CN103175919B - 尿液中(s)-nnal和(r)-nnal的气相色谱-质谱-质谱联用检测方法 - Google Patents
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Abstract
尿液中(S)-NNAL和(R)-NNAL的气相色谱-质谱-质谱联用检测方法，包括：向尿液样品加入rac-NNAL-甲基-d3溶液、磷酸二氢氨缓冲溶液（pH6.4,0.6M）和β-葡糖苷酸酶混匀后置入微波辅助萃取仪中在37℃恒温酶解,再将酶解后的尿样经过MIP-NNAL固相萃取小柱净化，减压浓缩至干，加入三乙基胺无水乙腈溶液、(S)-(+)-α-甲氧基-α-三氟甲基苯乙酰氯的无水乙腈溶液，衍生化后再对样品进行GC-MS-MS分析，进而换算出尿样中(S)-NNAL和(R)-NNAL的含量。本发明提供了一种检测限低、稳定性好、前处理简单、快速准确的尿样中(S)-NNAL和(R)-NNAL的分析检测方法，填补了这一技术领域的空白。
Description
技术领域
本发明属于烟草特有亚硝胺在尿液中的生物标志物理化检验技术领域，具体涉及尿液中(S)-NNAL和(R)-NNAL的气相色谱-质谱-质谱联用检测方法。
背景技术
近年来，人们对吸烟与健康问题越来越重视，因此国内外对烟气中的各种有害化学成分的研究越来越深入。经过多年研究，国际癌症研究机构（IARC）等的毒性评价结果认为：烟草特有亚硝胺中的4-(甲基亚硝胺基)-1-(3-吡啶基）-1-丁酮(NNK）对动物有致癌性，NNK和它的代谢物是潜在的肺癌致癌物。因此，现在烟草行业内外迫切需要建立一种准确评价不同人群对NNK暴露程度的方法，而生物标志物法是一种公认且有效的监测NNK暴露人群暴露程度的方法。
到目前为止，众多烟草科技工作者的长期研究证明，在吸烟者的尿液中未检测到NNK，NNK在人体和实验室动物体内的主要代谢物是4-（甲基亚硝胺基）-1-（3-吡啶基）-1-丁醇(NNAL)和NNAL糖苷化合物（包括NNAL-O-Glucuronide和NNAL-N-Glucuronide），这些代谢产物主要通过尿液和其它体液排出体外。虽然烟草和卷烟烟气中的NNK有致癌性，但它在人体中的主要代谢产物NNAL的毒性显著降低，NNAL糖苷化以后毒性进一步降低。在生物代谢样品分析中，由于尿样容易获得，又可以有效反映NNK的暴露情况，所以一直成为研究热点。现在，检测尿液中的NNAL和NNAL糖苷化合物已经成为一种检测吸烟者、无烟气烟草制品消费者和被动吸烟者暴露于NNK的常用接触生物标志物。
NNK分子中没有手性碳原子，因此NNK分子没有对映异构体，但NNK分子中有一个羰基，该羰基随着NNK进入人体后被羰基还原酶还原为羟基，生成一对NNAL对映异构体，分别为(S)-NNAL和(R)-NNAL。2002年，Hecht等的研究发现揭示，人尿样中游离形式的(R)-NNAL的含量略约是(S)-NNAL含量的1.1倍，但人尿样中(R)-NNAL糖苷化合物的含量是(S)-NNAL糖苷化合物含量的的两倍左右，这说明(S)-NNAL和(R)-NNAL的进一步代谢途径差别很大，人体代谢排出(S)-NNAL的速度远低于排出(R)-NNAL的速度，同时也说明人体对(S)-NNAL有一种立体选择性的保留能力，特别是老鼠在摄入NNK后相当长一段时间内其肺部(S)-NNAL的比例也远高于(R)-NNAL。其他学者的研究结果也显示吸烟的肺癌患者尿样中(S)-NNAL与(R)-NNAL的比值明显大于普通吸烟者。结合流行病学调查分析结果，人们推测人肺脏内可能有(S)-NNAL的受体，此受体可特异性结合(S)-NNAL，这可能就是吸烟吸收NNK导致肺癌的原因之一。
