CN102445510A - 测定肝微粒体中nnk代谢物的液质联用方法 - Google Patents
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Abstract
测定肝微粒体中NNK代谢物的液质联用方法，属于生物化学分析领域，具体为一种分析测定肝微粒体中4-(甲基亚硝基)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮(NNK)代谢物的液质联用方法。本发明方法主要包括以下步骤：（1）肝微粒体孵育体系的配制；（2）样品处理：（3）样品分析，通过液质联用方法进行肝微粒体中NNK代谢物测定。本发明的优点在于：前处理简单、分析速度快、选择性好、检测灵敏度高，且可分析比较NNK在不同种属肝微粒体中的代谢。可以为进一步研究NNK及其他亚硝胺化合物的体内外代谢奠定方法学基础，具有重要意义。
Description
技术领域
本发明涉及生物化学分析领域，具体为一种分析测定肝微粒体中4-(甲基亚硝基)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮(NNK)代谢物的液质联用方法。
背景技术
NNK可诱导实验动物产生多种癌症，国际癌症研究组织（IARC）将它定为一类致癌物（Smokeless tobacco and tobacco-specific nitrosamines. IARC monographs on the evaluation of carcinogenic risks to humans, vol. 89. Lyon (FR): IARC, 2007.）。生物实验表明NNK是大鼠肺癌的强烈致癌剂（Brunnemann K, Hoffmann D. Analytical studies on tobacco-specific N-nitrosamines in tobacco and tobacco smoke[J]. Critical reviews in toxicology, 1991, 21(4): 235-240.）。NNK不论以何种途径处理实验动物，均能诱发实验动物肺癌的发生，且多数为肺腺癌（Hecht S S. Biochemistry, Biology, and Carcinogenicity of Tobacco-Specific N-Nitrosamines[J]. Chemical Research in Toxicology , 1998, 11 (6): 559-603.）。
NNK需要通过代谢活化才能表现其致癌性，NNK和它的主要代谢物NNAL代谢活化为DNA加合物对它们致癌性的表达非常关键。NNK和NNAL的代谢、加合物形成和脱毒反应现在已了解得比较清楚，它们在人类和啮齿类动物中有很多相同的反应，但是存在量的差异（Hoffmann D, Hecht S S. Advances in tobacco carcinogenesis. In Handbook of Experimental Pharmacology (Cooper C S, and Grover P L, Eds.). Springer-Verlag, Heidelberg, 1990: 63-102.）。对NNK进行体内体外代谢研究可以进一步阐明烟草引发癌症的机制，并为后续癌症预防研究提供技术支持。
肝微粒体是指肝细胞被匀浆破碎时，内膜系统的膜结构破裂后自己重新封闭起来的小囊泡(主要是内质网和高尔基体)，这些小囊泡的直径大约100 nm左右，是异质性的集合体。在体外试验中，具有蛋白质合成、蛋白质糖基化和脂类合成等基本功能。肝微粒体在药物代谢研究中应用广泛，可以进行细胞色素酶（CYP）反应表型研究，基于CYP的药物相互作用研究，以及代谢稳定性的研究，目前已越来越多的运用肝微粒体体外温孵法预测药物在体内的代谢清除，一般通过测定药物体外代谢酶促动力学，运用合理的药代动力学模型来推断体内药物的代谢清除。
