CN103180441B - 皮肤及毛发颜色控制因子 - Google Patents

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Abstract

一种选自ATG7基因、RAB11A基因、CLIP-170基因、Rubicon基因和RAB7B基因的、与角质形成细胞中黑色素量调节以及皮肤或毛发颜色控制相关的基因，以及由该基因编码的分子。

Description

皮肤及毛发颜色控制因子
技术领域
本发明涉及角质形成细胞（keratinocyte）中黑色素量的调节，以及皮肤或者毛发的颜色的控制。
背景技术
作为决定皮肤或者毛发的颜色的因子，虽然报告有种种，但是认为其中存在于表皮的黑色素的量或质对皮肤或者毛发的颜色产生大的影响。即，皮肤或者毛发的颜色的形成受到由在黑色素细胞（melanocyte）中的被称为黑素体（melanosome）的细胞小器官中制造的黑色素（melanin）向表皮或者毛囊的角质形成细胞中传送从而遍及表皮或者毛发整体的过程的很大影响。从很久以前就已知由该黑色素细胞产生的黑色素的产生量是与个体的皮肤或者毛发的颜色相关联的因子。
现有的皮肤美白剂主要是以在黑色素细胞中的黑色素产生为目的而开发的。例如，在非专利文献1中，作为具有通过阻碍酪氨酸酶的酶活性而抑制黑色素产生的作用的皮肤美白剂，报告有抗坏血酸、熊果苷、曲酸等，其中，酪氨酸酶是有关从黑色素前体的酪氨酸转化为黑色素的酶。
另一方面，还报告有由皮肤颜色的不同而发现在黑色素细胞中黑色素的存在模式或者成熟状态中的差异（非专利文献2）。即，认为在黑色素细胞中的黑色素动态可能会在决定皮肤颜色中具有某些作用。在至今的报告中，启示了感受器分子PAR-2参与黑色素细胞中黑色素的获取（贪食），以及通过调节其活性来控制皮肤颜色的可能性（非专利文献3）。另外，还启示了蛋白质分子动力蛋白（Dynein）或者动力激活蛋白（Dynactin）参与黑色素传送到黑色素细胞之后局部存在于该黑色素细胞内（非专利文献4和5）。进一步，最近启示了与称作丝状伪足（Filopodia）的细胞结构的形成相关的蛋白质分子MyoX参与从黑色素细胞传送至角质形成细胞、以及从角质形成细胞传送至角质形成细胞的两种黑色素传送（非专利文献6）。然而，关于在黑色素细胞中产生的黑色素（黑素体）通过角质形成细胞来获取、输送、以及代谢的机理，尚未充分明确，也没有验证其对于皮肤颜色的作用。
另外，最近，还启示了通过使用来自不同民族的角质形成细胞进行探讨，在获取的黑色素的代谢能中存在民族差异（非专利文献7）。本论文报告了在表皮细胞获取了用荧光物质标识的黑色素之后，根据表皮细胞内的荧光消退的结果发现，黑色素在白人的表皮细胞中容易分解。然而，关于参与分解的机理或者特定的因子没有任何提及。
已知CLIP-170、RAB7B、Rubicon、RAB11A和ATG7作为参与囊泡的输送或者局部存在、或者囊泡的分解或者自噬的分子（非专利文献8～16）。但是，角质形成细胞内的黑色素动态，例如这些分子参与黑色素的获取、输送、局部存在或者存积、排出或者分解等迄今为止尚未明确。
现有技术文献
非专利文献
非专利文献1：美白战略（南江堂）IV.，美白剂的药理和临床，p95-116
非专利文献2：Thong et al，(2003)Br J Dermatol149:498-505
非专利文献3：Lin et al，(2008)Pigment Cell Melanoma Res21:172-183
非专利文献4：Byers et al，(2003)J Invest Dermatol121:813-820
非专利文献5：Byers et al，(2007)J Invest Dermatol127:1736-1744
非专利文献6：Singh et al，(2010)FASEB J24:3756-3769
非专利文献7：Ebanks et al，(2011)J Invest Dermatol131:1226-1233
非专利文献8：Vaughan et al，(1999)J Cell Sci112:1437-1447
非专利文献9：Yang et al，(2004)Biochem Biophys Res Commun318:792-799
非专利文献10：Wang et al，(2007)Blood110:962-971
非专利文献11：Yao et al，(2009)J Immunol183:1751-1758
非专利文献12：Progida et al，(2010)J Cell Sci123:1480-1491
非专利文献13：Matsunaga et al，(2009)Nat Cell Biol11:385-396
非专利文献14：Bryant et al，(2010)Nat Cell Biol12:1035-1045
非专利文献15：Ishida-Yamamoto et al，(2007)J Invest Dermatol127:2166-2170
非专利文献16：Komatsu et al，(2005)J Cell Biol169:425-434
