CN103163086B - 黄曲霉毒素的太赫兹波谱检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种黄曲霉毒素的太赫兹波谱检测方法，包括以下步骤：A1，均质样品；A2，粗滤与稀释；A3，样品过柱；A4，清洗杂质；A5，洗脱A6，待测样品制备与保存；A7，制作太赫兹痕量检测样品；A8，样品的太赫兹时域光谱检测；A9，黄曲霉毒素太赫兹谱库的建立；A10，基于太赫兹波谱检测的黄曲霉毒素类型识别将A8得到的样品的太赫兹波谱与黄曲霉毒素波谱库中波谱比对，采用模板匹配法得到相关性最强的黄曲霉毒素的类型，该类型即为样品中黄曲霉毒素的类型。利用本技术发明对黄曲霉毒素进行检测，突出的优势是检测速度快，具有比一般生化的检测方法更高的智能性；检测过程简单，操作简便。
Description
技术领域
本发明涉及微量有害物质物理检测的新方法，尤其涉及的是一种黄曲霉毒素的太赫兹波谱检测方法。
背景技术
黄曲霉素是食品安全检测中国家规定必检的一个项目，目前多采用生化的检测方法。这类检测方法都还存在着这样或那样的缺陷。如TLC方法虽然简便，但灵敏度差；HPLC虽然灵敏度高，但样品处理烦琐，操作复杂，仪器昂贵。ELISA重复性差试剂寿命短需要低温保存。在操作过程中，这类方法大多需要使用剧毒的真菌毒素作为标定标准物，有对操作人员造成巨大沾污的危险。在对样品进行预处理过程中，需要使用多种有毒、异味的有机溶剂，不仅毒害操作人员，而且污染环境。操作过程烦琐、时间长，劳动强度大。仪器设备复杂、笨重，难以实现现场快速分析。
发明内容
本发明是一种黄曲霉毒素的太赫兹波谱检测方法，它采用了物理的检测方法，用于解决在黄曲霉素检测过程中遇到的上述问题。它不仅可以检测出被检物是否含有黄曲霉素，而且可以辨别黄曲霉素的种类，在检测的精确度上，不亚于ELISA方法，而检测过程却大大简化，检测耗时大大缩短。
本发明的技术方案如下：
将怀疑有黄曲霉菌感染的粮食、食品和食用油作为待检对象，并制作待检物的样品。
利用黄曲霉毒素免疫亲和柱对待检物中含有的黄曲霉毒素进行提取。
提取的黄曲霉毒素保存在非极性、易挥发的有机溶剂(如甲醇、氯仿)中，并低温、密封保存。
检测时首先制作用于太赫兹波谱检测的样品。考虑到黄曲霉素检测浓度过低带来的不力影响，本技术方案采用了痕量检测方法。该方法的基本过程为：将含有黄曲霉素的溶剂滴到载玻片上，并涂抹均匀，然后让有机溶剂挥发，有机容易挥发完后就会在载玻片上留下一层黄曲霉毒素的薄层，考虑到薄层不均匀或过薄影响检测效果，可多滴几次，并使溶剂完全挥发，以增加薄层厚度，增强检测效果。
载有黄曲霉毒素薄层的载玻片放在太赫兹时域波谱检测系统(THz-TDS)上采用透射法进行波谱测量，得到黄曲霉毒素的波谱。
采用上述方法先获取各种已知黄曲霉毒素波谱，并作为知识存储到一个专家系统中。
通过1-5步得到的待检样品的波谱，与存储在专家系统中的波谱进行比对或匹配，以判断是否有黄曲霉素和黄曲霉毒素的类型。
将黄曲霉毒素的检测结果在计算机上输出，形成并打印检测报告。
有益效果：
1.利用本技术发明对黄曲霉毒素进行检测，突出的优势是检测速度快。因为样品对太赫兹波的响应非常快，在纳秒量级，检测系统采集这种响应并采用计算机进行分析计算也在秒量级上。一般检测时为了提高准确性，需要进行多次检测(一般为三次)，并将检测结果取平均值，加上人工分析、给出结论的时间，一般不超过半个小时。而一般的生化检测的检测时间，多在数天至数小时时间不等，本技术发明大大缩短了检测时间。
2.本技术发明采用计算机技术进行分析判断，具有比一般生化的检测方法更高的智能性。生化检测大多最后的判断还是需要人工的方法，智能化程度不高，而且受到检测人员经验的限制，往往会出现判断失误的情况。本技术发明通过计算机对采集的太赫兹波谱进行智能分析和识别，最大限度规避了人工判断带来的风险，具有很高的可靠性。
