CN103140227B - 制备微管蛋白细胞溶素的方法 - Google Patents

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Abstract

微管蛋白细胞溶素是一系列天然存在的细胞毒剂，其作为抗癌治疗剂具有重要意义。本发明描述用于制备天然存在的和非天然存在的微管蛋白细胞溶素及其类似物和衍生物的方法和中间体。

Description

制备微管蛋白细胞溶素的方法
相关申请的交叉参考
本申请依据35 U.S.C. § 119(e)，要求2010年8月6日提交的美国临时申请系列号61/371,433的优先权，该公开的全部内容结合到本发明中作为参考。
技术领域
本文描述的本发明涉及制备微管蛋白细胞溶素(tubulysins)的方法。
发明背景和概述
微管蛋白细胞溶素是从粘细菌菌种中分离出来的一类新的天然产物的成员(F. Sasse, et al., J. Antibiot. 2000, 53, 879-885)。作为细胞骨架影响剂(interacting agents)，微管蛋白细胞溶素是有丝分裂毒剂，其抑制微管蛋白聚合并导致细胞周期停滞和细胞凋亡(H. Steinmetz, et al., Chem. Int. Ed. 2004, 43, 4888-4892；M. Khalil, et al., ChemBioChem. 2006, 7, 678-683；G. Kaur, et al., Biochem. J. 2006, 396, 235-242)。微管蛋白细胞溶素是非常有效的细胞毒性分子，超过任何临床相关的传统化学疗法的细胞生长抑制作用，例如埃博霉素(epothilones)、紫杉醇(paclitaxel)和长春碱。此外，它们对抗对多种药物具有抗药性的细胞系是有效的(A. Dömling, et al., Mol. Diversity 2005, 9, 141-147)。这些化合物对一组癌细胞系(a panel of cancer cell lines)显示出高的试验细胞毒性，其具有低皮摩尔范围内的IC50值；因此，它们作为潜在的抗癌治疗剂具有重要意义。
本文描述微管蛋白细胞溶素。在结构上，微管蛋白细胞溶素通常包括线形tetrapeptoid骨架，包括具有下式T的示例性化合物及其药学上可接受的盐；
(T)
其中
Ar1是任选取代的芳基；
R1是氢、烷基、芳基烷基或形成前体药物的基团；
R2选自任选取代的烷基和任选取代的环烷基；
R4是任选取代的烷基或任选取代的环烷基；
R3是任选取代的烷基；
R5和R6各自独立地选自任选取代的烷基和任选取代的环烷基；
R7是任选取代的烷基；和
n是1、2、3或4。
本文所述的另一组示例性微管蛋白细胞溶素更特别由一或多个非天然存在的或疏水性氨基酸片段组成，如N-甲基哌可酸(Mep)、异亮氨酸(Ile)、
缬氨酸微管蛋白(Tubuvalin) (Tuv)、
、
酪氨酸微管蛋白(tubutyrosine) (Tut，酪氨酸的类似物)
、
苯丙氨酸微管蛋白(tubuphenylalanine) (Tup，苯丙氨酸的类似物)，
以及上述各个化合物的类似物和衍生物。更有效的天然存在的微管蛋白细胞溶素的分子结构中的一个常见特征是酸和/或碱敏感的N-酰氧基甲基取代基(或者甲醛的N,O-缩醛)，其由式(T)中的R2-C(O)代表。
本文所述的另一组示例性微管蛋白细胞溶素是那些具有式1的化合物。
式1，
几个天然微管蛋白细胞溶素的结构
已有报导具有C-末端苯丙氨酸微管蛋白(tubuphenylalanine) (RA=H)的微管蛋白细胞溶素D的全合成(H. Peltier, et al., J. Am. Chem. Soc. 2006, 128, 16018-16019)。近来有报导对微管蛋白细胞溶素B (RA=OH)合成的改良性合成方案(O. Pando, et at., Org. Lett. 2009, 11, 5567-5569)。但是，试图按公布的程序来提供较大量的微管蛋白细胞溶素并没有成功，部分由低收率所妨碍，很难除去杂质，这需要高成本的色谱分离步骤，和/或缺乏几个步骤的重现性。采用微管蛋白细胞溶素作为抗癌治疗剂的关键重点是需要可靠和有效的方法来制备微管蛋白细胞溶素及其类似物和衍生物。本文描述制备天然微管蛋白细胞溶素或其类似物或衍生物(包括式(T)和式(1)化合物)的改进方法。
在本发明的一示例性实施方案中，本文描述天然微管蛋白细胞溶素或其类似物或衍生物(包括式(T)和式(1)化合物)的制备方法。所述方法包括本文所述的一或多个步骤。在另一实施方案中，描述一种制备式B化合物的方法，其中R5和R6按本文各实施方案中所述，例如各自独立地选自任选取代的烷基或任选取代的环烷基；和R8是C1-C6正烷基；其中所述方法包括在非质子溶剂中，将式A化合物用甲硅烷基化剂(如三乙基甲硅烷基氯)和碱(如咪唑)处理的步骤。
应理解的是R5和R6可各自包括在所述任选的取代基上的常规保护基。
在另一实施方案中，描述一种制备式C化合物的方法，其中R5和R6按本文各实施方案中所述，例如各自独立地选自任选取代的烷基或任选取代的环烷基；R8是C1-C6正烷基；和R2按本文各实施方案中所述，如选自任选取代的烷基或任选取代的环烷基；其中所述方法包括在低于室温的温度下，如约-78℃至约0℃的范围内，在非质子溶剂中，将式B化合物用式ClCH2OC(O)R2化合物处理的步骤；其中式ClCH2OC(O)R2化合物与式B化合物的摩尔比为约1-约1.5。