由于卷烟烟气中的NNK释放量只有几个纳克每支卷烟，而NNK进入人体后又被代谢为多种物质，加之尿样基质复杂，所以尿样中的(S)-NNAL和(R)-NNAL的检测非常困难，国内外许多相关行业都无法开展尿样中(S)-NNAL和(R)-NNAL的检测工作。在这种背景下，许多相关行业迫切需要建立一种能够快速准确测定人体尿样中(S)-NNAL和(R)-NNAL的含量和比例的方法，以便为肺癌的早期检测等提供进一步参考信息。针对现有技术的不足，本发明提供的尿液中(S)-NNAL和(R)-NNAL的气相色谱-质谱-质谱联用检测方法，具有检测限低、速度快、准确度和灵敏度高、成本低廉的特点，适用于各种人体尿液常见样本中的(S)-NNAL和(R)-NNAL的检测，因此该方法对于检测尿液中的(S)-NNAL和(R)-NNAL的含量以及评估人体对烟气中NNK的暴露程度具有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于针对现有方法很难开展尿样中(S)-NNAL和(R)-NNAL的检测工作的不足，提供一种尿液中(S)-NNAL和(R)-NNAL的气相色谱-质谱-质谱联用检测方法，为评估个体对烟气中NNK的暴露程度提供一种科学的判定方法，该方法具有检测限低、稳定性好、前处理简单、快速准确等优点。本方法适用于尿液中(S)-NNAL和(R)-NNAL的气相色谱-质谱-质谱联用检测，为一种科学评估个体对烟气中NNK的暴露程度的方法。
本发明的目的通过下述技术方案予以实现：
尿液中(S)-NNAL和(R)-NNAL的气相色谱-质谱-质谱联用检测方法，包括以下步骤：
①用测定旋光并比对的方法确定(S)-NNAL和(R)-NNAL的构型并作为参照，或用Mosher方法确定(S)-NNAL-(S)-(+)-α-甲氧基-α-三氟甲基苯乙酸酯和(R)-NNAL-甲基-d3-(S)-(+)-α-甲氧基-α-三氟甲基苯乙酸酯的构型并作为参照；
②配制含有rac-NNAL和氘代rac-NNAL-甲基-d3的混合标准溶液，再用(S)-(+)-α-甲氧基-α-三氟甲基苯乙酰氯的无水乙腈溶液和三乙基胺的无水乙腈溶液衍生化，然后对衍生化以后的混合标准溶液进行GC-MS-MS分析;用确定构型后的(S)-NNAL-(S)-(+)-α-甲氧基-α-三氟甲基苯乙酸酯和(R)-NNAL-(S)-(+)-α-甲氧基-α-三氟甲基苯乙酸酯通过保留时间确定相应的色谱峰保留时间，并建立(S)-NNAL-(S)-(+)-α-甲氧基-α-三氟甲基苯乙酸酯的标准溶液工作曲线和(R)-NNAL-(S)-(+)-α-甲氧基-α-三氟甲基苯乙酸酯的标准溶液工作曲线；
③将在室温下解冻后的尿液样品摇匀，加入rac-NNAL-甲基-d3溶液、磷酸二氢氨缓冲溶液（pH6.4,0.6M）和β-葡糖苷酸酶，充分混匀后置入微波辅助萃取仪中在37℃恒温酶解,再将酶解后的尿样上样到MIP-NNAL固相萃取小柱净化，淋洗后用二氯甲烷洗脱，加入无水硫酸钠干燥后过滤，减压浓缩至干，加入三乙基胺无水乙腈溶液、(S)-(+)-α-甲氧基-α-三氟甲基苯乙酰氯的无水乙腈溶液，盖紧，衍生化后立即对样品进行GC-MS-MS分析。