3.本技术发明用于检测黄曲霉毒素检测过程简单，操作简便，无专业技术人员稍加培训即可完成检测工作，劳动强度大大降低，检测效率大大提高。而传统的生化检测方法，动用仪器和试剂多，检测人员技术水平要求高，检测程序复杂，非专业检测人员不能掌握，本技术发明很好地克服了以上缺点。
附图说明
图1为黄曲霉毒素B1浓度分别为1ppm，3ppm和5ppm时的太赫兹时域谱(溶剂为乙腈)；
图2为黄曲霉毒素B1浓度分别为10ppm，30ppm和50ppm时的太赫兹时域谱(溶剂为乙腈)；
图3为各种浓度下的黄曲霉毒素B1的太赫兹频域谱(溶剂为乙腈)；
具体实施方式
以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。
本发明黄曲霉毒素的太赫兹波谱检测方法的具体实施方案如下：
1.均质样品
将固体样品(如花生、大豆、小麦等)去除杂质，用水浸泡，待样品松软后，取出样品放入搅拌器中搅拌1-2分钟，使之高速均质。对于粉状样品，可加水置于锥形瓶中，在摇床上震动30分钟进行均质。
2.粗滤与稀释
将均质液通过槽纹滤纸过滤，准确移取15ml滤液并加入30ml水进行稀释。
3.样品过柱
将免疫亲和柱连接于玻璃注射器下，准确移取15ml样品提取液注入玻璃注射器中。将空气压力泵与玻璃注射器连接，调节压力使溶液约以6ml/min流速缓慢通过免疫亲和柱，直至2-3ml空气通过柱体。
4.清洗杂质
以10ml水清洗亲和柱2次，弃去全部流出的液体，并使2-3ml的空气通过柱体。
5.洗脱
准确加入1.0ml色谱级甲醇洗脱，流速为1-2ml/min，收集全部洗脱液于玻璃试管中，至此，黄曲霉毒素已被提取出来并保存在甲醇溶剂中。
【原理】黄曲霉毒素免疫亲和柱含有黄曲霉毒素特异抗体，黄曲霉毒素交联在层析介质中的抗体上，此抗体对黄曲霉毒素具有专一性，而对其他物质没有专一性。
【注意事项】
(1)样品过柱、甲醇洗脱速度要慢、均匀
(2)洗脱时的溶剂应是可溶解黄曲霉毒素的非极性有机溶剂，本技术发明中
使用甲醇作为洗脱剂
(3)亲和柱不要在无水状态下时间过长，以免琼脂干燥萎缩
(4)用过的免疫亲和柱可反复多次使用。保存方法是，先用4×10ml甲醇+水(70+30，V/V)过柱，调节流速约2滴/秒，再用2×10ml水过柱，流速也为2滴/秒。洗后用Pbs缓冲溶液填充柱子，放入2-8℃冰箱内保存。
6.待测样品制备与保存
将试管中收集的样品溶液保存在不透光的密闭的玻璃瓶内，放入2-8℃冰箱保存。注意要保持玻璃瓶密闭良好，以免溶剂的挥发。
7.制作太赫兹痕量检测样品
由于溶剂中保存的黄曲霉毒素一般浓度较低，直接注入比色皿中进行太赫兹波的透射检测，会造成太赫兹响应不敏感甚至无响应的问题，因此本技术发明提出了采用痕量检测的方法，可以有效解决因黄曲霉毒素浓度过低造成太赫兹响应不敏感的问题。具体过程如下：
(1)用注射器扎透保存有样品的玻璃瓶上的橡皮塞，提取部分溶液到注射器中
(2)将注射器中的溶液滴在载玻片上，用另一载玻片将溶液摊平
(3)放在通风处使溶剂挥发，此时载玻片上只留下黄曲霉毒素的薄层
(4)重复上述过程，直至载玻片上留有的黄曲霉毒素的薄层有足够的厚度
【注意事项】
(1)在载玻片上摊平溶液时应小心、缓慢，尽量均匀不要溢出载玻片外
(2)操作过程要做好防护工作，带口罩、手套、穿工作服，以免有毒溶剂对皮肤和呼吸道造成伤害。
8.样品的太赫兹时域光谱检测
将载玻片放入太赫兹时域光谱检测系统(THz-TDS)样品检测位置，使太赫兹光源焦点对准载玻片的中心，连续照射3分钟，总共进行3次共9分钟检测，以保证取尽可能多的平均值，检测系统将自动采集检测数据并上传给计算机进行处理显示，获取检测样品的太赫兹波谱及其他相关光学参数。