应理解的是R2、R5和R6可各自包括在所述任选的取代基上的常规保护基。
在另一实施方案中，描述一种制备式D化合物的方法，其中R5和R6按本文各实施方案中所述，例如选自任选取代的烷基或任选取代的环烷基；R8是C1-C6正烷基；R2按本文各实施方案中所述，如选自任选取代的烷基或任选取代的环烷基；和R7是任选取代的烷基；其中所述方法以下步骤：
a) 由式E化合物制备式(E1)化合物，其中X1是离去基团；和
b) 在还原条件下，在式E1化合物存在下，处理式C化合物。
应理解的是R2、R5、R6和R7可各自包括在所述任选的取代基上的常规保护基。
在另一实施方案中，描述一种制备式F化合物的方法，其中R5和R6按本文各实施方案中所述，例如选自任选取代的烷基或任选取代的环烷基；R2按本文各实施方案中所述，如选自任选取代的烷基或任选取代的环烷基；和R7是任选取代的烷基；其中所述方法包括将式D化合物用水解酶处理的步骤。
应理解的是R2、R5、R6和R7可各自包括在所述任选的取代基上的常规保护基。
在另一实施方案中，描述一种制备式G化合物的方法，其中R5和R6按本文各实施方案中所述，例如选自任选取代的烷基或任选取代的环烷基；R2按本文各实施方案中所述，如选自任选取代的烷基或任选取代的环烷基；和R7是任选取代的烷基；其中所述方法包括将化合物F的甲硅烷基醚用非碱性含氟试剂处理的步骤。
应理解的是R2、R5、R6和R7可各自包括在所述任选的取代基上的常规保护基。
在另一实施方案中，描述一种制备式H化合物的方法，其中R5和R6按本文各实施方案中所述，例如选自任选取代的烷基或任选取代的环烷基；R2和R4按本文各实施方案中所述，如选自任选取代的烷基或任选取代的环烷基；和R7是任选取代的烷基；其中所述方法包括将式G化合物用式R4C(O)X2的酰化剂处理的步骤，其中X2是离去基团。
应理解的是R2、R4、R5、R6和R7可各自包括在所述任选的取代基上的常规保护基。
在另一实施方案中，描述一种制备式(T)化合物的方法，其中Ar1是任选取代的芳基；R1是氢、任选取代的烷基、任选取代的芳基烷基或形成前体药物的基团；R5和R6按本文各实施方案中所述，例如选自任选取代的烷基或任选取代的环烷基；R3是任选取代的烷基；R2和R4按本文各实施方案中所述，例如选自任选取代的烷基或任选取代的环烷基；和R7是任选取代的烷基；其中所述方法包括由式H化合物形成活性酯中间体；和使所述活性酯中间体与式I化合物反应，得到式T化合物的步骤。
应理解的是Ar1、R1、R2、R4、R5、R6和R7可各自包括在所述任选的取代基上的常规保护基。
发明详述
在一实施方案中，描述一种制备式B化合物的方法，其中R5和R6按本文各实施方案中所述，例如选自任选取代的烷基或任选取代的环烷基；和R8是C1-C6正烷基；其中所述方法包括在非质子溶剂中，将式A化合物用三乙基甲硅烷基氯和咪唑处理的步骤。
在先前报导的中间体式2的甲硅烷基醚的制法中，描述使用大过量的三氟甲基磺酸三乙基甲硅烷基酯(TESOTf)和二甲基吡啶(参见例如Peltier, et al., 2006)。发现所述报导的方法必须使反应的产物进行色谱纯化的步骤。与所报导的相反，本文已惊奇地发现可使用活性较弱的试剂TESCl。本文还惊奇地发现虽然TESCl是活性较弱的试剂，但可将其以近于化学计量的量用于本文所述的方法中。在此应理解的是当较大规模进行所述方法时，使用活性较弱的TESCl也是有优势的，而活性较高的试剂可能代表一种安全问题。还已发现使用近似化学计量的量的TESCl能使得色谱纯化步骤变得不再必要。在一可替换的实施方案中，进行所述方法而不必进行随后的纯化。在前述实施方案的另一可替换方案和本文所述的各个其它实施方案中，R5是异丙基。在前述实施方案的另一可替换方案和本文所述的各个其它实施方案中，R6是仲丁基。在前述实施方案的另一可替换方案和本文所述的各个其它实施方案中，R8是甲基。在前述实施方案的另一可替换方案和本文所述的各个其它实施方案中，所述甲硅烷基醚是TES。
在本文所述方法的一示例性实例中，描述一种以高收率制备甲硅烷基醚2的方法，其中将化合物1用1.05当量的TESCl和1.1当量的咪唑处理。
在前述实例的一个可替换实例中，化合物2不经色谱纯化。
在另一实施方案中，描述一种制备式C化合物的方法，其中R5和R6各自独立地选自任选取代的烷基或任选取代的环烷基；R8是C1-C6正烷基；和R2选自任选取代的烷基或任选取代的环烷基；其中所述方法包括在约-78℃至约0℃的温度下，在非质子溶剂中，将式B化合物用约1-约1.5当量的碱和约1-约1.5当量的式ClCH2OC(O)R2化合物处理的步骤。
在另一实施方案中，描述上述实施方案的方法，其中式B和C化合物具有下列流程对B’和C’中所示的立体化学。
在另一示例性实施方案中，描述上述实施方案中任一项的方法，其中使用约1-约1.3当量的式ClCH2OC(O)R2的化合物。在另一示例性实施例中，描述上述实施方案中任一项的方法，其中使用约1.2当量的式ClCH2OC(O)R2的化合物。在另一示例性实施方案中，描述上述实施方案中任一项的方法，其中R2是正丙基。在前述实施方案的另一替换方案和此处所述的各个其它实施方案中，R2是CH2CH(CH3)2、CH2CH2CH3、CH2CH3、CH=C(CH3)2或CH3。
