CN113341005A - Gc-ims和荧光光谱联用检测产黄曲霉毒素真菌污染的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种GC‑IMS和荧光光谱联用检测产黄曲霉毒素真菌污染的方法，包括如下步骤：样品处理，GC‑IMS检测，荧光光谱检测，GC‑IMS谱图特征区域选取，荧光光谱特征区域选取，GC‑IMS和荧光光谱检测的数据特征提取和融合，对提取的特征数据分别进行主成分分析分析，随后提取两种数据源的PCA前十维主成分作为新型特征向量直接组合在一起，形成融合数据；将融合后的数据进行正交偏最小二乘判别，将特征融合后的数据输入到正交偏最小二乘判别模型中，由融合信号的测试集样本数据特征值作为输入，通过正交偏最小二乘判别算法获得最终的分类模型，从而应用于未知样本的检测。此方法简单易操作，减少了运算成本，也具有较好的分类性能，具有较高的推广利用价值。
Description
技术领域
本发明属于快速分析检测领域，涉及GC-IMS和荧光光谱联用检测产黄曲霉毒素真菌污染的方法。
背景技术
黄曲霉毒素主要是由黄曲霉菌和寄生曲霉菌产生的一种次生代谢产物，是一种有毒化合物。黄曲霉毒素污染可发生在各种各样的农产品中，如谷物、坚果和油类产品等。农产品中黄曲霉毒素的污染将给人和动物带来严重的健康问题，并带来巨大的经济影响。黄曲霉毒素主要攻击人体肝脏，具有严重的致癌性、致突变性和免疫抑制作用。通常来说，农产品（如谷物等）如若只被非产毒菌污染，或未被产毒菌或黄曲霉毒素污染，仍然可以用来饲养家禽。及时判定农产品被产毒菌污染的情况有利于及时做好预防及后续处理措施。由于黄曲霉毒素存在的潜在风险，对农产品中黄曲霉毒素的监控具有重要意义。在我国的农产品作物中，花生极易感染黄曲霉菌和寄生曲霉菌，从而导致花生贮藏过程中的黄曲霉毒素污染。
目前来说，检测黄曲霉毒素的方法有两类：一类是直接检测黄曲霉毒素的含量；另一类是检测产黄曲霉毒素的真菌（黄曲霉和寄生曲霉），从而间接监控黄曲霉毒素的产生。近些年来，已经开发出了多种方法来检测农产品中黄曲霉毒素或产毒真菌的污染。例如，高效液相色谱(HPLC)、薄层色谱(TLC)和酶联免疫吸附法是测定黄曲霉毒素的常规分析方法；传统的微生物学方法和诊断培养基常被用于鉴定产毒真菌。这些方法灵敏度高且重复性好，但需要繁琐的样品前处理，以及相对昂贵的试剂和一次性柱（如免疫亲和柱和多功能柱等），这使得它们无法用于受黄曲霉毒素污染农产品的快速筛选。同时，这些方法属于有损检测。因此，为了满足食品工业早期质量控制的需要，开发一种快速灵敏的无损分析方法来有效地检测黄曲霉毒素或产黄曲霉毒素的真菌对食品安全具有重要意义。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种GC-IMS和荧光光谱联用检测产黄曲霉毒素真菌污染的方法。
一种GC-IMS和荧光光谱联用检测产黄曲霉毒素真菌污染的方法，包括如下步骤：
步骤一, 样品处理；
步骤二, GC-IMS检测；
步骤三, 荧光光谱检测；
步骤四，GC-IMS谱图特征区域选取；
步骤五，荧光光谱特征区域选取；
步骤六，GC-IMS和荧光光谱检测的数据特征提取和融合，利用数据处理软件对步骤四和步骤五中提取的特征数据分别进行主成分分析（PCA）分析，随后提取两种数据源的PCA前十维主成分作为新型特征向量直接组合在一起，形成融合数据；
步骤七，判别模型建立和应用，将融合后的数据利用SIMCA软件进行正交偏最小二乘判别，将特征融合后的数据输入到正交偏最小二乘判别模型中，由融合信号的测试集样本数据特征值作为输入，通过正交偏最小二乘判别算法获得最终的分类模型，通过将步骤六获得的未知样本特征融合信息导入所建立的分类模型，区分受潜在产黄曲霉毒素真菌污染的样品。
所述的预测方法，根据样品相应调节检测条件，适用于受潜在产黄曲霉毒素真菌污染的农作物，包括花生、小麦和稻米。
所述的检测方法，包括如下步骤：
