JP6075891B2 - 皮膚及び毛髪色制御因子 - Google Patents
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Description
また最近では、異なる民族に由来するケラチノサイトを用いた検討から、取り込まれたメラニンの代謝能に民族差があることも示唆されている(非特許文献12)。非特許文献12では、蛍光物質で標識したメラニンを表皮細胞に取り込ませた後に、表皮細胞内の蛍光の消退を解析する評価系を用いて、メラニンが白人由来の表皮細胞で分解されやすいことを報告している。しかしながら、分解に寄与するメカニズムや特定の因子については何ら言及されてはいない。
下記工程を含むケラチノサイトにおけるメラニン量調節剤の評価又は選択方法:
細胞に被験物質を投与する工程;
該細胞におけるオートファジーの活性を測定する工程;及び
該測定の結果に基づいて、該被験物質のメラニン量調節作用を評価する工程、
を提供する。
別の態様において、本発明は、以下、
下記工程を含む皮膚又は毛髪色制御剤の評価又は選択方法:
細胞に被験物質を投与する工程;
該細胞におけるオートファジーの活性を測定する工程;及び
該測定の結果に基づいて、該被験物質の皮膚又は毛髪色制御作用を評価する工程、
を提供する。
さらに別の態様において、本発明は、皮膚又は毛髪色制御を所望する被験体のケラチノサイトにおけるオートファジーの活性を調節する工程を含む、被験体における皮膚又は毛髪色制御方法を提供する。
オートファジー活性は、例えば、オートファジー関連遺伝子又は当該遺伝子にコードされる分子の発現若しくは活性に反映されており、これらの発現若しくは活性を検出又は決定することによって測定することができる。オートファジー関連遺伝子又はそれにコードされる分子の発現若しくは活性は、当該分野で通常使用される任意の解析方法によって測定することができる。遺伝子発現解析方法としては、例えば、ドットブロット法、ノーザンブロット法、RNaseプロテクションアッセイ法、ルシフェラーゼ等によるリポーターアッセイ、RT−PCR法、DNAマイクロアレイ等が挙げられる。遺伝子にコードされるタンパク質の発現若しくは活性の解析方法又は定量の方法としては、ウエスタンブロッティング法、免疫染色法、蛍光染色法、ELISA、バインディングアッセイ等が挙げられる。
ケラチノサイトにおけるオートファジーの活性を変化させることによって、ケラチノサイトにおけるメラニン量を調節することができ、それによって皮膚表皮層や毛包の毛母細胞やさらにはシャフトを構成する毛皮質細胞におけるメラニン量及び分布を調節し、結果として皮膚及び毛髪の色を制御することができる。
したがって、ケラチノサイトにおいてオートファジーの活性化に関与する遺伝子又は分子の発現若しくは活性を増加させることにより、皮膚及び毛髪の色は明るくなる。逆に、当該遺伝子又は分子の発現若しくは活性を減少させることにより、皮膚及び毛髪の色は暗くなる。
したがって、ケラチノサイトにおいてオートファジーの活性抑制に関与する遺伝子又は分子の発現若しくは活性を低下させることにより、皮膚及び毛髪の色は明るくなる。逆に、当該遺伝子又は分子の発現若しくは活性を増加させることにより、皮膚及び毛髪の色は暗くなる。
例えば、作用機序未知のオートファジー誘導剤又はオートファジー阻害剤を投与して、オートファジー活性を亢進又は低下させたときに発現が変化する遺伝子又は分子を決定し、それらの遺伝子又は分子を過剰発現又は発現抑制したときのオートファジーの活性の変化を調べることによって、オートファジーの活性化又は活性抑制に関与する遺伝子又は分子を同定することができる。あるいは、オートファジーとの関連が既知の遺伝子又は分子の場合、それらの遺伝子又は分子を過剰発現又は発現抑制したときのオートファジーの活性の変化を調べるだけでよい。
本発明の別の例示的実施態様は、メラニン量低減が所望されるケラチノサイトにおけるオートファジーの活性を増強することによって、当該ケラチノサイトにおけるメラニン量を減少させる工程を含む、ケラチノサイトにおけるメラニン量の低減方法である。
別の実施形態は、メラニン量低減が所望されるケラチノサイトにおけるオートファジーの活性化に関与する遺伝子又はそれにコードされる分子の発現若しくは活性を増強することによって、当該ケラチノサイトにおけるメラニン量を減少させる工程を含む、ケラチノサイトにおけるメラニン量の低減方法である。
