CN103191239A

CN103191239A - 乙醇回流提取的枳实或枳壳总黄酮提取物及其用途

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Publication number: CN103191239A
Application number: CN2013101154093A
Authority: CN
Inventors: 吕武清; 唐春山; 谢宁; 杨小玲; 孙继寅; 宋友昕; 李志勇
Original assignee: Jiangxi Qingfeng Drugs Research Co Ltd; JIANGXI QINGFENG PHARMACEUTICAL CO Ltd
Current assignee: Jiangxi Qingfeng Drugs Research Co Ltd; JIANGXI QINGFENG PHARMACEUTICAL CO Ltd; JIANGXI QINGFENG PHARMACEUTICAL RES CO Ltd
Priority date: 2010-12-28
Filing date: 2010-12-28
Publication date: 2013-07-10

Abstract

本发明涉及一种枳实或枳壳总黄酮提取物，取枳实或枳壳，切成饮片或粉碎，加5～16倍体积的30％～90％乙醇回流提取1～3次，每次回流提取1～3小时，滤过；合并滤液，滤液回收乙醇，水溶液通过已处理好的非极性大孔树脂，依次用水、20％以下的乙醇洗脱除去杂质，再用25％～90％乙醇、0.5％～2％氢氧化钠洗脱，收集乙醇洗脱液，减压浓缩至相对密度约1.20～1.40(50℃～70℃)的流浸膏，减压干燥，干燥的温度为60～80℃，粉碎，即得枳实或枳壳总黄酮提取物，该提取物可制备用于胃肠运动障碍型功能性消化不良；上腹疼痛、腹胀、厌食、嗳气、恶心、呕吐及化疗药物或其他原因引起的呕吐的药物用途。

Description

乙醇回流提取的枳实或枳壳总黄酮提取物及其用途

技术领域

本发明涉及一种乙醇回流提取的枳实或枳壳总黄酮提取物及其用途。

背景技术

功能性消化不良(FD)是一种常见、多发病。又称为胃动力不足，或胃动力障碍。是一种常见的临床综合症，国外统计资料表明，1/3人群患过FD，占门诊人数的20％～30％。国内占消化系门诊患者50％左右，发生于20％～40％的正常人群。另外，80％以上的肿瘤患者化疗后会引起呕吐，止呕主要以灭吐灵、枢复宁等药物为主，但化药止呕伴有倦怠、头晕、头痛，甚至有可能出现颈背肌肉痉挛症状。

目前西医治疗主要以吗叮啉、西沙必利、莫沙必利等为主；但随其大量使用，发现有明显心脏毒副作用，不少患者在应用西沙必利后出现Q-T间期延长及心律失常，特别是尖端扭转型室速等严重不良反应，甚至导致死亡。为此，美国食品与药品管理局决定于2000年7月23日起停止使用该药，我国药品监督管理局也对西沙必利的使用做出了限定，但仍可在医师指导下应用。

中医治疗以破气消积，化痰散痞类中药；治疗积滞内停，痞满胀痛等，枳实为代表药之一。枳实、枳壳为芸香科植物酸橙Citrus aurantium L.及其栽培变种或甜橙Citrus sinensis Osbeckr的干燥幼果或未成熟果实。枳实、枳壳从《神农本草经》、《名医别录》记载：“除胸胁痰癖，逐停水，破结实，消胀满”、从金代医学家李东垣《内外伤辨惑论》中首创枳实导滞丸以手工制作，到目前临床配方应用及现代中药规模化生产并用于消化道疾病，前后有近二千年的历史；枳实、枳壳主要成分为黄酮等，其水煎液及橙皮苷等能显著增强正常小鼠和阿托品产生小鼠抑制模型的小肠的推进运动，具有促胃肠动力的作用。但枳实、枳壳仅少量用于临床配方及中成药制剂，大量资源没有得到广泛应用，其天然的破气消积作用可能与现代促进胃动力药的作用类同性没有得到充分挖掘。

发明内容

本发明的目的是提供一种乙醇回流提取的枳实或枳壳总黄酮提取物，用于胃肠运动障碍型功能性消化不良；上腹疼痛、腹胀、厌食、嗳气、恶心、呕吐及化疗药物或其他原因引起的呕吐。

本发明提供的枳实或枳壳总黄酮提取物，通过将枳实或枳壳用乙醇回流提取得到，其中乙醇回流提取方法是：取枳实或枳壳，切成饮片或粉碎，加5～16倍体积的30％～90％乙醇回流提取1～3次，每次回流提取1～3小时，滤过；合并滤液，滤液回收乙醇，水溶液通过已处理好的非极性大孔树脂，依次用水、20％以下的乙醇洗脱除去杂质，再用25％～90％乙醇、0.5％～2％氢氧化钠洗脱，收集乙醇洗脱液，减压浓缩至相对密度约1.20～1.40(50℃～70℃)的流浸膏，减压干燥干燥的温度为60～80℃，粉碎，即得。

优选的，具体的乙醇回流提取方法如下：取枳实或枳壳，切成饮片或粉碎，加6～14倍体积的40％～85％乙醇回流提取2～3次，每次回流提取1～2.5小时，滤过；合并滤液，滤液回收乙醇，水溶液通过已处理好的非极性大孔树脂，依次用水、20％以下的乙醇洗脱除去杂质，再用30％～85％乙醇、0.5％～1.8％氢氧化钠洗脱，收集乙醇洗脱液，减压浓缩至相对密度约1.25～1.40(55℃～70℃)的流浸膏，减压干燥，干燥的温度为65～80℃，粉碎，即得。

优选的，具体的乙醇回流提取方法如下：取枳实或枳壳，切成饮片或粉碎，加7～12倍体积的45％～80％乙醇回流提取2～3次，每次回流提取1.5～2.5小时，滤过；合并滤液，滤液回收乙醇，水溶液通过已处理好的非极性大孔树脂，依次用水、20％以下的乙醇洗脱除去杂质，再用35％～75％乙醇、0.5～1.6％氢氧化钠洗脱，收集乙醇洗脱液，减压浓缩至相对密度约1.25～1.35(55℃～65℃)的流浸膏，减压干燥，干燥的温度为70～80℃，粉碎，即得。