步骤一, 花生样品处理：将市售花生籽粒置于110 mW s/cm 2的紫外灯下灭菌1-2h后，分别接种一定浓度的不同真菌悬浮液，不同接种样品取M个平行实验样品，M为5-20之间的正整数；将接种后的花生样品取3 g放置于 20 mL顶空进样瓶中，瓶口用棉花封口，每一组的花生籽粒样品分别放置在不同的塑料框中并用聚乙烯薄膜袋套住但不扎口，薄膜袋表面扎有通气小孔，减少杂菌污染的同时保持空气流通，随后将所有样品放置在28 ± 1 ℃、相对湿度85%的恒温恒湿箱中培养3天后进行检测；
步骤二, GC-IMS检测过程：将装有3 g接种样品的20 mL顶空进样瓶静置30-60min后进行GC-IMS检测，样品顶空孵化温度为60 ℃，孵化时间为5-10 min，样品进样体积为500 μL，GC-IMS使用的色谱柱为非极性Rtx-WAX色谱柱（30 m × 0.53 mm × 1 μm），程序总时间为20 min，载气流速条件设置为：初始流速为2.0 mL/min，保持1 min；随后在10 min内流速线性增至80 mL/min，并在之后的10-20 min内流速线性增速到150 mL/min，每个样品进样完成后，设置进样针进行氮气吹扫2-5 min，以去除残留挥发物影响，检测后即可获得样品的指纹图谱信息；
步骤三，荧光光谱检测过程：在装有3g接种花生的20 mL顶空瓶中加入 0.6 g 氯化钠及12 mL甲醇/水（ 7：3，v/v)，并静置提取6-8 h，随后用定量滤纸过滤, 再用有机膜过滤至滤液澄清，取澄清液进行荧光测定，采用365 nm作为激发波长扫描花生甲醇提取物在200-800 nm的荧光，从而得到样品的发射光谱；
步骤四，GC-IMS谱图特征区域选取：对上述花生样品的指纹图谱，采用比较法选择峰强度较明显的60个谱图特征区域，并提取其峰强度信息，所述比较法为根据特征物质在指纹信息谱图中颜色的差异变化或峰强度信号，选择不同真菌接种花生间物质颜色变化明显或峰强度差异大的谱图特征区域作为后续数据处理的特征信息；
步骤五，荧光光谱特征区域选取：根据分析受不同真菌侵染花生籽粒的荧光发射光谱，最终选择380-620 nm的光谱范围作为荧光光谱的特征波长范围；
步骤六，两种检测技术的数据特征提取和融合：利用SPSS 19.0数据处理软件对步骤四和步骤五中提取的特征数据分别进行主成分分析（PCA）分析，随后提取两种数据源的PCA前十维主成分作为新型特征向量直接组合在一起，形成融合数据；
步骤七，判别模型建立和应用：将融合后的数据利用SIMCA软件进行正交偏最小二乘判别，将特征融合后的数据输入到正交偏最小二乘判别模型中，由融合信号的测试集样本数据特征值作为输入，通过正交偏最小二乘判别算法获得最终的分类模型，通过将步骤六获得的未知样本特征融合信息导入所建立的分类模型，区分受潜在产黄曲霉毒素真菌污染的花生。
本发明具有以下有益效果：
（1）本发明采用一种简单快速的GC-IMS和荧光光谱技术对花生等样品进行检测，能全面提取样品关键的特征信息，并大大降低了运算成本。GC-IMS反映了样品释放的挥发物信息，荧光光谱反映了样品内部的荧光物质信息，通过将两种技术信息融合来分析受潜在产黄曲霉毒素真菌污染的花生，能有效提高样品判定准确率。
（2）本发明对每个样品的检测时间短，分析简单易操作，检测结果可靠性良好，具有较高的应用价值说明。
附图说明
图1是受5种真菌侵染的花生籽粒贮藏第3天的HS-GC-IMS指纹谱图。
图2是受5种真菌侵染的花生籽粒贮藏第3天的荧光光谱。
具体实施方式
下面结合附图和实例施对本发明作进一步说明。
本发明采用一种基于GC-IMS和荧光光谱联用技术快速检测花生受潜在产黄曲霉毒素真菌污染的方法。黄曲霉毒素在一定的紫外光照射条件下可以发出固有的天然荧光。但是花生籽粒中含有多种荧光蛋白，常规荧光分析需要将样品提取液通过免疫亲和柱去除背景荧光物质，以保证黄曲霉毒素检测的准确性。因此，本发明在样品提取液不进行免疫亲和分离的情况下，通过荧光分光光度法检测花生籽粒提取液中的荧光信号，并利用化学计量学方法构建分类模型。GC-IMS是近年来发展起来的一种气相快速分离检测技术，也是通过检测样品释放的挥发物来实现定性定量分析。GC-IMS和荧光光谱技术均能提供花生籽粒中黄曲霉真菌污染的不同类型的数据信息，将这两种数据结合在一起可能会产生协同效应。
