CN103193782A - 光敏剂叶绿酸钠盐衍生物及其制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及光敏剂叶绿酸钠盐衍生物及其制备方法和在制备治疗肿瘤药物中的新用途，尤其是在制备光动力学治疗膀胱癌肿瘤光敏剂药物中的用途。所述的光敏剂叶绿酸钠盐衍生物包括如下结构式的叶绿酸e₄钠盐、e₆钠盐和f钠盐化合物，本发明的叶绿酸钠盐经体外对人膀胱癌细胞的杀伤作用试验，结果显示，其对肿瘤细胞有明显的杀伤效应，尤其治疗膀胱原位癌和难治性、反复复发性表浅性膀胱肿瘤时，疗效好，毒性极小，安全性大，治疗时不需避光，有其独特的优势，为临床应用提供了有意义的实验依据。

Description

光敏剂叶绿酸钠盐衍生物及其制备方法和用途

技术领域

本发明涉及光敏剂叶绿酸钠盐衍生物及其制备方法和在制药中的新用途，具体涉及光敏剂叶绿酸钠盐衍生物在制备治疗肿瘤药物中的新用途，尤其是在制备治疗膀胱癌等肿瘤光敏剂药物中的用途。

背景技术

蚕砂在我国中医药的应用已有悠久历史，通常用于祛风除湿，和胃化浊等。唐代陈藏器《本草拾遗》、明代李时珍《本草纲目》等均载有蚕砂治疗妇人血崩、血少和血瘀等疾病。研究显示，蚕砂含有丰富的叶绿素，它是卟啉类化合物，它的酸水解产物含叶绿酸a和紫红素-18等化合物，还有研究表明，叶绿素的碱水解产物含叶绿酸e₆和叶绿酸e₄等化合物。

已知光敏剂（photosensitizer，又称增感剂，敏化剂）是一种本身（或其代谢产物）能选择的浓集于要作用的细胞的化学物质，它（或其代谢产物）在适当波长光的激发下能发生光动力反应而破坏靶细胞。光敏剂与一般抗癌药物的不同之处，是其使用受到设备条件的严格限制，因为光敏药物必须和专用的光动力激光治疗仪联合使用才能对患者产生治疗效果。目前已有三种光敏药物获得美国食品与药品管理局(FDA)的批准，即PHOTOFRIN(通用名Porfimer sodium)、Visudyne(通用名verteporfin，或化学结构简称BDP-MA)和氨基酮戊酸(5-aminolaevulanic acid,ALA)。后二种主要用于非肿瘤性疾病(老年性眼底黄斑病变、光化学性角化病)的治疗。迄今为止，PHOTOFRIN是已获得美国FDA批准可应用于多种实体恶性肿瘤治疗的唯一的光敏药物。随着光敏剂研究的发展，不同的疾病对光敏剂的有关参数的要求也不相同，不同的临床用途要求不同的光敏剂与之匹配。理想的新型光敏剂需要符合下述要求：①组分单一，结构明确；②方便给药，缩短给药到治疗的时间；③排泄快、毒、副作用小，避光时间短；④有较高的作用效率，产生足够的ROS；⑤在病变组织上被选择性吸收，对健康组织应不吸收或少吸收；⑥与相应的治疗疾病有匹配的作用波长，等等。

研究显示，叶绿酸类化合物对增生迅速的组织，具有蓄积作用，而肿瘤组织的蓄积是正常组织的10-15倍。本发明拟研究提出叶绿酸类化合物作为治疗肿瘤的光敏剂药物。

发明内容

本发明的目的是提供光敏剂叶绿酸钠盐衍生物及其制备方法和在制药中的新用途，具体涉及光敏剂叶绿酸钠盐衍生物在制备治疗肿瘤药物中的新用途，尤其是在制备治疗膀胱癌等肿瘤光敏剂药物中的用途。

本发明的光敏剂叶绿酸钠盐衍生物包括叶绿酸e₄钠盐、e₆钠盐和f钠盐，可由中药蚕砂为原料制备得到。经试验证实，所述的光敏剂叶绿酸钠盐衍生物应用于光动力学治疗肠道肿瘤和乳腺肿瘤效果良好，尤其是用于治疗膀胱原位癌和难治性、反复复发性表浅性膀胱肿瘤时，对肿瘤细胞有明显的杀伤效应，疗效好，毒性极小，安全性大，治疗时不需避光，有其独特的优势，是一类理想的光敏剂。

本发明提供了制备叶绿酸钠盐衍生物的方法，其包括步骤：

以中药蚕砂为原料，用有机溶剂提取得到的叶绿素粗品，溶于极性有机溶剂中，经过碱水解、分离、提取、纯化得到叶绿酸e₆，再由叶绿酸e₆分别转化为e₄、和f，再制备成相应的钠盐；或在叶绿酸固体中，加入2-10％氢氧化钠水溶液，使其刚刚完全溶解，真空干燥，得叶绿酸钠盐固体。