在本文所述方法的一示例性实例中，描述一种制备N,O-缩醛3的方法。在另一示例性实例中，在约-45℃下，在非质子溶剂中，将化合物2用1.1当量的六甲基二硅氮烷钾(KHMDS)和1.2当量的丁酸氯甲酯处理。在另一示例性实例中，可使用任何前述实施例所形成的产物，而不必进行色谱纯化。
在另一实施方案中，描述一种制备式D化合物的方法，其中R5和R6各自独立地选自任选取代的烷基和环烷基；R8是C1-C6正烷基；R2选自任选取代的烷基和环烷基；和R7是任选取代的烷基；其中所述方法包括以下步骤：
a) 由式E化合物制备式(E1)化合物，其中X1是离去基团；和
b) 在还原条件下，用式E1化合物处理式C化合物。
在一示例性实施例中，使用H2和披钯碳催化剂(Pd/C)，将化合物3和D-N-甲基-哌可酸(pipecolic acid)的五氟苯基酯的混合物还原生成化合物4。本文已发现哌可酸的活性酯的差向异构化可出现在反应过程中或其制备过程中或在上述报导的反应条件下的还原过程中。例如，在较大规模重复那些报导的方法中，与先前报导指出的不发生差向异构化相反(例如参见Peltier, 2006)，本文发现形成了显著量的差向异构化的化合物。另外，本文发现使用所报导的方法，形成了显著量的经所述丁酰基重排形成的化合物8的重排产物。最后，本文发现使用先前报导的方法得到所要求产物的一般收率仅为所报导的大约一半。本文已发现使用二异丙基碳二亚胺(DIC)和短的反应时间能减少差向异构化反应得到的不需要的副产物和重排反应得到的副产物二者的量。在前述实施方案的另一替换方案中，和此处所述的各个其它实施方案中，n是3。在前述实施方案的另一替换方案中，和此处所述的各个其它实施方案中，R7是甲基。
在一示例性实施例中，发现将制备D-N-甲基-哌可酸五氟苯基酯的反应时间限制在约1小时能减少立体异构体三肽9的形成。还已发现使用干燥的10% Pd/C作为催化剂，而非使用更常用的湿或潮湿催化剂，能减少还原期间形成的差向异构体9的量。还已发现使用干燥的10% Pd/C和/或缩短反应时间也能减少重排酰胺8的形成。
先前已有报导从仲羟基中除去保护基得到所要求产物5和环状O,N-缩醛副产物的不可分离的混合物，如以下流程中所示。
另外，在重复所报导的方法中，本文发现使用碱性条件除去甲基酯，接着乙酰化所述羟基能形成另外的先前未报导的副产物iso-7。这种另外的副产物很难检测并且很难从所要求的化合物7中分离出来。不受理论的束缚，本文认为iso-7源于所述丁酸酯基团由N-羟甲基重排为仲羟基，如下所示。
已发现在所述仲羟基上引入R4CO后，重新调整(reordering)两个脱保护步骤顺序并对各脱保护反应使用不同的条件能改善式H化合物的收率，例如化合物7，如以下详述的。
在另一实施方案中，描述一种制备式F化合物的方法，其中R5和R6各自独立地选自任选取代的烷基和任选取代的环烷基；R2选自任选取代的烷基和任选取代的环烷基；和R7是任选取代的烷基；其中所述方法包括将式D化合物用水解酶处理的步骤。
在另一实施方案中，其中处理步骤的前述过程包括将在水可混溶的溶剂中的化合物D的溶液加入到含有水解酶的缓冲溶液中，以使所述酯沉淀最小化的速率加入。在另一实施方案中，加入酯的时间为约24小时至约100小时。在另一实施方案中，加入酯的时间为约48小时至约100小时。在前述实施方案的另一替换方案中，和此处所述的各个其它实施方案中，R8是甲基。在另一实施方案中，描述其中水解酶是酯酶的前述实施方案中任何一个的实施方案。在另一实施方案中，描述其中酯酶是猪肝酯酶的前述实施方案中任何一个的实施方案。
在一示例性实施例中，用90小时的时间，将化合物4的二甲亚砜(DMSO)溶液加入到猪肝酯酶的缓冲溶液中。在另一示例性实例中，所述缓冲液是磷酸盐缓冲液。在另一示例性实施例中，所述酶溶液的pH值为6.5-8.5。在另一示例性实施例中，所述酶溶液的实例的pH值为7.4-7.8。应理解的是使用的缓冲物质可以是任何与用于除去所述酯的水解酶相容的缓冲物质。
在另一实施方案中，描述一种制备式G化合物的方法，其中R5和R6各自独立地选自任选取代的烷基和任选取代的环烷基；R2选自任选取代的烷基和任选取代的环烷基；和R7是任选取代的烷基；其中所述方法包括将式F化合物的甲硅烷基醚用非碱性氟化物试剂处理的步骤。本文已发现使用碱性条件可导致副产物的生成，该副产物由酯基重排生成化合物G’而产生。
在一示例性实施例中，在对应的醇6’的制备中，将化合物6用Et3N•3HF处理以裂解TES-醚。应该理解，其它裂解化合物F的甲硅烷基醚的非碱性氟化物试剂可用于本文所述的方法和过程中，包括但不限于吡啶•HF等，以裂解TES-醚。
在另一实施方案中，描述一种制备式H化合物的方法，其中R5和R6各自独立地选自任选取代的烷基和任选取代的环烷基；R2和R4独立地选自任选取代的烷基和任选取代的环烷基；和R7是任选取代的烷基；其中所述方法包括将式G化合物用式R4C(O)X2的酰化剂处理的步骤，其中X2是离去基团。应理解的是所得到的产物可包含不同量的化合物H和R4CO2H的混酐。在另一实施方案中，以上实施方案中所述的方法还包括将反应产物用水处理以制备不含或基本不含酸酐的H的步骤。在另一实施方案中，描述其中X2是R4CO2的以上实施方案的方法。在另一实施方案中，描述其中R4是C1-C4烷基的以上实施方案中任何一项的方法。在前述实施方案的另一替换方案中，和此处所述的各个其它实施方案中，R4是甲基。在另一实施方案中，描述其中R6是仲丁基的以上实施方案中任何一项的方法。在另一实施方案中，描述其中R7是甲基的以上实施方案中任何一项的方法。在另一实施方案中，描述其中R5是异丙基的以上实施方案中任何一项的方法。