目前，还没有GC-IMS和荧光光谱联用技术直接用于鉴别受潜在产黄曲霉毒素真菌污染花生的相关报道，本发明提供了一种基于GC-IMS和荧光光谱联用技术快速检测花生受潜在产黄曲霉毒素真菌污染的方法。并且，受产毒菌侵染花生的挥发物信息和特征荧光信息是稳定的，这为进行受潜在产黄曲霉毒素真菌污染花生的鉴别提供了可能。
一种基于GC-IMS和荧光光谱联用技术快速检测花生受潜在产黄曲霉毒素真菌污染的方法：
（1）花生样品处理：将市售花生籽粒置于110 mW s/cm 2的紫外灯下灭菌1-2h后，分别接种一定浓度的不同真菌悬浮液，不同接种样品取M个平行实验样品（M为5-20之间的正整数）。将接种后的花生样品取3 g放置于 20 mL顶空进样瓶中，瓶口用棉花封口，每一组的花生籽粒样品分别放置在不同的塑料框中并用聚乙烯薄膜袋套住但不扎口，薄膜袋表面扎有通气小孔，减少杂菌污染的同时保持空气流通。随后将所有样品放置在28 ± 1 ℃、相对湿度85%的恒温恒湿箱中培养3天后进行检测。
（2）GC-IMS检测过程：将装有3 g接种样品的20 mL顶空进样瓶静置30-60 min后进行GC-IMS检测。样品顶空孵化温度为60 ℃，孵化时间为5-10 min，样品进样体积为500 μL。GC-IMS使用的色谱柱为非极性Rtx-WAX色谱柱（30 m × 0.53 mm × 1 μm），程序总时间为20 min。载气流速条件设置为：初始流速为2.0 mL/min，保持1 min；随后在10 min内流速线性增至80 mL/min，并在之后的10-20 min内流速线性增速到150 mL/min。每个样品进样完成后，设置进样针进行氮气吹扫2-5 min，以去除残留挥发物影响。 检测后即可获得样品的指纹图谱信息。
（3）荧光光谱检测过程：在装有3g接种花生的20 mL顶空瓶中加入 0.6 g 氯化钠及12 mL甲醇/水（ 7：3，v/v)，并静置提取6-8 h。随后用定量滤纸过滤, 再用有机膜过滤至滤液澄清，取澄清液进行荧光测定。采用365 nm作为激发波长扫描花生甲醇提取物在200-800 nm的荧光，从而得到样品的发射光谱。
（4）GC-IMS谱图特征区域选取：对上述花生样品的指纹图谱，采用比较法选择峰强度较明显的60个谱图特征区域，并提取其峰强度信息。所述比较法为根据特征物质在指纹信息谱图中颜色的差异变化或峰强度信号，选择不同真菌接种花生间物质颜色变化明显或峰强度差异大的谱图特征区域作为后续数据处理的特征信息。
（5）荧光光谱特征区域选取：根据分析受不同真菌侵染花生籽粒的荧光发射光谱，最终选择380-620 nm的光谱范围作为荧光光谱的特征波长范围。
（6）两种检测技术的数据特征提取和融合：利用SPSS 19.0数据处理软件对步骤四和步骤五中提取的特征数据分别进行主成分分析（PCA）分析，随后提取两种数据源的PCA前十维主成分作为新型特征向量直接组合在一起，形成融合数据。
（7）判别模型建立和应用：将融合后的数据利用SIMCA软件进行正交偏最小二乘判别，将特征融合后的数据输入到正交偏最小二乘判别模型中，由融合信号的测试集样本数据特征值作为输入，通过正交偏最小二乘判别算法获得最终的分类模型，将分类正确率作为评价特征融合方法的依据。通过将步骤六获得的未知样本特征融合信息导入所建立的分类模型，区分受潜在产黄曲霉毒素真菌污染的花生。
实施例
本发明适用于花生、小麦、稻米等农作物受潜在产黄曲霉毒素真菌污染的检测，主要适用于GC-IMS和荧光光谱联合检测，并对其数据进行处理。以下的实施例便于更好的理解本发明，但并不限定本发明。
一种基于GC-IMS和荧光光谱联用技术快速检测花生受潜在产黄曲霉毒素真菌污染的方法，它的步骤如下：
