KR102256277B1

KR102256277B1 - Rab5A 억제제를 유효성분으로 함유하는 피부 색소형성 억제용 조성물

Info

Publication number: KR102256277B1
Application number: KR1020170086986A
Authority: KR
Inventors: 이애영; 김난형; 이태룡
Original assignee: 동국대학교 산학협력단
Priority date: 2017-07-10
Filing date: 2017-07-10
Publication date: 2021-05-27
Also published as: KR20190006253A

Abstract

본 발명은 Rab5A 억제제를 유효성분으로 함유하는 색소형성 억제용 조성물에 관한 것으로, 상기 조성물은 티로시나제의 발현을 억제하고, 멜라노좀의 이동 및 포식을 감소시킬 수 있으므로 색소형성 억제 용도로 유용하게 이용될 수 있다.

Description

Rab5A 억제제를 유효성분으로 함유하는 피부 색소형성 억제용 조성물{Composition for Suppressing Cutaneous Pigmentation Containing Rab5A Inhibitors}

본 발명은 Rab5A 억제제를 유효성분으로 함유하는 피부 색소형성 억제용 조성물에 관한 것이다.

기미(melasma)는 색소가 과도하게 침착되는 가장 흔한 피부 질환의 하나이며, 피부 색소침착은 멜라닌세포에서 생성된 멜라노좀이 멜라닌세포 주변의 각질형성세포로 이동하는 과정 및 각질형성세포의 분해를 통하여 이루어진다. 이러한 멜라노좀의 이동에는 멜라닌세포의 세포체(cell body) 및 수상돌기(dendrite)에서 멜라노좀으로 채워진 위족(filophodia)의 형성 등과 같은 기작이 필요한 것으로 알려져 있다.

Rab 단백질은 구아노신 삼인산-결합 단백질(guanosine triphosphatase (GTP)-binding proteins) 패밀리를 형성하는 단백질의 하나로 세포 내의 특정 구역(compartment)에 위치하는 것으로 알려져 있다. 이 단백질은 세포 내에서 막 이동(membrane transport)의 조절에 관여하는 것으로 알려져 있으며, 예를 들어 Rab27A/Melanophilin/Myosin5a 단백질 복합체는 멜라닌세포의 말초 액틴 네트워크(peripheral actin network)로 멜라노좀을 이동시키는 것으로 알려져 있다(Westbroek et al., 2008). 인간은 약 60개의 Rab 유전자를 가지고 있으며(Seabra et al., 2002), Rab7 및 Rab27a와 같은 일부 Rab 단백질들은 피부의 색소침착에 관여하는 것으로 알려져 있다(Bahadoran et al., 2001 등).

본 발명자들은 Rab5A(RAS-associated protein Rab5A)가 티로시나제 등 색소 형성에 관여하는 단백질들의 발현을 증가시키고, 멜라노좀의 이동 및 포식을 증가시킴으로써 피부 색소침착에 관여하는 것을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

1. 미국 등록특허 US 9,561,167 2. 미국 공개특허 US 2006/0252036

본 발명의 일 목적은 Rab5A(RAS-associated protein Rab5A) 억제제를 유효성분으로 포함하는 색소형성 억제용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 멜라닌세포와 시험물질을 접촉시키는 단계; 상기 시험물질과 접촉한 멜라닌세포를 배양하는 단계; 및 상기 배양한 멜라닌세포에서 티로시나제(tyrosinase), 키네신(kinesin), Rab7, Rab27A, EEA1(early endosome antigen 1), Trp-1(tyrosinase-related protein-1), RAC1(ras-related C3 botulinum toxin substrate 1), RhoA(Ras homolog gene family member A), CDC42(Cell division control protein 42 homolog) 및 디네인(dynein)으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 수준을 측정하여 시험물질의 유효성 여부를 판단하는 단계를 포함하는 색소형성 억제제 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 일 양상은 Rab5A 억제제를 유효성분으로 포함하는 색소형성 억제용 조성물을 제공한다.

본 명세서에서 사용하는 용어, 'Rab5A(RAS-associated protein Rab5A)'는 구아노신 삼인산-결합 단백질(guanosine triphosphatase (GTP)-binding proteins)의 하나이며, 세포 내에서 세포막의 세포질쪽 표면 및 초기 엔도좀(early endosome) 등에 주로 분포하는 것으로 알려져 있다.

본 명세서에서 사용하는 용어, 'Rab5A 억제제'는 Rab5A 유전자의 전사를 방해하여 mRNA 생성을 억제하거나 또는 mRNA가 번역되는 것을 억제하는 물질, mRNA의분해를 촉진하는 물질, Rab5A 단백질의 활성을 촉진하는 물질 및 단백질의 분해를 촉진할 수 있는 물질을 모두 포함한다.

본 발명의 일 실시예에 따르면 Rab5A의 발현이 증가하면 멜라닌 합성에 관여하는 티로시나제(tyrosinase)의 발현이 증가하기 때문에 상기 Rab5A 억제제는 색소형성 억제 용도로 유용하게 사용될 수 있다.