在一示例性实施方案中，将化合物6’用乙酸酐在吡啶中处理。本文已发现缩短该方法的步骤的时间可通过限定形成先前未描述的其它酰化副产物(如式7a)的量，来改善化合物H的收率。应理解的是得到的产物可含有不同量的7和乙酸的混酐。在另一实施方案中，将上述步骤得到的反应产物用水在二氧六环中处理，生成化合物7，其不含或基本不含酸酐。应清楚的是在中间体混酐的水解中，可用其它溶剂代替二氧六环。或者，该步骤可不用溶剂进行。
在另一实施方案中，描述一种制备微管蛋白细胞溶素T的方法，其中Ar1是任选取代的芳基；R1是氢、烷基、芳基烷基或形成前体药物的基团；R5和R6各自独立地选自任选取代的烷基和任选取代的环烷基；R3是任选取代的烷基；R2和R4独立地选自任选取代的烷基和任选取代的环烷基；和R7是任选取代的烷基；其中该方法包括以下步骤：
c) 由式H化合物形成活性酯中间体；和
d) 使所述活性酯中间体与式I化合物反应。
本文已发现当将I的游离酸(其中R1是氢)按先前报导用于该步骤中时，可使所要求的产物T与另外的氨基酸I反应以形成聚氨基酸副产物，该副产物含有在先前未见报道的副反应中的所述氨基酸I的多种复制品。本文还已发现在加入化合物I之前除去过量的活性酯形成剂，可减少或消除该副反应至可接受的水平。在一实施方案中，将化合物H用过量的活性酯形成剂和五氟苯酚处理而形成化合物H的五氟苯酚酯，接着在加入化合物I之前除去过量的活性酯形成剂。在前述实施方案的另一替换方案中，和此处所述的各个其它实施方案中，Ar1是苯基。在前述实施方案的另一替换方案和此处所述的各个其它实施方案中，Ar1是取代的苯基。在前述实施方案的另一替换方案和此处所述的各个其它实施方案中，Ar1是4-取代的苯基。在前述实施方案的另一替换方案和此处所述的各个其它实施方案中，Ar1是RA-取代的苯基。在前述实施方案的另一替换方案和此处所述的各个其它实施方案中，Ar1是4-羟基苯基或其羟基被保护的形式。在前述实施方案的另一替换方案和此处所述的各个其它实施方案中，R3是甲基。在前述实施方案的另一替换方案和此处所述的各个其它实施方案中，R1是氢。
在一示例性实施方案中，将化合物7用过量的聚合物形式的碳二亚胺和五氟苯酚处理，形成7的五氟苯酯，经过滤除去聚合的碳二亚胺；然后将氨基酸(S)-tubutyrosine加入到溶液中，得到微管蛋白细胞溶素B。在另一实施方案中，描述其中所述聚合的碳二亚胺是聚苯乙烯-CH2-N=C=N-环己烷(PS-DCC)的上述实施方案中任何一项的方法。
在另一实施方案中，描述具有式D的化合物，其中该化合物不含或基本不含有具有式C-1的化合物，其中R2、R5、R6、R7和R8按本文所述的任何实施方案中所述。不受理论的束缚，本文认为化合物C-1由对应的化合物C通过酰基转移形成。
在另一实施方案中，描述化合物4，其不含或基本不含化合物8和/或化合物9。在另一实施方案中，形成光学纯形式的化合物4。
在另一实施方案中，描述化合物H，其中化合物H不含或基本不含具有式噁嗪-2的化合物。
在另一实施方案中，描述化合物F，其中R2、R5、R6、R7和R8按本文所述的任何实施方案中所述。
在另一实施方案中，描述具有式6的化合物。
在另一实施方案中，描述化合物G，其中该化合物不含或基本不含化合物G’，其中R2、R5、R6和R7按本文所述的任何实施方案中所述。
在另一实施方案中，描述化合物6’，其中化合物6’不含或基本不含以下所示的G’异构体。
在另一实施方案中，描述化合物7，其中化合物7不含或基本不含下述的化合物7a。
在另一实施方案中，描述化合物H，其中R4是Me，R2、R5、R6和R7按本文所述的任何实施方案中所述；并且化合物H不含或基本不含其中R4和R2都是Me的化合物H。
在前述实施方案的另一替换方案和此处所述的各个其它实施方案中，R5是异丙基。
在前述实施方案的另一替换方案和此处所述的各个其它实施方案中，R6是仲丁基。
在前述实施方案的另一替换方案和此处所述的各个其它实施方案中，R8是甲基。
在前述实施方案的另一替换方案和此处所述的各个其它实施方案中，R2是CH2CH(CH3)2、CH2CH2CH3、CH2CH3、CH=C(CH3)2或CH3。
在前述实施方案的另一替换方案和此处所述的各个其它实施方案中，n是3。
在前述实施方案的另一替换方案和此处所述的各个其它实施方案中，R7是甲基。
在前述实施方案的另一替换方案和此处所述的各个其它实施方案中，R8是甲基。
在前述实施方案的另一替换方案和此处所述的各个其它实施方案中，R4是甲基。
在前述实施方案的另一替换方案和此处所述的各个其它实施方案中，Ar1是苯基。在前述实施方案的另一替换方案和此处所述的各个其它实施方案中，Ar1是取代的苯基。在前述实施方案的另一替换方案和此处所述的各个其它实施方案中，Ar1是4-取代的苯基。在前述实施方案的另一替换方案和此处所述的各个其它实施方案中，Ar1是RA-取代的苯基。在前述实施方案的另一替换方案和此处所述的各个其它实施方案中，Ar1是4-羟基苯基或其羟基被保护的形式。
在前述实施方案的另一替换方案和此处所述的各个其它实施方案中，R3是甲基。
在前述实施方案的另一替换方案和此处所述的各个其它实施方案中，R1是氢。
本发明的示例性实施方案通过下列列举的条款进一步说明：