所述的尿液中(S)-NNAL和(R)-NNAL的气相色谱-质谱-质谱联用检测方法，其中分析检测尿样中尿液中(S)-NNAL和(R)-NNAL时进行Mosher衍生化。
所述的尿液中(S)-NNAL和(R)-NNAL的气相色谱-质谱-质谱联用检测方法中，使用微波辅助萃取仪在37℃对尿样进行恒温酶解。
具体实施方式
以下结合应用实施例对本发明作进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不限定本发明的保护范围。
实施例1：
除非另有说明，本发明中所采用的百分数均为重量百分数。
尿液中(S)-NNAL和(R)-NNAL的气相色谱-质谱-质谱联用检测方法，包括以下步骤：
1.化学试剂
(S)-(+)-α-甲氧基-α-三氟甲基苯乙酰氯(CAS号20445-33-4)，(S)-(+)-α--甲氧基-(三氟甲基)苯乙酸酐(CAS号85541-57-7),4-(-甲基亚硝氨基)-1-(3-吡啶基)-丁醇(NNAL)(rac NNAL,CAS号76014-81-8),4-(甲基-d3-亚硝氨基)-1-(3-吡啶基)-1-丁醇(rac-NNAL-甲基-d3CAS号1020719-61-2)，三乙基胺，β-葡萄糖甘酸酶（类型IX-A，来自大肠杆菌）
(S)-NNAL和(R)-NNAL的制备和绝对构型的确定：制备型OD-H手性色谱柱，流动相异丙醇：正己烷的比例为10：90，分别收集两个流出色谱峰，分别浓缩直至其残留物重量都大于1mg。分别取两个色谱峰的浓缩物，用2ml乙醇溶解，测定其比旋光度值，比旋光度值为负值的浓缩物为(S)-NNAL，比旋光度值为正值的浓缩物为(R)-NNAL。
2.标准曲线建立
外消旋体NNAL标准溶液：以无水乙腈为溶剂，配制浓度为1μg／mL的rac NNAL标准品单标溶液，保留四位有效数字；以同样方式以无水乙腈为溶剂分别配制浓度为1μg／mL的rac-NNAL-甲基-d3的单标溶液；以无水乙腈为溶剂，按表1配制含有rac-NNAL和氘代rac-NNAL-甲基-d3的8个混合标准溶液；配制浓度为10ng／mL的(S)-(+)-α-甲氧基-α-三氟甲基苯乙酰氯的无水乙腈溶液;配制浓度为10ng／mL的三乙基胺的无水乙腈溶液;分别取0.5mL8个混合标准溶液于8个GC-MS-MS色谱瓶中,在0℃度无水条件下,再按照表2分别加入(S)-(+)-α-甲氧基-α-三氟甲基苯乙酰氯的无水乙腈溶液和三乙基胺乙腈溶液，室温震荡10分钟,在室温下静置2小时；然后立即对8个衍生化以后的混合标准溶液进行GC-MS-MS分析;将确定构型后的(S)-NNAL或(R)-NNAL用乙腈溶解抽干，(S)-(+)-α-甲氧基-α-三氟甲基苯乙酰氯进行衍生化，通过保留时间确定衍生化后的(S)-NNAL-(S)-(+)-α-甲氧基-α-三氟甲基苯乙酸酯和(R)-NNAL-(S)-(+)-α-甲氧基-α-三氟甲基苯乙酸酯的色谱峰。外消旋体NNAL标准溶液衍生化生成的一对非对映异构体的峰面积为1:1。以GC-MS-MS色谱图中(S)-NNAL-(S)-(+)-α-甲氧基-α-三氟甲基苯乙酸酯的浓度与(S)-NNAL-甲基-d3-(S)-(+)-α-甲氧基-α-三氟甲基苯乙酸酯的浓度之比为横坐标，以色谱图中(S)-NNAL-(S)-(+)-α-甲氧基-α-三氟甲基苯乙酸酯的定量离子对峰面积与(S)-NNAL-甲基-d3-(S)-(+)-α-甲氧基-α-三氟甲基苯乙酸酯的定量离子对峰面积之比为纵坐标，建立(S)-NNAL-(S)-(+)-α-甲氧基-α-三氟甲基苯乙酸酯的标准溶液工作曲线，以同样方法建立(R)-NNAL-(S)-(+)-α-甲氧基-α-三氟甲基苯乙酸酯的标准溶液工作曲线。