본 명세서에서 사용하는 용어, '색소형성 억제용 조성물'이란 색소형성에 관여하는 유전자의 발현 또는 mRNA의 번역을 억제하거나, 색소형성에 관여하는 단백질들의 활성 및 분해 수준을 조절할 수 있는 조성물을 의미한다.

본 발명의 일 실시예에 따르면 상기 색소는 멜라닌일 수 있으나 이에 한정되지 아니한다.

본 명세서에서 사용하는 용어, '멜라노좀(melanosome)'은 멜라닌을 포함하고 있는 막 형태의 과립으로 멜라닌을 멜라닌세포에서 각질형성세포로 이동시키는 역할을 한다. 멜라노좀은 멜라닌세포에서 수상돌기를 통해서 각질형성세포로 이동하며, 각질형성세포가 분해되면서 멜라노좀이 분해되면 멜라닌이 피부 각질층으로 이동하여 기미 등의 색소침착(pigmentation) 증상을 유발한다.

본 발명의 일 실시예에 따르면 상기 색소형성 억제용 조성물은 키네신의 발현을 억제하기 때문에 멜라노좀의 이동을 억제할 수 있으며, 또한 각질형성세포에 의한 멜라노좀의 포식을 억제할 수 있다.

본 발명의 색소형성 억제용 조성물은 약학 조성물 또는 기능성 화장료 조성물 중에서 선택된 다양한 형태로 제공될 수 있다.

본 발명의 조성물이 약학 조성물인 경우, 약학 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 사용하는 적절한 담체, 부형제, 붕해제, 감미제, 피복제, 팽창제, 윤활제, 활택제, 향미제, 항산화제, 완충액, 정균제, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 첨가제를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 조성물이 화장료 조성물인 경우, 화장료 조성물의 제형은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클린싱, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화 될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 유연 화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 아이 크림, 클렌징 크림, 클렌징 폼, 클렌징 워터, 팩, 스프레이 또는 파우더의 제형으로 제조될 수 있다.

본 발명의 다른 양상은

(a) 멜라닌세포와 시험물질을 접촉시키는 단계;

(b) 상기 시험물질과 접촉한 멜라닌세포를 배양하는 단계; 및

(c) 상기 배양한 멜라닌세포에서 티로시나제(tyrosinase), 키네신(kinesin), Rab7, Rab27A, EEA1(early endosome antigen 1), Trp-1(tyrosinase-related protein-1), RAC1(ras-related C3 botulinum toxin substrate 1), RhoA(Ras homolog gene family member A), CDC42(Cell division control protein 42 homolog) 및 디네인(dynein)으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 수준을 측정하여 시험물질의 유효성 여부를 판단하는 단계를 포함하는 색소형성 억제제 스크리닝 방법을 제공한다.

본 발명의 일 실시예에 따르면 상기 (a)의 멜라닌세포는 Rab5A가 과발현된 세포일 수 있다. Rab5A를 과발현시키는 방법은 당업계에 알려진 통상의 방법, 예를 들어 Rab5A를 암호화하는 유전자를 포함하는 벡터를 세포에 형질전환시키는 등의 방법을 이용할 수 있으나 이에 한정되지 아니한다.

본 발명의 일 실시예에 따르면 상기 (c)의 시험물질의 유효성 여부를 판단하는 단계는 시험물질 접촉 전과 비교하여 멜라닌세포에서 티로시나제, 키네신, Rab7, Rab27A, EEA1, Trp1, RAC1, RhoA 및 CDC42의 수준이 감소하거나, 디네인의 수준이 증가하는 경우 상기 시험물질이 색소형성 억제제로 유효한 것으로 판단하는 단계일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따르면 상기 '수준'을 측정하는 것은 단백질 농도, 활성, mRNA의 발현 정도를 측정하는 것을 의미한다. 상기 단백질 농도를 측정하는 것은 당업계에 알려진 통상의 방법, 예를 들어 웨스턴 블롯, ELISA(enzyme-linked immunospecific assay) 등을 이용하여 이루어 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따른 조성물은 티로시나제의 발현을 억제하고, 멜라노좀의 이동 및 포식을 감소시킬 수 있으므로 색소형성 억제 용도로 유용하게 이용될 수 있다.