また別の実施形態は、メラニン量増加が所望されるケラチノサイトにおけるオートファジーの活性抑制に関与する遺伝子又はそれにコードされる分子の発現若しくは活性を増強することによって、当該ケラチノサイトにおけるメラニン量を増加させる工程を含む、ケラチノサイトにおけるメラニン量の増加方法である。
また別の実施形態は、メラニン量低減が所望されるケラチノサイトにおけるオートファジーの活性抑制に関与する遺伝子又はそれにコードされる分子の発現若しくは活性を抑制することによって、当該ケラチノサイトにおけるメラニン量を減少させる工程を含む、ケラチノサイトにおけるメラニン量の低減方法である。
本発明の別の例示的実施態様は、皮膚色明色化を所望する被験体の皮膚ケラチノサイトにおけるオートファジーの活性を増強することによって、当該ケラチノサイトにおけるメラニン量を減少させる工程を含む、被験体の皮膚色を明色化する方法である。この方法によれば、例えば、皮膚美白が可能になる。
別の実施形態は、皮膚色明色化を所望する被験体の皮膚ケラチノサイトにおけるオートファジーの活性化に関与する遺伝子又はそれにコードされる分子の発現若しくは活性を増強することによって、当該ケラチノサイトにおけるメラニン量を減少させる工程を含む、被験体の皮膚色を明色化する方法である。この方法によれば、例えば、皮膚美白が可能になる。
また別の実施態様は、皮膚色褐色化又は暗色化を所望する被験体の皮膚ケラチノサイトにおけるオートファジーの活性抑制に関与する遺伝子又はそれにコードされる分子の発現若しくは活性を増強することによって、当該ケラチノサイトにおけるメラニン量を増加させる工程を含む、被験体の皮膚色を褐色化又は暗色化する方法である。この方法によれば、例えば、皮膚タンニングが可能になる。
また別の実施形態は、皮膚色明色化を所望する被験体の皮膚ケラチノサイトにおけるオートファジーの活性抑制に関与する遺伝子又はそれにコードされる分子の発現若しくは活性を抑制することによって、当該ケラチノサイトにおけるメラニン量を減少させる工程を含む、被験体の皮膚色を明色化する方法である。この方法によれば、例えば、皮膚美白が可能になる。
本発明の別の例示的実施態様は、毛髪色明色化を所望する被験体の毛包ケラチノサイトにおけるオートファジーの活性を増強することによって、当該ケラチノサイトにおけるメラニン量を減少させる工程を含む、被験体の毛髪色を明色化する方法である。この方法によれば、例えば、髪のライトニング又はブリーチングが可能になる。
別の実施形態は、毛髪色明色化を所望する被験体の毛包ケラチノサイトにおけるオートファジーの活性化に関与する遺伝子又はそれにコードされる分子の発現若しくは活性を増強することによって、当該ケラチノサイトにおけるメラニン量を減少させる工程を含む、被験体の毛髪色を明色化する方法である。この方法によれば、例えば、髪のライトニング又はブリーチングが可能になる。
また別の実施形態は、毛髪色褐色化又は暗色化を所望する被験体の毛包ケラチノサイトにおけるオートファジーの活性抑制に関与する遺伝子又はそれにコードされる分子の発現若しくは活性を増強することによって、当該ケラチノサイトにおけるメラニン量を増加させる工程を含む、被験体の毛髪色を褐色化又は暗色化する方法である。この方法によれば、例えば、ブリーチ後の髪の色戻し又は白髪染めが可能になる。
また別の実施形態は、毛髪色明色化を所望する被験体の毛包ケラチノサイトにおけるオートファジーの活性抑制に関与する遺伝子又はそれにコードされる分子の発現若しくは活性を抑制することによって、当該ケラチノサイトにおけるメラニン量を減少させる工程を含む、被験体の毛髪色を明色化する方法である。この方法によれば、例えば、髪のライトニング又はブリーチングが可能になる。
一方、オートファジーの活性を増強する物質は、ケラチノサイトにおけるメラニン量低下剤として選択される。このような物質としては、オートファジーの活性化に関与する遺伝子又はそれにコードされる分子の発現若しくは活性を増強する物質、及びオートファジーの活性抑制に関与する遺伝子又はそれにコードされる分子の発現若しくは活性を抑制する物質が挙げられる。当該剤は、ケラチノサイトにおけるメラニン量を減少させて皮膚又は毛髪色を明色化する、皮膚又は毛髪色の明色化剤(例えば、皮膚美白剤、髪のライトニング又はブリーチング剤等)として使用することができる。