表1rac-NNAK和氘代rac-NNAL-甲基-d3的混合标准溶液
表2混合标准溶液的衍生化
3.尿液样品处理
将在室温下解冻后的尿液样品摇匀，准确移取8mL尿液于50mL试管中，加入100μL浓度为1ng/mL的rac-NNAL-甲基-d3溶液，再加入2.0mL的磷酸二氢氨缓冲溶液（pH6.4,0.6M）和500μL的β-葡糖苷酸酶（1000U/mL尿液），充分混匀后置入微波辅助萃取仪，37℃恒温酶解60s,静置10分钟，再37℃恒温酶解60s，将酶解后的尿样上样到已经分别用1mL二氯甲烷、1mL甲醇、1mL水活化好的MIP-NNAL固相萃取小柱净化，用4mL去离子水淋洗并抽干，再分别用2mL甲苯、1mL甲苯/二氯甲烷（9：1）洗脱，最后用3*1mL二氯甲烷洗脱，合并洗脱液，加入1.0g无水硫酸钠干燥后过滤，减压浓缩至干，加入0.2mL浓度为1μg/mL的三乙基胺无水乙腈溶液，震荡1分钟，再在0℃度无水条件下加入0.2mL浓度为1μg/mL(S)-(+)-α-甲氧基-α-三氟甲基苯乙酰氯的无水乙腈溶液，盖紧，室温震荡10分钟,在室温下静置2小时；然后立即对样品进行GC-MS-MS分析。
4.GC-MS-MS检测条件
DB-5MS毛细管柱（60m*0.25mm ID*0.25μm），以流速1mL/min的氦气作为载气，进样口温度270℃，进样量2μL，不分流。
柱温：初始温度100℃，保持2min，然后以15℃/min-1的速率升至260℃，保持5min，再以25℃/min-1的速率升至320℃，保持3min。离子源温度250℃，离子源轰击电压70eV。各组分GC-MS-MS测定的监测参数见表3。
表3各待测组分GC-MS-MS测定参数
上述方法中涉及的NNK、(S)-NNAL和(R)-NNAL的化学结构式为：
实施例2：
1.外消旋体NNAL的衍生化：以无水乙腈为溶剂，配制浓度为1μg／mL的rac NNAL标准品单标溶液，保留四位有效数字；以同样方式以无水乙腈为溶剂分别配制浓度为1μg／mL的rac-NNAL-甲基-d3的单标溶液；以无水乙腈为溶剂，按表1配制含有rac-NNAL和氘代rac-NNAL-甲基-d3的8个混合标准溶液；配制浓度为10ng／mL的(S)-(+)-α-甲氧基-α-三氟甲基苯乙酰氯的无水乙腈溶液;配制浓度为10ng／mL的三乙基胺的无水乙腈溶液;分别取0.5mL8个混合标准溶液于8个GC-MS-MS色谱瓶中,在0℃度无水条件下,再按照表2分别加入(S)-(+)-α-甲氧基-α-三氟甲基苯乙酰氯的无水乙腈溶液和三乙基胺乙腈溶液，室温震荡10分钟,在室温下静置2小时；然后立即对8个衍生化以后的混合标准溶液进行GC-MS-MS分析。
2.实际尿液样品检测：将在室温下解冻后的尿液样品摇匀，准确移取8mL尿液于50mL试管中，加入100μL浓度为1ng/mL的rac-NNAL-甲基-d3溶液，再加入2.0mL的磷酸二氢氨缓冲溶液（pH6.4,0.6M）和500μL的β-葡糖苷酸酶（1000U/mL尿液），充分混匀后置入微波辅助萃取仪，37℃恒温酶解60s,静置10分钟，再37℃恒温酶解60s，将酶解后的尿样上样到已经分别用1mL二氯甲烷、1mL甲醇、1mL水活化好的MIP-NNAL固相萃取小柱净化，用4mL去离子水淋洗并抽干，再分别用2mL甲苯、1mL甲苯/二氯甲烷（9：1）洗脱，最后用3*1mL二氯甲烷洗脱，合并洗脱液，加入1.0g无水硫酸钠干燥后过滤，减压浓缩至干，加入0.2mL浓度为1μg/mL的三乙基胺无水乙腈溶液，震荡1分钟，再在0℃度无水条件下加入0.2mL浓度为1μg/mL(S)-(+)-α-甲氧基-α-三氟甲基苯乙酰氯的无水乙腈溶液，盖紧，室温震荡10分钟,在室温下静置2小时；然后立即对样品进行GC-MS-MS分析。