发明内容
在一个实施方式中，本发明提供以下的一种角质形成细胞中黑色素量调节剂的评价和/或选择方法，其中，
包括下述工序：
向细胞给予被检测物质的工序；
测定该细胞中选自ATG7、RAB11A、CLIP-170、Rubicon和RAB7B的基因中至少1种基因的表达的变化、或者由该基因编码的分子中至少1种分子的表达或活性的变化的工序；
基于该测定的结果，评价该被检测物质的黑色素量调节作用的工序；以及
基于该评价的结果，选择该被检测物质作为角质形成细胞中黑色素量调节剂的工序。
在其它实施方式中，本发明提供以下的一种皮肤或者毛发颜色控制剂的评价和/或选择方法，其中，
包括下述工序：
向细胞给予被检测物质的工序；
测定该细胞中选自ATG7、RAB11A、CLIP-170、Rubicon和RAB7B的基因中至少1种基因的表达的变化、或者由该基因编码的分子中至少1种分子的表达或活性的变化的工序；
基于该测定的结果，评价该被检测物质的皮肤或者毛发颜色控制作用的工序；以及
基于该评价的结果，选择该被检测物质作为皮肤或者毛发颜色控制剂的工序。
进一步在其它的实施方式中，本发明提供一种调节角质形成细胞中黑色素量的方法，其中，包括对希望黑色素量调节的角质形成细胞中选自ATG7、RAB11A、CLIP-170、Rubicon和RAB7B的基因中至少1种基因的表达或者由该基因编码的分子中至少1种分子的表达或活性进行调节的工序。
进一步在其它实施方式中，本发明提供一种控制被检测体中皮肤或毛发颜色的方法，其中，包括对希望皮肤或毛发颜色控制的被检测体的角质形成细胞中选自ATG7、RAB11A、CLIP-170、Rubicon和RAB7B的基因中至少1种基因的表达或者由该基因编码的分子中至少1种分子的表达或活性进行调节的工序。
另外在其它的实施方式中，本发明提供一种选自ATG7、RAB11A、CLIP-170、Rubicon和RAB7B的基因或者由该基因编码的分子在用于调节角质形成细胞中黑色素量中的用途。
另外在其它实施方式中，本发明提供一种选自ATG7、RAB11A、CLIP-170、Rubicon和RAB7B的基因或者由该基因编码的分子在用于控制皮肤或者毛发颜色中的用途。
进一步在一个实施方式中，本发明提供一种皮肤或毛发颜色控制基因，其特征为，所述皮肤或毛发颜色控制基因选自ATG7基因、RAB11A基因、CLIP-170基因、Rubicon基因和RAB7B基因，并且与角质形成细胞中黑色素量调节相关。
附图说明
图1为显示在CLIP-170、RAB7B或者Rubicon基因的表达抑制后的角质形成细胞中黑色素分布的显微镜图像。A．左上：对照、右上：CLIP-170抑制、左下：RAB7B抑制、右下：Rubicon抑制。B．A中四方形所围部分的放大图像。
图2为CLIP-170、RAB7B或者Rubicon基因的表达抑制后的角质形成细胞中黑色素量变化。
图3为CLIP-170、RAB7B或者Rubicon基因的表达抑制后的角质形成细胞中黑色素（黑素体）量变化：蛋白质印迹（Western blotting）像。
图4为黑色素添加后RAB7B的表达变化。
图5为RAB11A或ATG7基因的表达抑制后的角质形成细胞中黑色素（黑素体）量变化：蛋白质印迹像。A：RAB11A表达抑制。B：ATG7表达抑制。
图6为皮肤中RAB11A基因表达和皮肤颜色的相关性。A：RAB11A基因表达量在民族间的比较。B：RAB11A基因表达量和皮肤颜色（L*值）的相关性。
具体实施方式
本发明涉及参与角质形成细胞中黑色素的局部存在、存积、排出或者分解，并且与角质形成细胞中黑色素量调节、以及皮肤或者毛发颜色控制相关的因子。另外，本发明涉及使用该因子调节角质形成细胞中黑色素量的方法；控制皮肤或者毛发颜色的方法；以及使用该因子评价和/或选择角质形成细胞中黑色素量调节剂、或者皮肤或者毛发颜色控制剂的方法。
本发明者们为了明确皮肤或者毛发颜色与角质形成细胞内基因表达的关联性，探索角质形成细胞中黑色素量调节相关的基因，另外针对该基因表达对角质形成细胞中黑色素动态的影响进行调查，结果发现角质形成细胞中黑色素局部存在、存积、排出或者分解相关的几个基因，并且这些的基因的表达量和皮肤颜色之间具有高的相关性。从这些结果，本发明者们发现如果利用该基因或者其表达产物，可以控制角质形成细胞中黑色素量、或者皮肤或者毛发颜色。
根据本发明，可以提供皮肤或者毛发颜色控制基因，其通过对角质形成细胞中黑色素的局部存在、存积、排出分解产生影响而能够控制皮肤或者毛发颜色。通过调节该基因或者其表达产物的表达或活性，可以调节角质形成细胞中黑色素的量或者分布，控制皮肤或者毛发的颜色。另外该基因或者其表达产物，将其表达或活性作为指标，可以评价和/或选择能够控制皮肤或者毛发颜色的素材，因此对于皮肤或者毛发颜色控制剂，例如美白剂、晒黑剂（tanning agent）、毛发染色剂或者漂白剂、黑发剂等的开发有用。
本发明提供选自ATG7基因、RAB11A基因、CLIP-170基因、Rubicon基因以及RAB7B基因中的皮肤或者毛发颜色控制基因。