1. 一种制备下式化合物或其药学上可接受的盐的方法，
其中Ar1是任选取代的芳基；R1是氢、烷基、芳基烷基或形成前体药物的基团；R2选自任选取代的烷基和任选取代的环烷基；R3是任选取代的烷基；R4是任选取代的烷基或任选取代的环烷基；R5和R6各自独立地选自任选取代的烷基和任选取代的环烷基；R7是任选取代的烷基；和n是1、2、3或4；其中该方法包括：在非质子溶剂中，将式A化合物用三乙基甲硅烷基氯和咪唑处理的步骤，其中R8是C1-C6非支链烷基
；
或者在温度约-78℃至约0℃下，在非质子溶剂中，将式B化合物用碱和式ClCH2OC(O)R2化合物处理的步骤；其中式ClCH2OC(O)R2化合物与式B化合物的摩尔比为约1-约1.5，其中R8是C1-C6非支链烷基
；
或者以下步骤a) 由式E化合物制备式(E1)化合物，其中X1是离去基团
；
和b) 在还原条件下，在式E1化合物的存在下，处理式C化合物，其中R8是C1-C6非支链烷基
；
或者将化合物D用水解酶处理的步骤，其中R8是C1-C6非支链烷基
；
或者将化合物F的甲硅烷基醚用非碱性氟化物试剂处理的步骤
；
或者将式G化合物用式R4C(O)X2的酰化剂处理的步骤，其中X2是离去基团
；
或者以下步骤c) 由式H化合物形成活性酯中间体
；
和d) 使活性酯中间体与式I化合物反应
；
或者其组合。1a. 条款1的方法，其中R4是任选取代的烷基。
2. 条款1或1a的方法，其包括在非质子溶剂中，将式A化合物用三乙基甲硅烷基氯和咪唑处理的步骤，其中R8是C1-C6非支链烷基
。
3. 条款1或1a的方法，其包括在温度约-78℃至约0℃下，在非质子溶剂中，将式B化合物用碱和式ClCH2OC(O)R2化合物处理的步骤；其中式ClCH2OC(O)R2化合物与式B化合物的摩尔比为约1-约1.5，其中R8是C1-C6非支链烷基
。
4. 条款1或1a的方法，其包括步骤：a) 由式E化合物制备式(E1)化合物，其中X1是离去基团
；
和b) 在还原条件下，在式E1化合物存在下，处理式C化合物，其中R8是C1-C6非支链烷基
。
5. 条款1或1a的方法，其包括将化合物D用水解酶处理的步骤，其中R8是C1-C6非支链烷基
。
6. 条款1或1a的方法，其包括将式G化合物用式R4C(O)X2的酰化剂处理的步骤，其中X2是离去基团
。
7. 条款1或1a的方法，其包括步骤：c) 由式H化合物形成活性酯中间体
；
和d) 使活性酯中间体与式I化合物反应
。
8. 条款1-7或1a中任一项的方法，其中R1是氢、苄基或C1-C4烷基。
9. 以上条款的任一项的方法，其中R1是氢。
10. 以上条款的任一项的方法，其中R2是C1-C8烷基或C3-C8环烷基。
11. 以上条款的任一项的方法，其中R2是正丁基。
12. 以上条款的任一项的方法，其中R3是C1-C4烷基。
13. 以上条款的任一项的方法，其中R3是甲基。
14. 以上条款的任一项的方法，其中Ar1是苯基或羟基苯基。
15. 以上条款的任一项的方法，其中Ar1是4-羟基苯基。
16. 以上条款的任一项的方法，其中R4是C1-C8烷基或C3-C8环烷基。
17. 以上条款的任一项的方法，其中R4是甲基。
18. 以上条款的任一项的方法，其中R5是支链C3-C6或C3-C8环烷基。
19. 以上条款的任一项的方法，其中R5是异丙基。
20. 以上条款的任一项的方法，其中R6是支链C3-C6或C3-C8环烷基。
21. 以上条款的任一项的方法，其中R5是仲丁基。
22. 以上条款的任一项的方法，其中R7是C1-C6烷基。
23. 以上条款的任一项的方法，其中R7是甲基。
24. 以上条款的任一项的方法，其中R2是CH2CH(CH3)2、CH2CH2CH3、CH2CH3、CH=C(CH3)2或CH3。
25. 以上条款的任一项的方法，其中Ar1是取代的苯基。
26. 以上条款的任一项的方法，其中Ar1是4-取代的苯基。
27. 以上条款的任一项的方法，其中Ar1是RA-取代的苯基。
28. 以上条款的任一项的方法，其中Ar1是4-羟基苯基或其羟基被保护的形式。
应理解的是本文中所用术语微管蛋白细胞溶素指天然存在的微管蛋白细胞溶素，以及微管蛋白细胞溶素的类似物或衍生物的总称和个别的称谓。微管蛋白细胞溶素的示例性实例在表1中给出。
本文中所用术语微管蛋白细胞溶素一般指本文所述的化合物及其类似物和衍生物。还应理解的是在各上述内容中，任何对应的药学上可接受的盐也包括在本文所述的示例性实施方案中。
应理解的是这样的衍生物可包括本文所述的化合物的前体药物、包括一或多个保护基的本文所述的化合物，包括在制备本文所述的其它化合物中使用的化合物。
另外，本文所用术语微管蛋白细胞溶素还指本文所述的化合物的前体药物衍生物，且包括其各种类似物和衍生物的前体药物。另外，本文所用术语微管蛋白细胞溶素指各个本文所述化合物的无定形以及任何和所有的形态学形式。另外，本文所用术语微管蛋白细胞溶素指本文所述的化合物的任何和所有的水合物或其它溶剂合物。
应理解的是可将前述各实施方案以化学相关方式组合以产生本文所述的实施方案的亚组。因此，还应理解的是所有这样的亚组也都是本文所述的本发明的示例性实施方案。