使用(S)-NNAL-(S)-(+)-α-甲氧基-α-三氟甲基苯乙酸酯的标准溶液工作曲线和(R)-NNAL-(S)-(+)-α-甲氧基-α-三氟甲基苯乙酸酯的标准溶液工作曲线计算待测样品中的(S)-NNAL-(S)-(+)-α-甲氧基-α-三氟甲基苯乙酸酯和(R)-NNAL-(S)-(+)-α-甲氧基-α-三氟甲基苯乙酸酯，进而换算出该尿液中(S)-NNAL和(R)-NNAL的浓度分别为0.96ng/mL和0.83ng/mL。
实施例3：
1.(S)-NNAL和(R)-NNAL的制备和绝对构型的确定：用rac NNAL标准品的无水乙腈溶液、(S)-(+)-α-甲氧基-α-三氟甲基苯乙酸酐的无水乙腈溶液和(R)-(+)-α-甲氧基-α-三氟甲基苯乙酸酐的无水乙腈溶液、和三乙胺分别进行Mosher反应，再经过纯化和1H NMR谱图测试，用Mosher方法确定(S)-NNAL-(S)-(+)-α-甲氧基-α-三氟甲基苯乙酸酯和(R)-NNAL-(S)-(+)-α-甲氧基-α-三氟甲基苯乙酸酯的绝对构型。
2.外消旋体NNAL的衍生化和标准曲线的建立：以无水乙腈为溶剂，配制浓度为1μg／mL的rac NNAL标准品单标溶液，保留四位有效数字；以同样方式以无水乙腈为溶剂分别配制浓度为1μg／mL的rac-NNAL-甲基-d3的单标溶液；以无水乙腈为溶剂，按表1配制含有rac-NNAL和氘代rac-NNAL-甲基-d3的8个混合标准溶液；配制浓度为10ng／mL的(S)-(+)-α-甲氧基-α-三氟甲基苯乙酸酐的无水乙腈溶液;配制浓度为10ng／mL的三乙基胺的无水乙腈溶液;分别取0.5mL8个混合标准溶液于8个GC-MS-MS色谱瓶中,在0℃度无水条件下,再分别加入(S)-(+)-α-甲氧基-α-三氟甲基苯乙酸酐的无水乙腈溶液和三乙基胺乙腈溶液，室温震荡10分钟,在室温下静置2小时；然后立即对8个衍生化以后的混合标准溶液进行GC-MS-MS分析。用确定构型后的(S)-NNAL-(S)-(+)-α-甲氧基-α-三氟甲基苯乙酸酯和(R)-NNAL-(S)-(+)-α-甲氧基-α-三氟甲基苯乙酸酯作为参照，通过保留时间确定衍生化后的混合标准溶液中的(S)-NNAL-(S)-(+)-α-甲氧基-α-三氟甲基苯乙酸酯和(R)-NNAL-(S)-(+)-α-甲氧基-α-三氟甲基苯乙酸酯的色谱峰。外消旋体NNAL标准溶液衍生化生成的一对非对映异构体的峰面积为1:1。以GC-MS-MS色谱图中(S)-NNAL-(S)-(+)-α-甲氧基-α-三氟甲基苯乙酸酯的浓度与(S)-NNAL-甲基-d3-(S)-(+)-α-甲氧基-α-三氟甲基苯乙酸酯的浓度之比为横坐标，以色谱图中(S)-NNAL-(S)-(+)-α-甲氧基-α-三氟甲基苯乙酸酯的定量离子对峰面积与(S)-NNAL-甲基-d3-(S)-(+)-α-甲氧基-α-三氟甲基苯乙酸酯的定量离子对峰面积之比为纵坐标，建立(S)-NNAL-(S)-(+)-α-甲氧基-α-三氟甲基苯乙酸酯的标准溶液工作曲线，以同样方法建立(R)-NNAL-(S)-(+)-α-甲氧基-α-三氟甲基苯乙酸酯的标准溶液工作曲线。