一方、オートファジーの活性を増強する物質は、ケラチノサイトにおけるメラニン量を減少させて、皮膚又は毛髪色を明色化する、皮膚又は毛髪色の明色化剤(例えば、皮膚美白剤、髪のライトニング又はブリーチング剤等)として選択される。このような物質としては、オートファジーの活性化に関与する遺伝子又はそれにコードされる分子の発現若しくは活性を増強する物質、及びオートファジーの活性抑制に関与する遺伝子又はそれにコードされる分子の発現若しくは活性を抑制する物質が挙げられる。
細胞に被験物質を投与する工程;
該細胞におけるオートファジーの活性の変化を測定する工程;及び
該測定の結果に基づいて、該被験物質のメラニン量調節作用を評価する工程。
細胞に被験物質を投与する工程;
該細胞におけるオートファジーの活性の変化を測定する工程;及び
該測定の結果に基づいて、該被験物質のケラチノサイトにおけるメラニン量調節作用を評価する工程。
(i) オートファジーの活性化に関与する遺伝子又はそれにコードされる分子の発現若しくは活性が抑制された場合;又は
(ii) オートファジーの活性抑制に関与する遺伝子又はそれにコードされる分子の発現若しくは活性が増強された場合。
(i) オートファジーの活性化に関与する遺伝子又はそれにコードされる分子の発現若しくは活性が増強された場合;又は
(ii) オートファジーの活性抑制に関与する遺伝子又はそれにコードされる分子の発現若しくは活性が抑制された場合。
細胞に被験物質を投与する工程;
該細胞におけるオートファジーの活性の変化を測定する工程;及び
該測定の結果に基づいて、該被験物質の皮膚又は毛髪色制御作用を評価する工程。
細胞に被験物質を投与する工程;
該細胞におけるオートファジーの活性の変化を測定する工程;及び
該測定の結果に基づいて、該被験物質の皮膚又は毛髪色制御作用を評価する工程。
(i) オートファジーの活性化に関与する遺伝子又はそれにコードされる分子の発現若しくは活性が抑制された場合;又は
(ii) オートファジーの活性抑制に関与する遺伝子又はそれにコードされる分子の発現若しくは活性が増強された場合。
(i) オートファジーの活性化に関与する遺伝子又はそれにコードされる分子の発現若しくは活性が増強された場合;又は
(ii) オートファジーの活性抑制に関与する遺伝子又はそれにコードされる分子の発現若しくは活性が抑制された場合。
(i) オートファジーの活性化に関与する遺伝子又はそれにコードされる分子の発現若しくは活性を抑制する工程;又は
(ii) オートファジーの活性抑制に関与する遺伝子又はそれにコードされる分子の発現若しくは活性を増強する工程。
(i) オートファジーの活性化に関与する遺伝子又はそれにコードされる分子の発現若しくは活性を増強する工程;又は
(ii) オートファジーの活性抑制に関与する遺伝子又はそれにコードされる分子の発現若しくは活性を抑制する工程。
(i) オートファジーの活性化に関与する遺伝子又はそれにコードされる分子の発現若しくは活性を抑制する工程;又は
(ii) オートファジーの活性抑制に関与する遺伝子又はそれにコードされる分子の発現若しくは活性を増強する工程。
(i) オートファジーの活性化に関与する遺伝子又はそれにコードされる分子の発現若しくは活性を増強する工程;又は
(ii) オートファジーの活性抑制に関与する遺伝子又はそれにコードされる分子の発現若しくは活性を抑制する工程。
(i) オートファジーの活性化に関与する遺伝子又はそれにコードされる分子の発現若しくは活性を抑制する工程;又は
(ii) オートファジーの活性抑制に関与する遺伝子又はそれにコードされる分子の発現若しくは活性を増強する工程。
(i) オートファジーの活性化に関与する遺伝子又はそれにコードされる分子の発現若しくは活性を増強する工程;又は
(ii) オートファジーの活性抑制に関与する遺伝子又はそれにコードされる分子の発現若しくは活性を抑制する工程。
(正常ヒト新生児包皮由来ケラチノサイト;NHEKs)
正常ヒト新生児包皮由来ケラチノサイト(NHEKs)はKURABOより購入した。細胞を、6ウェルプレートに1×105細胞/ウェルの密度で播種し、37℃、5%(v/v)CO2下で24時間培養した。培地は、EpiLife培地(KURABO)[10μg/mlインスリン、0.1μg/ml hEGF、0.5μg/mlハイドロコルチゾン、50μg/mlゲンタマイシン、50ng/mlアンフォテリシンB、及び0.4%(v/v)ウシ脳下垂体抽出物(bovine pituitary extract;BPE)添加]を用いた。培養後、BPEとhEGFを除いた培地でさらに24時間培養して、以下の実験に用いた。
