CN103145864B - 党参均一多糖CPP1b及其制备和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种党参均一多糖CPP1b，主要由鼠李糖、半乳糖、阿拉伯糖及半乳糖醛酸以摩尔百分比为44.28：20.42：11.32：23.97构成，其重均分子量为1.45×10⁵ Da；其主要的糖链为1, 2-连接的鼠李糖（rha,45%), 1,4-连接的半乳糖醛酸(GalA,25%)和1,2,6连接的半乳糖（Gal,30%)。本发明公开的党参均一多糖CPP1b制备方法简单，科学合理，只需经过一次阴离子交换柱色谱就可制备出纯度很高的产品，所制备产物具有抗肿瘤作用，益智作用，具有很高的临床应用价值及保健功能。

Description

党参均一多糖CPP1b及其制备和应用

技术领域

本发明涉及一种植物提取物，具体地，涉及党参均一多糖CPP1b及其制备和应用。

背景技术

党参（Codonopsis pilosula）为桔梗科党参属植物的干燥根，是中国常用的中药，常作为贵重药材人参的替代品。中医认为其具有补中益气、和脾胃、除烦渴之功效。党参多糖是党参中的一种主要成分。Yongxu Sun等人（Yongxu Sun, Jicheng Liu. Structural characterization of a water-soluble polysaccharide from the Roots of Codonopsis pilosula and its immunity activity [J]. International Journal of Biological Macromolecules, 2008, 43: 279-282.）分离出一中性党参多糖并研究其免疫活性，其单糖组成为阿拉伯糖、鼠李糖和半乳糖。Yajun Zhang等人（Yajun Zhang, Lixia Zhang, Jingfeng Yang, Zhongyan Liang. Structure analysis of water-soluble polysaccharide CPPS3 isolated from Codonopsis pilosula [J]. Fitoterapia, 2010, 81: 157-161）分离出的CPPS3也为一中性多糖, 其单糖组成为阿拉伯糖、鼠李糖和半乳糖。

但是关于党参均一多糖CPP1b的研究未见报道。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有的缺陷，提供了一种党参均一多糖CPP1b制备和应用以及它的制备方法和应用。

为了解决上述技术问题，本发明提供了如下的技术方案：

一种党参均一多糖CPP1b，主要由鼠李糖、半乳糖、阿拉伯糖及半乳糖醛酸以摩尔百分比为44.28：20.42：11.32：23.97构成，其重均分子量为1.45×10⁵ Da；其主要的糖链为1, 2-连接的鼠李糖（rha, 45%),  1, 4-连接的半乳糖醛酸(GalA, 25%)和1, 2, 6连接的半乳糖（Gal, 30%)；其结构单元具有以下结构式：

其中， A指3位乙酰氧基取代的半乳糖醛酸，B指3位乙酰氧基取代4位乙酰氨基取代的半乳糖，C和D指鼠李糖，侧链E指阿拉伯糖。

党参均一多糖CPP1b的制备方法，包括以下步骤：

（1）党参多糖CPP1的提取

党参药材粉碎后，经95%乙醇脱脂处理后，于90℃以上温度的热水中进行提取，提取液浓缩后，提取液用终浓度为10-40%乙醇沉淀，过滤，沉淀为粗党参多糖CPP1；

（2）党参均一多糖CPP1b的分离纯化

党参多糖CPP1进行除蛋白、脱色素、透析，冷冻干燥后，将CPP1溶解于蒸馏水中，3000-4000rpm离心5-15min，上清液进行阴离子交换柱色谱（DEAE-Cellulose）纯化，首先用蒸馏水平衡过夜，分别用蒸馏水、含0.1M、0.2M、1M浓度的NaCl溶液洗脱，流速为0.1-12 mL/min，收集0.2M NaCl溶液的洗脱液，以苯酚硫酸法（490nm）进行检测，制备洗脱曲线，合并主峰，浓缩，3500 Da的透析膜透析后，冷冻干燥，得到党参均一多糖CPP1b。