本文所述的化合物可包含一或多个手性中心，或者另外可具有存在多个立体异构体的能力。应理解的是在一实施方案中，本文所述的本发明并不限定于任何特定的立体化学要求，并且所述化合物和组合物、方法、用途和包含它们的药物可以是光学纯的，或者可以是任何各种立体异构体的混合物，包括对映异构体的外消旋体和其它混合物、非对映异构体的其它混合物等。还应理解的是这些立体异构体的混合物可包括在一或多个手性中心处的单一立体化学构型，同时包括在一或多个其它手性中心处的立体化学构型的混合物。
类似地，本文所述的化合物可包括几何中心，例如顺式、反式、(E)-和(Z)-双键。应理解的是在另一实施方案中，本文所述的本发明并不限定于任何特定的几何异构体要求，并且所述化合物和组合物、方法、用途和包含它们的药物可以是纯的，或者可以是任何各种几何异构体的混合物。还应理解的是此类几何异构体的混合物可包括在一或多个双键处的单一构型，同时包括在一或多个其它双键处的几何异构体的混合物。
本文所用的术语非质子溶剂指在反应条件下不生成溶质的溶剂。非质子溶剂的示例性实例是四氢呋喃(THF)、2,5-二甲基-四氢呋喃、2-甲基-四氢呋喃、四氢吡喃、乙醚、叔丁基甲基醚、二甲基甲酰胺、N-甲级吡咯烷酮(NMP)等。应理解的是这些溶剂的混合物也可用于本文所述的方法中。
如本文所用的，试剂的当量指将原料转换为要求的产物所必需的试剂的理论量，即如果将1摩尔原料转换为1摩尔产物理论上需要1摩尔试剂，那么1当量的试剂代表1摩尔试剂；如果将1摩尔原料转换为1摩尔产物理论上需要X摩尔试剂，那么1当量的试剂代表X摩尔试剂。
本文所用的术语活性酯形成剂一般指可用于将羧酸转化为活性酯的试剂或试剂组合。
本文所用的术语活性酯一般指羧酸酯化合物，其中酯的二价氧部分是离去基团，其导致产生一种酯，该酯被激活与含有官能团(如胺、醇或巯基)的化合物反应。形成活性酯的化合物的示例性实例是N-羟基琥珀酰亚胺、N-羟基邻苯二甲酰亚胺、被吸电子基团取代的苯酚，例如但不限于4-硝基苯酚、五氟苯酚、N,N’-二取代的异脲、取代的羟基杂芳基，例如但不限于2-吡啶醇、1-羟基苯并三唑、1-羟基-7-氮杂-苯并三唑、氰基甲醇等。例如，将活性酯用带有氨基、羟基或硫醇基的化合物置换的反应条件是温和的。例如，将活性酯用带有氨基、羟基或硫醇基的化合物置换的反应条件是在室温或低于室温的条件下进行。例如，将活性酯用带有氨基、羟基或硫醇基的化合物置换的反应条件是在不加入强碱下进行。例如，将活性酯用带有氨基、羟基或硫醇基的化合物置换的反应条件是在加入叔胺碱下进行的，例如具有共轭酸pKa约11或以下、约10.5或以下及诸如此类的叔胺碱。
本文所用的术语“烷基”包括任选为支链的碳原子链。本文所述术语“链烯基”和“炔基”包括碳原子链，其任选为支链并分别包括至少一个双键或三键。应理解的是炔基还可包括一或多个双键。还应理解的是在某些实施方案中，烷基有利地具有有限的长度，包括C1-C24、C1-C12、C1-C8、C1-C6和C1-C4。还应理解的是在某些实施方案中，链烯基和/或炔基可各自有利地具有有限的长度，包括C2-C24、C2-C12、C2-C8、C2-C6和C2-C4。本文中应理解较短的烷基、链烯基和/或炔基可在较少的程度上增加对所述化合物的亲油性，因此将具有不同的药物代谢动力学行为。示例性烷基是但不限于甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、2-戊基、3-戊基、新戊基、己基、庚基、辛基等。
本文所用的术语“环烷基”包括任选为支链的碳原子链，其中至少一部分链为环状。应理解的是环烷基烷基是环烷基的亚组(subset)。应理解的是环烷基可以是多环的。示例性环烷基包括但不限于环丙基、环戊基、环己基、2-甲基环丙基、环戊基乙-2-基、金刚烷基等。本文所用术语“环烯基”包括任选为支链的碳原子链，并包括至少一个双键，其中至少一部分链为环状。应理解的是一或多个双键可以在环烯基的环状部分和/或环烯基的非环状部分。应理解的是环烯基烷基和环烷基烯基各自是环烯基的亚组。应理解的是环烷基可以是多环的。示例性环烯基包括但不限于环戊烯基、环己基乙烯-2-基、环庚烯基丙烯基等。还应理解的是形成环烷基和/或环烯基的链有利地具有限定的长度，包括C3-C24、C3-C12、C3-C8、C3-C6和C5-C6。应理解的是形成环烷基和/或环烯基的较短的烷基和/或烯基链分别可在较少的程度上增加对所述化合物的亲油性，因此将具有不同的药物代谢动力学行为。
本文所用的术语“杂烷基”包括包含碳和至少一个杂原子的并任选为支链的碳原子链。示例性杂原子包括氮、氧和硫。在某些变式中，示例性杂原子还包括磷和硒。包括杂环基和杂环的本文所用术语“环杂烷基”包括包含碳和至少一个杂原子的原子链，如杂烷基，并任选为支链，其中至少部分链为环状。示例性杂原子包括氮、氧和硫。在某些变式中，示例性杂原子还包括磷和硒。示例性环杂烷基包括但不限于四氢呋喃基、吡咯烷基、四氢吡喃基、哌啶基、吗啉基、哌嗪基、高哌嗪基、奎宁环基等。
本文所用的术语“芳基”包括单环和多环芳基，其包括芳族碳环和芳族杂环基，其各自可被任选取代。本文所用的术语“碳芳基(carbaryl)”包括芳族碳环基团，其各自可任选被取代。示例性芳族碳环基团包括但不限于苯基、萘基等。本文所用的术语“杂芳基”包括芳族杂环基团，其各自可任选被取代。示例性芳族杂环基团包括但不限于吡啶基、嘧啶基、吡嗪基、三嗪基、四嗪基、喹啉基、喹唑啉基、喹喔啉基、噻吩基、吡唑基、咪唑基、噁唑基、噻唑基、异噁唑基、异噻唑基、噁二唑基、噻二唑基、三唑基、苯并咪唑基、苯并噁唑基、苯并噻唑基、苯并异噁唑基、苯并异噻唑基等。