도 1은 멜라닌세포에 miR-675, pMIR-RAB5A 벡터, pMIR-RAB5A mutant 1 벡터 및 pMIR-RAB5A mutant 2 벡터 각각 또는 이들의 조합을 트렌스펙션한 후 루시퍼라제 활성을 측정한 결과를 보여주는 도이다.
도 2는 각질형성세포 및 멜라닌세포에 miR-675 유사체 또는 miR-675 억제제를 트랜스펙션한 후 Rab5A 단백질의 발현 수준을 확인한 결과를 보여주는 도이다.
도 3은 기미를 진단 받은 환자의 피부 조직 샘플에서 Rab5A, Rab7 및 Rab27A의 mRNA 수준을 측정한 결과를 보여주는 도이다.
도 4는 기미를 진단 받은 환자로부터 분리한 정상 색소침착 피부 조직 및 과색소침착 피부 조직을 Rab5A 및 c-Kit로 이중염색한 결과를 보여주는 도이다.
도 5는 Rab5A를 과발현시킨 각질형성세포 및 멜라닌세포에서 Rab5A 및 티로시나제의 발현 변화를 확인한 결과를 보여주는 도이다.
도 6은 멜라닌세포-각질형성세포(Rab5A 과발현)의 세포 배양액으로부터 분리한 엑소좀에서 Rab5A, Rab7 및 Rab27A의 mRNA 수준을 확인한 결과를 보여주는 도이다.
도 7은 멜라닌세포-각질형성세포(Rab5A 과발현)의 세포 배양액으로부터 분리한 엑소좀에서 Rab5A 단백질 수준을 확인한 결과를 보여주는 도이다.
도 8은 Rab5A를 과발현시킨 세포에서 분리한 엑소좀을 정상 멜라닌세포에 처리한 후 Rab5A, 티로시나제 및 EEA1(early endosome antigen 1)의 단백질 수준을 확인한 결과를 보여주는 도이다.
도 9는 멜라닌세포에서 Rab5A를 과발현 또는 녹다운시킨 후 티로시나제, Trp-1(tyrosinase-related protein-1), Trp-2, Rab7 및 Rab27A의 발현 변화를 확인한 결과를 보여주는 도이다.
도 10은 멜라닌세포에서 Rab5A를 녹다운시킨 후 Rab5A 항체를 이용하여 면역침강을 수행한 결과를 보여주는 도이다.
도 11은 멜라닌세포에 WT Rab5A, Rab5A S34N 및 Rab5A Q79N을 각각 트랜스펙션한 후 티로시나제, Trp-1, Trp-2, EEA1, Rab7 및 Rab27A의 발현 변화를 확인한 결과를 보여주는 도이다.
도 12는 멜라닌세포에 WT Rab5A, Rab5A S34N 및 Rab5A Q79N을 각각 트랜스펙션한 후 Rab5A와 Trp-1의 세포 내 위치를 공초점 현미경으로 확인한 결과를 보여주는 도이다.
도 13은 멜라닌세포에서 Rab5A를 과발현 또는 녹다운시킨 후 키네신 및 디네인의 발현 변화를 확인한 결과를 보여주는 도이다.
도 14는 멜라닌세포에서 Rab5A를 녹다운시킨 후 키네신 및 티로시나제의 발현 변화를 공초점 현미경으로 확인한 결과를 보여주는 도이다.
도 15는 멜라닌세포에서 Rab5A를 녹다운시킨 후 디네인 및 티로시나제의 발현 변화를 공초점 현미경으로 확인한 결과를 보여주는 도이다.
도 16은 Rab5A를 녹다운시킨 각질형성세포 및/또는 멜라닌세포에서 TYRP-1(Tyrosinase-related protein 1) 및 K14 항체를 이용하여 FACS로 분석한 결과를 보여주는 도이다.
도 17은 Rab5A를 과발현시킨 멜라닌세포에서 RAC1(ras-related C3 botulinum toxin substrate 1), RhoA 및 CDC42의 단백질 수준을 웨스턴 블롯으로 확인한 결과를 보여주는 도이다.
도 18은 Rab5A를 과발현시킨 각질형성세포에 멜라노좀을 처리한 후 색소 입자(pigment globules)를 염색한 결과를 보여주는 도이다.

이하 하나 이상의 구체예를 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 하나 이상의 구체예를 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실험 방법

1. 피부 조직 분리 및 인간 표피세포 배양

기미를 진단 받은 여성 환자(나이 44 내지 65세, 평균 나이 51.2세) 7명으로부터 과색소침착 부위 및 정상색소침착 부위의 피부 조직 일부를 생검(biopsy)으로 분리하였다.

수술 과정에서 분리된 성인 피부 조직을 진피(dermis) 및 표피(epidermis)로 분리하여 표피세포(epidermal cell)를 준비하였다.

표피세포 중에서 각질형성세포(Keratinocytes)는 소 뇌하수체 추출물(bovine pituitary extract, 이하 BPE로 기재함), 소 인슐린(bovine insulin, 이하 BI로 기재함), 하이드로코르티존(hydrocortisone), 인간 표피 성장인자(human epidermal growth factor, 이하 hEGF로 기재함) 및 소 트랜스페린(bovine transferrin, 이하 BT로 기재함; Invitrogen, Carlsbad, CA)을 포함하는 EpiLife Medium (Invitrogen)에서 배양하였다.

멜라닌세포(Melanocyte)는 BPE, BI, 소 태아 혈청(fetal bovine serum, 이하 FBS로 기재함), 하이드로코르티존, BT, 염기성 섬유모세포 성장인자(basic fibroblast growth factor, 이하 bFGF로 기재함), 헤파린 및 포볼 12-미리스테이트 13-아세테이트(phorbol 12-myristate 13-acetate)를 포함하는 Medium 254 (Invitrogen)에서 배양하였다. 상기 각질형성세포 및 멜라닌세포는 각각 3 내지 5 및 7 내지 15번까지 계대배양하면서 실험에 이용하였다.