本发明的党参均一多糖CPP1b在制备抗肿瘤药物中的应用。

本发明的党参均一多糖CPP1b在制备辅助抗肿瘤药物中的应用。

本发明的党参均一多糖CPP1b在制备益智药物中的应用。

相关实验：

一、党参均一多糖CPP1b的分子特征及结构分析：

 （1）形状：CPP1b为白色絮状物

（2）分子均一性

 CPP1b的分子均一性由高效体积排阻色谱法测得。高效体积排阻色谱系统包括：Waters 600泵，两根串联色谱柱（UltrahydrogelTM1000、500，7.8（ID）×30.0 cm（L），Waters），示差折光检测器，流动相为超纯水，流速为0.8 mL/min，进样量为10 mL，CPP1b溶解在超纯水中浓度为2 mg/mL，0.45 mm滤膜过滤后进样。CPP1b的重均分子量（Mw）、多分散系数（Mw/ Mn）、均方根旋转半径（RMS）由高效体积排阻色谱与多角度激光散射连用技术（HPSEC-MALLS）分析得到，其系统包括：高效体积排阻色谱系统与上述相同，多角度激光散射仪（Wyatt DAWN-EOS），MALLS光源气体为He和Ne，波长为690nm，流动相为0.9% NaCl+0.2%NaN₃，流速为0.8 mL/min，进样量为10 mL，CPP1b溶解在0.9% NaCl+0.2%NaN₃溶液中浓度为10 mg/mL，0.45 mm滤膜过滤后进样。

   CPP1b的HPSEC色谱图见图2，其重均分子量（Mw）与均方根旋转半径（RMS）的关系图见图3。

   CPP1b的HPSEC色谱图（图2）显示CPP1b为均一对称峰，即为均一多糖分子。CPP1b的重均分子量（Mw）为1.45×105 Da，CPP1b的均方根旋转半径（RMS）为29.7 nm，聚分散系数Mw/Mn为1.20。重均分子量（Mw）对均方根旋转半径（RMS）作图，其斜率可用以评价多糖的分子构象。当斜率梯度为0.3显示为高度分支的聚合物，0.5显示为无规则线团，0.6显示为良好的线性链，测得CPP1b的Rg对Mw作图得到的斜率为0.45±0.04，故CPP1b在0.9% NaCl溶液中呈无规线团。

  （3）CPP1b的单糖组成分析

   采用气相色谱法测定中性单糖组成。称取CPP1b10mg，加入2 M TFA 2 mL,120℃水解3 h，冷却后，减压蒸干，加入甲醇1 mL，蒸干，重复3次，完全除去TFA。分别加入10 mg盐酸羟胺，7 mg 内标肌醇六乙酰酯，0.5 mL吡啶，90 ℃反应30 min，冷却至室温，加入0.5 ml乙酸酐，90 ℃再反应30 min，减压蒸干，溶于0.5 mL氯仿中，即得样品的糖腈乙酸酯衍生物，进行GC（Shimadzu, Japan）分析。GC条件，色谱柱：OV-101，进样量：1 mL程序升温：以15 ℃ /min的速率从175℃升到190℃，保留5min；再以5 ℃ /min的速率升到250℃，保留1.5min。标准品（鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖）混合物按照以上方法处理。

    采用气相色谱法测定酸性单糖组成。称取CPP1b 10 mg，水解（同上），后残渣中加入78 mL （13 mL/mg 酸）0.5 mol/L 碳酸钠。溶液与30℃保持45min，然后加4%的硼氢化钠溶液0.5 mL与室温放置1.5h。滴加25%乙酸至不产生气泡为止（约需6～8滴）以除去多余的硼氢化钠。溶液通过阳离子交换柱，以6 mL水洗脱。洗脱液45℃真空蒸干。分两次加入甲醇（3 mL）蒸干以除去硼酸盐。85℃真空加热2h将糖醛酸转换为内酯。残渣溶于1 mL吡啶中，加入1 mL正丙胺，盖严，55 ℃加热30min。冷却后，再加热至55℃氮气吹干。残渣分别加入0.5 mL吡啶和乙酸酐，95℃加热1 h。GC条件，色谱柱：OV-101，进样量：2 mL；程序升温：160 ℃保留4 min，以5 ℃/min的速率升到190 ℃保留4 min，再以3 ℃/min升到210 ℃保留15 min，以10 ℃/min升到260 ℃保留5 min。标准品（鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖、葡萄糖醛酸及半乳糖醛酸）混合物按照以上方法处理。