上述所列举的基因虽然按照下述表1在公知的数据库中进行登记，但是其参与角质形成细胞内的黑色素的动态，例如黑色素的获取、输送、局部存在、存积、排出或者分解等是在现有技术中未知的。
[表1]
CLIP-170通过在微管中维系囊泡，作为直接控制细胞内输送的分子而被公知。更具体而言，已知CLIP-170对Dynein或者Dynactin的动力蛋白质和微管的相互作用进行居间调节（Vaughan et al,1999,J CellSci112,1437-1447）。
RAB7B属于深入参与囊泡的输送的低分子量G蛋白质RabGTPase家族，是在2004年开始被确定的分子（Yang et al,2004,BiochemBiophys Res Commun318,792-799）。报告有主要在单核细胞、或巨噬细胞、树状细胞等免疫系统细胞中大量表达，参与免疫控制的TLR4（Toll样受体4（Toll-like receptor4））或者TLR9（Toll样受体9（Toll-like receptor9））的参与胞吞作用（endocytosis）（Wang et al,2007,Blood110,962-971;Yao et al,2009,J Immunol183,1751-1758）。另外，已知在Hela细胞中，RAB7B调节作为囊泡的分解酶的组织蛋白酶D（Cathepsin-D）的成熟，通过RAB7B的表达抑制来妨碍向细胞内的分解器官溶酶体的正常输送（Progida et al,2010,J Cell Sci123,1480-1491）。
Rubicon最近作为抑制细胞内的自噬作用（autophagy）的分子而有所报告（Matsunaga et al,2009,Nat Cell Biol11,385-396）。
RAB11A已知其与RAB7B同样属于深入参与囊泡的输送的低分子量G蛋白质Rab GTPase家族，参与囊泡的再循环、细胞极性的形成、胞吐作用等各种各样的囊泡输送（Bryant et al,2010,Nat Cell Biol12,1035-1045）。另外，还报告有在表皮颗粒层中RAB11A参与板层颗粒（板层体lamellar body）的细胞外分泌（Ishida-Yamamoto et al,2007,JInvest Dermatol127,2166-2170）。
ATG7为控制自体吞噬（autophagy）的因子之一。自体吞噬也称为自噬作用，是将细胞内小器官等大的蛋白质结构体用膜包住，通过与作为蛋白质的分解器官的溶酶体（lysosome）融合来分解内容物的机构。已知ATG7为多个自体吞噬相关因子中的1个，参与自噬体的形成（Komatsu et al,2005,J Cell Biol169,425-434）。
如后述实施例所示，在分别抑制了角质形成细胞中ATG7基因、RAB11A基因、CLIP-170基因、Rubicon基因以及RAB7B基因的表达的情况下，该角质形成细胞的黑色素量增加。另外，角质形成细胞中黑色素量的增加伴随着上述基因表达产物的表达抑制。进而，通过抑制角质形成细胞中这些基因的表达，该角质形成细胞中通常能看到的黑色素向细胞核附近的局部存在会被阻碍，黑色素在细胞质内分散存在。另外，黑色素的排出或分解被抑制，从而在细胞内存积。另外如后述实施例所示，确认上述基因的表达量和皮肤颜色之间具有高的相关性。即，上述ATG7基因、RAB11A基因、CLIP-170基因、Rubicon基因以及RAB7B基因及其表达产物参与角质形成细胞内的黑色素局部存在、存积、排出或者分解，并有助于细胞的黑色素量调节或者皮肤以及毛发颜色的控制。
黑色素在角质形成细胞内的动态，例如，从黑色素细胞传送的黑色素的获取、输送、局部存在、存积、排出、分解等主要深入参与在由角质形成细胞构成的皮肤表皮层或者毛囊的毛母细胞（hair matrixcell）或者构成毛干（hair shaft）的毛皮质细胞中的黑色素的量和分布，进一步影响皮肤和毛发的颜色。
因此，上述ATG7基因、RAB11A基因、CLIP-170基因、Rubicon基因以及RAB7B基因，为皮肤或毛发颜色控制基因，通过改变其表达，可以调节角质形成细胞中黑色素的存积、局部存在和/或分解，由此调节皮肤表皮层或者毛囊的毛母细胞或者进一步是构成毛干的毛皮质细胞中的黑色素量及分布，作为结果可以控制皮肤和毛发的颜色。
本发明的皮肤或毛发颜色控制基因的表达降低，会使角质形成细胞中黑色素量增加，使细胞的颜色暗色化。相反，通过增加这些基因的表达，角质形成细胞中黑色素量降低，细胞的颜色亮色化。
另外，本发明的皮肤或者毛发颜色控制基因的表达降低阻碍角质形成细胞中黑色素向细胞核附近的局部存在，使黑色素在细胞内分散存在，或者，抑制黑色素的排出或者分解，使细胞的颜色暗色化。相反，通过这些基因的表达增加，会促进角质形成细胞中黑色素向细胞核附近的局部存在化、排出或者分解，细胞的颜色亮色化。
因此，通过使本发明的皮肤或者毛发颜色控制基因的表达或者由这些基因编码的分子（表达产物）的表达或活性增加，皮肤和毛发的颜色变亮。相反，通过使本发明的皮肤或者毛发颜色控制基因的表达或者由这些基因编码的分子（表达产物）的表达或活性减少，皮肤和毛发的颜色变暗。