(メラノソーム)
メラノーマMNT−1細胞は、Dr. PiedGiorgio Natali (Regina Elena Institute, Rome, Italy)の好意により提供された。MNT−1細胞をRPMI−1640培地[10%(v/v)FBS及び10%(v/v)AIM−V medium添加]で培養し、その後該細胞からメラノソームを単離した。
(新生児包皮由来ケラチノサイト;NHEKs)
コーカシアン系アメリカ人及びアフリカ系アメリカ人ドナーの新生児包皮は、National Disease Research Interchange(フィラデルフィア)から入手し、Yoshida et al (FASEB J 21:2829−2839, 2007)に記載の方法に従ってNHEKsを調製した。すなわち、包皮をディスパーゼ処理することで表皮と真皮を分離し、表皮シートを0.25%トリプシン/EDTA溶液中37℃で10分間処理することで細胞を単離し、専用培地を用いて;NHEKsを初代培養した。
(三次元培養ヒト皮膚モデル)
三次元(3D)培養ヒト皮膚モデル(3D−human skin substitutes;3D−HSSs)は、MatTek Co.から購入し(MEL−300A又はB)、製品マニュアルに従って、EPI−100NMM−113 medium(MatTek Co.)中で37℃、5%CO2下で維持した。
培養NHEKsは、MNT−1細胞由来単離メラノソームとともに、リソソーム阻害剤であるE−64−D及びペプスタチンA(各20μg/ml)の存在下又は非存在下で培養した。24時間後、細胞をPBSで洗浄し、さらにE−64−D及びペプスタチンA(各20μg/ml)の存在下又は非存在下で24時間培養した。細胞をPBSで洗浄し、プロテアーゼ阻害剤カクテル(Roche)を含むRIPAバッファー(Sigma−Aldrich)で溶解し、超音波でホモジェナイズして、上清を回収し、SDS−ポリアクリルアミド電気泳動で分離した。分離したサンプルをSequi−Blot(登録商標)PVDF膜(Bio−Rad)に転写し、メラノソームタンパク質Pmel−17に特異的抗体(clone HMB−45、DAKO Inc.)によるウエスタンブロッティング解析を行った。
ウエスタンブロッティングでは、上記PVDF膜をPmel−17特異的抗体(2000倍希釈)とともにインキュベートし、洗浄して、2次抗体とインキュベートした。2次抗体は、ペルオキシダーゼ結合抗マウスIgG又はペルオキシダーゼ結合抗ウサギIgG(5000倍希釈、GE Healthcare UK Ltd.)を用いた。バンドは、ECL western blotting detection reagents(GE Healthcare UK Ltd.)で可視化した。次いで、内部標準としてロードしたβ−アクチンに特異的な抗体(Sigma−Aldrich)で膜を再ブロットし、ロードしたタンパク質量を標準化した。
一部のデータについては、ウエスタンブロッティング解析で得られたPmel−17の各バンドのβ−アクチンのバンドに対する相対強度を求め、メラニン蓄積量を定量化した。
結果を図1に示す。リソソーム阻害剤の添加により、NHEKsにメラノソームが蓄積した。この結果より、NHEKsにおけるメラノソーム分解にリソソームの活性が関与していることが示唆された。
コーカシアン系アメリカ人及びアフリカ系アメリカ人の新生児包皮由来ケラチノサイト(NHEKs)における、オートファジー関連因子ATG7又はATG13の発現量を調べた。
NHEKsは、2日間培養した後、参考例1と同様の手順で、ATG7特異的抗体(Epitomics Inc.)又はATG13特異的抗体(MBL International)によるウエスタンブロッティング解析を行った。
結果を図2に示す。明色の皮膚を有するコーカシアン系アメリカ人由来のNHEKsは、暗色の皮膚を有するアフリカ系アメリカ人由来のNHEKsと比べて、オートファジー関連因子の発現が高かった。
コーカシアン系アメリカ人及びアフリカ系アメリカ人の新生児包皮由来ケラチノサイト(NHEKs)における、オートファジーの活性を調べた。