优选的，具体的乙醇回流提取方法如下：取枳实或枳壳，切成饮片或粉碎，加7～11倍体积的55％～75％乙醇回流提取2～3次，每次回流提取1.5～2小时，滤过；合并滤液，滤液回收乙醇，水溶液通过已处理好的非极性大孔树脂，依次用水、20％以下的乙醇洗脱除去杂质，再用40％～65％乙醇、0.5～1.3％氢氧化钠洗脱，收集乙醇洗脱液，减压浓缩至相对密度约1.30～1.35(60℃～65℃)的流浸膏，减压干燥，干燥的温度为70～75℃，粉碎，即得。

优选的，具体的乙醇回流提取方法如下：取枳实或枳壳，切成饮片或粉碎，加9倍体积的65％乙醇回流提取3次，每次回流提取1.5小时，滤过；合并滤液，滤液回收乙醇，水溶液通过已处理好的非极性大孔树脂，依次用水、20％以下的乙醇洗脱除去杂质，再用40％～55％乙醇、0.8～1.2％氢氧化钠洗脱，收集乙醇洗脱液，减压浓缩至相对密度约1.30(60℃)的流浸膏，减压干燥，干燥的温度为75℃，粉碎，即得。

优选的，具体的乙醇回流提取方法如下：取枳实或枳壳，切成饮片或粉碎，加7～9倍体积的60％～70％乙醇回流提取2次，每次回流提取1.5小时，滤过；合并滤液，滤液回收乙醇，水溶液通过已处理好的非极性大孔树脂，依次用水、20％以下的乙醇洗脱除去杂质，再用40％～55％乙醇、0.7％～1.3％氢氧化钠洗脱，收集乙醇洗脱液，减压浓缩至相对密度约1.30(60℃)的流浸膏，减压干燥，干燥的温度为75℃，粉碎，即得。

优选的，具体的乙醇回流提取方法如下：取枳实或枳壳，切成饮片或粉碎，加8倍体积的70％乙醇回流提取2次，每次回流提取2小时，滤过；合并滤液，滤液回收乙醇，水溶液通过已处理好的非极性大孔树脂，依次用水、20％以下的乙醇洗脱除去杂质，再用40％～50％乙醇、0.9％～1.1％氢氧化钠洗脱，收集乙醇洗脱液，减压浓缩至相对密度约1.30(60℃)的流浸膏，减压干燥，干燥的温度为75℃，粉碎，即得。

优选的，具体的乙醇回流提取方法如下：取枳实或枳壳，切成饮片，加7倍体积的65％乙醇回流提取2次，每次回流提取2小时，滤过；合并滤液，滤液回收乙醇，水溶液通过已处理好的D101大孔树脂柱，依次用水、15％乙醇、45％乙醇、1％氢氧化钠洗脱，收集45％乙醇洗脱液，减压浓缩至相对密度约1.30(60℃)的流浸膏，减压干燥，干燥的温度为75℃，粉碎，即得。

优选的，其中15％乙醇部分洗脱体积为每1ml树脂用3ml洗脱，45％乙醇洗脱时选择每1ml树脂用4ml洗脱。

优选的，其中枳实或枳壳通过8目筛粉碎。

优选的，其中总黄酮含量50％以上。

优选的，其中总黄酮含量80％以上。

优选的，其中还包含黄酮类化学成分及其医学上可以接受的酚酸类成分，黄酮类化学成分含柚皮苷、新橙皮苷、橙皮苷、新柚皮苷、野漆树苷及其苷元中的一种或多种。

优选的，其中柚皮苷含量、新橙皮苷含量分别达25％以上。

优选的，其中大孔树脂上样量按树脂体积(ml)：生药质量(g)为5∶1。

优选的，其中每1ml树脂的上样流速在1.25～1.55ml/h之间。

优选的，其中每1ml树脂的洗脱流速为1.25～1.45ml/h之间，所述非极性大孔树脂径高比为1∶10，上样后药液的静态吸附时间为1小时。

优选的，其中所述非极性大孔树脂重复8次后用10倍量的5％氢氧化钠溶液浸泡2小时，用水洗至中性；再用10倍量的3％盐酸溶液浸泡2小时，用水洗至中性以再生后使用。

一方面，本发明提供了枳实或枳壳总黄酮提取物用于制备治疗胃肠运动障碍型功能性消化不良疾病药物的用途。

在一方面，本发明提供了枳实或枳壳总黄酮提取物用于制备治疗化疗药物或其他原因引起的呕吐疾病药物的用途。

在一方面，本发明提供了枳实或枳壳总黄酮提取物用于制备治疗上腹疼痛疾病药物的用途。

在一方面，本发明提供了枳实或枳壳总黄酮提取物用于制备治疗腹胀、厌食、嗳气疾病药物的用途。

在一方面，本发明提供了枳实或枳壳总黄酮提取物用于制备治疗恶心疾病药物的用途。

另一方面，本发明还提供了一种枳实或枳壳总黄酮提取物制剂，该制剂以所述的枳实或枳壳总黄酮提取物为主要活性成分。

实验数据证明，本发明乙醇回流提取获得的枳实或枳壳总黄酮提取物，可用于治疗胃肠运动障碍型功能性消化不良；上腹疼痛、腹胀、厌食、嗳气、恶心、呕吐及化疗药物或其他原因引起的呕吐。

更重要地是，本发明乙醇回流提取获得的枳实或枳壳总黄酮提取物除具有显著的促进胃动力作用外，还对顺铂等药物所致的呕吐极其有效，具有吗叮啉所没有的效果。同时又没有西沙必利、莫沙必利的心脏毒副作用，能彻底避免西沙必利、莫沙必利导致的心脏安全性风险。