（1）花生样品处理：将市售花生籽粒置于110 mW s/cm 2的紫外灯下灭菌1-2h后，选取5批花生样品分别接种0.2mL浓度为106 CFU/mL的黄曲霉、寄生曲霉、烟曲霉、黑曲霉和黑根霉孢子悬浮液，不同接种样品取9个平行实验样品。其中黄曲霉和寄生曲霉为产黄曲霉毒素的真菌；烟曲霉、黑曲霉和黑根霉为不产黄曲霉毒素的真菌。将接种后的花生样品分别取3 g放置于20 mL顶空进样瓶中，瓶口用棉花封口，每一组的花生籽粒样品分别放置在不同的塑料框中并用聚乙烯薄膜袋套住但不扎口，薄膜袋表面扎有通气小孔，减少杂菌污染的同时保持空气流通。随后将所有样品放置在28 ± 1 ℃、相对湿度85%的恒温恒湿箱中培养3天后进行检测。
（2）GC-IMS检测过程：将装有3 g接种样品的20 mL顶空进样瓶静置60 min后进行GC-IMS检测。样品顶空孵化温度为60 ℃，孵化时间为5-10 min，样品进样体积为500 μL。GC-IMS使用的色谱柱为非极性Rtx-WAX色谱柱（30 m × 0.53 mm × 1 μm），程序总时间为20 min。载气流速条件设置为：初始流速为2.0 mL/min，保持1 min；随后在10 min内流速线性增至80 mL/min，并在之后的10-20 min内流速线性增速到150 mL/min。每个样品进样完成后，设置进样针进行氮气吹扫2 min，以去除残留挥发物影响。 检测后即可获得样品的指纹图谱信息。
（3）荧光光谱检测过程：在装有3g接种花生的20 mL顶空瓶中加入 0.6 g 氯化钠及12 mL甲醇/水（ 7：3，v/v)，并静置提取6 h。随后用定量滤纸过滤, 再用有机膜过滤至滤液澄清，取澄清液进行荧光测定。采用365 nm作为激发波长扫描花生甲醇提取物200-800nm的荧光，从而得到样品的发射光谱。
（4）GC-IMS谱图特征区域选取：对上述花生样品的指纹图谱，采用比较法选择峰强度较明显的60个谱图特征区域，并提取其峰强度信息，结果如图1所示。所述比较法为根据特征物质在指纹信息谱图中颜色的差异变化或峰强度信号，选择不同真菌接种花生间物质颜色变化明显或峰强度差异大的谱图特征区域作为后续数据处理的特征信息。
（5）荧光光谱特征区域选取：根据分析受不同真菌侵染花生籽粒的荧光发射光谱，最终选择380-620 nm的光谱范围作为荧光光谱的特征波长范围，结果如图2所示。
（6）两种检测技术的数据特征提取和融合：利用SPSS 19.0数据处理软件对步骤四和步骤五中提取的特征数据分别进行主成分分析（PCA）分析，随后提取两种数据源的PCA前十维主成分作为新型特征向量直接组合在一起，形成融合数据。
（7）判别模型建立和应用：将融合后的数据利用SIMCA软件进行正交偏最小二乘判别，将特征融合后的数据输入到正交偏最小二乘判别模型中，由融合信号的测试集样本数据特征值作为输入，通过正交偏最小二乘判别算法获得最终的分类模型，将分类正确率作为评价特征融合方法的依据。通过将步骤六获得的未知样本特征融合信息导入所建立的分类模型，区分受潜在产黄曲霉毒素真菌污染的花生，分类准确率达到96.7 %，具有较好的分类效果，具体见表1。该结果说明提取GC-IMS和荧光光谱数据的前十维主成分作为特征信息快速检测花生受潜在产黄曲霉毒素真菌污染的方法具有较高的推广应用价值。
表1受产黄曲霉毒素侵染花生籽粒的OPLS-DA分类结果
Claims (3)
1.一种GC-IMS和荧光光谱联用检测产黄曲霉毒素真菌污染的方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤一, 样品处理；
步骤二, GC-IMS检测；
步骤三, 荧光光谱检测；
步骤四，GC-IMS谱图特征区域选取；
步骤五，荧光光谱特征区域选取；
步骤六，GC-IMS和荧光光谱检测的数据特征提取和融合，利用数据处理软件对步骤四和步骤五中提取的特征数据分别进行主成分分析（PCA）分析，随后提取两种数据源的PCA前十维主成分作为新型特征向量直接组合在一起，形成融合数据；
步骤七，判别模型建立和应用，将融合后的数据利用SIMCA软件进行正交偏最小二乘判别，将特征融合后的数据输入到正交偏最小二乘判别模型中，由融合信号的测试集样本数据特征值作为输入，通过正交偏最小二乘判别算法获得最终的分类模型，通过将步骤六获得的未知样本特征融合信息导入所建立的分类模型，区分受潜在产黄曲霉毒素真菌污染的样品。