NHEKsは、オートファジー阻害剤であるヒドロキシクロロキン(HCQ、10μM)の存在下又は非存在下で48時間培養し、参考例1と同様の手順で、オートファジーの基質であるp62特異的抗体(2000倍希釈、MBL International)、又はLC3特異的抗体(2000倍希釈、MBL International,又はCosmo Bio Co. Ltd.)によるウエスタンブロッティング解析を行った。なお、LC3タンパク質としては、LC3-I及びLC3−Iにホスファチジルエタノールアミンが付加されオートファゴソームに局在するLC3−IIを検出した。ウエスタンブロッティングの各バンドのβ−アクチンのバンドに対する相対強度を求め、オートファジー活性を定量化した。
結果を図3に示す。オートファジー阻害剤であるヒドロキシクロロキン存在下において、コーカシアン系アメリカ人由来のNHEKsは、アフリカ系アメリカ人由来のNHEKsと比べて、p62及びLC3−IIの蓄積量が多く、高いオートファジー活性を有することが示された。
コーカシアン系アメリカ人及びアフリカ系アメリカ人の新生児包皮由来ケラチノサイト(NHEKs)を、MNT−1細胞由来単離メラノソームとともに0、4、8、24又は48時間培養した。細胞をPBSで洗浄し、参考例1と同様の手順で、LC3特異的抗体、又はCOX−IV特異的抗体(Abcam Inc.)によるウエスタンブロッティング解析を行った。ウエスタンブロッティングの各バンドをβ−アクチンに対して標準化し、相対強度を求めた。
結果を図4に示す。コーカシアン系アメリカ人由来のNHEKsは、メラノソームによりLC3−II量が増加し、また、オートファジー活性により分解されるマーカーの一つとして知られるCOX−IV量は減少したことから、オートファジー活性が高く、メラニンを積極的に分解するようになっていることが示唆される。一方、アフリカ系アメリカ人由来のNHEKsは、メラノームによりLC3-II量が減少しており、オートファジー活性が抑制されていることから、メラニンを積極的に蓄積するようになっていることが示唆される。以上のことから、ケラチノサイトにおけるオートファジーの活性が皮膚のメラニン量、および皮膚色と関係していることが考えられる。
NHEKsに、HiPerfect Transfection Reagent(QUIAGEN)を用いて、製品マニュアルに従い、10nMのATG7特異的siRNA、ATG13特異的siRNA、UVRAG特異的siRNA、又は非特異的siRNA(対照)をトランスフェクトした。48時間後、MNT−1細胞由来単離メラノソームを添加し、24時間培養した。培養物をPBSで洗浄して細胞に取り込まれなかったメラノソームを洗浄し、さらに24時間培養した後、参考例1と同様の手順で、ATG7特異的抗体(Epitomics Inc.)、LC3特異的抗体(Cosmo Bio Co.Ltd.又はMBL International)、p62特異的抗体(MBL International)又はメラノソームタンパク質であるPmel17に特異的な抗体(clone HMB−45、DAKO Inc.)によるウエスタンブロッティング解析を行った。結果を図5A及びBに示す。ATG7、ATG13及びUVRAGの特異的な発現阻害により、ケラチノサイトにおいてオートファジーの基質であるp62が蓄積し、Pmel17の量が顕著に増加した。
NHEKsに10nMのATG7特異的siRNA又は非特異的siRNA(対照)をトランスフェクトし、NHEMsと共に7日間培養した。細胞をPBSで洗浄後に乾燥し、SolvableTM(PerkinElmer)で溶解させ、吸光度計(Microplate Reader Model 550; Bio−Rad Laboratories)によりメラニン量を測定した。結果を図5Cに示す。ATG7発現阻害によりケラチノサイトとメラノサイトとの共培養におけるメラニン量が増加した。
これらの結果は、オートファジーがケラチノサイトにおけるメラノソーム分解に寄与していることを示唆する。
NHEKsに、HiPerfect Transfection Reagent(QUIAGEN)を用いて、製品マニュアルに従い、100pM、1nM、又は10nMのRAB11A特異的siRNA又はATG7特異的siRNA、あるいは10nMの非特異的siRNA(対照)をトランスフェクトした。48時間後、MNT−1細胞由来単離メラノソームを添加し、24時間培養した。培養物をPBSで洗浄して細胞に取り込まれなかったメラノソームを洗浄し、さらに24時間培養した後、参考例1と同様の手順で、RAB11A特異的抗体(Life Technologies, Corp.)、ATG7特異的抗体(Epitomics Inc.)、又はPmel17特異的な抗体(clone HMB−45、DAKO Inc.)によるウエスタンブロッティング解析を行った。