在本说明书中，统一将上述皮肤或者毛发颜色控制基因以及由该基因编码的分子（表达产物）称作皮肤或毛发颜色控制因子。由本发明者们初次发现该皮肤或者毛发颜色控制因子与皮肤或毛发颜色的关联性。
通过改变上述本发明的皮肤或者毛发颜色控制基因的表达或活性，改变角质形成细胞中黑色素的存积量、局部存在、排出或者分解等来调节黑色素量，可以控制皮肤或毛发的颜色。换言之，本发明的皮肤或毛发颜色控制因子可以在用于角质形成细胞中黑色素量调节中或者在用于皮肤或者毛发颜色控制中使用。或者，本发明的皮肤或者毛发颜色控制因子可以在用于角质形成细胞中黑色素量调节或者在用于皮肤或者毛发颜色控制的制剂的制造中使用。
在通过上述本发明的黑色素量调节、或者皮肤或者毛发颜色控制中，在被检测体的角质形成细胞中，可以使用本领域中通常使用的任意手段改变该基因中至少1种基因的表达、或者由该基因编码的分子中至少1种分子的表达或活性。
使该基因的表达、或者该分子的表达或活性变化的手段不特别限定。例如，作为使基因表达变化的手段，可以列举通过反义寡核苷酸或者siRNA等产生的基因敲除作用（gene knock down）、特异性启动子产生的靶基因的转录活化、使用载体从外部插入基因、添加具有使其它基因的表达变化的作用的任意物质等。其中，进一步优选添加具有使该基因的表达变化的作用的任意物质等。
作为由上述基因所编码的分子，可以列举由上述基因编码的mRNA以及多肽。在此，“分子的表达或活性的变化”是指使分子总体的表达或活性变化的任意状态。例如可以包括分子的表达量的变化、分子的分解速度的变化、分子的活化率的变化、分子的失活率的变化等，优选为分子的表达量的变化。
作为使分子的表达或活性变化的手段，可以列举使上述基因表达变化的手段、使蛋白质表达变化的手段、使分子的酶活性等变化的手段、使分子和其靶因子之间的相互作用变化的手段、使分子作用所影响的信号路径变化的手段等。其中更加优选使基因表达变化的手段、使蛋白质表达变化的手段等。
作为上述被检测体，可以列举天然或通过基因工程学被改变的、具有表达上述基因中至少1种基因的能力、并希望调节黑色素量的角质形成细胞以及含有该细胞的培养物、组织、器官以及动物。
作为上述角质形成细胞，优选存在于皮肤或毛囊中的角质形成细胞，进一步优选表皮角质形成细胞、毛母细胞、以及毛皮质细胞。作为含有上述角质形成细胞的培养物、组织、器官，优选培养角质形成细胞、以及表皮组织、毛囊组织、皮肤和它们的培养物。作为上述动物，优选人或非人的哺乳动物。
在一个实施方式中，由上述本发明的黑色素量调节或者皮肤或毛发颜色控制中，将上述角质形成细胞、或者含有其的培养物、组织或者器官作为被检测体，可以在体外进行。优选被检测体为培养角质形成细胞、培养皮肤组织、培养表皮、或者培养毛囊。
在其它的一个实施方式中，通过上述本发明的黑色素量调节或者皮肤或毛发颜色控制中，希望进行黑色素存积量、局部存在、排出或者分解的调节或者皮肤或毛发颜色的控制的动物可以是被检测体。优选该调节或者控制可以根据美容目的，例如皮肤的美白或者晒黑、毛发的染色（亮化或者暗化）或者漂白、漂白后的恢复颜色、白发染黑等目的来非治疗性地进行。在本说明书中，“非治疗性”是指不包括医疗行为的概念，即不包括通过治疗对人体的处置行为的概念。
本发明例举的实施方式为增加角质形成细胞中黑色素量的方法，其中，包括通过对希望黑色素量增加的角质形成细胞中选自ATG7、RAB11A、CLIP-170、Rubicon以及RAB7B的基因中至少1种基因的表达或者由该基因编码的分子中至少1种分子的表达或活性进行抑制，从而使该角质形成细胞中黑色素量增加的工序。
其它实施方式为降低角质形成细胞中黑色素量的方法，其中，包括通过对希望黑色素量降低的角质形成细胞中该基因的表达或者该分子的表达或活性进行增强，从而使该角质形成细胞中黑色素量减少的工序。
本发明的其它例举实施方式为使被检测体的皮肤颜色褐色化或者暗色化的方法，其中，包括通过对希望皮肤颜色褐色化或者暗色化的被检测体的皮肤角质形成细胞中选自ATG7、RAB11A、CLIP-170、Rubicon以及RAB7B的基因中至少1种基因的表达或者由该基因编码的分子中至少1种分子的表达或活性进行抑制，从而使该角质形成细胞中黑色素量增加，或者使该角质形成细胞内的黑色素分散存在的工序。根据该方法，例如可以使皮肤晒黑（tanning）。
其它的实施方式为使被检测体的皮肤颜色亮色化的方法，其中，包括通过对希望皮肤颜色亮色化的被检测体的皮肤角质形成细胞中该基因的表达或者该分子的表达或活性进行增强，由此使该角质形成细胞中黑色素量减少，或者使该角质形成细胞中的黑色素局部存在局限化的工序。根据该方法，例如可以使皮肤美白。
本发明的进一步其它例示的实施方式为使被检测体的毛发颜色褐色化或暗色化的方法，其中，包括通过对希望毛发颜色褐色化或者暗色化的被检测体的毛囊角质形成细胞中选自ATG7、RAB11A、CLIP-170、Rubicon以及RAB7B的基因中至少1种基因的表达或者由该基因编码的分子中至少1种分子的表达或活性进行抑制，由此使该角质形成细胞中黑色素量增加，或者使该角质形成细胞内的黑色素分散存在的工序。根据该方法，例如可以使漂白后的毛发的颜色恢复或者白发染黑。
