗涤用水合并液共800ml，以2BV/h流速通经过100ml的Hz-818吸附树脂吸附。吸附完全以后，分别采用200ml pH值=2.0的水、pH值=2.0体积比10%的乙醇-水混合液以2BV/h流速洗脱，洗脱液不合并，接着分别采用100ml pH值=2.0体积比为50%、60%、70%、80%的乙醇-水混合液以2BV/ h流速洗脱，合并洗脱液约500ml。将上述洗脱液40℃减压旋蒸至50ml后转移至100ml烧杯中，进行结晶操作：首先向上述液体中加入2倍体积的乙醇，磁力搅拌混合均匀后缓慢滴加6mol/L氨水，调节pH值3.0，等到晶体析出后在20℃对悬浮液再搅拌30分钟，然后将其在4℃的条件下静置8h，最后采用G4玻砂漏斗抽滤，所得滤饼采用丙酮5ml洗涤，重复3次，真空抽滤干燥得到头孢克洛5.0g，收率68.3%，HPLC检测纯度为98.62%。

（3）D-苯甘氨酸的分离：将分离头孢克洛所得上柱漏出液和pH值=2.0的水洗脱液合并后所得1000ml 溶液，用6mol/L盐酸调节pH值至2.0，然后经过50ml的732阳离子交换树脂交换吸附，上样流速1BV/h。上样结束以后，采用0.75mol/L的HCl以1BV/h的流速解析。开始流出来的50m解析液弃之，收集后续流出的250ml的解析液。将上述解析液40℃减压旋蒸至50ml后转移至100ml的烧杯中，进行结晶操作。首先向上述液体中缓缓滴加6mol/L的氨水，调节溶液的pH值至8.0，并在20℃的条件下磁力搅拌30分钟，随后将上述溶液在4℃的条件下静置8h，然后采用G4玻砂漏斗抽滤，所得滤饼采用丙酮5ml洗涤，重复3次，真空抽滤干燥得到D-苯甘氨酸 3.453g，收率83.6%%，HPLC检测纯度为98.2%。

实施例3

一种从头孢克洛酶促反应液中分离纯化各组分的方法，包括以下步骤：

（1）7-ACCA的回收：首先称取酶法合成头孢克洛反应液200ml，过滤除去固定化酶后，采用去离子水反复洗涤固定化酶，合并滤液和水洗涤液得到780ml头孢克洛酶促反应液，其中含有1.47 g 7-ACCA，7.3g头孢克洛，4.13g D-苯甘氨酸，用6mol/L盐酸调节pH值为1.34，维持该过程的温度为20℃，200rpm磁力搅拌30分钟后，将上述头孢克洛反应液通过G4玻砂漏斗过滤，用pH值=1.34的水5ml洗涤，重复三至四次。真空抽滤干燥得到7-ACCA 1.17g，收率80%，HPLC检测纯度为99.82%。合并滤液及洗涤用水混合后，在20℃水浴0、2h、4h、6h后分别取样测定其主要组分的浓度并计算其回收率。HPLC检测结果表明，20℃在6h内头孢克洛和D-苯甘氨酸的回收率分别在99.1%以上。

（2）头孢克洛的分离：将过滤7-ACCA后所得滤液及洗涤用水合并液共800ml，以2BV/h流速通经过100ml的HP-20吸附树脂吸附。吸附完全以后，分别采用200ml pH值=1.34的水、pH值=1.34体积比10%的乙醇-水混合液以2BV/h流速洗脱，洗脱液不合并，接着分别采用100ml pH值=1.34体积比为50%、60%、70%、80%的乙醇-水混合液以2BV/ h流速洗脱，合并洗脱液约450ml。将上述洗脱液40℃减压旋蒸至40ml后转移至100ml烧杯中，进行结晶操作：首先向上述液体中加入0.5倍体积的乙醇，磁力搅拌混合均匀后缓慢滴加6mol/L氨水，调节pH值4.0，等到晶体析出后在20℃对悬浮液再搅拌30分钟，然后将其在4℃的条件下静置8h，最后采用G4玻砂漏斗抽滤，所得滤饼采用丙酮5ml洗涤，重复3次，真空抽滤干燥得到头孢克洛 4.8g，收率65.75%，HPLC检测纯度为99.72%。