結果を図6に示す。Pmel17量は、RAB11A及びATG7のsiRNA濃度に依存して増加した。この結果は、ケラチノサイトのオートファジー活性レベルとメラニン蓄積との間に負の相関があることを示唆する。
培養NHEKsに、HiPerfect Transfection Reagent(QUIAGEN)を用いて、製品マニュアルに従い、10nMのATG5特異的siRNA、UVRAG特異的siRNA、又は非特異的siRNA(対照)をトランスフェクトした。48時間後、MNT−1細胞由来単離メラノソームを添加し、24時間培養した。培養物をPBSで洗浄して細胞に取り込まれなかったメラノソームを洗浄し、さらに24時間培養した後、参考例1と同様の手順で、Pmel17特異的抗体(clone HMB−45、DAKO Inc.)によるウエスタンブロッティング解析を行った。
結果を図7に示す。ATG5又はUVRAGの特異的阻害により、Pmel17(clone;HMB45)の量が顕著に増加した。この結果は、NHEKsにおけるメラノソーム分解にオートファジー関連因子が寄与していることを示唆する。
オートファジー抑制因子であるmTORの抑制がメラニン蓄積に与える影響を調べた。培養NHEKsに、HiPerfect Transfection Reagent(QUIAGEN)を用いて、製品マニュアルに従い、10nMのmTOR特異的siRNA又は非特異的siRNA(対照)をトランスフェクトした。24時間後、MNT−1細胞由来単離メラノソームを添加し、24時間培養した。培養物をPBSで洗浄して細胞に取り込まれなかったメラノソームを洗浄し、さらに24時間培養した後、参考例1と同様の手順で、LC3特異的抗体(Cosmo Bio Co.Ltd.又はMBL International)及びPmel17特異的な抗体(clone HMB−45、DAKO Inc.)によるウエスタンブロッティング解析を行った。ウエスタンブロッティングの各バンドをβ−アクチンに対して標準化し、相対強度を求めた。
結果を図8に示す。オートファジー抑制因子であるmTORの特異的阻害でオートファジー活性が亢進したため、LC3−II量が増加し、Pmel17は顕著に低下した。この結果から、mTORは、オートファジー機構を介してメラニン蓄積量に影響していることが示唆された。
3D−HSSs(three-dimensional human skin substitutes、NHEK及びNHEMを含む再構成表皮モデル)は、オートファジー誘導剤であるベラパミル(10μM)又はラパマイシン(1μM)とともに14日間培養した。培地は1日おきに交換した。培養後、参考例1と同様の手順で、p62特異的抗体(MBL International)及びLC3特異的抗体(Cosmo Bio Co.Ltd.又はMBL International)によるウエスタンブロッティング解析を行った。
また、3D−HSSsをエンドセリン−1及びSCF存在下でオートファジー阻害剤であるヒドロキシクロロキン(HCQ、10μM)とともに14日間培養し、ウエスタンブロッティング解析を行った。
結果を図9に示す。オートファジー誘導剤により、3D−HSSsの暗色化が抑えられた(図9A、培養14日後)。またオートファジー活性の指標因子であるLC3−IIの量が増加し、オートファジーにより分解を受ける基質タンパク質p62の量が減少した(図9B、培養6日後)。一方、オートファジー阻害剤であるHCQにより、3D−HSSsは暗色化し、またp62の量が増加した(図9C、D)。
アフリカ系アメリカ人から皮膚組織を採取し、オートファジー誘導剤ベラパミル(10μM)若しくはラパマイシン(1μM)、又はオートファジー阻害剤ヒドロキシクロロキン(HCQ、10μM)の存在下又は非存在下で培養した。8日培養後に、培養皮膚の明度(L*値)を色差計(Colorimeter;cyberDERM社)により測定した。結果を図10に示す。オートファジー誘導剤とともに培養された皮膚のL*値は上昇した(すなわち、皮膚色が明るくなった)一方で、オートファジー阻害剤とともに培養された皮膚のL*値は低下した(すなわち、皮膚色が暗くなった)。