    CPP1b中性单糖组成的气相色谱图见图4，结果显示CPP1b主要由鼠李糖、阿拉伯糖及半乳糖组成，其摩尔比为2.59:1.32:1.46。

    CPP1b中酸性单糖组成的气相色谱图见图5，结果显示CPP1b酸性单糖为半乳糖醛酸，其摩尔百分含量为23.97%。

（4） CPP1b元素分析

经元素分析：其C元素摩尔百分含量为24.16%，N元素摩尔百分含量为0.14%，H元素摩尔百分含量为42.34%，O元素摩尔百分含量为33.28%，S元素摩尔百分含量为0.08%。经考马斯亮蓝方法分析CPP1b不含蛋白质。

（5） CPP1b的甲基化分析

A、还原 取干燥的CPP1b溶解于蒸馏水中，加入催化剂（1-cyclohexyl-3-(2-morpholinoethyl) -carbodiimide methyl-p-toluenesulfonate），并用0.1mol/L的HCl调PH至4.75，搅拌1h后加入5 mL含800 mg NaBH₄的水溶液，并用2 mol/L的HCl不断调PH至7.0，反应结束，调PH至4.0。反应溶液在室温下透析过夜（透析袋3500Da），冷冻干燥。将还原的多糖溶解，加入1:9的乙酸甲醇溶液，溶剂完全蒸发，再加入1:9的乙酸甲醇溶液，完全蒸发，重复4次。最后加入0.5 mL甲醇并蒸发，重复2次。

B、甲基化  将还原后CPP1b充分溶于2.5 mL DMSO，置10 mL圆底烧瓶中。然后加入100 mg的氢氧化钠粉末，充氮气，室温下超声10 min（或者90 min），放置90 min。冰浴中滴加1.875 mL（0.75×2.5倍）碘甲烷，约需1min。在室温下超声10 min（或者30 min），放置30 min，加水1 mL终止反应，加入1mol/L HAc中和，透析，冷冻干燥。如此重复三次，经IR检测，即得甲基化的样品。

C、水解  上述甲基化样品中加入88%甲酸5.0 mL，100℃密封水解3 h，减压蒸发至干。加入2 mol/L三氟乙酸2.0 mL，120℃水解3 h，减压蒸发至干。然后加甲醇3.0 mL，再减压蒸发至干，如此重复三次。

D、乙酰化  残渣中加入新配置的0.5 mL硼氢化钠的氨水溶液（硼氢化钠溶解在2 mol/L的氨水中）2.5 mL，60℃反应60 min，加丙酮1.25 mL终止反应，40℃加压蒸干。残渣溶于0.5 mL 18 mol/L的乙酸中，加入2.5 mL乙酸乙酯，然后再加入7.5 mL的乙酸酐，混合后加入0.25 mL 70%高氯酸，充分混合。反应5 min后，冰浴冷却，加入10 mL蒸馏水，再加入0.5 mL 1-甲基咪唑（催化剂），混合，反应5 min。加入二氯甲烷1.5 mL萃取，去二氯甲烷层，GC-MS分析。

GC-MS分析条件，DB-5色谱柱（50 m × 0.25 mm i.d., 膜厚0.25 mm）程序升温：以5 ℃ /min的速率从150℃升到170℃，再以8 ℃ /min的速率升到225℃保留1min，以8 ℃ /min的速率升到250℃保留5min。载气为He，接口温度为250℃，离子源温度为200℃。

甲基化分析结果表明，CPP1b主要连接方式有2位取代的鼠李糖（45%），4位取代的半乳糖（25%）及2,6二位取代的半乳糖（30%）。鉴于CPP1b甲基化之前经过还原反应，故4位取代的半乳糖还原之前应为4位取代的半乳糖醛酸。

（6） CPP1b的超微结构分析

A、透射电镜分析（TEM）  取干燥的CPP1b配制成5 mg/mL的水溶液，吸取10uL进行透射电镜研究。结果显示CPP1b在透射电镜呈卵形颗粒状（见图6）。

B、扫描电镜分析（SEM） 取CPP1b适量，涂在铝条上，喷金一分钟后，进行扫描电镜研究。结果显示CPP1b在扫描电镜下呈光滑的片层结构（见图7）。

C、原子力电镜分析（AFM） 取干燥的CPP1b配制成1 mg/mL的水溶液，吸取5 mL溶液滴在处理后的硅片上，干燥后进行AFM研究（见图8）。结果显示CPP1b在原子力电镜下呈现连撞结构，且直径大约为100 nm。