本文所用的术语“氨基”包括基团NH2、烷基氨基和二烷基氨基，其中二烷基氨基中的两个烷基可以相同或不同，即烷基烷基氨基。例如，烷基包括甲氨基、乙氨基、二甲氨基、甲基乙基氨基等。另外，应理解的是当氨基修饰或者被另一个术语修饰时，如氨基烷基或酰基氨基，则以上所述术语的变式包括在其中。例如，氨基烷基包括H2N-烷基、甲氨基烷基、乙氨基烷基、二甲氨基烷基、甲基乙基氨基烷基等，例如，酰基氨基包括酰基甲氨基、酰基乙氨基等。
本文所用的术语“氨基及其衍生物”包括本文所述的氨基和烷基氨基、链烯基氨基、炔基氨基、杂烷基氨基、杂烯基氨基、杂炔基氨基、环烷基氨基、环烯基氨基、环杂烷基氨基、环杂烯基氨基、芳基氨基、芳基烷基氨基、芳基链烯基氨基、芳基炔基氨基、酰基氨基等，其各自可任选被取代。术语 “氨基衍生物”还包括脲、氨基甲酸酯等。
本文所用的术语“羟基及其衍生物”包括OH和烷氧基、链烯基氧基、炔基氧基、杂烷基氧基、杂链烯基氧基、杂炔基氧基、环烷基氧基、环烯基氧基、环杂烷基氧基、环杂烯基氧基、芳基氧基、芳基烷基氧基、芳基链烯基氧基、芳基炔基氧基、酰氧基等，其各自可任选被取代。术语 “羟基衍生物”还包括氨基甲酸酯等。
本文所用的术语“硫醇(thio)及其衍生物”包括SH和烷基硫基、链烯基硫基、炔基硫基、杂烷基巯基、杂烯基硫基、杂炔基硫基、环烷基硫基、环烯基硫基、环杂烷基硫基、环杂烯基硫基、芳基硫基、芳基烷基硫基、芳基链烯基硫基、芳基炔基硫基、酰基硫基等，其各自可任选被取代。术语 “硫醇衍生物”还包括硫代氨基甲酸酯等。
本文所用的术语“酰基”包括甲酰基和烷基羰基、链烯基羰基、炔基羰基、杂烷基羰基、杂烯基羰基、杂炔基羰基、环烷基羰基、环烯基羰基、环杂烷基羰基、环杂烯基羰基、芳基羰基、芳基烷基羰基、芳基链烯基羰基、芳基炔基羰基、酰基羰基等，其各自可任选被取代。
本文所用的术语“羧酸盐及其衍生物”包括基团CO2H及其盐、和其酯和酰胺，以及CN。
本文所用的术语“任选取代的”包括在任选被取代的基团上用其它官能团代替氢原子。这样的其它官能团示例性地包括但不限于氨基、羟基、卤代、硫醇基、烷基、卤代烷基、杂烷基、芳基、芳基烷基、芳基杂烷基、硝基、磺酸及其衍生物、羧酸及其衍生物等。例如，任何氨基、羟基、硫醇基、烷基、卤代烷基、杂烷基、芳基、芳基烷基、芳基杂烷基和/或磺酸可任选被取代。
本文所用的术语“任选取代的芳基”包括在任选被取代的芳基上用其它官能团代替氢原子。这样的其它官能团示例性地包括但不限于氨基、羟基、卤代、硫醇基、烷基、卤代烷基、杂烷基、芳基、芳基烷基、芳基杂烷基、硝基、磺酸及其衍生物、羧酸及其衍生物等。例如，任何氨基、羟基、硫醇基、烷基、卤代烷基、杂烷基、芳基、芳基烷基、芳基杂烷基和/或磺酸可任选被取代。
示例性取代基包括但不限于基团-(CH2)xZX，其中x是0-6的整数，而ZX选自卤素、羟基、烷酰基氧基，包括C1-C6烷酰基氧基，任选取代的芳酰基氧基、烷基，包括C1-C6烷基，烷氧基，包括C1-C6烷氧基，环烷基，包括C3-C8环烷基，环烷氧基，包括C3-C8环烷氧基，链烯基，包括C2-C6链烯基，炔基，包括C2-C6炔基，卤代烷基，包括C1-C6卤代烷基，卤代烷氧基，包括C1-C6卤代烷氧基，卤代环烷基，包括C3-C8卤代环烷基，卤代环烷氧基，包括C3-C8卤代环烷氧基，氨基、C1-C6烷基氨基、(C1-C6烷基)(C1-C6烷基)氨基、烷基羰基氨基、N-(C1-C6烷基)烷基羰基氨基、氨基烷基、C1-C6烷基氨基烷基、(C1-C6烷基)(C1-C6烷基)氨基烷基、烷基羰基氨基烷基、N-( C1-C6烷基)烷基羰基氨基烷基、氰基和硝基；或者ZX选自-CO2R4和-CONR5R6，其中R4、R5和R6各自在每次出现时独立地选自氢、C1-C6烷基和芳基-C1-C6烷基。
本文所用的术语“前体药物”一般指任何化合物，当将其给予生物系统时，其由于一或多种自发的化学反应、酶催化的化学反应和/或代谢化学反应或其组合反应而产生生物学上的活性物质。在体内，前体药物一般通过酶(如酯酶、酰胺酶、磷酸酯酶等)、简单的生物化学或体内其它过程释放或再生药理学上更具活性的药物来发挥作用。这种激活可在给予宿主服用前体药物之前、之后或过程中通过内源性宿主酶或非-内源性酶的作用而发生。前体药物用途的其它细节在U.S. Pat. No. 5,627,165；和Pathalk et al., 有机合成中的酶保护基技术(Enzymic protecting group techniques in organic synthesis), Stereosel. Biocatal. 775-797 (2000)中有描述。应理解的是一经达到诸如靶向传递、安全性、稳定性等目的，立即利于将前体药物转化为初始药物，接着随后快速消除释放的遗留的形成前体药物的基团。
前体药物可由本文所述的化合物通过将最终在体内裂解的基团连接在所述化合物上存在的一或多个官能团(如-OH-、-SH、-CO2H、-NR2)上而制备。示例性前体药物包括但不限于羧酸酯，其中所述基团是烷基、芳基、芳烷基、酰氧基烷基、烷氧基羰基氧基烷基以及羟基、硫醇基和胺的酯，其中连接的基团是酰基、烷氧基羰基、氨基羰基、磷酸酯或硫酸酯。示例性酯，也称为活性酯，包括但不限于1-茚满基、N-氧基琥珀酰亚胺；酰氧基烷基，如乙酰氧基甲基、特戊酰氧基甲基、β-乙酰氧基乙基、β-特戊酰氧基乙基、1-(环己基羰基氧基)丙-1-基、(1-氨基乙基)羰基氧基甲基等；烷氧基羰基氧基烷基，如乙氧基羰基氧基甲基、α-乙氧基羰基氧基乙基、β-乙氧基羰基氧基乙基等；二烷基氨基烷基，包括二低级烷基氨基烷基，如二甲氨基甲基、二甲氨基乙基、二乙氨基甲基、二乙氨基乙基等；2-(烷氧基羰基)-2-烯基，如2-(异丁氧基羰基)戊-2-烯基、2-(乙氧基羰基)丁-2-烯基等；和内酯基团，如酞基、二甲氧基酞基等。