選択した候補物質のメラニン量調節活性を調べた。NHEK及びNHEMを含む3D−HSSsの上部(角層側)のみに上記で選択した候補物質を添加して14日間培養した。培養後、組織を水酸化ナトリウム(2N)水溶液で可溶化することにより、組織中のメラニン量を測定した。同様に候補物質を添加して培養した3D−HSSsの細胞呼吸活性を、アラマーブルー法によって測定することにより、候補物質の細胞毒性を調べた。2種類の候補物質サンプルA及びBについての結果を図11に示す。候補物質がメラニン量増強活性を有することが確認された。また細胞呼吸活性の結果より、これらの候補物質に細胞毒性がないことが確認された。
Claims (6)
- ケラチノサイトにおけるメラニン量調節剤の評価又は選択方法であって、
下記工程:
ケラチノサイトに被験物質を投与する工程;
該ケラチノサイトにおけるオートファジーの活性の変化を測定する工程;及び
該測定の結果に基づいて、該被験物質のメラニン量調節作用を評価する工程、
を含み、
該ケラチノサイトが、培養ケラチノサイト、又は表皮若しくは毛包組織の培養物に含まれるケラチノサイトであり、
以下の場合に、該被験物質がケラチノサイトにおけるメラニン量を増加させる作用があると評価され、
(i) オートファジーの活性化に関与する遺伝子又はそれにコードされる分子の発現若しくは活性が抑制された場合;又は
(ii) オートファジーの活性抑制に関与する遺伝子又はそれにコードされる分子の発現若しくは活性が増強された場合、
以下の場合に、該被験物質がケラチノサイトにおけるメラニン量を低下させる作用があると評価され、
(i') オートファジーの活性化に関与する遺伝子又はそれにコードされる分子の発現若しくは活性が増強された場合;又は
(ii') オートファジーの活性抑制に関与する遺伝子又はそれにコードされる分子の発現若しくは活性が抑制された場合、
該オートファジーの活性化に関与する遺伝子又はそれにコードされる分子、及び該オートファジーの活性抑制に関与する遺伝子又はそれにコードされる分子が、以下:
オートファジー経路における、ファゴフォアの発生、ファゴフォアの伸長又は成長、オートファゴソームの形成、オートファゴソームとリソソームとの融合、オートリソソームの形成、及びオートリソソーム内部における物質の分解のいずれかのステップに関与する遺伝子又はそれにコードされる分子であり;かつ
ATG7、RAB11A、CLIP−170、Rubicon及びRAB7Bからなる群から選択される遺伝子ならびにそれらにコードされる分子を含まない、
方法。 - メラニンに起因する皮膚色の制御剤の評価又は選択方法であって、
下記工程:
ケラチノサイトに被験物質を投与する工程;
該ケラチノサイトにおけるオートファジーの活性を測定する工程;及び
該測定の結果に基づいて、該被験物質の皮膚色制御作用を評価する工程、
を含み、
該ケラチノサイトが、培養ケラチノサイト、又は表皮若しくは毛包組織の培養物に含まれるケラチノサイトであり、
以下の場合に、該被験物質が皮膚色を暗色化する作用があると評価され、
(i) オートファジーの活性化に関与する遺伝子又はそれにコードされる分子の発現若しくは活性が抑制された場合;又は
(ii) オートファジーの活性抑制に関与する遺伝子又はそれにコードされる分子の発現若しくは活性が増強された場合、
以下の場合に、該被験物質が皮膚色を明色化する作用があると評価され、
(i') オートファジーの活性化に関与する遺伝子又はそれにコードされる分子の発現若しくは活性が増強された場合;又は
(ii') オートファジーの活性抑制に関与する遺伝子又はそれにコードされる分子の発現若しくは活性が抑制された場合、
該オートファジーの活性化に関与する遺伝子又はそれにコードされる分子、及び該オートファジーの活性抑制に関与する遺伝子又はそれにコードされる分子が、以下:
オートファジー経路における、ファゴフォアの発生、ファゴフォアの伸長又は成長、オートファゴソームの形成、オートファゴソームとリソソームとの融合、オートリソソームの形成、及びオートリソソーム内部における物質の分解のいずれかのステップに関与する遺伝子又はそれにコードされる分子であり;かつ
ATG7、RAB11A、CLIP−170、Rubicon及びRAB7Bからなる群から選択される遺伝子ならびにそれらにコードされる分子を含まない、
方法。 - 前記投与工程が、ケラチノサイトに被験物質及びメラノソームを投与する工程である、
請求項2記載の方法。 - 毛髪色制御剤の評価又は選択方法であって、
下記工程:
ケラチノサイトに被験物質を投与する工程;
該ケラチノサイトにおけるオートファジーの活性を測定する工程;及び