3.实际尿液样品检测：将在室温下解冻后的尿液样品摇匀，准确移取8mL尿液于50mL试管中，加入100μL浓度为1ng/mL的rac-NNAL-甲基-d3溶液，再加入2.0mL的磷酸二氢氨缓冲溶液（pH6.4,0.6M）和500μL的β-葡糖苷酸酶（1000U/mL尿液），充分混匀后置入微波辅助萃取仪，37℃恒温酶解60s,静置10分钟，再37℃恒温酶解60s，将酶解后的尿样上样到已经分别用1mL二氯甲烷、1mL甲醇、1mL水活化好的MIP-NNAL固相萃取小柱净化，用4mL去离子水淋洗并抽干，再分别用2mL甲苯、1mL甲苯/二氯甲烷（9：1）洗脱，最后用3*1mL二氯甲烷洗脱，合并洗脱液，加入1.0g无水硫酸钠干燥后过滤，减压浓缩至干，加入0.2mL浓度为1μg/mL的三乙基胺无水乙腈溶液，震荡1分钟，再在0℃度无水条件下加入0.2mL浓度为1μg/mL(S)-(+)-α-甲氧基-α-三氟甲基苯乙酸酐的无水乙腈溶液，盖紧，室温震荡10分钟,在室温下静置2小时；然后立即对样品进行GC-MS-MS分析。使用(S)-NNAL-(S)-(+)-α-甲氧基-α-三氟甲基苯乙酸酯的标准溶液工作曲线和(R)-NNAL-(S)-(+)-α-甲氧基-α-三氟甲基苯乙酸酯的标准溶液工作曲线计算待测样品中的(S)-NNAL-(S)-(+)-α-甲氧基-α-三氟甲基苯乙酸酯和(R)-NNAL-(S)-(+)-α-甲氧基-α-三氟甲基苯乙酸酯，进而换算出该尿液中(S)-NNAL和(R)-NNAL的浓度分别为0.61ng/mL和0.53ng/mL。
实施例4：
1.外消旋体NNAL的衍生化：以无水乙腈为溶剂，配制浓度为1μg／mL的rac NNAL标准品单标溶液，保留四位有效数字；以同样方式以无水乙腈为溶剂分别配制浓度为1μg／mL的rac-NNAL-甲基-d3的单标溶液；以无水乙腈为溶剂，按表1配制含有rac-NNAL和氘代rac-NNAL-甲基-d3的8个混合标准溶液；配制浓度为10ng／mL的(S)-(+)-α-甲氧基-α-三氟甲基苯乙酰氯的无水乙腈溶液;配制浓度为10ng／mL的三乙基胺的无水乙腈溶液;分别取0.5mL8个混合标准溶液于8个GC-MS-MS色谱瓶中,在0℃度无水条件下,再按照表2分别加入(S)-(+)-α-甲氧基-α-三氟甲基苯乙酰氯的无水乙腈溶液和三乙基胺乙腈溶液，室温震荡10分钟,在室温下静置2小时；然后立即对8个衍生化以后的混合标准溶液进行GC-MS-MS分析。
2.实际尿液样品检测：将在室温下解冻后的尿液样品摇匀，准确移取8mL尿液于50mL试管中，加入100μL浓度为1ng/mL的rac-NNAL-甲基-d3溶液，再加入2.0mL的磷酸二氢氨缓冲溶液（pH6.4,0.6M）和500μL的β-葡糖苷酸酶（1000U/mL尿液），充分混匀后在37℃恒温水浴中酶解16小时，将酶解后的尿样上样到已经分别用1mL二氯甲烷、1mL甲醇、1mL水活化好的MIP-NNAL固相萃取小柱净化，用4mL去离子水淋洗并抽干，再分别用2mL甲苯、1mL甲苯/二氯甲烷（9：1）洗脱，最后用3*1mL二氯甲烷洗脱，合并洗脱液，加入1.0g无水硫酸钠干燥后过滤，减压浓缩至干，加入0.2mL浓度为1μg/mL的三乙基胺无水乙腈溶液，震荡1分钟，再在0℃度无水条件下加入0.2mL浓度为1μg/mL(S)-(+)-α-甲氧基-α-三氟甲基苯乙酰氯的无水乙腈溶液，盖紧，室温震荡10分钟,在室温下静置2小时；然后立即对样品进行GC-MS-MS分析。