而医学和药学研究人员无法预先在不做实验的前提下，预先得知本发明乙醇回流提取获得的枳实或枳壳总黄酮提取物具有上述良好的效果。

综上所述，本发明提供的乙醇回流提取获得的枳实或枳壳总黄酮提取物及其用途带来显著的技术效果。

具体实施方式

实施例1

制备方法：取枳实或枳壳，切成饮片，加10倍体积的35％乙醇回流提取3次，每次回流提取1.5小时，滤过；合并滤液，滤液回收乙醇，水溶液通过已处理好的AB-8大孔树脂，依次用水、18％乙醇洗脱除去杂质，再用37％乙醇、0.5％氢氧化钠洗脱，收集37％乙醇洗脱液，减压浓缩至相对密度约1.22(50℃)的流浸膏，减压干燥(63℃)，粉碎，即得。

实施例2

制备方法：取枳实或枳壳，切成饮片，加6倍体积的56％乙醇回流提取3次，每次回流提取1小时，滤过；合并滤液，滤液回收乙醇，水溶液通过已处理好的D101大孔树脂，依次用水、16％乙醇洗脱除去杂质，再用35％乙醇、0.7％氢氧化钠洗脱，收集35％乙醇洗脱液，减压浓缩至相对密度约1.20(55℃)的流浸膏，减压干燥(60℃)，粉碎，即得。

实施例3

制备方法：取枳实或枳壳，切成饮片，加11倍体积的40％乙醇回流提取2次，每次回流提取1小时，滤过；合并滤液，滤液回收乙醇，水溶液通过已处理好的D101大孔树脂，依次用水、14％乙醇洗脱除去杂质，再用40％乙醇、0.8％氢氧化钠洗脱，收集40％乙醇洗脱液，减压浓缩至相对密度约1.23(55℃)的流浸膏，减压干燥(65℃)，粉碎，即得。

实施例4

制备方法：取枳实或枳壳，切成饮片，加5倍体积的45％乙醇回流提取3次，每次回流提取1小时，滤过；合并滤液，滤液回收乙醇，水溶液通过已处理好的D101大孔树脂，依次用水、15％乙醇洗脱除去杂质，再用35％乙醇、0.6％氢氧化钠洗脱，收集35％乙醇洗脱液，减压浓缩至相对密度约1.20(60℃)的流浸膏，减压干燥(70℃)，粉碎，即得。

实施例5

制备方法：取枳实或枳壳，切成饮片，加12倍体积的55％乙醇回流提取2次，每次回流提取2小时，滤过；合并滤液，滤液回收乙醇，水溶液通过已处理好的AB-8大孔树脂，依次用水、10％乙醇洗脱除去杂质，再用45％乙醇、0.8％氢氧化钠洗脱，收集45％乙醇洗脱液，减压浓缩至相对密度约1.22(58℃)的流浸膏，减压干燥(65℃)，粉碎，即得。

实施例6

制备方法：取枳实或枳壳，切成饮片，加7倍体积的50％乙醇回流提取2次，每次回流提取2小时，滤过；合并滤液，滤液回收乙醇，水溶液通过已处理好的D101大孔树脂，依次用水、15％乙醇洗脱除去杂质，再用45％乙醇、1.1％氢氧化钠洗脱，收集45％乙醇洗脱液，减压浓缩至相对密度约1.25(55℃)的流浸膏，减压干燥(65℃)，粉碎，即得。

实施例7

制备方法：取枳实或枳壳，粉碎，加8倍体积的60％乙醇回流提取2次，每次回流提取2.5小时，滤过；合并滤液，滤液回收乙醇，水溶液通过已处理好的AB-8大孔树脂，依次用水、9％乙醇洗脱除去杂质，再用42％乙醇、0.8％氢氧化钠洗脱，收集42％乙醇洗脱液，减压浓缩至相对密度约1.30(50℃)的流浸膏，减压干燥(65℃)，粉碎，即得。

实施例8

制备方法：取枳实或枳壳，粉碎，加8倍体积的60％乙醇回流提取2次，每次回流提取2.5小时，滤过；合并滤液，滤液回收乙醇，水溶液通过已处理好的AB-8大孔树脂，依次用水、14％乙醇洗脱除去杂质，再用50％乙醇、0.9％氢氧化钠洗脱，收集50％乙醇洗脱液，减压浓缩至相对密度约1.30(55℃)的流浸膏，减压干燥(65℃)，粉碎，即得。

实施例9

制备方法：取枳实或枳壳，粉碎，加9倍体积的70％乙醇回流提取2次，每次回流提取2小时，滤过；合并滤液，滤液回收乙醇，水溶液通过已处理好的AB-8大孔树脂，依次用水、8％乙醇洗脱除去杂质，再用45％乙醇、0.9％氢氧化钠洗脱，收集45％乙醇洗脱液，减压浓缩至相对密度约1.25(55℃)的流浸膏，减压干燥(70℃)，粉碎，即得。

实施例10

制备方法：取枳实或枳壳，粉碎，加9倍体积的65％乙醇回流提取2次，每次回流提取2小时，滤过；合并滤液，滤液回收乙醇，水溶液通过已处理好的AB-8大孔树脂，依次用水、15％乙醇洗脱除去杂质，再用45％乙醇、0.9％氢氧化钠洗脱，收集45％乙醇洗脱液，减压浓缩至相对密度约1.30(60℃)的流浸膏，减压干燥(70℃)，粉碎，即得。

实施例11

取枳实或枳壳，切成饮片，加7倍体积的65％乙醇回流提取3次，每次回流提取1.5小时，滤过；合并滤液，滤液回收乙醇，水溶液通过已处理好的D101大孔树脂柱，依次用水、15％乙醇、40％乙醇、1％氢氧化钠洗脱，收集40％乙醇洗脱液，减压浓缩至相对密度约1.30(60℃)的流浸膏，减压干燥(75℃)，粉碎，即得。

实施例12

取枳实或枳壳，切成饮片，加7倍体积的65％乙醇回流提取2次，每次回流提取2小时，滤过；合并滤液，滤液回收乙醇，水溶液通过已处理好的D101大孔树脂柱，依次用水、15％乙醇、45％乙醇、1％氢氧化钠洗脱，收集45％乙醇洗脱液，减压浓缩至相对密度约1.30(60℃)的流浸膏，减压干燥(75℃)，粉碎，即得。

