JP5220791B2 - メラニン産生誘導剤および被験物質の評価方法 - Google Patents
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Description
(1) 色素細胞におけるメラニン産生を誘導するメラニン産生誘導剤であって、インターロイキン−8、結合組織成長因子およびインターロイキン−1ファミリー メンバー9からなる群より選ばれた少なくとも1種の因子を含有することを特徴とするメラニン産生誘導剤、
(2) 被験物質の美白作用を評価する被験物質の評価方法であって、
(A)色素細胞を含有する細胞群に、インターロイキン−8、結合組織成長因子およびインターロイキン−1ファミリー メンバー9からなる群より選ばれた少なくとも1種の因子を接触させ、前記細胞群中の色素細胞におけるメラニン産生を誘導するステップ、
(B)前記ステップ(A)で得られた細胞群に被験物質を接触させ、前記細胞群中の色素細胞により産生されたメラニンの量を測定するステップ、および
(C)前記ステップ(B)で測定されたメラニンの量に基づき、前記因子を介して誘導されるメラニン産生の抑制を調べ、前記被験物質の美白作用を評価するステップ
を含む被験物質の評価方法、
(3) 前記細胞群がヒト細胞からなる細胞群である前記(2)に記載の評価方法、ならびに
(4) 前記細胞群がヒト色素細胞からなる細胞群またはヒト色素細胞とヒト表皮角化細胞とからなる細胞群である前記(3)に記載の評価方法
に関する。
本発明のメラニン産生誘導剤は、色素細胞におけるメラニン産生を誘導するメラニン産生誘導剤であって、インターロイキン−8(以下、「IL−8」という)、結合組織成長因子(以下、「CTGF」という)およびインターロイキン−1ファミリー メンバー9(以下、「IL−1F9」という)からなる群より選ばれた少なくとも1種の因子を含有することを特徴とする。
本発明の被験物質の評価方法は、被験物質の美白作用を評価する被験物質の評価方法であって、
(A)色素細胞を含有する細胞群に、IL−8、CTGFおよびIL−1F9からなる群より選ばれた少なくとも1種の因子を接触させ、前記細胞群中の色素細胞におけるメラニン産生を誘導するステップ、
(B)前記ステップ(A)で得られた細胞群に被験物質を接触させ、前記細胞群中の色素細胞により産生されたメラニンの量を測定するステップ、および
(C)前記ステップ(B)で測定されたメラニンの量に基づき、前記因子を介して誘導されるメラニン産生の抑制を調べ、前記被験物質の美白作用を評価するステップ
を含むことを特徴とする。
DK−SFM〔ライフテクノロジーズ社製〕と色素細胞増殖培地254〔倉敷紡績(株)製〕とを、DK−SFMと254との体積比(DK−SFM/254)が1/1となるように添加して、DK−SFM/254培地を得た。なお、前記DK−SFM/254培地中のカルシウム濃度は、0.15mM未満であった。
塩基性線維芽細胞増殖因子(b−FGF)〔シグマ・アルドリッチ・コーポレーション製〕およびα-色素細胞刺激ホルモン(αMSH)〔シグマ・アルドリッチ・コーポレーション製〕を、b−FGF濃度が5ng/mLおよびαMSH濃度が10ng/mLとなるように3次元培養皮膚維持培地〔倉敷紡績(株)製、商品名:NMM〕に添加してNMM長期維持培地を得た。なお、前記NMM長期維持培地中のカルシウム濃度は、1.2mMであった。
FBS、アデニン〔シグマ・アルドリッチ・コーポレーション製〕、EGF、ヒドロコルチゾン、インスリン、イソプロテレノール〔シグマ・アルドリッチ・コーポレーション製〕、トランスフェリンおよびトリヨードチロニン〔シグマ・アルドリッチ・コーポレーション製〕を、FBS濃度が10体積%、アデニン濃度が0.18mM、EGF濃度が10ng/mL、ヒドロコルチゾン濃度が0.4μg/mL、インスリン濃度が5μg/mL、イソプロテレノール濃度が10μM、トランスフェリン濃度が5μg/mLおよびトリヨードチロニン濃度が2nMとなるようにDMEM/F12混合培地[DMEM〔ライフテクノロジーズ社製〕とF12〔ライフテクノロジーズ社製〕との混合物(DMEM/F12の体積比=3/1)]に添加して、DMEM/F12調整培地を得た。なお、前記DMEM/F12調整培地中のカルシウム濃度は、0.15mM未満であった。
正常ヒト表皮角化細胞(以下、「NHK」という)〔倉敷紡績(株)製〕と正常ヒト色素細胞(以下、「NHM」という)〔倉敷紡績(株)製〕とを、NHK/NHM(細胞数比)が10/3となるように混合してNHK/NHM混合物を得た。
製造例4で得られたNHK/NHM混合物を、全細胞濃度が1.0×104細胞/cm2となるように6cmディッシュ上の培地に播種し、5体積%二酸化炭素下、37℃で7日間培養した。なお、培地として、製造例1で得られたDK−SFM/254培地、製造例2で得られたNMM長期維持培地または製造例3で得られたDMEM/F12調整培地を用いた。また、培養期間中、前記6cmディッシュ上の培地を、1日おきに新鮮な培地に交換した。
NHK(実験番号1)、NHM(実験番号2)、または製造例1で得られたNHKとNHMとの混合物(実験番号3)を、細胞濃度が1.0×104細胞/cm2となるように6cmディッシュ上のDK−SFM/254培地に播種し、5体積%二酸化炭素下、37℃で7日間培養した。なお、培養期間中、前記6cmディッシュ上の培地を、1日おきに新鮮な培地に交換した。