其它的实施方式为通过对希望毛发颜色亮色化的被检测体的毛囊角质形成细胞中该基因的表达或该分子的表达或活性进行增强，由此使该角质形成细胞中黑色素量减少，或者使该角质形成细胞中的黑色素局部存在局限化的工序。根据该方法，例如可以使毛发亮化或漂白化。
上述本发明的皮肤或者毛发颜色控制因子，即ATG7基因、RAB11A基因、CLIP-170基因、Rubicon基因以及RAB7B基因或者使这些基因的表达产物的表达或活性变化的物质是，通过使角质形成细胞中黑色素的存积量、局部存在、排出或者分解等变化而能调节其的黑色素量，控制皮肤或者毛发颜色的物质。因此，本发明还提供使用本发明的皮肤或者毛发颜色控制因子的角质形成细胞的黑色素量调节剂或者皮肤或者毛发颜色控制剂的评价和/或选择方法。
根据本发明的角质形成细胞中黑色素量调节剂的评价和/或选择方法，包括：向细胞中给予被检测物质的工序；测定该细胞中上述本发明的皮肤或毛发颜色控制基因中至少1种基因的表达的变化、或者由该基因编码的分子中至少1种分子的表达或活性的变化的工序；基于该测定的结果，评价该被检测物质的黑色素量调节作用的工序；以及基于该评价的结果，选择该被检测物质作为角质形成细胞中黑色素量调节剂的工序。
给予被检测物质的细胞只要是具有表达上述本发明的皮肤或者毛发颜色控制基因中的至少1种基因的能力，可以是天然的细胞也可以是在基因工程学上被改变的细胞，没有特别限定。细胞优选为培养细胞、或者来自动物的组织或者器官培养物的细胞，更加优选培养人细胞。此外，细胞优选为皮肤细胞，更优选为表皮细胞或者毛囊细胞，进一步优选为来自人的培养表皮细胞（例如，人正常表皮细胞（NormalHuman Epidermal Keratinocyte;NHEK））、或者人组织培养毛囊细胞。
被检测物质的种类不特别限定，可以为天然物也可以为合成物，另外可以为单一物质也可以为组成物或者混合物。给予的形态取决于被检测物质而可以为任意形态。
皮肤或者毛发颜色控制基因的表达或者由该基因编码的分子的表达或活性可以通过本领域中通常使用的任意分析方法进行测定。作为基因表达分析方法，例如，可以列举斑点杂交（Dot blot）法、Northern杂交（Northern blot）法、RNA酶保护试验（RNase Protection Assay，RPA）、由荧光素酶（Luciferase）等进行的报告试验（reporter assay）、RT-PCR法、DNA微阵列（DNA microarray）等。
作为由基因编码的分子的表达或活性的分析方法，可以列举蛋白质印迹法（Western blotting）、免疫染色法、ELISA、结合试验（bindingassay）等。
基于测定的该基因表达或者该分子的表达或活性，能够评价通过被检测物质的给予所造成的该基因表达或者该分子的表达或活性的变化。例如，可以测定在被检测物质的给予前后本发明的皮肤或者毛发颜色控制基因的表达或者其编码的分子的表达或活性，根据需要将测定值定量化之后，比较给予前后的结果。另外，例如从被检测物质的给予群与非给予群或者对照物质给予群中，测定本发明的皮肤或者毛发颜色控制基因的表达或者其编码的分子的表达或活性，根据需要将测定值定量化之后，可以在给予群与非给予群、或者给予群与对照物质给予群之间进行比较。另外，例如，给予不同浓度的被检测物质，测定本发明的皮肤或者毛发颜色控制基因的表达或者其编码的分子的表达或活性，调查由于被检测物质的浓度带来的测定结果的差别。
对于该基因的表达或者该分子的表达或活性造成影响的被检测物质可以将其作为具有角质形成细胞中黑色素量的调节作用的物质来进行评价。
例如，抑制本发明的皮肤或者毛发颜色抑制基因的表达或者由该基因编码的分子的表达或活性的物质可以作为角质形成细胞中黑色素量增加剂而被选择。该制剂通过使角质形成细胞中黑色素量增加而作为使皮肤或者毛发颜色褐色化或者暗色化的、皮肤或者毛发颜色的褐色化或者暗色化剂（例如，皮肤晒黑剂、毛发暗色化剂、漂白后毛发颜色恢复剂、黑发剂等）来使用。另一方面，可以选择增强该基因的表达或者该分子的表达或活性的物质作为角质形成细胞中黑色素量降低剂。该制剂通过使角质形成细胞中黑色素量减少而作为使皮肤或者毛发颜色亮色化的、皮肤或毛发颜色的亮色化剂（例如，皮肤美白剂、毛发的亮化或者漂白剂等）来使用。
本发明提供皮肤或者毛发颜色控制剂的评价和/或选择方法。该方法包括向细胞给予被检测物质的工序；测定在该细胞中上述本发明的皮肤或者毛发颜色控制基因中至少1种基因的表达、或者由该基因编码的分子中至少1种分子的表达或活性的变化的工序；基于该测定结果，评价该被检测物质的皮肤或者毛发颜色控制作用的工序；以及基于该评价结果，选择该被检测物质作为皮肤或者毛发颜色控制剂的工序。
在该方法中使用的细胞、被检测物质、基因或者分子的表达或活性的测定方法、以及该测定结果的评价方法与上述相同。
对该基因的表达或者该分子的表达或活性造成影响的被检测物质可以作为具有皮肤或者毛发颜色控制作用的物质进行评价，可以作为能够用于皮肤或者毛发颜色控制中的皮肤或者毛发颜色控制剂而被选择。