使用(S)-NNAL-(S)-(+)-α-甲氧基-α-三氟甲基苯乙酸酯的标准溶液工作曲线和(R)-NNAL-(S)-(+)-α-甲氧基-α-三氟甲基苯乙酸酯的标准溶液工作曲线计算待测样品中的(S)-NNAL-(S)-(+)-α-甲氧基-α-三氟甲基苯乙酸酯和(R)-NNAL-(S)-(+)-α-甲氧基-α-三氟甲基苯乙酸酯，进而换算出该尿液中(S)-NNAL和(R)-NNAL的浓度分别为1.16ng/mL和1.13ng/mL。
需要指出，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
与现有技术相比，本发明具有以下突出优点：
1.本发明使用衍生化-GC-MS-MS法测定尿液中(S)-NNAL和(R)-NNAL，具有检测限低、稳定性好、前处理简单、快速准确等优点；
2.本发明方法的检测结果受主观判断因素影响小，易于推广应用。
3、针对现有方法很难开展尿样中(S)-NNAL和(R)-NNAL的检测工作的不足，提供一种尿液中(S)-NNAL和(R)-NNAL的气相色谱-质谱-质谱联用检测方法，为评估个体对烟气中NNK的暴露程度提供一种科学的判定方法。
4、本方法适用于尿液中(S)-NNAL和(R)-NNAL的气相色谱-质谱-质谱联用检测，为一种科学评估个体对烟气中NNK的暴露程度的方法。
Claims (1)
1.尿液中(S)-NNAL和(R)-NNAL的气相色谱-质谱-质谱联用检测方法，其特征在于该方法包括以下步骤：
①用测定旋光并比对的方法确定(S)-NNAL和(R)-NNAL的构型并作为参照，或用Mosher方法确定(S)-NNAL-(S)-(+)-α-甲氧基-α-三氟甲基苯乙酸酯和(R)-NNAL-甲基-d3-(S)-(+)-α-甲氧基-α-三氟甲基苯乙酸酯的构型并作为参照；
②配制含有rac-NNAL和氘代rac-NNAL-甲基-d3的混合标准溶液，再用(S)-(+)-α-甲氧基-α-三氟甲基苯乙酰氯的无水乙腈溶液和三乙基胺的无水乙腈溶液衍生化，然后对衍生化以后的混合标准溶液进行GC-MS-MS分析;用确定构型后的(S)-NNAL-(S)-(+)-α-甲氧基-α-三氟甲基苯乙酸酯和(R)-NNAL-(S)-(+)-α-甲氧基-α-三氟甲基苯乙酸酯通过保留时间确定相应的色谱峰保留时间，并建立(S)-NNAL-(S)-(+)-α-甲氧基-α-三氟甲基苯乙酸酯的标准溶液工作曲线和(R)-NNAL-(S)-(+)-α-甲氧基-α-三氟甲基苯乙酸酯的标准溶液工作曲线；
③将在室温下解冻后的尿液样品摇匀，加入rac-NNAL-甲基-d3溶液、磷酸二氢氨缓冲溶液和β-葡糖苷酸酶，充分混匀后置入微波辅助萃取仪中在37℃恒温酶解,再将酶解后的尿样上样到MIP-NNAL固相萃取小柱净化，淋洗后用二氯甲烷洗脱，加入无水硫酸钠干燥后过滤，减压浓缩至干，加入三乙基胺无水乙腈溶液、(S)-(+)-α-甲氧基-α-三氟甲基苯乙酰氯的无水乙腈溶液，盖紧，衍生化后立即对样品进行GC-MS-MS分析，色谱柱采用DB-5MS毛细 管柱，60m*0.25mm ID*0.25μm；升温程序为：柱温：初始温度100℃，保持2min，然后以15℃/min的速率升至260℃，保持5min，再以25℃/min的速率升至320℃，保持3min。
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