製造例1で得られたNHKとNHMとの混合物を、細胞濃度が1.0×104細胞/cm2となるように6cmディッシュ上のDK−SFM/254培地に播種し、5体積%二酸化炭素下、37℃で培養した。なお、培養期間中、前記6cmディッシュ上の培地を、1日おきに新鮮な培地に交換した。
細胞濃度が1.0×104個/cm2となるように播種された6cmディッシュ上のNHK細胞に対して、UV−B照射量が7.5mJ/cm2となるようにUV−Bを照射した。つぎに、UV−B照射後のNHKを、細胞濃度が1.0×104細胞/cm2となるように6cmディッシュ上のDK−SFM/254培地に播種し、5体積%二酸化炭素下、37℃で培養した。なお、培養期間中、前記6cmディッシュ上の培地を、1日おきに新鮮な培地に交換した。
IF(U/N≧3,IF(N and U≧20,抽出,IF(U≧100,抽出,除外),除外) (2)
(式中、Nは、UV−B未照射の細胞における遺伝子のシグナル強度、Uは、UV−B照射後の細胞における遺伝子のシグナル強度を示す)
で表される条件式に基づいて、UV−B照射後のNHKにおける発現量がUV−B非照射のNHKにおける発現量と比べて3倍以上となっている遺伝子を選抜した。つぎに、選抜された遺伝子によりコードされる因子を、メラニン産生を誘導する候補因子として選抜した。
(1)候補分子の使用濃度の検討
製造例1で得られたNHKとNHMとの混合物を、細胞濃度が1.0×104細胞/cm2となるように6cmディッシュ上のDK−SFM/254培地に播種した。その後、播種後の前記培地に、表1に示される候補因子のいずれかを、前記候補因子の濃度が各種濃度となるように添加した。その後、前記混合物を5体積%二酸化炭素下、37℃で培養した。なお、培養期間中、前記6cmディッシュ上の培地を、1日おきに新鮮な培地に交換した。
製造例2で得られたNHKとNHMとの混合物を、細胞濃度が1.0×104細胞/cm2となるように6cmディッシュ上のDK−SFM/254培地に播種した。つぎに、播種後の前記培地に、表1に示される候補因子のいずれかを、前記候補因子の濃度が前記至適濃度となるように添加した。その後、前記混合物を5体積%二酸化炭素下、37℃で培養した。なお、培養期間中、前記6cmディッシュ上の培地を、1日おきに新鮮な培地に交換した。
前記(2)において、前記因子を添加する代わりに、前記因子を培地に添加しないこと(実験番号6)、陽性対照であるαMSHを培地に添加したこと(実験番号7)、IL−8を培地に添加したこと(実験番号8)、CTGFを培地に添加したこと(実験番号9)またはIL−1F9を培地に添加したこと(実験番号10)を除き、前記(2)と同様にして、メラニン量の相対値を算出した。
(1)IL−8を用いたコウジ酸の評価
製造例2で得られたHaCaT細胞とNHMとの混合物を、細胞濃度が1.0×104細胞/cm2となるように6cmディッシュ上のDK−SFM/254培地に播種した。その後、IL−8を、前記混合物を播種したDK−SFM/254培地に、IL−8濃度が5ng/mLとなるように添加した。さらに、得られた培地に、美白作用を有することが知られているコウジ酸を、コウジ酸濃度が1mMとなるように添加した。
前記(1)において、IL−8を、前記混合物を播種したDK−SFM/254培地に、IL−8濃度が5ng/mLとなるように添加する代わりに、CTGFを、前記混合物を播種したDK−SFM/254培地に、CTGF濃度が5ng/mLとなるように添加したことを除き、前記(1)と同様にして、前記混合物の培養物におけるメラニン量の相対値を算出した。
前記(1)において、IL−1F9を、前記混合物を播種したDK−SFM/254培地に、IL−1F9濃度が5ng/mLとなるように添加する代わりに、IL−1F9を、前記混合物を播種したDK−SFM/254培地に、IL−1F9濃度が5ng/mLとなるように添加したことを除き、前記(1)と同様にして、前記混合物の培養物におけるメラニン量の相対値を算出した。
Claims (4)
- 色素細胞におけるメラニン産生を誘導するメラニン産生誘導剤であって、インターロイキン−8、結合組織成長因子およびインターロイキン−1ファミリー メンバー9からなる群より選ばれた少なくとも1種の因子を含有することを特徴とするメラニン産生誘導剤。
- 被験物質の美白作用を評価する被験物質の評価方法であって、
(A)色素細胞を含有する細胞群に、インターロイキン−8、結合組織成長因子およびインターロイキン−1ファミリー メンバー9からなる群より選ばれた少なくとも1種の因子を接触させ、前記細胞群中の色素細胞におけるメラニン産生を誘導するステップ、
(B)前記ステップ(A)で得られた細胞群に被験物質を接触させ、前記細胞群中の色素細胞により産生されたメラニンの量を測定するステップ、および
(C)前記ステップ(B)で測定されたメラニンの量に基づき、前記因子を介して誘導されるメラニン産生の抑制を調べ、前記被験物質の美白作用を評価するステップ
を含む被験物質の評価方法。 - 前記細胞群がヒト細胞からなる細胞群である請求項2に記載の評価方法。
- 前記細胞群がヒト色素細胞からなる細胞群またはヒト色素細胞とヒト表皮角化細胞とからなる細胞群である請求項3に記載の評価方法。
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