D、CPP1b的红外光谱（IR）分析

取干燥的CPP1b 2 mg，用KBr压片后用NEXUS 670傅里叶红外光谱仪在4000-400 cm-¹以1 cm^-1分辨率扫描。

CPP1b的红外光谱图见图9。3430.6 cm^-1为典型的-OH伸缩振动峰，2937.2 cm^-1为C-H的伸缩及弯曲振动峰。1743.5 cm^-1、1416 cm^-1、1329.6 cm^-1处的峰说明CPP1b中-COOH的存在。1613 cm^-1为水合物谱带。1200-1000 处cm^-1为多糖类化合物特征谱带，1019-1145 cm^-1吸收峰的出现表面CPP1b中含吡喃糖。764.3 cm^-1说明CPP1b中出现a型吡喃糖。

（7） 核磁共振（NMR）分析

A、1H NMR分析

1H NMR可用于确定多糖中糖残基的糖苷键构型。CPP1b的1H NMR图谱见图10，结果显示：1）在异头区域，出现6个共振信号。2）在高场区，δ 1.08和δ 1.13的共振信号为鼠李糖残基的甲级质子信号。3）13C NMR 1.90 和δ 2.02分别为N-乙酰基和O-乙酰基的甲基质子信号。

B、13C NMR分析

   13C NMR可通过异头碳的共振区（δ 90～100）峰的个数确定糖残基的数量和相对含量。CPP1b的13C NMR图谱见图11，结果显示：1）在异头区域，出现5个共振信号（δ 101.1，δ 101.6，δ 102.0，δ 102.7， δ 102.9），说明CPP1b含有5个糖残基。2）在高场区，δ 19.1和δ 19.3 为鼠李糖残疾的甲基碳信号。3）在低场区，δ 177.7 的强信号归属于半乳糖醛酸的羧基碳信号；δ 173.3 和δ 173.5 分别归属于O-乙酰基的甲基碳信号和N-乙酰基的甲基碳信号。

   C、2D NMR分析

   COSY（化学位移相关谱，1H-1H Chemical shift correlation spectroscopy）能提供糖环中相邻氢核间的耦合关系，CPP1b的COSY图谱见图12。HMQC（异核多量子相关谱，Heteronuclear Multiple Quantum  Correlation）能提供直接相连的13C和1H间的耦合关系，明确归属糖单元中所有直接相连的C-H连接信息，因此对1H进行归属后，可通过HMQC对13C进行归属。CPP1b的HMQC图谱见图13。HMBC （异核多键相关谱，Heteronuclear Multiple Bond Correlation）能够灵敏地提供远程的13C和1H间的耦合关系，此外，HMBC还可作为一种序列分析工具提供糖单元之间的连接位置。CPP1b的HMBC图谱见图14。NOESY(核欧佛豪瑟效应频谱, nuclear Overhauser effect spectroscopy)能提供相邻1H-1H之间的耦合信息，也可作为一种序列分析工具提供糖单元之间的连接位置。CPP1b的NOESY图谱见图15。

综合以上图谱分析，对CPP1b中糖残基的1H和13C的化学位移进行归属，结果如表1和表2所示。

综合CPP1b中多元单糖残基的1H和13C化学位移分析结果，结合单糖组成分析，甲基化分析结果，可推测CPP1b具有如下结构特征：

CPP1b的主链由4)--D-GalpA3Ac，2,6)- -D-Galp3Ac4NAc，2)--L-Rhap ^I，2)--L-Rhap ^II线性连接。其中，4位连接的吡喃型-D-半乳糖醛酸(4)--D-GalpA3Ac）3位被乙酰氧基取代，2,6二位连接的吡喃型-D-半乳糖(2,6)--D-Galp3Ac4NAc）3位被乙酰氧基取代4位被乙酰氨基取代。此外，主链还含有2个吡喃型的-L-鼠李糖残基(2)--L-Rhap ^I和(2)--L- Rhap ^II）。