2.根据权利要求1所述的预测方法，其特征在于，根据样品相应调节检测条件，适用于受潜在产黄曲霉毒素真菌污染的农作物，包括花生、小麦和稻米。
3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤一, 花生样品处理：将市售花生籽粒置于110 mW s/cm 2的紫外灯下灭菌1-2h后，分别接种一定浓度的不同真菌悬浮液，不同接种样品取M个平行实验样品，M为5-20之间的正整数；将接种后的花生样品取3 g放置于 20 mL顶空进样瓶中，瓶口用棉花封口，每一组的花生籽粒样品分别放置在不同的塑料框中并用聚乙烯薄膜袋套住但不扎口，薄膜袋表面扎有通气小孔，减少杂菌污染的同时保持空气流通，随后将所有样品放置在28 ± 1 ℃、相对湿度85%的恒温恒湿箱中培养3天后进行检测；
步骤二, GC-IMS检测过程：将装有3 g接种样品的20 mL顶空进样瓶静置30-60 min后进行GC-IMS检测，样品顶空孵化温度为60 ℃，孵化时间为5-10 min，样品进样体积为500 μL，GC-IMS使用的色谱柱为非极性Rtx-WAX色谱柱（30 m × 0.53 mm × 1 μm），程序总时间为20 min，载气流速条件设置为：初始流速为2.0 mL/min，保持1 min；随后在10 min内流速线性增至80 mL/min，并在之后的10-20 min内流速线性增速到150 mL/min，每个样品进样完成后，设置进样针进行氮气吹扫2-5 min，以去除残留挥发物影响，检测后即可获得样品的指纹图谱信息；
步骤三，荧光光谱检测过程：在装有3g接种花生的20 mL顶空瓶中加入 0.6 g 氯化钠及12 mL甲醇/水（ 7：3，v/v)，并静置提取6-8 h，随后用定量滤纸过滤, 再用有机膜过滤至滤液澄清，取澄清液进行荧光测定，采用365 nm作为激发波长扫描花生甲醇提取物在200-800 nm的荧光，从而得到样品的发射光谱；
步骤四，GC-IMS谱图特征区域选取：对上述花生样品的指纹图谱，采用比较法选择峰强度较明显的60个谱图特征区域，并提取其峰强度信息，所述比较法为根据特征物质在指纹信息谱图中颜色的差异变化或峰强度信号，选择不同真菌接种花生间物质颜色变化明显或峰强度差异大的谱图特征区域作为后续数据处理的特征信息；
步骤五，荧光光谱特征区域选取：根据分析受不同真菌侵染花生籽粒的荧光发射光谱，最终选择380-620 nm的光谱范围作为荧光光谱的特征波长范围；
步骤六，两种检测技术的数据特征提取和融合：利用SPSS 19.0数据处理软件对步骤四和步骤五中提取的特征数据分别进行主成分分析（PCA）分析，随后提取两种数据源的PCA前十维主成分作为新型特征向量直接组合在一起，形成融合数据；
步骤七，判别模型建立和应用：将融合后的数据利用SIMCA软件进行正交偏最小二乘判别，将特征融合后的数据输入到正交偏最小二乘判别模型中，由融合信号的测试集样本数据特征值作为输入，通过正交偏最小二乘判别算法获得最终的分类模型，通过将步骤六获得的未知样本特征融合信息导入所建立的分类模型，区分受潜在产黄曲霉毒素真菌污染的花生。
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|---|---|
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114252500A (zh) * | 2021-12-21 | 2022-03-29 | 浙江大学 | 基于gc-ims的侧柏受柏肤小蠹入侵数量的早期预测方法 |
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-
2021
- 2021-05-19 CN CN202110547668.8A patent/CN113341005A/zh active Pending
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