섬유아세포(fibroblast)는 10% FBS(Invitrogen)를 포함하는 DMEM(Invitrogen) 배지에 진피세포(dermal cell)를 부유시켜 배양하였고, 5 내지 10번까지 계대배양하면서 실험에 이용하였다.

2. Rab5A 과발현( overexpression ) 및 녹다운(knockdown)

Rab5A 과발현을 위하여 Rab5A 유전자를 포함하는 pCMV 플라스미드(pCMV-CDH11)를 Lipofectamine 2000(Invitrogen)을 이용하여 제조사의 프로토콜에 따라 세포에 트랜스펙션하였다.

또한, Rab5A 녹다운을 위하여 인간 Rab5A siRNA(50 nM 또는 100 nM) 또는 음성 대조군(ON-TARGETplus SMARTpool 또는 Non-targeting siRNA; Dharmacon)을 TransIT-siQUEST transfection reagent를 이용하여 제조사의 프로토콜에 따라 세포에 트랜스펙션하였다. 24시간 후에 세포를 다른 추가 실험에 이용하였다.

3. 실시간 RT- PCR (Real-time RT- PCR ) 분석

성숙한(mature) miRNA 발현 수준은 인간 miR-675 스템 루프(stem loop)에 특이적인 TaqMan MicroRNA Assays(Applied Biosystems, Foster, CA)를 이용하여 제조사의 프로토콜에 따라 측정하였다. 실험 결과의 정규화(normalization)를 위한 하우스키핑 유전자(housekeeping gene)는 U18(Roche, Mannheim, Germany)을 이용하였다.

GAPDH 대비 mRNA의 상대적 발현 수준은 the Light Cycler Real-Time PCR (Roche)을 이용한 qPCR로 측정하였으며, 이용한 프라이머는 하기와 같다:

Rab5A-F: 5'-AGCTGGTCAAGAACGATACCA-3′' (서열번호 1)

Rab5A-R: 5'-TTTTGCTCTTGCAAAGGACTC-3' (서열번호 2)

Rab7-F: 5'-GATTGCACGGAATGCACTTA-3' (서열번호 3)

Rab7-R: 5'-TGATAGGTTCAGGAAATTCGTTG-3' (서열번호 4)

Rab27a-F: 5'-AGGCCAGAGAATCCACCTG-3' (서열번호 5)

Rab27a-R: 5'-CGCTGTCGTTAAGCTACGAA-3' (서열번호 6)

GAPDH-F: 5'-TCCACTGGCGTCTTCACC-3′' (서열번호 7)

GAPDH-R: 5'-GGCAGAGATGATGACCCTTT-3' (서열번호 8)

4. 웨스턴 블롯 (Western blot analysis)

단백질 20 ㎍을 10% SDS-PAGE(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis)로 분리하고, 니트로셀룰로스 막(nitrocellulose membranes; 이하, NC 막으로 표기함)으로 단백질을 이동시킨 후 상기 NC 막을 일차 항체와 반응시켰다. 사용한 일차 항체는 하기와 같다: Rab5a, Rab7, Rab27A, RAC1, RhoA, CDC42 및 Dynein (rabbit polyclonal; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA); Trp-1, Trp-2 및 Tyrosinase (goat; Santa Cruz Biotechnology); 및 Kinesin (rabbit polyclonal; Abcam, Cambridge, UK).

일차 항체와 반응이 끝난 NC 막을 anti-rabbit 또는 anti-goat 이차 항체(horseradish peroxidase-conjugated antibodies)와 추가로 반응시키고, ECL 용액(enhanced chemiluminescence solution; Thermo, Rockford, IL, USA)을 처리하여 발색시켰다. 발색 신호는 Image Reader(LAS-3000; Fuji Photo Film, Tokyo, Japan)로 확인하였으며, 단백질 밴드는 덴시토메트리(densitometry)로 분석하였다.

5. 면역침전법( Immunoprecipitation )

세포 용해물(cell lysates)을 Rab5A 항체 및 레진(Pierce^TM Direct IP kit; Thermo Scientific, Waltham, MA, USA)과 4℃에서 반응시키고, 제조사의 프로토콜에 따라 레진과 결합하지 않은 단백질들을 제거하였다. 이후 레진과 결합한 단백질들을 Rab5A, Rab7, Trp-1 및 티로시나제(tyrosinase) 항체로 분석하였다.

6. 면역조직화학염색( immunohistochemistry )

기미 환자에서 분리한 피부 조직을 파라핀에 포매(embedding)하여 파라핀 블록을 만들고, 상기 파라핀 블록에서 피부 조직 슬라이드를 제작하였다. 상기 슬라이드에서 파라핀 제거(deparaffinization) 및 재수화 과정(rehydration)을 진행한 후, 슬라이드를 3% 소 혈청 알부민(bovine serum albumin)과 반응시켰다. 이후 상기 피부 조직 슬라이드 또는 세포와 anti-Rab5A 항체 및 1:200 Alexa Fluor 488-labeled goat anti-rabbit IgG (488; Molecular Probes, Eugene, OR, USA)를 반응시키고, 다음으로 anti-C-KIT 14 항체 및 Alexa Fluor 594-labeled goat anti-mouse IgG (594; Molecular Probes) 항체를 반응시켰다. 핵은 Hoechst 33258 (Sigma-Aldrich)로 교차염색(counterstain)하였고, 형광 이미지는 image analysis system (Dp Manager 2.1; Olympus Optical Co., Tokyo, Japan)으로 분석하였다.