末端残基吡喃型-L-阿拉伯糖与主链吡喃型-D-半乳糖残基(2,6)--D-Galp3Ac4NAc）的2位相连。

根据以上结构特征，CPP1b可能的一种分子结构如上述所示。

 二、应用实验：

实验1、党参均一多糖CPP1b的抗肿瘤活性研究

本试验采用人肺癌细胞A549测试CPP1b的抗肿瘤活性。A549培养于RPMI 1640培养基、胎牛血FBS（10％）中，培养条件：湿度5% CO₂，温度37℃。采用MTT法检测细胞的增殖活性，取40 mL的细胞母液加无菌去离子水稀释至500 mL（每孔含有细胞5000个）。选取4个浓度梯度，分别为50, 100, 200, 400 mg/mL。采用8mg/mL甲氨蝶呤作阳性对照。空白对照只含培养基、MTT和DMSO。当细胞与样品分别培养24,48h后，加入MTT (5 mg/mL )溶液，培养4h后，每孔加入100 mL DMSO，在570nm Bio-Rad 680酶标仪下检测。CPP1b的抗肿瘤活性结果见图16。

由图16可见，党参均一多糖CPP1b具有明显的抗肿瘤活性。CPP1b各浓度梯度培养24h后抑制率分别46.6%, 48.3%, 51.5%, 61.9%，CPP1b各浓度梯度培养48 h后抑制率分别为 46.8%, 55.8%, 60.3%, 65.4%，具有明显的量效关系。

实验2、党参均一多糖CPP1b的辅助抗肿瘤活性研究

本试验采用人肺癌细胞A549测试CPP1b的辅助抗肿瘤活性。A549培养于RPMI 1640培养基、胎牛血FBS（10％）中，培养条件：湿度5% CO₂，温度37℃。采用MTT法检测细胞的增殖活性，取40 mL的细胞母液加无菌去离子水稀释至500 mL（每孔含有细胞5000个）。CPP1b的辅助抗肿瘤活性为200 mg/mL CPP1b+8mg/mL甲氨蝶呤（MTX），采用8mg/mL甲氨蝶呤作阳性对照。空白对照只含培养基、MTT和DMSO。当细胞与样品分别培养24, 48h后，加入MTT(5 mg/mL )溶液，培养4h后，每孔加入100 mLDMSO，在570nm Bio-Rad 680酶标仪下检测。CPP1b的辅助抗肿瘤活性结果见图16。

   由图16可见，党参均一多糖CPP1b具有明显的辅助抗肿瘤活性。当细胞与200 mg/mL CPP1b+8mg/mL甲氨蝶呤（MTX）培养48h后，其抑制率达79.3%。

实验3、益智实验

党参均一多糖CPP1b的益智作用研究

实验材料及仪器：

1、动物: 选用出生后3周龄的昆明种幼龄小白鼠, 体重14g, 雌雄各半, 购自兰州大学实验动物中心，实验动物合格证号：（甘）2005-0013。

2、药物：CPP1b，阳性药物：小儿智力糖浆（国药准字Z34020580），批号20110916，规格10ml×10支，口服，人剂量为每次30-45ml,氢溴酸东莨菪碱注射液（国药准字H31021519），批号101201，规格0.3mg/ml，上海和丰制药有限公司。

3、实验仪器:WMT-100 Morris水迷宫视频跟踪分析系统(成都泰盟有限公司)

4、动物分组及给药与造模

三周龄的昆明种幼龄小白鼠40只, 体重14±2g, 雌雄各半,适应性喂养1周后， 随机分为4组, 每组10只。分别为第一组：空白对照组，第二组：模型组，第三组：阳性对照组，第四组：CPP1b。

第一组：空白对照组，每天灌胃给予25ml/kg生理盐水。

第二组：模型组，每天灌胃给予25ml/kg生理盐水。

第三组：阳性对照组，每天灌胃给予25ml/kg小儿智力口服液

第四组：CPP1b 组   100mg/kg.d   20mg/ml, 5.0ml/kg体重

第1,2组：空白对照组和模型组灌服(ig)生理盐水,阳性对照组灌服阳性药物：试验药物组（4组） 灌胃给予CPP1b。灌胃量均为0.5ml/20g, 每日1 次, 连续灌服21天。分别在18，19，20天给药1hr后，进行学习记忆训练；第21天给药（末次）1hr后，除空白对照组外，其余各组给予氢溴酸东莨菪碱造模，在进行Morris水迷宫实验前15min 腹腔注射（ip）3mg/kg氢溴酸东莨菪碱，给药体积0.2mL/20g, 每天1次，共4次。