所述的叶绿酸衍生物和氢氧化钠的摩尔比为1∶2-3；

所述的叶绿酸钠盐包括如下结构式的叶绿酸e₄钠盐、e₆钠盐和f钠盐，

本发明进一步提供了所述的叶绿酸钠盐衍生物的用途，尤其是用于制备治疗肠道肿瘤和乳腺肿瘤的光敏剂药物，更尤其是用于制备治疗膀胱癌的光敏剂药物。

本发明的叶绿酸钠盐经体外对人膀胱癌T24细胞的杀伤作用试验，结果显示，治疗膀胱原位癌和难治性、反复复发性表浅性膀胱肿瘤时，对肿瘤细胞有明显的杀伤效应，疗效好，毒性极小，安全性大，治疗时不需避光，有其独特的优势，为临床应用提供了有意义的实验依据。

表1显示了本发明的光敏剂叶绿酸钠盐衍生物对人膀胱癌细胞T24细胞的杀伤效应。

表1叶绿酸光敏剂对人膀胱癌T24细胞的生长抑制率

为了便于理解，以下将通过具体实施方式对本发明进行详细地描述，将有助于理解本发明。需要特别指出的是，这些描述仅仅是示例性的描述，并不构成对本发明范围的限制。依据本说明书的论述，本发明的许多变化、改变对所属领域技术人员来说都是显而易见的。

具体实施方式

本发明实施例中采用岛津10AT高压液相仪（HPLC）测定保留时间（Rt），使用C₁₈柱25cm×0.4mm，流动相：（1）1M醋酸铵：甲醇=2∶8（V/V），(2)丙酮：甲醇=1∶1（V/V）；梯度：（1）0-15min，（2）0-100%，紫外检测器。

用Ion Spec HiRes,MALDI质谱仪测定质谱。

用薄层层析（TLC）测定制备过程中的质量，用上海试剂公司生产的硅胶G板10×10cm玻璃板，室温25℃，展开剂：正丁醇∶乙醇∶氨水=2∶1∶1（v/v）。

实施例1

制备叶绿酸e₆钠盐

用中药蚕砂为原料，粉碎，加3-5倍体积的80%丙酮溶解,在60℃水浴中搅拌2-4小时，过滤，滤渣再用80％的丙酮浸提2次，合并滤液，蒸去丙酮。残留的水溶液用10％NaOH调pH到10，用等体积的纯化汽油提取3-4次，去杂质，浓缩，得膏状叶绿素粗品。

取叶绿素粗品200g，加入80％的丙酮800ml,搅拌均匀后加入20%的NaOH 30ml，60℃水解60min,蒸去丙酮，放置，分层后取碱性水溶液，用18%的HCl调溶液的pH到10左右。用400ml纯化汽油提取去杂质4次，过滤，滤液再用18%的HCl调溶液的pH到3，有沉淀析出，滤取沉淀，用水洗涤，真空干燥，得墨绿色晶体。经硅胶柱层析（洗脱液，丙酮∶甲醇∶甲酸=50∶25∶1，V/V）得叶绿酸e₆ 3.86g。

叶绿酸e₆的TLC鉴定，HPLC保留时间的测定和质谱测定的结果如下：

TLC:Rf=0.27

HPLC:Rt=6.475min

MS m/z:598(M+H+1)⁺，597(M+H)⁺，596(M+H-1)⁺

取叶绿酸e₆ 5g,溶于无水丙酮中，加入4%NaOH乙醇溶液，到pH9-10，蒸去丙酮和乙醇，真空干燥，得叶绿酸e₆钠盐（e₆·Na）5.24g。

实施例2

制备叶绿酸e₄钠盐

取实施例1所述的方法制得的叶绿酸e₆ 5g，溶于100ml吡啶中，在120℃油浴中通氮气回流60min,减压蒸去吡啶，加入200ml水，调pH到3得墨绿色晶体，真空干燥，滤取沉淀，得叶绿酸e₄ 4.32g.