7. 공초점 현미경(Confocal microscopy) 관찰

Rab5A를 과발현 또는 녹다운시킨 세포를 anti-Rab5A 또는 anti-Trp-1 항체와 반응시키고, 이후 1:200으로 희석한 Alexa Fluor-labeled goat anti-rabbit IgG 또는 Alexa Fluor-labeled donkey anti-goat IgG (Molecular Probes, Eugene, OR) 항체와 각각 반응시켰다. 세포핵은 Hoechst 33258로 교차염색하였다. 염색 이미지는 EZ-C1 software (EZ-C1; Nikon, Tokyo, Japan)를 이용하여 획득하였으며, NIS-Elements AR 3.2 software (Nikon Instruments, Melville, NY)를 이용하여 형광 신호를 측정하였다.

8. 루시퍼라제 어세이 ( luciferase activity assay)

인간 Rab5A 유전자에서 3'-UTR 부위(서열번호 9)를 PCR로 증폭하고, 증폭 산물을 pMIR-REPORT luciferase vector(Ambion, Austin, TX)의 루시퍼라제 유전자 뒤에 삽입시켜 pMIR-RAB5A 벡터를 제작하였다.

pMIR-RAB5A 벡터 제작시 PCR에 사용한 프라이머는 하기와 같다:

Rab5A-3UTR-F: 5'-AAAGCTGCGCACTAGTGAATGCAGAGAGAGGAGAAG-3' (서열번호 10)

Rab5A-3UTR-R: 5'-ATCCTTTATTAAGCTT TTGGATTTGCAAATGACT-3' (서열번호 11)

또한, QuickChange site-directed mutagenesis kit(Stratagene, Lo Jolla, CA, USA)를 이용하여 제조사의 프로토콜에 따라 인간 Rab5A 유전자의 3'-UTR 부위에서 일부 염기서열을 제거하거나 또는 염기서열을 변형시키고, 이를 pMIR-REPORT luciferase vector에 삽입시켜 pMIR-RAB5A mutant 1 및 pMIR-RAB5A mutant 2 벡터를 제작하였다(서열번호 12: 3'-UTR mutant 1; 서열번호 13: 3'-UTR mutant 2).

멜라닌세포를 6-웰 플레이트에 분주하고, 각각의 웰에 레닐라 루시퍼라제(Renilla luciferase)를 포함하는 pRL-TK 벡터(Promega, Madison, WI)와 함께 상기 pMIR-Rab5A 3UTR 벡터 또는 pMIR-Rab5A 3UTR mutant 벡터를 트랜스펙션하고, 각각의 웰에 50 nM의 miR-675, 또는 음성 대조군을 트랜스펙션하였다. 트랜스펙션은 Lipofectamine 2000을 이용하였으며, 24시간 후 Dual-Luciferase Reporter Assay (Promega)를 이용하여 루시퍼라제 활성을 측정하였다.

9. 멜라노좀 이동( melanosome transfer) 확인

FACS를 이용하여 멜라닌세포에서 각질형성세포로 이동하는 멜라노좀의 양을 분석하였다(Lin et al., 2008). 먼저 세포를 2% 포름알데히드로 실온에서 고정시키고, BD PhosFlow Perm/Wash Buffer I(BD Biosciences, San Jose, CA)을 포함하는 PBS로 10분 동안 세척하였다. 이후 세포와 FITC-conjugated goat anti-TYRP-1(Santa Cruz Biotechnology) 항체 및 phycoerythrin-conjugated mouse anti-Cytokeratin 14(BD Biosciences) 항체를 30분 동안 실온에서 반응시켰다. 다음으로 세포를 PBS로 세척하고, Cytomics FC500 Flow Cytometer (Beckman Coulter, Hialeah, FL) 및 CXP software (Beckman Coulter)를 이용하여 세포를 분석하였다. 멜라노좀 이동 효율은 사이토케라틴 14(Cytokeratin 14) 및 TYRP-1(tyrosinase-related protein 1)으로 이중 염색된 세포의 수를 사이토케라틴14 (Cytokeratin14) 양성인 세포의 수로 나누어 산출하였다.

10. 통계 분석

실험 결과에 대한 통계 분석은 Student's t-test를 이용하였으며, 분석 결과는 평균±표준편차(means±SD)로 표시하였다. p 값이 0.05보다 작은 경우 통계적으로 유의성이 있는 것으로 판단하였다.