5、Morris水迷宫测试。

水迷宫为一直径0.8m，高0.4m的圆形水池，池内水深0.2m。水池按方位平均分为4个象限，在一个象限内置一直径0.04m、高0.18m的逃逸平台，逃逸平台没于水面下0.02m．测试时，水温保持在2l℃左右，水用奶粉染成乳白色以隐蔽逃逸平台。实验过程中水池及周围环境保持不变。

学习记忆训练方法：给药后1hr进行训练，2次／d，间隔10min，每次分别从不同入水点将小鼠面向容器壁放入放入Morris水迷宫中，小鼠找到并爬上平台后，让其停留20s，若入水后120s未找到平台者，将其引致平台，放置20s引导其学习与记忆。记录小鼠入水后爬上平台所用的时间，将三天训练的平均结果作为小鼠初始学习记忆情况的指标。

测定方法：具体实验过程中，实验各组分别先取1只小鼠给予氢溴酸东莨菪碱造模，平行操作。待各组第一只水迷宫实验结束后，再给每组第二只小鼠注射，依次类推。各动物于造模后30min进行水迷宫测试。1次／d，从固定入水点将小鼠面向容器壁放入放入Morris水迷宫中进行测试，共测定3天。此次不再对其进行引导。记录小鼠入水后爬上平台所用的时间（潜伏期）作为检测小鼠对空间和线索的学习指标。入水后120s未找到平台者，潜伏期记为120s。

6、数据统计：数据以表示。采用SPSS13.0软件进行单因素方差分析，t检验进行组间比较。P<0.05表示具有显著性差异。

7、结果

Morris水迷宫实验

随着训练次数的增加，各组小鼠找到平台的潜伏期逐渐缩短，在造模前补肾健脑各组平均潜伏期与空白对照组和阳性组及模型组相比，均没有显著性差异。见表3。造模后第一天和造模前各组潜伏期比较发现，除空白对照组外，造模后各组潜伏期明显高于造模前。造模后CPP1b与模型组比较潜伏期明显缩短。见表4和图17及图18。

阿尔茨海默病(Alzheimer′s disease , AD)是一种中枢神经系统原发性退行性疾病，患者智力、记忆力及认知功能进行性降低,最终丧失思考、说话及活动能力。由于直接对人体进行抗AD 的研究目前尚有许多限制，模拟AD 的动物痴呆模型对于AD 治疗药物的筛选和发病机制的探讨至关重要。东莨菪碱通过阻断脑内M 受体干扰记忆和认知功能,现已广泛用于动物实验中建立动物认知功能损伤的AD 模型，以验证药物的作用。