該測定の結果に基づいて、該被験物質の毛髪色制御作用を評価する工程、
を含み、
該ケラチノサイトが、培養ケラチノサイト、又は表皮若しくは毛包組織の培養物に含まれるケラチノサイトであり、
以下の場合に、該被験物質が毛髪色を暗色化する作用があると評価され、
(i) オートファジーの活性化に関与する遺伝子又はそれにコードされる分子の発現若しくは活性が抑制された場合;又は
(ii) オートファジーの活性抑制に関与する遺伝子又はそれにコードされる分子の発現若しくは活性が増強された場合、
以下の場合に、該被験物質が毛髪色を明色化する作用があると評価され、
(i') オートファジーの活性化に関与する遺伝子又はそれにコードされる分子の発現若しくは活性が増強された場合;又は
(ii') オートファジーの活性抑制に関与する遺伝子又はそれにコードされる分子の発現若しくは活性が抑制された場合、
該オートファジーの活性化に関与する遺伝子又はそれにコードされる分子、及び該オートファジーの活性抑制に関与する遺伝子又はそれにコードされる分子が、以下:
オートファジー経路における、ファゴフォアの発生、ファゴフォアの伸長又は成長、オートファゴソームの形成、オートファゴソームとリソソームとの融合、オートリソソームの形成、及びオートリソソーム内部における物質の分解のいずれかのステップに関与する遺伝子又はそれにコードされる分子であり;かつ
ATG7、RAB11A、CLIP−170、Rubicon及びRAB7Bからなる群から選択される遺伝子ならびにそれらにコードされる分子を含まない、
方法。 - ケラチノサイトにおけるメラニン量の調節方法であって、
メラニン量調節が所望されるケラチノサイトにおけるオートファジーの活性を調節する工程、及びオートファジーの活性を調節したケラチノサイトにおけるメラニン量を評価する工程を含み、
該ケラチノサイトが、培養ケラチノサイト、又は表皮若しくは毛包組織の培養物に含まれるケラチノサイトであり、
該オートファジーの活性を調節する工程が、以下の工程によりケラチノサイトにおけるメラニン量を増加させる工程であるか、
(i) オートファジーの活性化に関与する遺伝子又はそれにコードされる分子の発現若しくは活性を抑制する工程;又は
(ii) オートファジーの活性抑制に関与する遺伝子又はそれにコードされる分子の発現若しくは活性を増強する工程、
あるいは
該オートファジーの活性を調節する工程が、以下の工程によりケラチノサイトにおけるメラニン量を減少させる工程であり、
(i') オートファジーの活性化に関与する遺伝子又はそれにコードされる分子の発現若しくは活性を増強する工程;又は
(ii') オートファジーの活性抑制に関与する遺伝子又はそれにコードされる分子の発現若しくは活性を抑制する工程、
該オートファジーの活性化に関与する遺伝子又はそれにコードされる分子、及び該オートファジーの活性抑制に関与する遺伝子又はそれにコードされる分子が、以下:
オートファジー経路における、ファゴフォアの発生、ファゴフォアの伸長又は成長、オートファゴソームの形成、オートファゴソームとリソソームとの融合、オートリソソームの形成、及びオートリソソーム内部における物質の分解のいずれかのステップに関与する遺伝子又はそれにコードされる分子であり;かつ
ATG7、RAB11A、CLIP−170、Rubicon及びRAB7Bからなる群から選択される遺伝子ならびにそれらにコードされる分子を含まない、
方法。 - 前記オートファジーの活性化に関与する遺伝子又はそれにコードされる分子、及びオートファジーの活性抑制に関与する遺伝子又はそれにコードされる分子が、以下:
ATG1、ULK1又はULK2;ATG13;ATG17;ATG29;ATG31;ATG101;FIP200;VPS34;VPS15又はp150;ATG6、VPS30又はBeclin1;ATG14;Ambra1;ATG2;ATG9;ATG18又はWIPI1−4;DFVP1;DFCP1;VMP1;mTOR;ATG5;ATG10;ATG12;ATG16又はATG16L1;ATG3;ATG4又はATG4A−D;ATG8、LC3、GATE−16又はGABARAP;p62;および、UVRAG又はVPS38、
からなる群より選択される遺伝子又はそれにコードされる分子である、請求項1〜5のいずれか1項記載の方法。
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