对于NNK代谢物的检测，文献报道多采用[5-3H]NNK标记，液相色谱法（HPLC法）分析（Hecht S S. Metabolism of 4-(Methylnitrosamino)-1-(3-pyridyl)- 1-butanone by Cultured Monkey Lung Explants[J]. Drug Metabolism and Disposition, 2000, 28(1): 5-9.；Berhard Schrader, Hirsch-Ernst, Ekkehard scholz, et al. Metabolism of 4-(Methylnitrosamino)-1-(3-pyridyl)-1-butanone in primary cultures of rat alveolar type Ⅱ cells[J]. Drug Metabolism and Disposition, 2000, 28(2): 180-185.；Mullett W M, Levsen K, Borlak J, et al. Automated in-tube solid-phase microextraction coupled with HPLC for the determination of N-nitrosamines in cell cultures[J]. Analytical Chemistry, 2002, 74(7): 1695-1701）。同位素放射性标记试验需具备相应的安全防护措施和条件，每次试验或阶段性试验结束后，都可能有不同程度的放射性污染和放射性废物的出现，要面临去污染处理和放射性废物处理等问题，近年来应用日益受限。且建立的HPLC法分析时间长，峰形质量不高，分离效果不佳。因此建立一种对所有NNK代谢物都适用且简单快速、选择性好、检测灵敏度高的液质联用方法，并将之应用于肝微粒体体系进行分析，可以为进一步研究NNK及其他亚硝胺化合物的体内外代谢奠定方法学基础，具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是针对上述现有分析技术的不足，提供一种快速、灵敏、实用的同时测定肝微粒体中7种NNK代谢物的液质联用方法。其特点是：前处理简单、分析速度快、选择性好、检测灵敏度高，且可分析比较NNK在不同种属肝微粒体中的代谢。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的来实现的：
测定肝微粒体中NNK代谢物的液质联用方法，包括以下步骤：
（1）肝微粒体孵育体系的配制
孵育：取离心管，依次加入孵育液B，孵育液A，所需浓度的NNK（使NNK终浓度为0.5-200μMol），补加磷酸盐缓冲溶液配成肝微粒体孵育体系；
反应：将离心管置于37.0 ℃水浴中5 min，加入肝微粒体，轻摇孵育体系使之均匀后不再晃动，置于37.0 ℃水浴中静止反应30 min；
（2）样品处理：取出反应产物，加入预冷的内标乙腈溶液（三种氘代内标：NNK-d4、HPB-d4、NNAL-d3使内标的最终含量水平为1ng/mL，但本实验所选内标浓度是根据具体实验决定的，可根据实际需要选定）终止反应，放于4℃冰箱中保存60 min使蛋白沉淀，3500 rpm离心10 min，取上清再于10000 rpm离心5 min，上清液过0.22 μm滤膜后进样2 μL分析；
（3）样品分析,进行肝微粒体中NNK代谢物测定，具体条件如下：
色谱条件：
色谱柱：Waters Atlantis HILIC Silica柱 (3.0×100 mm，3 μm，美国Waters公司)；流动相：A：水（含10 mM甲酸铵），B：乙腈；流速：500 μL/min；洗脱方式：梯度洗脱，具体条件如表1所示；进样量：2 μL；柱温：26 ℃；
表1：NNK代谢物液相色谱梯度洗脱条件
| 时间（min） | 流速（μL/min） | A（%） | B（%） |
| 0 | 500 | 10 | 90 |
| 2 | 500 | 25 | 75 |
| 6 | 500 | 25 | 75 |
| 6.1 | 500 | 10 | 90 |
| 10 | 500 | 10 | 90 |
质谱条件：
电离模式：电喷雾电离（ESI）；扫描模式：正离子扫描；检测方式：多反应监测（MRM）；电喷雾电压（IS）：5500 V；离子源温度（TEM）：600 ℃；雾化气（GS1, N2）：65 psi；辅助加热气（GS2 , N2）：60 psi；气帘气（Curtain gas, CUR, N2）：35 psi；碰撞气（Collision gas, CAD, N2）：8 psi；驻留时间（Dwell Time）：50 ms；入口电压EP（Entrance Potential）：10 V；出口电压CXP（Collision Cell Exit Potential）：12 V。