实验数据1：提取工艺优化研究

黄酮苷类化合物一般易溶于热水、甲醇、乙醇、吡啶及稀碱溶液中，而难溶或不溶于苯、乙醚、氯仿、石油醚等有机溶剂中。枳实中的主要活性成分是以柚皮苷和新橙皮苷为代表的二氢黄酮类成分，这些二氢黄酮的极性比一般的黄酮类成分都大，可溶于水及低浓度乙醇中，易溶于热水或热的稀乙醇溶液。

根据药材中所含主要化学成分的理化性质，参考有关文献，同时结合预试验结果，采用醇提取，提取液上大孔树脂纯化的方法。

考察指标分别为得膏率、总黄酮含量和总黄酮的转移率

1.提取工艺条件的优选

1.1提取溶剂的选择

将枳实药材粉碎过8目筛，取12份，分为4组，每组平均三份，各自用水、65％乙醇、95％乙醇和饱和石灰水提取。结果见表1。

表1 提取溶剂的选择

结论：由表1可知，三种提取溶剂以65％乙醇提取效果最好，因此以65％乙醇为提取溶剂。

1.2药材粒度的选择

将粉碎好的枳实过筛，各取饮片、破碎成黄豆大小颗粒、8目、20目、40目三份，共15份，分别加乙醇回流提取。结果见表2。

表2 药材粒度的选择

结论：由表2中有关数据可知，加乙醇回流提取，药材的粒度有较大的差别，并不是药材颗粒越细越好，其中以破碎成黄豆大小颗粒及8目药材得膏率和总黄酮苷的转移率最高，结合生产实际，择黄豆大小颗粒作为药材最终的破碎粒度。

1.3正交试验法优选提取工艺

根据以上的实验结果，现以提取过程中提取时间(A)、提取次数(B)、加65％乙醇量(C)、提取前浸泡时间(D)四项作为考察因素，每一因素设三个水平，按L9(3⁴)正交表进行正交实验设计(表3、表4)，考察指标为得膏率和总黄酮苷转移率。

表3 因素水平表

取枳实药材颗粒27份，每组平均三份，共九组，按表4L9(34)正交试验表设计试验。结果见表4。

表4 L9(3⁴)正交试验表

(1)直观分析：

得膏率最佳工艺：B₃C₃A₃D₁(B、C为主要因素)

总黄酮苷转移率最佳工艺：B₃C₃A₁D₁(B、C为主要因素)

(2)方差分析

结果见表5。

表5 以总黄酮苷转移率为指标的方差分析

^＊F_{1-0.05(2，2)}＝19.0^＊＊F_1-0.01(2，2)＝99.0

(3)结论：直观分析可知，提取次数(B)及所用溶剂体积(C)对提取效果影响较大，提取时间(A)及浸泡时间(D)对提取效果影响较小。以转移率为指标进行方差分析，表5分析结果进一步验证了直观分析结论，即所设因素B、C对提取效果有较大影响。由于因素A对煎煮效果影响较小，由此初步确定提取条件为18倍量65％乙醇(与药材重量比)提3次(8倍、5倍、5倍)，每次提取时间1h，药材不浸泡。

2.验证试验

取枳实药材(黄豆大小颗粒)3份，按正交试验选取的最佳提取工艺条件进行验证试验，即：18倍量65％乙醇(8倍/lh、5倍/lh、5倍/lh)分别提取3次，药材不浸泡。结果见表6。

表6 验证试验测定结果

结论：由表6可知，按优选工艺65％乙醇提取3次，总黄酮苷已有95％以上被提出，且三个样品总黄酮苷转移率较为一致(RSD为1.88％)，结果显示最后确定的最佳提取工艺是合理、稳定的。

实验数据2：枳实总黄酮提取物的纯化研究

2.1分离纯化工艺考察

枳实药材用65％乙醇提取后提出大量水溶性杂质，必须对65％乙醇提液进行进一步纯化处理，以提高黄酮类有效成分的含量，水溶性杂质多为无机盐、糖类、果胶及蛋白质类，而枳实中的活性成分为黄酮类化合物，根据黄酮类化物特性及目前我国常用的分离纯化方法，因此选择用大孔树脂来富集纯化该黄酮类成分。

通过上样量考察，最终确定1000ml的大孔树脂吸附200g生药作为最终的上样量(即0.2g生药/ml树脂)。

之后，通过洗脱体积的考察，确定15％乙醇部分洗脱体积确定为3000ml(即每1ml树脂用3ml15％乙醇洗脱)，45％乙醇洗脱时选择用4000ml(即1ml树脂用4ml45％乙醇洗脱)。

再进一步地，通过上样流速的考察，确定上样流速应选择在1250ml/h～1550ml/h之间较好(即每1ml树脂的上样流速在1.25～1.55ml/h之间)。

2.2正交优选大孔树脂优化工艺

根据以上的实验结果，现以洗脱流速、大孔树脂的径高比和上样后药液的静态吸附时间三项作为考察因素，每一因素设三个水平，按L9(3⁴)正交表进行正交实验设计(表7、表8)，考察指标为得膏率、总黄酮苷的含量和总黄酮苷转移率。

表7 因素水平表

取相当于生药200g水溶液9份，按表8L9(3⁴)上预先处理好的大孔树脂(每根树脂装1000ml大孔树脂)，分别用4000ml的水、3000ml15％的乙醇、4000ml45％乙醇和3000ml95％乙醇洗脱。结果见表8。

表8 L9(3⁴)正交试验表

(1)直观分析

根据R值分析，得膏率最佳工艺：A₁B₁C₃(A为主要因素)

根据R值分析，总黄酮苷转移率最佳工艺：A₁B₁C₃(A为主要因素)

(2)方差分析

结果见表9、表10。

表9 以得膏率为指标的方差分析

表10 以总黄酮苷转移率为指标的方差分析

^＊F_1-0.05(₂，₂)＝19.0^＊＊F_1-0.01(2，2)＝99.0

(3)结论：直观分析可知，树脂的洗脱流速(A)为主要因素，大孔树脂的径高比(C)和上样后药液的静态吸附时间(B)影响较小。以得膏率和总黄酮苷的转移率为指标进行方差分析，表9、10中分析结果进一步验证了直观分析结论，即所设因素A对洗脱效果有较大影响。由于总黄酮含量为本项目的主要指标，结合柱层析柱径比工业化生产实际，初步确定最佳条件为A₁B₁C₂即：洗脱流速为1250～1450ml/h(即每1ml树脂的洗脱流速为1.25～1.45ml/h之间)，径高比为1∶10，上样后药液的静态吸附时间为1小时。