（3）D-苯甘氨酸的分离：将分离头孢克洛所得上柱漏出液和pH值=1.6的水洗脱液合并后所得1000ml 溶液，用6mol/L盐酸调节pH值至2.0，然后经过50ml的JK-006阳离子交换树脂交换吸附，上样流速1BV/h。上样结束以后，采用0.5 mol/L的HCl以1BV/h的流速解析。开始流出来的50m解析液弃之，收集后续流出的300ml的解析液。将上述解析液40℃减压旋蒸至80ml后转移至100ml的烧杯中，进行结晶操作。首先向上述液体中缓缓滴加6mol/L的氨水，调节溶液的pH值至5.0，并在20℃的条件下磁力搅拌30分钟，随后将上述溶液在4℃的条件下静置8h，然后采用G4玻砂漏斗抽滤，所得滤饼采用丙酮5ml洗涤，重复3次，真空抽滤干燥得到D-苯甘氨酸 3.8g，收率92%，HPLC检测纯度为99.28%。

按照上述实施例，便可很好地实现本发明。值得说明的是，基于上述设计的前提下，为解决同样的技术问题，即使在本发明上做出的一些无实质性的改动或润色，所采用的技术方案的实质仍然与本发明一样，故其也应当在本发明的保护范围内。

Claims (10)

1.一种从头孢克洛酶促反应液中分离纯化各组分的方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）采用酸沉淀法从头孢克洛酶促反应液中回收未反应的母核7-ACCA；

（2）采用大孔吸附树脂分离纯化头孢克洛；

（3）采用阳离子交换树脂分离纯化D-苯甘氨酸。

2.根据权利要求1所述的一种从头孢克洛酶促反应液中分离纯化各组分的方法，其特征在于，所述步骤（1）具体方法如下：将酶促反应液过滤除去固定化酶，调节酶促反应液的pH值至1～2，搅拌30min，然后进行过滤，洗涤干燥滤饼即得7-ACCA，收集所得滤液和水洗涤液备用。

3.根据权利要求2所述的一种从头孢克洛酶促反应液中分离纯化各组分的方法，其特征在于，所述步骤（2）具体方法如下：将步骤（1）所得滤液和水洗涤液合并，通过大孔吸附树脂吸附，采用乙醇-水混合液洗脱，然后将洗脱液浓缩并调节pH值结晶即得头孢克洛，收集该过程的滤液和水洗脱液备用。

4. 根据权利要求3所述的一种从头孢克洛酶促反应液中分离纯化各组分的方法，其特征在于，所述大孔吸附树脂为Hz-816、Hz-818或HP-20。

5. 根据权利要求3所述的一种从头孢克洛酶促反应液中分离纯化各组分的方法，其特征在于，所述乙醇-水混合液的pH值不超过3，上述洗脱采用梯度洗脱，且乙醇体积分数为20%以下洗脱液弃之，乙醇体积分数≥50%时收集，合并后用于浓缩结晶；所述洗脱液的体积≥4倍柱体积，浓缩倍数≥10。

6. 根据权利要求3所述的一种从头孢克洛酶促反应液中分离纯化各组分的方法，其特征在于，所述结晶头孢克洛的条件：往浓缩后的洗脱液中加入其0.5～2倍体积的乙醇，且采用氨水保持pH值为3.0～4.0。

7. 根据权利要求3所述的一种从头孢克洛酶促反应液中分离纯化各组分的方法，其特征在于，所述步骤（3）具体方法如下：将步骤（2）所得滤液和水洗脱液合并，经过离子交换树脂吸附，采用解析剂进行解析，将解析液浓缩并调节pH值结晶即得D-苯甘氨酸晶体。

8. 根据权利要求7所述的一种从头孢克洛酶促反应液中分离纯化各组分的方法，其特征在于，所述离子交换树脂为JK-006或732阳离子交换树脂；所述解析剂为盐酸，且浓度为0.5～2mol/L。

9. 根据权利要求7所述的一种从头孢克洛酶促反应液中分离纯化各组分的方法，其特征在于，所述解析剂的体积≥4倍柱体积，浓缩倍数≥2。

10. 根据权利要求7所述的一种从头孢克洛酶促反应液中分离纯化各组分的方法，其特征在于，采用氨水调节解析液的PH值至3～9。