所述肝微粒体为小鼠、大鼠、比格犬、食蟹猴或人的肝微粒体。
表2列出了正离子模式多反应监测(MRM)条件下各分析物及内标化合物的母离子、子离子以及优化的去簇电压DP和碰撞能量CE值。
表2 分析物及内标物的MRM参数
注：各分析物上面一行数据为定量时采用的MRM参数,下面一行数据为辅助定性所用参数
NNAL：4-(甲基亚硝胺基)-1-(3-吡啶基)-1-丁醇；NNK-N-Oxide：4-(甲基亚硝基)-1-(3-吡啶基-N-氧化)-1-丁酮；NNAL-N-Oxide ：4-(甲基亚硝基)-1-(3-吡啶基-N-氧化)-1-丁醇； HPB：4-羟基-1-(3-吡啶基)-1-丁酮；PBD：1-(3-吡啶基)-1,4-二醇；酮酸：1-(3-吡啶基)-1-丁酮-4-羧酸；羟基酸：1-(3-吡啶基)-1-丁醇-4-羧酸；NNK-d4：4-(甲基亚硝胺基)-1-(3-吡啶基-d4)-1-丁酮；HPB-d4：4-羟基-1-(3-吡啶基)-1-丁酮-（3,3,4,4-D4）；NNAL-d3：4-(甲基-d3-亚硝胺基)-1-(3-吡啶基)-1-丁醇。
本发明的优点在于：前处理简单、分析速度快、选择性好、检测灵敏度高，且可分析比较NNK在不同种属肝微粒体中的代谢。可以为进一步研究NNK及其他亚硝胺化合物的体内外代谢奠定方法学基础，具有重要意义。
附图说明
附图1为NNK代谢物标准品的色谱质谱图。
附图2为肝微粒体样品中各分析物的提取离子图。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明做进一步说明：
实施例1
1. 仪器与试剂：
超纯水（电阻率≥18.2 MΩ.cm）；甲醇（色谱纯，美国J&T Baker 公司）；乙腈（色谱纯，美国J&T Baker 公司）；甲酸（色谱纯，美国TEDIA公司）；甲酸铵（纯度≥99%,Alfa Aesar公司）；乙酸铵（色谱纯，美国TEDIA公司）；0.22 μm有机相针式滤器（美国Agilent公司）。
4-(甲基亚硝胺基)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮(NNK)；4-(甲基亚硝胺基)-1-(3-吡啶基)-1-丁醇（NNAL）；4-(甲基亚硝基)-1-(3-吡啶基-N-氧化)-1-丁酮（NNK-N-Oxide）；4-(甲基亚硝基)-1-(3-吡啶基-N-氧化)-1-丁醇（NNAL-N-Oxide）；4-羟基-1-(3-吡啶基)-1-丁酮（HPB）；1-(3-吡啶基)-1,4-二醇（PBD, 羟基醇或二醇）；1-(3-吡啶基)-1-丁酮-4-羧酸（酮酸）；1-(3-吡啶基)-1-丁醇-4-羧酸（羟基酸，铵盐）；4-(甲基亚硝胺基)-1-(3-吡啶基-d4)-1-丁酮（NNK-d4）；4-羟基-1-(3-吡啶基)-1-丁酮-（3,3,4,4-D4）（HPB-d4）；4-(甲基-d3-亚硝胺基)-1-(3-吡啶基)-1-丁醇（NNAL-d3）（纯度>98%，加拿大TRC公司）。
磷酸盐缓冲溶液，孵育液A，孵育液B(这两种孵育液按要求混合后可产生启动孵育体系所需的酶，可直接从北京汇智康泰公司购买，也可自行配制)，小鼠、大鼠、比格犬、食蟹猴及人肝微粒体（北京汇智泰康医药技术有限公司）
Agilent 1200 高效液相色谱仪（美国Agilent公司）；API5500质谱仪（美国AB公司）；Milli-Q超纯水仪(美国MILLIPORE公司)；CP2245分析天平（感量0.0001 g ,德国Sartorius公司）；Thermo超低温冰箱（美国Thermo SCIENTIFIC公司）；SIGMA 3-15高速离心机(德国Sartorius公司)； SIGMA 3-18K 低温高速离心机（德国Sartorius公司）；涡旋震荡器（德国IKA公司）；KQ-700DE型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。
2. 试验方法：
准备工作：提前制备碎冰，放置于合适容器，将孵育液A、孵育液B及肝微粒体自-80 ℃冰箱取出放置于冰浴上解冻；提前打开水浴装置，使温度稳定于37.0 ℃；预冷加有内标的乙腈溶液。
孵育：取1.5 mL离心管，加入10 μL孵育液B，50 μL孵育液A，2.5 μL所需浓度的NNK，补加187.5 μL的磷酸盐缓冲溶液配成250 μL的孵育体系；每个NNK浓度水平设三个平行，同时设置样品空白（加入等体积的超纯水），所有操作于冰浴上进行。