在这一步中，得到的太赫兹波谱图如图1-3(太赫兹检测系统参数如下：飞秒激光脉冲中心波长：800nm；输出功率：720mW；太赫兹频率范围：0.2-3T(1T＝1012Hz)；光电导材料：砷化镓；太赫兹探测材料：碲化锌；相对湿度小于2％，温度为294K(21℃)。图2和图3检测参数同图1)所示。图中是按照上述样品制备步骤，分别制备了1ppm，3ppm，5ppm，10ppm，30ppm，50ppm的黄曲霉毒素样品，显示了其中部分样品的太赫兹波谱图。
9.黄曲霉毒素太赫兹谱库的建立
为了能够识别检测的对象，需要事先建立黄曲霉毒素的谱库，以便以后的波谱比对。将已知类型的黄曲霉毒素按照上述方法进行太赫兹波谱检测，得到相应的太赫兹波谱，建立太赫兹波谱与黄曲霉毒素种类的对应关系，并建立黄曲霉毒素的太赫兹波谱库。
10.基于太赫兹波谱检测的黄曲霉毒素类型识别
将第8步得到的样品的太赫兹波谱与黄曲霉毒素波谱库中波谱比对，采用模板匹配法得到相关性最强的黄曲霉毒素的类型，该类型即为样品中黄曲霉毒素的类型。
11.向用户出具检测报告。检测报告给出各种类型黄曲霉毒素与样品相关性大小列表，以及检测人员推荐的样品的黄曲霉毒素类型。
表1部分黄曲霉毒素ELISA法与太赫兹法检测结果对照表
注：(1)ELISA检测采用试剂盒的方式，采用的试剂盒分别是国内华安麦科生物技术有限公司、健仑生物科技有限公司的黄曲霉毒素试剂盒。
(2)太赫兹检测使用的是首都师范大学光电子教育部重点实验室的THz-TDS系统。
应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。
Claims (1)
1.一种黄曲霉毒素的太赫兹波谱检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
A1，均质样品；
A2，粗滤与稀释；
A3，样品过柱；将免疫亲和柱连接于玻璃注射器下，准确移取15ml样品提取液注入玻璃注射器中，将空气压力泵与玻璃注射器连接，调节压力使溶液以6ml/min流速缓慢通过免疫亲和柱，直至2-3ml空气通过柱体；
A4，清洗杂质；
A5，洗脱；准确加入1.0ml色谱级甲醇洗脱，流速为1-2ml/min，收集全部洗脱液于玻璃试管中，至此，黄曲霉毒素已被提取出来并保存在甲醇溶剂中；
A6，待测样品制备与保存；
将试管中收集的样品溶液保存在不透光的密闭的玻璃瓶内，放入2-8℃冰箱保存，注意要保持玻璃瓶密闭良好，以免溶剂的挥发；
A7，制作太赫兹痕量检测样品，具体过程如下：
(1)用注射器扎透保存有样品的玻璃瓶上的橡皮塞，提取部分溶液到注射器中；
(2)将注射器中的溶液滴在载玻片上，用另一载玻片将溶液摊平；
(3)放在通风处使溶剂挥发，此时载玻片上只留下黄曲霉毒素的薄层；
(4)重复上述过程；
A8，样品的太赫兹时域光谱检测：
将载玻片放入太赫兹时域光谱检测系统样品检测位置，使太赫兹光源焦点对准载玻片的中心，检测系统将自动采集检测数据并上传给计算机进行处理显示，获取检测样品的太赫兹波谱及其他相关光学参数；
A9，黄曲霉毒素太赫兹谱库的建立；
将已知类型的黄曲霉毒素按照步骤A8的方法进行太赫兹时域光谱检测，得到相应的太赫兹波谱，建立太赫兹波谱与黄曲霉毒素种类的对应关系，并建立黄曲霉毒素的太赫兹波谱库；
A10，基于太赫兹波谱检测的黄曲霉毒素类型识别；
将A8得到的样品的太赫兹波谱与黄曲霉毒素波谱库中波谱比对，采用模板匹配法得到相关性最强的黄曲霉毒素的类型，该类型即为样品中黄曲霉毒素的类型。
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