2.3验证试验及树脂使用次数试验

取枳实药材(黄豆大小颗粒)加乙醇回流提取，回收乙醇，水溶液为13份，每份相当于200g生药，备用。

a.取1份上样于1000ml大孔树脂(树脂柱径高比为1∶10)，上样流速为1400ml/h，静态吸附1小时。依次用4000ml的水、3000ml15％的乙醇、4000ml45％乙醇和3000ml95％乙醇洗脱以1400ml/h的流速洗脱。收集45％乙醇洗脱液进行含量测定。结果见表11。

b.将a用后的树脂以水洗至无醇味，另取一份冰箱冷藏的样品上此树脂，按a的步骤重复处理。树脂依次进行下次吸附(以下步骤同a.b)。

表11 验证试验测定结果

结论：从表11中可以看出按最佳工艺所进行的验证试验，重复8次所得的样品总黄酮苷含量和总黄酮苷转移率均有所提高。且样品的各项指标均一，稳定，说明此工艺最佳、稳定的。同时在使用8次以后需要对树脂进行再生处理。

2.4树脂再生后使用试验

将树脂用10倍量的5％氢氧化钠溶液浸泡2小时，用水洗至中性；再用10倍量的3％盐酸溶液浸泡2小时，用水洗至中性。再生好的树脂，按验证试验及树脂使用次数试验项下方法依次吸附洗脱3次，计算得膏率，液相检测总黄酮苷含量和转移率。结果见表12。

表12 树脂再生后使用试验

结果显示树脂再生后使用情况良好。

根据上述分离、纯化研究，药材提取后合并提取液，滤过，滤液通过已处理好的D101大孔树脂柱，依次用水、15％乙醇、45％乙醇、1％氢氧化钠洗脱，收集45％乙醇洗脱液。

实验数据3：枳实总黄酮提取物干燥方法及干燥温度的研究

取枳实药材1kg，共10份，照上述确定的提取、纯化工艺，经提取、纯化后，收集45％乙醇洗脱液，减压回收乙醇并浓缩至相对密度约1.30(60℃)的浸膏，对上述浸膏分别采用烘干法、真空干燥法进行比较研究。烘干法和真空干燥法分别进行5种不同温度(50℃、65℃、75℃、85℃、95℃)的比较。考察总黄酮苷的含量。结果见表13和表14。

表13 烘干法不同温度的测定结果

表14 真空干燥法不同温度的测定结果

从表13、14可知，烘干法在同一温度水平上较真空干燥所需时间长，效果不如真空干燥。烘干法烘干的样品色泽较差，不易粉碎，且随着温度的上升，烘干法易因局部过热而引起碳化，从而造成样品颜色发黑，有效成分丢失。真空干燥时易拉干成蜂窝状，有利于粉碎，且色泽较好，同时真空干燥的温度控制在75℃左右为宜，省时又不会造成有效成分的丢失。

以下全部选用实施例12枳实总黄酮苷提取物作为实验组

实验数据4：枳实总黄酮苷提取物镇吐作用

4.1枳实总黄酮苷提取物对硫酸铜致家鸽呕吐的影响

家鸽60只，体重280～350g，雌雄各半。随机分为6组：对照组、实施例12枳实总黄酮苷提取物(20、40、80、160mg·kg^-1)4个剂量组以及阳性药组(吗丁琳40mg·kg^-1)，每组10只，♀

各半。各组家鸽禁食不禁水16小时，次日一次给药，对照组给予蒸馏水灌胃，其他组灌胃相应药物，10ml·kg^-1。1小时后各组家鸽给予3.5％的硫酸铜溶液10mg·kg^-1灌胃造模。记录各组家鸽呕吐潜伏时间和2小时内呕吐次数，试验结果显示，枳实总黄酮苷提取物(20、40、80、160mg·kg^-1)一次给药均不能延长硫酸铜所致家鸽的呕吐潜伏时间，但枳实总黄酮苷提取物(40、80mg·kg^-1)一次给药能减少硫酸铜所致家鸽的呕吐次数，见表15。

表15 枳实总黄酮苷提取物对硫酸铜致家鸽呕吐的影响

注：与对照组比较，^*P＜0.05，^**P＜0.01

4.2枳实总黄酮苷提取物对顺铂致家鸽呕吐的影响

家鸽80只，体重280～350g，雌雄各半。随机分为8组：对照组、实施例12枳实总黄酮苷提取物(20、40、80、160mg·kg^-1)4个剂量组以及阳性药3组(吗丁琳80、160mg·kg^-1和盐酸昂丹司琼注射液5ug·kg^-1)每组10只，♀

各半。各组家鸽禁食不禁水16小时，次日一次给药，对照组给予蒸馏水灌胃，其他组给予相应药物，1小时后腹腔注射给予13mg·kg^-1的注射用顺铂。记录各组家鸽呕吐潜伏时间和4小时内呕吐次数，试验结果显示，枳实总黄酮苷提取物80mg·kg^-1一次给药能延长顺铂所致家鸽的呕吐时间，但20、40和160mg·kg^-1时均不能延长顺铂所致家鸽的呕吐时间；枳实总黄酮苷提取物(80、160mg·kg^-1)一次给药能减少顺铂所致家鸽的呕吐次数，见表16

表16 枳实总黄酮苷提取物对顺铂致家鸽呕吐的影响

注：与对照组比较，^*P＜0.05，^**P＜0.01

4.3枳实总黄酮苷提取物对阿朴吗啡致杂种犬呕吐的影响

杂种犬56只，体重8.0～10.0kg，雌雄各半。随机分为7组：对照组、实施例12枳实总黄酮苷提取物(15、30、60、120mg·kg^-1)4个剂量组以及阳性药2组(吗丁啉30mg·kg^-1和盐酸甲氧氯普胺注射液1mg·kg^-1)，每组8只，♀