실험 결과

1. MiR -675에 의한 Rab5A의 발현 변화 확인

루시퍼라제 어세이 결과, miR-675가 대조군(non-targeting control gene)과 비교하여 Rab5A 3'-UTR의 루시퍼라제 활성을 현저하게 감소시키는 것을 확인할 수 있었다(p=0.05). 반면에 miR-675는 일부 서열이 변형된 Rab5A 3'-UTR의 루시퍼라제 활성은 감소시키지 않는 것을 알 수 있었다.

또한, miR-675 유사체(mimic)를 각질형성세포 및 멜라닌세포 각각에 트랜스펙션시킨 경우 농도 의존적으로 Rab5A 단백질 수준이 감소하였으며, miR-675 억제제를 트랜스펙션시킨 경우 반대로 Rab5A 단백질 수준이 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 아울러 섬유아세포와 비교하여 각질형성세포 및 멜라닌세포에서 Rab5A이 더 많이 발현되는 것을 알 수 있었다.

또한, miR-675 수준이 감소한 기미 환자의 피부 조직 샘플에서 Rab5A mRNA의 상대적 발현 수준을 측정한 결과 정상 색소침착 피부 조직과 비교하여 과색소침착 피부 조직에서 Rab7 및 Rab27A의 mRNA 수준이 증가되어 있고, Rab5A mRNA 수준 또한 유의하게 증가한 것을 확인할 수 있었다(P<0.05). 또한 상기 피부 조직을 염색한 결과 과색소침착 피부 조직의 경우 Rab5A가 진하게 염색되어 발현이 증가된 것을 알 수 있었다.

도 1은 멜라닌세포에 miR-675, pMIR-RAB5A 벡터, pMIR-RAB5A mutant 1 벡터 및 pMIR-RAB5A mutant 2 벡터 각각 또는 이들의 조합을 트렌스펙션한 후 루시퍼라제 활성을 측정한 결과를 보여주는 그래프이다.

도 2는 각질형성세포 및 멜라닌세포에 miR-675 유사체 또는 miR-675 억제제를 트랜스펙션시킨 후 Rab5A 단백질의 발현 수준을 확인한 결과를 보여주는 그래프이다. 도 2에서 3P는 miR-675 유사체; 3PI는 miR-675 억제제를 의미한다.

도 3은 기미를 진단 받은 환자의 피부 조직 샘플에서 Rab5A, Rab7 및 Rab27A의 mRNA 수준을 측정한 결과를 보여주는 그래프이다.

도 4는 기미를 진단 받은 환자로부터 분리한 정상 색소침착 피부 조직 및 과색소침착 피부 조직을 Rab5A 및 c-Kit로 이중염색한 결과를 보여주는 것이다.

2. Rab5A 과발현에 의한 단백질 발현 변화 확인

Rab5A가 각질형성세포에서 많이 발현되기 때문에, Rab5A를 과발현 또는 녹다운시킨 상태로 멜라닌세포 단독 또는 멜라닌세포-각질형성세포를 공동배양하여 Rab5A가 멜라닌합성(melanogenesis)에 미치는 영향을 확인하였다. 공동배양한 경우 각질형성세포 또는 멜라닌세포 각각에서 Rab5A를 과발현 또는 녹다운시킨 상태로 실험을 진행하였다.

확인 결과, Rab5A를 과발현시킨 모든 세포에서 티로시나제의 발현이 증가하는 것을 확인할 수 있었다.

또한, 멜라닌세포-각질형성세포(Rab5A 과발현)의 세포 배양액으로부터 엑소좀을 분리하여 Rab5A mRNA 및 단백질 수준을 확인한 결과, Rab5A의 mRNA 및 단백질 수준이 현저하게 증가한 것을 알 수 있었으며, 반면 Rab7 및 Rab27A의 mRNA 수준은 약 2배 정도 증가한 것을 확인할 수 있었다.

또한, Rab5A를 과발현시킨 세포로부터 분리한 엑소좀을 정상 멜라닌세포(Rab5A를 과발현시키지 않은 멜라닌세포)에 처리한 경우 티로시나제 및 EEA1(early endosome antigen 1)의 단백질 수준 또한 시간이 경과함에 따라 증가하는 것을 확인할 수 있었다.

도 5는 Rab5A를 과발현시킨 각질형성세포 및 멜라닌세포에서 Rab5A 및 티로시나제의 발현 변화를 확인한 결과를 보여주는 것이다. KC는 각질형성세포, MC는 멜라닌세포를 의미하고, KC(Rab5A) 및 MC(Rab5A)는 각각 Rab5A를 과발현시킨 각질형성세포 및 멜라닌세포를 의미한다.

도 6은 멜라닌세포-각질형성세포(Rab5A 과발현)의 세포 배양액으로부터 분리한 엑소좀에서 Rab5A, Rab7 및 Rab27A의 mRNA 수준을 확인한 결과를 보여주는 것이다.

도 7은 멜라닌세포-각질형성세포(Rab5A 과발현)의 세포 배양액으로부터 분리한 엑소좀에서 Rab5A 단백질 수준을 확인한 결과를 보여주는 것이다.