本研究利用每日腹腔注射（ip）3mg/kg氢溴酸东莨菪碱造成长时小鼠学习记忆障碍，实验结果，CPP1b能够在一定范围内改善东莨菪碱模型小鼠的空间学习记忆能力。

本发明具有以下有益效果：

1.是从党参中发现的一种新的酸性均一多糖，经阴离子交换柱色谱（DEAE-Cellulose）纯化可得到该多糖，来源于党参，因党参分布广泛，获得途径方便快捷。

2.本发明的均一党参多糖CPP1b是一种新的酸性均一多糖，该产品可进一步进行衍生化如硫酸酯化或硒酸化衍生出该产品的衍生物。

3.本法简单，科学合理，只需经过一次阴离子交换柱色谱就可制备出纯度很高的产品。

4.本发明的党参均一多糖CPP1b具有抗肿瘤作用，益智作用，具有很高的临床应用价值及保健功能。

附图说明

附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：

   图1为本发明党参均一多糖CPP1b的阴离子交换色谱图。

图2为本发明党参均一多糖CPP1b的高效体积排阻色谱图。

图3为本发明党参均一多糖CPP1b的重均分子量（Mw）与均方根旋转半径（RMS）的关系图。

图4为本发明党参均一多糖CPP1b的中性单糖气相色谱图。

图5为本发明党参均一多糖CPP1b的酸性单糖气相色谱图。

图6为本发明党参均一多糖CPP1b的透射电镜图。

图7为本发明党参均一多糖CPP1b的扫描电镜图。

图8为本发明党参均一多糖CPP1b的原子力显微电镜图。

图9为本发明党参均一多糖CPP1b的红外光谱图。

图10为本发明党参均一多糖CPP1b的1D 1H NMR图。

图11为本发明党参均一多糖CPP1b的1D 13C NMR图。

图12为本发明党参均一多糖CPP1b的COSY图。

图13为本发明党参均一多糖CPP1b的HMQC图。

图14为本发明党参均一多糖CPP1b的HMBC图。

图15为本发明党参均一多糖CPP1b的NOESY图。

图16为本发明党参均一多糖CPP1b的抗肿瘤及辅助抗肿瘤活性结果。

图17 党参均一多糖CPP1b对小鼠学习记忆的影响。

图18 造模前后各组实验动物潜伏期的变化。

具体实施方式

产品实施例

党参均一多糖CPP1b，主要由鼠李糖、半乳糖、阿拉伯糖及半乳糖醛酸以摩尔百分比为44.28：20.42：11.32：23.97构成，其重均分子量为1.45×10⁵ Da；其主要的糖链为1, 2-连接的鼠李糖（rha, 45%),  1, 4-连接的半乳糖醛酸(GalA, 25%)和1, 2, 6连接的半乳糖（Gal, 30%)；其结构单元具有以下结构式：

其中， A指3位乙酰氧基取代的半乳糖醛酸，B指3位乙酰氧基取代4位乙酰氨基取代的半乳糖，C和D指鼠李糖，侧链E指阿拉伯糖。

制备实施例

实施例1

党参均一多糖CPP1b的制备方法，包括以下步骤：

 (1)党参粗多糖的制备

取党参药材（采于甘肃文县），粉碎，用95%乙醇回流脱脂，药渣干燥后，称重，用9倍量的水94℃提取4次，每次2 h，过滤，合并滤液，离心后减压浓缩，搅拌下加入95%的乙醇使乙醇浓度达到30%，4～8℃静置过夜，离心（4000 rmp，10 min），收集沉淀，冷冻干燥。采用Savag法除蛋白和过氧化氢法脱色素，浓缩至一定的体积，加乙醇使最终浓度达到80%，去上清，沉淀冷冻干燥得党参粗多糖CPP1。

(2)党参均一多糖CPP1b的分离纯化

将党参粗多糖溶解于一定蒸馏水中溶解于水中，流水透析24h，再蒸馏水透析24h（透析袋截留分子量为3500Da），冷冻干燥。将透析后党参粗多糖溶解于一定蒸馏水中，离心后上阴离子交换柱色谱DEAE-Cellulose（2.6×70 cm），交换柱先用蒸馏水平衡过夜，分别用蒸馏水、0.1M、0.2M、1M不同浓度NaCl溶液洗脱，流速为5 mL/12min，每管收集5 mL，以苯酚硫酸法（490nm）进行检测，以管号为横坐标，吸光度值为纵坐标，作曲线，根据曲线合并洗脱液收集0.2M NaCl溶液的洗脱液（CPP1b的阴离子交换色谱图见图1），浓缩，透析后冷冻干燥得均一多糖CPP1b。

实施例2

党参均一多糖CPP1b的制备方法，包括以下步骤：

 (1)党参粗多糖的制备

取党参药材（采于甘肃文县），粉碎，用95%乙醇回流脱脂，药渣干燥后，称重，用20倍量的水90℃提取4次，每次1h，过滤，合并滤液，离心后减压浓缩，搅拌下加入95%的乙醇使乙醇浓度达到20%，4～8℃静置过夜，离心（3000 rmp，15min），收集沉淀，冷冻干燥。采用Savag法除蛋白和过氧化氢法脱色素，浓缩至一定的体积，加乙醇使最终浓度达到80%，去上清，沉淀冷冻干燥得党参粗多糖CPP1。