各半。各组杂种犬禁食不禁水16小时，次日一次给药，对照组给予蒸馏水灌胃，其他组给予相应药物灌胃，5ml·kg^-1。1小时后给予500ug·kg^-1的阿朴吗啡皮下注射。记录各组杂种犬呕吐潜伏时间和1小时内呕吐次数。试验结果显示，枳实总黄酮苷提取物(15、30、60、120mg·kg^-1)一次给药均不能减少阿朴吗啡致杂种犬呕吐次数；枳实总黄酮苷提取物(15、30、120mg·kg^-1)亦不能延长阿朴吗啡致杂种犬的呕吐潜伏时间，但枳实总黄酮苷提取物60mg·kg^-1时能延长杂种犬的呕吐潜伏时间，见表17。

表17 枳实总黄酮苷提取物对阿朴吗啡致杂种犬呕吐的影响

注：与对照组比较，^*P＜0.05

实验数据5：枳实总黄酮苷提取物对肠推进作用

5.1枳实总黄酮苷提取物对多巴胺致肠功能低下小鼠的影响

小鼠70只，体重19～22g，随机分为7组：对照组、模型组、实施例12枳实总黄酮苷提取物(25、50、100、200mg·kg^-1)4个剂量组以及阳性药组(吗丁啉50mg·kg^-1)，每组10只，♀

各半。各组小鼠禁食不禁水16小时，次日一次给药，对照组灌胃蒸馏水，其他组给予相应药物灌胃。各小鼠灌胃30分钟后除对照组外，其余小鼠给予1.7mg·kg^-1盐酸多巴胺注射液皮下注射造模，20分钟后 70只小鼠分别灌服2％的羧甲基纤维素钠碳末混悬液0.2ml·10g^-1，20分钟后小鼠脱颈处死，立即取出胃肠，平铺，测定碳末前端至幽门的距离和小肠全长，以两者之比计算推进百分率。试验结果显示，皮下注射1.7mg·kg^-1的多巴胺可明显抑制小鼠的肠推进，枳实总黄酮苷提取物(25、50、100mg·kg^-1)能提高由多巴胺抑制的小鼠肠推进活动，见表18。

表18 枳实总黄酮苷提取物对多巴胺致小鼠肠推进的影响

注：与对照组比较，^△P＜0.05，与模型组比较，^*P＜0.05，^**P＜0.01

5.2枳实总黄酮苷提取物对阿托品致肠功能低下小鼠的影响

各半。各组小鼠禁食不禁水16小时，次日一次给药，对照组灌胃蒸馏水，其他组给予相应药物灌胃。各小鼠灌胃30分钟后除对照组外，其余小鼠给予2.5mg·kg^-1的阿托品皮下注射造模，20分钟后70只小鼠分别灌服2％的羧甲基纤维素钠碳末混悬液0.2ml·10g^-1，20分钟后小鼠脱颈处死，立即取出胃肠，平铺，测定碳末前端至幽门的距离和小肠全长，以两者之比计算推进百分率。试验结果显示，皮下注射2.5mg·k_g ^-1的阿托品可明显抑制小鼠的肠推进，枳实总黄酮苷提取物50mg·kg^-1能提高由阿托品抑制的小鼠肠推进活动，见表19。

表19 枳实总黄酮苷提取物对阿托品致小鼠肠推进的影响

注：与对照组比较，^△P＜0.05；与模型组比较，^*P＜0.05

5.3枳实总黄酮苷提取物对肾上腺素致肠功能低下小鼠的影响

小鼠70只，体重19～22g，随机分为7组：对照组、模型组、实施例12枳实总黄酮苷提取物(25、50、100、200mg·kg-1)4个剂量组以及阳性药组(吗丁啉50mg·kg-1)，每组10只，♀各半。各组小鼠禁食不禁水16小时，次日一次给药，对照组灌胃蒸馏水，其他组给予相应药物灌胃。各小鼠灌胃30分钟后除对照组外，其余小鼠给予0.5mg·kg^-1的盐酸肾上腺素注射液皮下注射造模，20分钟后70只小鼠分别灌服2％的羧甲基纤维素钠碳末混悬液0.2ml·10g-1，20分钟后小鼠脱颈处死，立即取出胃肠，平铺，测定碳末前端至幽门的距离和小肠全长，以两者之比计算推进百分率。试验结果显示，皮下注射0.5mg·kg^-1的肾上腺素可明显抑制小鼠的肠推进，枳实总黄酮苷提取物(25、50、100、200mg·kg^-1)均不能改善由肾上腺素抑制的小鼠肠推进活动，见表20。

表20 枳实总黄酮苷提取物对肾上腺素致小鼠肠推进的影响

注：与对照组比较，^△△P＜0.01

实验数据6：枳实总黄酮苷提取物对胃液分泌量、胃酸和胃蛋白酶的影响

6.1对胃液分泌量、胃酸的影响

大鼠48只，体重230～270g，随机分为6组：对照组、实施例12枳实总黄酮苷提取物(20、40、80、160mg·kg^-1)4个剂量组以及阳性药组(吗丁啉40mg·kg^-1)，每组8只，♀

各半。试验前大鼠禁食不禁水36小时，大鼠一次灌胃给药，对照组给予蒸馏水，其他组给予相应药物。给药同时，各大鼠在乙醚浅麻醉下，打开腹腔，结扎幽门，收集幽门结扎后5小时的大鼠胃液，以3000r/min离心5min，去处食物残渣等胃内容物，用量筒准确称量胃液量。量取胃液1ml，置于三角烧瓶中加入等量蒸馏水，混合均匀，加入游离酸指示剂0.5％对二甲基偶氮苯胺乙醇溶液和总酸指示剂0.5％酚酞乙醇溶液各2滴，混合胃液中若含有盐酸，即呈樱红色。用滴定管滴加0.01mol/L的NaOH，，边加边摇动烧瓶，至红色消失，开始出现桔黄色为止。即为游离盐酸的终点。记下用去NaOH至红色不再变深为止的量，即为总酸度的终点。记下两次滴定用去NaOH溶液总量。计算游离盐酸和总酸的浓度以及总分泌量。试验结果显示，枳实总黄酮苷提取物(20、40、80mg·kg^-1)对幽门结扎大鼠的胃液分泌量无明显影响，但枳实总黄酮苷提取物160mg·kg^-1可减少大鼠的胃液分泌量；枳实总黄酮苷提取物(80、160mg·kg^-1)可升高幽门结扎大鼠游离盐酸和总酸的浓度，但枳实总黄酮苷提取物各剂量(20、40、80、160mg·kg^-1)对游离盐酸和总酸的分泌量无影响，见表21。