例如，抑制本发明的皮肤或者毛发颜色控制基因的表达或者由该基因编码的分子的表达或活性的物质通过使角质形成细胞中黑色素量增加而可以作为使皮肤或毛发颜色褐色化或者暗色化的、皮肤或者毛发颜色的褐色化或者暗色化剂（例如，皮肤晒黑剂、毛发暗色化剂、漂白后毛发颜色恢复剂、黑发剂等）而被选择。另一方面，增强该基因的表达或者该分子的表达或活性的物质通过使角质形成细胞中黑色素量减少而可以作为使皮肤或者毛发颜色亮色化的、皮肤或者毛发颜色的亮色化剂（例如，皮肤美白剂、毛发的亮色化或者漂白剂等）而被选择。
实施例
以下显示实施例来进一步具体说明本发明。
实施例1
皮肤或者毛发颜色控制基因表达对角质形成细胞中黑色素量产生的影响
1．黑色素的分离
将黑素瘤细胞株MNT-1细胞在含有10%AIM-V培养基和10%FBS（胎牛血清）的RPMI-1640培养基（均由Life Technologies公司制造）在37℃、5%CO2下进行培养。为了从MNT-1细胞中分离调制黑素体馏分，将在T-175烧瓶中培养的MNT-1细胞用0.05%的Trypsin/EDTA进行回收，用PBS清洗。接下来，加入3mL的裂解缓冲液（Lysis buffer）（0.1M Tris-HCl（pH7.5）、1%Igepal CA-630、0.01%SDS）缓慢混合，在4℃下振荡搅拌1小时。将该细胞提取液分注于1.5mL管中，以1,000g的速度离心10分钟（4℃），回收上清液。重复本离心操作共2次，将得到的上清液以20,000g的速度离心10分钟（4℃）。用PBS清洗小球丸（pellet），在同样的条件下进一步重复离心操作，将得到的小球丸作为黑素体馏分（Melanin）。
2．siRNA导入
将来自正常人新生儿表皮的表皮细胞（NHEK）使用作为增殖用培养基的表皮细胞用增殖培养基（Epilife（注册商标））以及培养基用添加剂（Humedia-KG2）（均由KURABO购得），在37℃、5%CO2的条件下进行培养。接下来，将细胞以0.75×105个细胞/mL/孔的细胞密度接种于12孔板上。向100μL实验用培养基Epilife（注册商标）（作为培养基用添加剂，添加0.5μg/mL氢化可的松以及50ng/mL两性霉素B）中，添加4μL的转染试剂HiPerFect（注册商标）Transfection Reagent（Qiagen），均匀搅拌。
从Ambion silencer select siRNA（Ambion，Life Technologies）购买CLIP-170基因、RAB7B基因、Rubicon基因、或者对照（靶基因不存在的非特异性序列）的siRNA，以使上述转染试剂的最终浓度为10nM的方式添加各siRNA搅拌之后，在室温下静置10分钟，调制siRNA-转染试剂复合物。将该试剂复合物添加于各孔中之后静静地将盘振荡均匀。第二天交换培养基。确认通过siRNA导入而特异性地抑制了靶基因和/或该分子的表达（未显示数据）。
在siRNA导入2天之后添加从MNT-1细胞中分离的黑色素，进一步在24小时后观察细胞内的黑色素量，并且进行黑色素定量以及根据蛋白质印迹法（Western blotting）的黑素体蛋白质（Pmel17）的表达定量。
3．细胞内黑色素的定量
从添加黑色素开始24小时之后用PBS将细胞培养盘进行3次清洗，向各孔中加入120μL的2MNaOH在100℃下使之溶解。将培养盘进行离心，对得到的上清液测定吸光度（405nm），算出黑色素量。黑色素量通过用规定方法求得的各孔中的蛋白质质量进行补正并用于评价。
4．黑素体蛋白质的表达分析
从添加黑色素开始24小时之后将细胞培养盘（12孔）用PBS清洗之后，添加0.1ml的RIPA Buffer（Sigma-Aldrich公司制造）回收细胞，用超声波处理破碎细胞。之后，在15,000rpm的速度下进行15分钟离心分离，对其上清液进行蛋白质定量之后，按照规定方法用于SDS-PAGE（12.5%凝胶）。一次抗体使用抗Pmel17抗体（anti-Pmel17antibody）（HMG45、1:500、DAKO公司制造）。二次抗体是将抗小鼠IgG-过氧化物酶连接的F(A’B)2片段（anti-mouse IgG peroxidase linkedF(AB’)2fragment）（GE healthcare bioscience)稀释5000倍来使用。之后，使用ECL plus蛋白质印迹检测试剂（Western blotting detection reagents）（GE healthcare bioscience）使其显色，使用LAS4000（GE healthcarebioscience）使之可视化。使用Sigma-Aldrich公司制造的β-肌动蛋白特异性单克隆抗体来评价作为内部标准的β-肌动蛋白的表达。