叶绿酸e₄的TLC鉴定，HPLC保留时间的测定和质谱测定的结果如下：

TLC:Rf=0.53

HPLC:Rt=6.632min

MS m/z:554(M+H+1)⁺，553(M+H)⁺

取叶绿酸e₄ 5g,制备叶绿酸e₄钠盐（e₄·Na），方法同实施实例1，得5.04g。

实施例3

制备叶绿酸f钠盐

取实施例1所述的方法制得的叶绿酸e₆ 5g，溶于100ml吡啶中，加25%KOH甲醇溶液250ml在通氧气条件下60min。在通氮气条件下回流60min,减压蒸去吡啶，加入200ml水，用18%HCl溶液调pH到3，有沉淀析出。滤取晶体，用水洗涤，真空干燥得叶绿酸f 4.0g。

叶绿酸f的TLC鉴定，HPLC保留时间的测定和质谱测定的结果如下：

TLC:Rf=0.65

HPLC:Rt=8.532min

MS m/z:550(M+H+1)⁺，539(M+H)⁺，538(M+H-1)⁺

取叶绿酸f5g,制备叶绿酸f钠盐（f·Na），方法同实施例1，得5.02g。

实施例4

按常规方法，进行不同浓度的叶绿酸钠盐体外人膀胱癌T24细胞杀伤作用试验，结果显示，所述的叶绿酸e₄钠盐，叶绿酸f钠盐和叶绿酸e₆钠盐，均明显抑制人膀胱癌T24细胞的生长，所述钠盐对肿瘤细胞有明显的杀伤效应。

表1为叶绿酸光敏剂对人膀胱癌T24细胞的生长抑制率。

表1

Claims (7)

1.光敏剂叶绿酸钠盐衍生物，其特征在于，所述叶绿酸钠盐衍生物包括如下结构式的叶绿酸e₄钠盐、e₆钠盐和f钠盐化合物，

2.一种如权利要求1所述的叶绿酸钠盐衍生物的制备方法，其特征在于，其包括步骤：

以中药蚕砂为原料，用有机溶剂提取得到叶绿素粗品，溶于极性有机溶剂中，加入氢氧化钠乙醇溶液，经过碱水解、分离、提取、纯化得到叶绿酸e₆，再由叶绿酸e₆分别转化为e₄、和f，再制备成相应的钠盐；或在叶绿酸固体中，加入2-10％氢氧化钠水溶液，使其完全溶解，真空干燥，得叶绿酸钠盐固体；

所述的叶绿酸衍生物和氢氧化钠的摩尔比为1∶2-3。

3.如权利要求2所述的叶绿酸衍生物钠盐的制备方法，其特征在于，制备叶绿酸e₆钠盐采用下述步骤：

用中药蚕砂为原料，粉碎，加3-5倍体积的80%丙酮溶解,在60℃水浴中搅拌2-4小时，过滤，滤渣再用80％的丙酮浸提2次，合并滤液，蒸去丙酮，残留的水溶液用10％NaOH调pH到10，用等体积的纯化汽油提取3-4次，去杂质，浓缩，得膏状叶绿素粗品；

取叶绿素粗品，加入80％的丙酮,搅拌均匀后加入20%的NaOH，60℃水解,蒸去丙酮，放置，分层后取碱性水溶液，用18%的HCl调溶液的pH到10左右，用纯化汽油提取去杂质，过滤，滤液再用18%的HCl调溶液的pH到3，沉淀析出，滤取沉淀，用水洗涤，真空干燥，得墨绿色晶体，经硅胶柱层析（洗脱液，丙酮∶甲醇∶甲酸=50∶25∶1，V/V）得叶绿酸e₆；

取叶绿酸e₆,溶于无水丙酮中，加入4%NaOH乙醇溶液，pH 9-10，蒸去丙酮和乙醇，真空干燥，得叶绿酸e₆钠盐。

4.如权利要求2所述的叶绿酸衍生物钠盐的制备方法，其特征在于，制备叶绿酸e₄钠盐采用下述步骤：

取制得的叶绿酸e₆，溶于100ml吡啶中，在120℃油浴中通氮气回流60min,减压蒸去吡啶，加入200ml水，调pH到3得墨绿色晶体，真空干燥，滤取沉淀，得叶绿酸e₄；溶于无水丙酮中，加入4%NaOH乙醇溶液，pH 9-10，蒸去丙酮和乙醇，真空干燥，得叶绿酸e₄钠盐。

5.如权利要求2所述的叶绿酸衍生物钠盐的制备方法，其特征在于，制备叶绿酸f钠盐采用下述步骤：

取制得的叶绿酸e₆，溶于100ml吡啶中，加25%KOH甲醇溶液250ml在通氧气条件下60min；在通氮气条件下回流60min,减压蒸去吡啶，加入200ml水，用18%HCl溶液调pH到3，沉淀析出，滤取晶体，用水洗涤，真空干燥得叶绿酸f；

取叶绿酸f,溶于无水丙酮中，加入4%NaOH乙醇溶液，pH 9-10，蒸去丙酮和乙醇，真空干燥，得绿酸f钠盐。

6.权利要求1所述的叶绿酸钠盐衍生物在制备光动力学治疗肿瘤光敏剂药物中的用途。

7.权利要求1所述的叶绿酸钠盐衍生物在制备光动力学治疗膀胱癌光敏剂药物中的用途。