反应：将离心管置于37.0 ℃水浴中5 min，分别加入20 mg/mL大鼠、小鼠、比格犬、食蟹猴及人肝微粒体6.67 μL，使体系肝微粒体蛋白浓度为0.5 mg/mL，轻摇孵育体系使之均匀后不再晃动，置于37.0 ℃水浴中静止反应30 min。（注：每次实验都是采用的一种物种的肝微粒体，一共对这五种动物进行了实验）。
样品处理：30 min后取出，加入750 μL预冷的内标乙腈溶液终止反应，放于4℃冰箱中保存60 min使蛋白沉淀，3500 rpm离心10 min，取上清再于10000 rpm离心5 min，上清液过0.22 μm滤膜后进样2 μL分析。
3. 液质联用分析：
色谱条件：
色谱柱：Waters Atlantis HILIC Silica柱 (3.0×100 mm，3 μm，美国Waters公司)；流动相：A：水（含10 mM甲酸铵），B：乙腈；流速：500 μL/min；洗脱方式：梯度洗脱，优化的洗脱条件如表1所示；进样量：2 μL；柱温：26 ℃
质谱条件：
电离模式：电喷雾电离（ESI）；扫描模式：正离子扫描；检测方式：多反应监测（MRM）；电喷雾电压（IS）：5500 V；离子源温度（TEM）：600 ℃；雾化气（GS1, N2）：65 psi；辅助加热气（GS2 , N2）：60 psi；气帘气（Curtain gas, CUR, N2）：35 psi；碰撞气（Collision gas, CAD, N2）：8 psi；驻留时间（Dwell Time）：50 ms；入口电压EP（Entrance Potential）：10 V；出口电压CXP（Collision Cell Exit Potential）：12 V。
Claims (5)
1.测定肝微粒体中NNK代谢物的液质联用方法，其特征在于：包括以下步骤：
（1）肝微粒体孵育体系的配制
孵育：取离心管，依次加入孵育液B，孵育液A，所需浓度的NNK，补加磷酸盐缓冲溶液配成肝微粒体孵育体系；
反应：将离心管置于37.0 ℃水浴中5 min，加入肝微粒体，轻摇孵育体系使之均匀后不再晃动，置于37.0 ℃水浴中静止反应30 min；
（2）样品处理：取出反应产物，加入预冷的内标乙腈溶液终止反应，放于4℃冰箱中保存60 min使蛋白沉淀，3500 rpm离心10 min，取上清再于10000 rpm离心5 min，上清液过0.22 μm滤膜后进样2 μL分析；
（3）样品分析,进行肝微粒体中NNK代谢物测定，具体条件如下：
色谱条件：
色谱柱： HILIC Silica柱；流动相：A：水（含10 mM甲酸铵），B：乙腈；流速：500 μL/min；洗脱方式：梯度洗脱；进样量：2 μL；柱温：26 ℃；
质谱条件：
电离模式：电喷雾电离（ESI）；扫描模式：正离子扫描；检测方式：多反应监测（MRM）；电喷雾电压（IS）：5500 V；离子源温度（TEM）：600 ℃；雾化气（GS1, N2）：65 psi；辅助加热气（GS2 , N2）：60 psi；气帘气（Curtain gas, CUR, N2）：35 psi；碰撞气（Collision gas, CAD, N2）：8 psi；驻留时间（Dwell Time）：50 ms；入口电压EP（Entrance Potential）：10 V；出口电压CXP（Collision Cell Exit Potential）：12 V。
2.根据权利要求1所述的测定肝微粒体中NNK代谢物的液质联用方法，其特征在于：所使用的色谱柱为美国Waters公司的Waters Atlantis HILIC Silica柱，型号为3.0×100 mm，3 μm。
3.根据权利要求1所述的测定肝微粒体中NNK代谢物的液质联用方法，其特征在于：步骤（3）中的梯度洗脱条件如下表：
液相色谱梯度洗脱条件
。
4.根据权利要求1所述的测定肝微粒体中NNK代谢物的液质联用方法，其特征在于：所述肝微粒体为小鼠、大鼠、比格犬、食蟹猴或人的肝微粒体。
5.根据权利要求1所述的测定肝微粒体中NNK代谢物的液质联用方法，其特征在于：所用内标为三种氘代内标，分别是：NNK-d4、HPB-d4、NNAL-d3。
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