表21 枳实总黄酮苷提取物对大鼠胃液分泌量、游离盐酸和总酸浓度的影响

注：与对照组比较，^*P＜0.05，^**P＜0.01

6.2对胃蛋白酶的影响

将内径1～2mm粗细匀称的毛细玻管洗净烤干，取适量蛋清充分打匀后用纱布过滤，将上述毛细玻璃管利用虹吸作用，灌满蛋清(管内应无气泡混入)。然后放置于85℃热蒸气中使蛋白质凝固。待冷却后，取出石蜡将蛋白管两端封固，贮冰箱中备用。实验时取胃液1ml放入50ml的三角烧瓶中，加0.05N盐酸溶液15ml，摇匀，放进约长2.5cm蛋白管二根。塞好瓶口，放于37℃恒温箱中温孵24h。用尺测量蛋白管两端透明部分的长度(mm)以四端之值求其平均值，用下列公式计算胃蛋白酶的单位＝平均值²×16。试验结果显示，枳实总黄酮苷提取物各剂量(20、40、80、160mg·kg^-1)对幽门结扎大鼠的胃蛋白酶活性无明显影响，见表22。

表22 枳实总黄酮苷提取物对大鼠游离盐酸、总酸分泌量和胃蛋白酶活性的影响

实验数据7：枳实总黄酮苷提取物对平滑肌的影响

7.1对离体胃肠平滑肌的影响

选用健康成年大鼠，猛击头部致昏，迅速取出全胃及十二指肠中段1-2cm，沿胃大弯处剪开，用含95％O₂和5％CO₂的混合气体充分饱和的pH7.35～7.45的Krebs液(成份：NaCl 117mmol/L、KCl4.8mmol/L、CaCl₂2.5mmol/L、MgCl₂1.2mmol/L、NaH₂PO₄1.2mmol/L、NaHCO₃25mmol/L、Glucose11mmol/L)反复冲洗去除内容物，分别取胃窦和胃底纵、横肌条以及十二指肠中段长约1cm，宽约0.5cm，底端固定于通气钩，上端与换能器(JH-2型肌张力传感器)相连，并将其置入盛有氧饱和的Krebs液(pH7.35～7.45)20ml的浴管中，调整前负荷为1g，每隔20min换液一次，通过通气钩向浴液内注入氧气，应用BL-420E生物机能实验系统记录其张力及频率。外管经恒流输液泵[持续、恒温(37±0.5℃)、恒速(3～4ml/min)]灌流以保持浴槽内温度。待标本稳定后，加入待测药品最终浓度分别为0.25mg/L、0.4mg/L、0.55mg/L、0.7mg/L、0.85mg/L和1.00mg/L，记录并观察用药前后频率及张力改变。离体试验结果显示，实施例12枳实总黄酮苷提取物(0.25mg.ml^-1～1.0mg.ml^-1)可降低胃窦和胃底纵、横形肌以及十二指肠平滑肌张力，抑制胃肠运动，见表23～27。

表23 枳实总黄酮苷提取物对离体胃窦横行肌张力和频率的影响

注：与给药前比较，^*P＜0.05，^**P＜0.01

表24 枳实总黄酮苷提取物对离体胃窦纵行肌张力和频率的影响

注：与给药前比较，^*P＜0.05，^**P＜0.01

表25 枳实总黄酮苷提取物对离体胃底横行肌张力和频率的影响

注：与给药前比较，^*P＜0.05，^**P＜0.01

表26 枳实总黄酮苷提取物对离体胃底纵行肌张力和频率的影响

注：与给药前比较，^*P＜0.05，^**P＜0.01

表27 枳实总黄酮苷提取物对离体十二指肠中段张力和频率的影响

注：与给药前比较，^*P＜0.05，^**P＜0.01

7.2对在体十二指肠平滑肌的影响

大鼠56只，体重180～230g，随机分为7组：对照组、模型组、实施例12枳实总黄酮苷提取物(20、40、80、160mg·kg^-1)4个剂量组以及阳性药组(吗丁琳40mg·kg^-1)，每组8只，♀各半。大鼠灌胃给药，对照组和模型组给予蒸馏水，其他组给予相应药物。各组大鼠禁食不禁水16小时，次日一次给药，各大鼠灌胃30分钟后除对照组外，其余大鼠给予1.5mg·kg^-1的盐酸多巴胺注射液皮下注射造模，水合氯醛麻醉，沿腹正中线打开腹腔，选择十二指肠中段约2-3cm，将肠段两端用缝合线固定在肠管固定管两侧的小孔上，再用一根缝合线将一端缝在肠段中间的肠壁上，另一端由肠管固定管中央穿出连在JH-2型肌张力传感器上，并通过BL-420E生物机能实验系统记录各大鼠十二指肠的张力及频率。试验结果显示，皮下注射1.5mg·kg^-1的多巴胺可明显抑制在体大鼠十二指肠的张力和频率，枳实总黄酮苷提取物(20、40、80、160mg·kg^-1)能提高由多巴胺抑制的大鼠十二指肠的张力和频率，见表28。