(2)党参均一多糖CPP1b的分离纯化

将党参粗多糖溶解于一定蒸馏水中溶解于水中，流水透析24h，再蒸馏水透析24h（透析袋截留分子量为3500Da），冷冻干燥。将透析后党参粗多糖溶解于一定蒸馏水中，离心后上阴离子交换柱色谱DEAE-Cellulose（2.6×70 cm），交换柱先用蒸馏水平衡过夜，分别用蒸馏水、0.1M、0.2M、1M不同浓度NaCl溶液洗脱，流速为10mL/12min，每管收集5 mL，以苯酚硫酸法（490nm）进行检测，以管号为横坐标，吸光度值为纵坐标，作曲线，根据曲线合并洗脱液收集0.2M NaCl溶液的洗脱液（CPP1b的阴离子交换色谱图见图1），浓缩，透析后冷冻干燥得均一多糖CPP1b。

实施例3

党参均一多糖CPP1b的制备方法，包括以下步骤：

(1)党参粗多糖的制备

取党参药材（采于甘肃文县），粉碎，用95%乙醇回流脱脂，药渣干燥后，称重，用10倍量的水90℃提取3次，每次2h，过滤，合并滤液，离心后减压浓缩，搅拌下加入95%的乙醇使乙醇浓度达到35%，4～8℃静置过夜，离心（4000 rmp，10min），收集沉淀，冷冻干燥。采用Savag法除蛋白和过氧化氢法脱色素，浓缩至一定的体积，加乙醇使最终浓度达到80%，去上清，沉淀冷冻干燥得党参粗多糖CPP1。

(2)党参均一多糖CPP1b的分离纯化

将党参粗多糖溶解于一定蒸馏水中溶解于水中，流水透析24h，再蒸馏水透析24h（透析袋截留分子量为3500Da），冷冻干燥。将透析后党参粗多糖溶解于一定蒸馏水中，离心后上阴离子交换柱色谱DEAE-Cellulose（2.6×70 cm），交换柱先用蒸馏水平衡过夜，分别用蒸馏水、0.1M、0.2M、1M不同浓度NaCl溶液洗脱，流速为12mL/12min，每管收集5 mL，以苯酚硫酸法（490nm）进行检测，以管号为横坐标，吸光度值为纵坐标，作曲线，根据曲线合并洗脱液收集0.2M NaCl溶液的洗脱液（CPP1b的阴离子交换色谱图见图1），浓缩，透析后冷冻干燥得均一多糖CPP1b。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种党参均一多糖CPP1b，其特征在于，主要由鼠李糖、半乳糖、阿拉伯糖及半乳糖醛酸以摩尔百分比为36.67：20.67：18.69：23.97构成，其重均分子量为1.45×10⁵ Da；其主要的糖链为1, 2-连接的45%的鼠李糖, 1, 4-连接的25%的半乳糖醛酸和1，2，6连接的30%的半乳糖；其结构单元具有以下结构式：

其中， A指3位乙酰氧基取代的半乳糖醛酸，B指3位乙酰氧基取代4位乙酰氨基取代的半乳糖，C和D指鼠李糖，侧链E指阿拉伯糖。

2.权利要求1所述的党参均一多糖CPP1b的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）党参多糖CPP1的提取

党参药材粉碎后，经95%乙醇脱脂处理后，于90℃以上温度的热水中进行提取，提取液浓缩后，提取液用终浓度为10-40%乙醇沉淀，过滤，沉淀为粗党参多糖CPP1；

（2）党参均一多糖CPP1b的分离纯化

党参多糖CPP1依次进行除蛋白、脱色素、透析，冷冻干燥后，将CPP1溶解于蒸馏水中，3000-4000rpm离心5-15min，上清液进行DEAE-Cellulose阴离子交换柱色谱纯化，首先用蒸馏水平衡过夜，分别用蒸馏水、0.1M、0.2M、1M不同浓度的NaCl溶液洗脱，流速为5mL/12min或10mL/12min或12mL/12min，每管收集5 mL，在490nm以苯酚硫酸法进行检测，以管号为横坐标，吸光度值为纵坐标，作曲线，根据曲线合并洗脱液收集0.2M NaCl溶液的洗脱液，浓缩，透析后冷冻干燥得均一多糖CPP1b。

3.权利要求1所述的党参均一多糖CPP1b在制备抗肿瘤药物中的应用。

4.权利要求1所述的党参均一多糖CPP1b在制备辅助抗肿瘤药物中的应用。

5.权利要求1所述的党参均一多糖CPP1b在制备益智药物中的应用。