도 8은 Rab5A를 과발현시킨 세포에서 분리한 엑소좀을 정상 멜라닌세포에 처리한 후 Rab5A, 티로시나제 및 EEA1(early endosome antigen 1)의 단백질 수준을 확인한 결과를 보여주는 것이다.

3. Rab5A가 멜라닌 합성에 미치는 영향 확인

멜라닌세포에서 Rab5A를 과발현시킨 결과 티로시나제, Trp-1(tyrosinase-related protein-1), Rab7 및 Rab27A의 단백질 수준이 증가하고, 반대로 Rab5A를 녹다운시키면 상기 단백질들의 수준이 감소하는 것을 확인할 수 있었다.

또한, anti-Rab5A 항체를 이용한 면역침강 실험 결과 Rab5A 녹다운에 의하여 Rab5A와 Rab7 또는 Rab5A와 Trp-1의 결합이 감소하는 것을 확인할 수 있었다.

또한, 멜라닌세포에 WT(wild) Rab5A, Rab5A S34N(GTPase 활성이 제거됨; dominant negative mutant) 및 Rab5A Q79N(GTPase 활성이 증가함; active mutant)을 각각 트랜스펙션한 후 단백질 변화를 확인하였다. 그 결과, WT Rab5A 또는 Rab5A Q79N을 트랜스펙션한 경우에는 티로시나제, Rab7, Trp-1 및 EEA1의 단백질 수준이 증가하지만, Rab5A S34N을 트랜스펙션한 경우에는 상기 단백질들의 수준이 감소하는 것을 확인할 수 있었다. 아울러 공초점 현미경으로 확인한 결과 WT Rab5A와 Rab5A Q79N은 Rab5A 및 Trp-1과 세포 내에서 같은 위치에 존재하지만, Rab5A S34N은 위치가 상이한 것을 알 수 있었다.

도 9는 멜라닌세포에서 Rab5A를 과발현 또는 녹다운시킨 경우에 티로시나제, Trp-1, Trp-2, Rab7 및 Rab27A의 발현 변화를 확인한 결과를 보여주는 것이다.

도 10은 멜라닌세포에서 Rab5A를 녹다운시킨 후 Rab5A 항체를 이용하여 면역침강을 수행한 결과를 보여주는 것이다.

도 11은 멜라닌세포에 WT Rab5A, Rab5A S34N 및 Rab5A Q79N을 각각 트랜스펙션한 후 티로시나제, Trp-1, Trp-2, EEA1, Rab7 및 Rab27A의 발현 변화를 확인한 결과를 보여주는 것이다.

도 12는 멜라닌세포에 WT Rab5A, Rab5A S34N 및 Rab5A Q79N을 각각 트랜스펙션한 후 Rab5A와 Trp-1의 세포 내 위치를 공초점 현미경으로 확인한 결과를 보여주는 것이다.

4. 멜라닌세포에서 Rab5A가 멜라노좀 이동에 미치는 영향 확인

멜라노좀은 멜라닌세포의 수상돌기(dendrite)로부터 각질형성세포로 이동하는데 미세소관 트랙(microtubule tracks)을 따라 키네신 슈퍼패밀리(kinesin superfamily) 단백질에 의하여 전방향(antegrade)으로 이동하고, 디네인(dynein) 및 디네인-연관 단백질(dynein-related proteins)들에 의하여 반대(retrograde)로 이동한다. 따라서 Rab5A가 멜라노좀 이동에 미치는 영향을 확인하기 위하여 Rab5A의 과발현 또는 녹다운에 의한 키네신 및 디네인의 발현 변화를 멜라닌세포에서 확인하였다.

확인 결과 Rab5A가 과발현되는 경우 키네신 수준이 증가하였으며, Rab5A가 녹다운되는 경우 반대의 경향을 보이는 것을 알 수 있었다. 반면에, 디네인은 Rab5A가 과발현되는 경우 수준이 감소하였으며, Rab5A가 녹다운되는 경우 수준이 증가하는 경향을 보였다. 또한, 공초점 현미경으로 확인한 결과 Rab5A가 녹다운되는 경우 키네신의 형광 신호가 약해지고, 반면에 디네인의 형광 신호는 강해지는 것을 알 수 있었으며, 티로시나제의 발현 또한 감소하는 것을 확인할 수 있었다.

도 13은 멜라닌세포에서 Rab5A를 과발현 또는 녹다운시킨 경우에 키네신 및 디네인의 발현 변화를 확인한 결과를 보여주는 것이다.

도 14는 멜라닌세포에서 Rab5A를 녹다운시킨 후 키네신 및 티로시나제의 발현 변화를 공초점 현미경으로 확인한 결과를 보여주는 것이다.

도 15는 멜라닌세포에서 Rab5A를 녹다운시킨 후 디네인 및 티로시나제의 발현 변화를 공초점 현미경으로 확인한 결과를 보여주는 것이다.