表28 枳实总黄酮苷提取物对在体十二指肠中段张力和频率的影响

注：与对照组比较，^△P<0.05，;与模型组比较，^*P<0．05，^**P<0．01。

Claims

1.枳实或枳壳总黄酮提取物用于制备治疗上腹疼痛疾病药物的用途，其特征在于：所述枳实或枳壳总黄酮提取物是通过将枳实或枳壳用乙醇回流提取得到，其中乙醇回流提取方法是：取枳实或枳壳，切成饮片或粉碎，加5～16倍体积的30％～90％乙醇回流提取1～3次，每次回流提取1～3小时，滤过；合并滤液，滤液回收乙醇，水溶液通过已处理好的非极性大孔树脂，其中每1ml树脂的上样流速在1.25～1.55ml/h之间，依次用水、20％以下的乙醇洗脱除去杂质，再用25％～90％乙醇、0.5％～2％氢氧化钠洗脱，收集乙醇洗脱液，减压浓缩至相对密度在50℃～70℃测定约为1.20～1.40的流浸膏，减压干燥，干燥的温度为60～80℃，粉碎，即得，其中总黄酮含量大于80％，还包含黄酮类化学成分及其医学上可以接受的酚酸类成分，黄酮类化学成分含柚皮苷、新橙皮苷、橙皮苷、新柚皮苷、野漆树苷及其苷元，所述柚皮苷含量、新橙皮苷含量分别达25％以上。

2.如权利要求1所述的用途，具体的乙醇回流提取方法如下：取枳实或枳壳，切成饮片或粉碎，加6～14倍体积的40％～85％乙醇回流提取2～3次，每次回流提取1～2.5小时，滤过；合并滤液，滤液回收乙醇，水溶液通过已处理好的非极性大孔树脂，依次用水、20％以下的乙醇洗脱除去杂质，再用30％～85％乙醇、0.5％～1.8％氢氧化钠洗脱，收集乙醇洗脱液，减压浓缩至相对密度在55℃～70℃测定约为1.25～1.40的流浸膏，减压干燥，干燥的温度为65～80℃，粉碎，即得。

3.如权利要求2所述的用途，具体的乙醇回流提取方法如下：取枳实或枳壳，切成饮片或粉碎，加7～12倍体积的45％～80％乙醇回流提取2～3次，每次回流提取1.5～2.5小时，滤过；合并滤液，滤液回收乙醇，水溶液通过已处理好的非极性大孔树脂，依次用水、20％以下的乙醇洗脱除去杂质，再用35％～75％乙醇、0.5～1.6％氢氧化钠洗脱，收集乙醇洗脱液，减压浓缩至相对密度在55℃～65℃测定约为1.25～1.35的流浸膏，减压干燥，干燥的温度为70～80℃，粉碎，即得。

4.如权利要求3所述的用途，具体的乙醇回流提取方法如下：取枳实或枳壳，切成饮片或粉碎，加7～11倍体积的55％～75％乙醇回流提取2～3次，每次回流提取1.5～2小时，滤过；合并滤液，滤液回收乙醇，水溶液通过已处理好的非极性大孔树脂，依次用水、20％以下的乙醇洗脱除去杂质，再用40％～65％乙醇、0.5～1.3％氢氧化钠洗脱，收集乙醇洗脱液，减压浓缩至相对密度在60℃～65℃测定约为1.30～1.35的流浸膏，减压干燥，干燥的温度为70～75℃，粉碎，即得。

5.如权利要求4所述的用途，具体的乙醇回流提取方法如下：取枳实或枳壳，切成饮片或粉碎，加9倍体积的65％乙醇回流提取3次，每次回流提取1.5小时，滤过；合并滤液，滤液回收乙醇，水溶液通过已处理好的非极性大孔树脂，依次用水、20％以下的乙醇洗脱除去杂质，再用40％～55％乙醇、0.8～1.2％氢氧化钠洗脱，收集乙醇洗脱液，减压浓缩至相对密度在60℃测定约为1.30的流浸膏，减压干燥，干燥的温度为75℃，粉碎，即得。

6.如权利要求4所述的用途，具体的乙醇回流提取方法如下：取枳实或枳壳，切成饮片或粉碎，加7～9倍体积的60％～70％乙醇回流提取2次，每次回流提取1.5小时，滤过；合并滤液，滤液回收乙醇，水溶液通过已处理好的非极性大孔树脂，依次用水、20％以下的乙醇洗脱除去杂质，再用40％～55％乙醇、0.7％～1.3％氢氧化钠洗脱，收集乙醇洗脱液，减压浓缩至相对密度在60℃测定约为1.30的流浸膏，减压干燥，干燥的温度为75℃，粉碎，即得。

7.如权利要求4所述的用途，具体的乙醇回流提取方法如下：取枳实或枳壳，切成饮片或粉碎，加8倍体积的70％乙醇回流提取2次，每次回流提取2小时，滤过；合并滤液，滤液回收乙醇，水溶液通过已处理好的非极性大孔树脂，依次用水、20％以下的乙醇洗脱除去杂质，再用40％～50％乙醇、0.9％～1.1％氢氧化钠洗脱，收集乙醇洗脱液，减压浓缩至相对密度在60℃测定约为1.30的流浸膏，减压干燥，干燥的温度为75℃，粉碎，即得。

8.如权利要求4所述的用途，具体的乙醇回流提取方法如下：取枳实或枳壳，切成饮片，加7倍体积的65％乙醇回流提取2次，每次回流提取2小时，滤过；合并滤液，滤液回收乙醇，水溶液通过已处理好的D101大孔树脂柱，依次用水、15％乙醇、45％乙醇、1％氢氧化钠洗脱，收集45％乙醇洗脱液，减压浓缩至相对密度在60℃测定约为1.30的流浸膏，减压干燥，干燥的温度为75℃，粉碎，即得。

9.如权利要求8所述的用途，其中15％乙醇部分洗脱体积为每1ml树脂用3ml洗脱，45％乙醇洗脱时选择每1ml树脂用4ml洗脱。

10.如权利要求1-9任一项所述的用途，其中枳实或枳壳破碎成黄豆大小颗粒。

11.如权利要求1～9任一项所述的用途，其中大孔树脂上样量按树脂体积ml：生药质量g为5∶1。

12.如权利要求1-9任一项所述的用途，其中每1ml树脂的洗脱流速为1.25～1.45ml/h之间，所述非极性大孔树脂径高比为1∶10，上样后药液的静态吸附时间为1小时。

13.如权利要求1-9任一项所述的用途，其中所述非极性大孔树脂重复8次后用10倍量的5％氢氧化钠溶液浸泡2小时，用水洗至中性；再用10倍量的3％盐酸溶液浸泡2小时，用水洗至中性以再生后使用。