结果示于图1～3。通过CLIP-170、RAB7B或者Rubicon的表达抑制，观察到黑色素在细胞内的存积增强，以及该黑色素的局部存在的变化（图1）。观察到在对照中确认的黑色素向核附近的局部存在被阻碍、且分散存在于细胞质内的倾向（图1B）。另外，从黑色素定量（图2）以及作为黑素体的构成蛋白质的Pmel-17蛋白质的表达分析（图3）的结果，显示通过CLIP-170、RAB7B或者Rubicon的表达抑制，角质形成细胞内的黑色素量相比于对照显著增加。
实施例2
伴随黑色素添加的皮肤或者毛发颜色控制因子的表达变化
调查由在角质形成细胞中获取的黑色素（黑素体）产生的本发明的皮肤颜色控制基因的表达变化。将从添加黑色素开始24小时之后的RAB7B的蛋白质和mRNA的表达作为一个例子来显示。
蛋白质表达按照以下进行评价。从添加黑色素开始24小时之后将培养盘用PBS清洗之后，使用0.1ml的RIPA buffer（Sigma-Aldrich公司制造）回收细胞，用超声波处理破碎细胞。之后，在15,000rpm的速度下进行15分钟离心分离，将其上清液进行蛋白质定量之后，按照规定方法用于SDS-PAGE（12.5%凝胶浓度）。一次抗体使用抗RAB7B抗体（anti-RAB7B antibody）（1:1000、Avnova公司制造）。二次抗体是将抗小鼠IgG-过氧化物酶连接的F(A’B)2片段（anti-mouse IgGperoxidase linked F(AB’)2fragment）（GE healthcare bioscience）稀释5000倍来使用。之后，使用ECL plus蛋白质印迹检测试剂（Westernblotting detection reagents）（GE healthcare bioscience）使其显色，使用LAS4000（GE healthcare bioscience）使之可视化。使用Sigma-Aldrich公司制造的β-肌动蛋白特异性单克隆抗体来评价作为内部标准的β-肌动蛋白的表达。
mRNA的表达按照下述方法进行评价。将培养细胞用PBS清洗之后，使用RNeasy（注册商标）Mini Kit（QIAGEN公司制造）根据规定方法提取总RNA。使用1μg提取的总RNA，通过逆转录反应合成cDNA。逆转录反应是使用高容量RNA-to cDNA试剂盒（High CapacityRNA-to cDNA Kit）（Life Technologies公司制造），通过MJ Research公司制造的帕尔贴热循环仪（Peltier Thermal Cycler）按照规定方法来进行。接下来，使用合成的cDNA和TaqMan（注册商标）探针，通过实时PCR法进行基因表达分析。对各基因特异的探针和引物由LifeTechnologies公司制造的TaqMan Gene Expression Assays(P/N4331182)获得。各个表达量通过内部标准基因RPLP0的表达来补正而进行评价。反应条件按照规定方法设定，使用Applied Biosystems公司制造的序列检测器（Sequence Detector）（ABI PRISM7500Real Time PCR System）进行。
结果示于图4。确认RAB7B的表达是随着黑色素的添加，在蛋白质和mRNA水平上显著增加（图4）。
实施例3
RAB11A或者ATG7基因表达对角质形成细胞中黑色素量产生的影响。
1．siRNA导入
将来自正常人新生儿表皮的表皮细胞（NHEK）使用作为增殖用培养基的表皮细胞用增殖培养基（Epilife（注册商标））以及培养基用添加剂（Humedia-KG2）（均由KURABO购得），在37℃、5%CO2的条件下进行培养。接下来，将细胞以0.75×105个细胞/mL/孔的细胞密度接种于12孔板上。向100μL实验用培养基Epilife（注册商标）（作为培养基用添加剂，添加0.5μg/mL氢化可的松以及50ng/mL两性霉素B）中，添加4μL的转染试剂HiPerFect（注册商标）Transfection Reagent（Qiagen），均匀搅拌。
从Ambion silencer select siRNA（Ambion，Life Technologies）购买RAB11A基因、ATG7基因或者对照（靶基因不存在的非特异性序列）的siRNA，以使上述转染试剂的最终浓度为10nM的方式添加各siRNA搅拌之后，在室温下静置10分钟，调制siRNA-转染试剂复合物。将该试剂复合物添加于各孔中之后静静地将盘振荡均匀。第二天交换培养基。确认通过siRNA导入而特异性地抑制靶基因和/或该分子的表达。
从siRNA导入开始2天之后，按照实施例1记载的方法添加从MNT-1细胞中分离的黑色素，进一步在24小时后通过蛋白质印迹法（Western blotting）进行细胞内的RAB11A以及ATG7基因的表达产物、以及黑素体蛋白质（Pmel17）的表达定量。对于RAB11A以及ATG7的表达分析，作为一次抗体分别使用抗RAB11抗体（anti-RAB11antibody）（1:2000、Invitrogen公司制造）或者抗ATG7抗体（anti-ATG7antibody）（1:2000、Epitomics公司制造），确认其表达抑制。使用Sigma-Aldrich公司制造的β-肌动蛋白特异性单克隆抗体评价作为内部标准的β-肌动蛋白的表达。