5. Rab5A 녹다운에 의한 멜라노좀 이동 감소 효과 확인

멜라닌세포와 각질형성세포를 공동배양한 후 단독으로 Rab5A를 녹다운시킨 각질형성세포 또는 멜라닌세포 및 각질형성세포 모두에서 Rab5A를 녹다운시킨 세포를 FACS로 분석한 결과, TYRP-1(Tyrosinase-related protein 1)과 K14 이중 양성인 세포의 비율이 감소하여 멜라노좀의 이동이 감소하는 것을 확인할 수 있었다.

또한, Rab5A가 과발현된 멜라닌세포에서 RAC-1(ras-related C3 botulinum toxin substrate 1), RhoA 및 CDC42의 단백질 수준을 웨스턴 블롯으로 확인한 결과 증가하는 것을 확인할 수 있었으며, Rab5A가 과발현되는 경우 더 많은 수의 멜라노좀이 각질형성세포에 의하여 포식(engulf)되는 것을 알 수 있었다.

도 16은 Rab5A를 녹다운시킨 각질형성세포 및/또는 멜라닌세포에서 TYRP-1 및 K14 항체를 이용하여 FACS로 분석한 결과를 보여주는 것이다.

도 17은 Rab5A를 과발현시킨 멜라닌세포에서 RAC-1, RhoA 및 CDC42의 단백질 수준을 웨스턴 블롯으로 확인한 결과를 보여주는 것이다.

도 18은 Rab5A를 과발현시킨 각질형성세포에 멜라노좀을 처리한 후 색소 입자(pigment globules)를 염색한 결과를 보여주는 것이다.

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

<110> DONGGUK UNIVERSITY GYEONGJU <120> Composition for Suppressing Cutaneous Pigmentation Containing Rab5A Inhibitors <130> PN170180 <160> 13 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic polynucleotides <400> 1 agctggtcaa gaacgatacc a 21 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic polynucleotides <400> 2 ttttgctctt gcaaaggact c 21 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic polynucleotides <400> 3 gattgcacgg aatgcactta 20 <210> 4 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic polynucleotides <400> 4 tgataggttc aggaaattcg ttg 23 <210> 5 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic polynucleotides <400> 5 aggccagaga atccacctg 19 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic polynucleotides <400> 6 cgctgtcgtt aagctacgaa 20 <210> 7 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic polynucleotides <400> 7 tccactggcg tcttcacc 18 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic polynucleotides <400> 8 ggcagagatg atgacccttt 20 <210> 9 <211> 45 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> 3'UTR <222> (1)..(45) <400> 9 uuucuguaau auuuaagagu ugcuuaaaag cauacaaaau guacu 45 <210> 10 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic polynucleotides <400> 10 aaagctgcgc actagtgaat gcagagagag gagaag 36 <210> 11 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic polynucleotides <400> 11 atcctttatt aagcttttgg atttgcaaat gact 34 <210> 12 <211> 38 <212> DNA <213> homo sapiens <220> <221> 3'UTR <222> (1)..(38) <223> 3'-UTR mutant 1 (deletion) <400> 12 uuucuguaau auuuaagagu ugcuuaaaaa aauguacu 38 <210> 13 <211> 45 <212> DNA <213> homo sapiens <220> <221> 3'UTR <222> (1)..(45) <223> mutaion 30-36 <400> 13 uuucuguaau auuuaagagu ugcuuaaaac cuuugaaaau guacu 45

Claims

Rab5A(RAS-associated protein Rab5A) 억제제를 유효성분으로 포함하는 색소형성 억제용 조성물.
제1항에 있어서, 상기 Rab5A 억제제는 Rab5A의 발현, 전사 또는 활성을 억제하는 것인 조성물.
제1항에 있어서, 상기 색소는 멜라닌인 것인 조성물.
제1항에 있어서, 상기 조성물은 멜라노좀(melanosome) 이동을 감소시키는 것인 조성물.
제1항에 있어서, 상기 조성물은 각질형성세포에 의한 멜라노좀의 포식을 억제하는 것인 조성물.
(a) Rab5A가 과발현된 멜라닌세포와 시험물질을 접촉시키는 단계;
(b) 상기 시험물질과 접촉한 멜라닌세포를 배양하는 단계; 및
(c) 상기 배양한 멜라닌세포에서 티로시나제(tyrosinase), 키네신(kinesin), Rab7, Rab27A, EEA1(early endosome antigen 1), Trp-1(tyrosinase-related protein-1), RAC1(ras-related C3 botulinum toxin substrate 1), RhoA(Ras homolog gene family member A), CDC42(Cell division control protein 42 homolog) 및 디네인(dynein)으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 수준을 측정하여 시험물질의 유효성 여부를 판단하는 단계를 포함하는 색소형성 억제제 스크리닝 방법.
삭제
제6항에 있어서, 상기 (c)의 시험물질의 유효성 여부를 판단하는 단계는 시험물질 접촉 전과 비교하여 멜라닌세포에서 티로시나제, 키네신, Rab7, Rab27A, EEA1, Trp1, RAC1, RhoA 및 CDC42의 수준이 감소하거나, 디네인의 수준이 증가하는 경우 상기 시험물질이 색소형성 억제제로 유효한 것으로 판단하는 것인 방법.