结果示于图5。从作为黑素体的构成蛋白质Pmel-17蛋白质的表达分析的结果显示，伴随着RAB11A（图5A）或者ATG7（图5B）的表达抑制，角质形成细胞中黑色素量相比于对照显著增加。
实施例4
皮肤或者毛发颜色控制基因表达与皮肤颜色的相关
调查RAB11A基因表达与皮肤颜色的相关。皮肤组织依赖于美国德克萨斯州达拉斯近郊的CONTRACT LABORATORY（RCTS），由当地皮肤科医生从白种人、亚洲人、西班牙裔美国人以及非裔美国人（分别n=3）的上手腕内侧部，在对皮肤进行测色之后通过钻取活组织检查而采集得到。本实验全部经由IRB（IntegReview）承认，并且是得到合适的知情同意的情况下实施的。从皮肤组织中提取RNA之后，作为DNA微阵列法使用Affymetrix公司的GeneChip（Human Genome U133plus2.0array）收罗性地分析基因表达，并且调查与肤色强度（明度L*值）之间的相关性。结果如图6所示。
作为肤色明度的指标的L*值按照白种人、亚洲人、西班牙裔美国人、接下来是非裔美国人的顺序提高，确认有民族差异（未显示数据）。另外，从DNA微阵列分析的结果可知，提取了RAB11A基因的表达数据，与白种人相比，按照亚洲人、西班牙裔美国人、接下来是非裔美国人的顺序降低表达（图6A）。进一步，确认RAB11A基因的表达量与L*值之间有高的相关性（图6B），显示皮肤颜色的程度越亮基因的表达越高。

Claims (14)

1.一种角质形成细胞中黑色素量调节剂的评价和/或选择方法，其中，
包括下述工序：
向细胞给予被检测物质的工序；
测定该细胞中选自ATG7、RAB11A、CLIP-170、Rubicon和RAB7B的基因中至少1种基因的表达的变化、或者由该基因编码的分子中至少1种分子的表达或活性的变化的工序；
基于该测定的结果，评价该被检测物质的黑色素量调节作用的工序；以及
基于该评价的结果，选择该被检测物质作为角质形成细胞中黑色素量调节剂的工序。
2.如权利要求1所述的方法，其中，
在所述基因的表达或者所述分子的表达或活性被抑制的情况下，选择所述被检测物质作为角质形成细胞中黑色素量增加剂。
3.如权利要求1所述的方法，其中，
在所述基因的表达或者所述分子的表达或活性被增强的情况下，选择所述被检测物质作为角质形成细胞中黑色素量降低剂。
4.一种皮肤或者毛发颜色控制剂的评价和/或选择方法，其中，
包括下述工序：
向细胞给予被检测物质的工序；
测定该细胞中选自ATG7、RAB11A、CLIP-170、Rubicon和RAB7B的基因中至少1种基因的表达的变化、或者由该基因编码的分子中至少1种分子的表达或活性的变化的工序；
基于该测定的结果，评价该被检测物质的皮肤或者毛发颜色控制作用的工序；以及
基于该评价的结果，选择该被检测物质作为皮肤或者毛发颜色控制剂的工序。
5.如权利要求4所述的方法，其中，
在所述基因的表达或者所述分子的表达或活性被抑制的情况下，评价所述被检测物质具有使皮肤或毛发颜色暗色化的作用，选择其作为皮肤或毛发的暗色化剂。
6.如权利要求4所述的方法，其中，
在所述基因的表达或者所述分子的表达或活性被增强的情况下，评价所述被检测物质具有使皮肤或者毛发颜色亮色化的作用，选择其作为皮肤或毛发的亮色化剂。
7.一种调节角质形成细胞中黑色素量的非治疗性方法，其中，
包括在希望黑色素量调节的角质形成细胞中，通过非外科手术地添加使选自ATG7、RAB11A、CLIP-170、Rubicon和RAB7B的基因中至少1种基因的表达或者由该基因编码的分子中至少1种分子的表达或活性变化的任意物质，对所述基因的表达或者该基因编码的分子的表达或活性进行调节的工序。
8.如权利要求7所述的方法，其中，
所述基因的表达或者所述分子的表达或活性被抑制，角质形成细胞中黑色素量增加。
9.如权利要求7所述的方法，其中，
所述基因的表达或者所述分子的表达或活性被增强，角质形成细胞中黑色素量减少。
10.一种控制被检测体中皮肤或毛发颜色的非治疗性方法，其中，
包括在希望皮肤或毛发颜色控制的被检测体的角质形成细胞中，通过非外科手术地添加使选自ATG7、RAB11A、CLIP-170、Rubicon和RAB7B的基因中至少1种基因的表达或者由该基因编码的分子中至少1种分子的表达或活性变化的任意物质，对所述基因的表达或者该基因编码的分子的表达或活性进行调节的工序。
11.如权利要求10所述的方法，其中，
皮肤角质形成细胞中所述基因的表达或者所述分子的表达或活性被抑制，皮肤颜色被暗色化。
12.如权利要求10所述的方法，其中，
在皮肤角质形成细胞中所述基因的表达或者所述分子的表达或活性被增强，皮肤颜色被亮色化。
13.如权利要求10所述的方法，其中，
毛囊角质形成细胞中所述基因的表达或者所述分子的表达或活性被抑制，毛发颜色被暗色化。
14.如权利要求10所述的方法，其中，
毛囊角质形成细胞中所述基因的表达或者所述分子的表达或活性被增强，毛发颜色被亮色化。
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