其它的示例性前体药物包含化学部分，如酰胺或磷基团，其功能是增加本文所述的化合物的溶解度和/或稳定性。氨基的其它示例性前体药物包括但不限于(C3-C20)烷酰基；卤代-(C3-C20)烷酰基；(C3-C20)烯酰基；(C4-C7)环烷酰基；(C3-C6)-环烷基(C2-C16)烷酰基；任选取代的芳酰基，如未取代的芳酰基或被1-3个选自下列取代基取代的芳酰基：卤素、氰基、三氟甲磺酰氧基、(C1-C3)烷基和(C1-C3)烷氧基，其各自任选进一步被1-3个卤原子单或多取代；任选取代的芳基(C2-C16)烷酰基，如未取代的或被1-3个选自下列取代基取代的芳基：卤素、(C1-C3)烷基和(C1-C3)烷氧基，其各自任选进一步被1-3个卤原子取代；和任选取代的杂芳基烷酰基，其在杂芳基上具有1-3个选自O、S和N的杂原子并在烷酰基部分具有2-10个碳原子，如未取代的或被1-3个选自下列取代基取代的杂芳基：卤素、氰基、三氟甲磺酰氧基、(C1-C3)烷基和(C1-C3)烷氧基，其各自任选进一步被1-3个卤原子取代。示例性的基团仅为举例，并不是穷举的，并可通过常规的方法制备。
应理解的是前体药物本身可不具有显著的生物活性，但在给药后在体内经历一或多种自发的化学反应、酶催化的化学反应和/或代谢化学反应或其组合反应而产生本文所述的化合物，该化合物是具有生物学活性的或者是所述生物活性化合物的前体。但是，应理解的是在某些情况下，前体药物是具有生物活性的。还应理解的是前体药物经常通过改善口服生物利用度、药效学的半衰期等而用于改善药物效力或安全性。前体药物还指本文所述化合物的衍生物，其包括简单掩盖药物不良特性或改善药物转运的基团。例如，本文所述的一或多种化合物可呈现出一种能被有利地阻断或减少的不良特性，其在临床药物应用中可能变成药理学上、制药学上或药代动力学上的障碍，例如低的口服药物吸收、缺乏位点特异性、化学不稳定性、毒性和较差的患者接受性(很差的味觉、气味、注射部位疼痛等)和其它特性。在此应理解的是前体药物或使用可逆衍生化的其它对策可用于药物临床应用的最优化。
当指化学反应时，本文所用的术语“处理”、“接触”或“反应”是指在适当的条件下加入或混合两种或更多种试剂以产生所指明的和/或所要求的产物。应理解的是产生所指明的和/或所要求的产物的反应可不必直接由最初加入的两种试剂组合产生，即可有一或多个在混合物中产生的中间体，其最终导致形成所指明的和/或所要求的产物。
本文所用的术语“组合物”一般指包含特定量的特定成分的任何产品，以及由特定量的特定成分组合直接或间接产生的任何产品。应理解的是本文所述的组合物可由本文所述的各个单独化合物或者由本文所述的化合物的盐、溶液、水合物、溶剂合物或其它形式制备。还应理解的是所述组合物可由本文所述的化合物的各种无定形、非-无定形、部分晶体、晶体和/或其它形态学形式制备。还应理解的是所述组合物可由本文所述的化合物的各种水合物和/或溶剂合物制备。因此，列举本文所述化合物的这些药用组合物应被理解为包括各个本文所述的化合物的各种形态学形式和/或溶剂合物或水合物形式或者这些形式的任何组合。例如，组合物可包括一或多种载体、稀释剂和/或赋形剂。可将本文所述的化合物或者含有它们组合物以治疗有效量配制成适于本文所述方法的任何常用的剂型。利用已知的程序(一般参见，Remington: The Science and Practice of Pharmacy, (21st ed., 2005))，可将本文所述的化合物或者含有它们组合物，包括这些制剂，通过用于本文所述方法的广泛种类的常规途径并以广泛种类剂量规格给药。
实施例
二肽3的合成
将4.9 g二肽1 (11.6 mmol)溶解于60 mL二氯甲烷中，在0℃下，向得到的溶液中加入咪唑(0.87g, 12.7 mmol)。将反应混合物稍稍温热以溶解所有的固体，然后再冷却至0℃。在0℃下，滴加入TESCl (2.02 mL, 12.1 mmol)，将反应混合物在氩气下搅拌并用2小时温热至室温。TLC (3:1己烷/EtOAc)表明完成转化。过滤反应液除去咪唑HCl盐，用去离子水提取，将水相用二氯甲烷回洗涤，将合并的有机相用盐水洗涤，经Na2SO4干燥，过滤除去Na2SO4，减压浓缩，与甲苯共蒸发，然后在高真空下干燥过夜，得到6.4 g粗产物2 (理论收率为5.9 g)。
将粗产物2与甲苯再次共蒸发，然后不经进一步纯化而使用。将该TES保护的二肽溶解于38 mL THF (无水，无抑制剂)并冷却至-45℃，搅拌15分钟，然后滴加入KHMDS (0.5 M在甲苯中，25.5 mL, 12.8 mmol, 1.1 equiv)。加入KHMDS完毕后，将反应混合物在-45℃下搅拌15分钟，加入丁酸氯甲酯(1.8 mL, 1.2 equiv, 14 mmol)。反应混合物由浅黄色变为青色。TLC (20% EtOAc/石油醚)表明大部分原料已转化。LC-MS表明残余约7%原料。将反应物通过加入3 mL MeOH猝灭，将混合物温热至室温并在减压下浓缩至油状残留物。将残留物溶解于石油醚中，然后通过短硅胶柱除去钾盐。将柱用13% EtOAc/石油醚洗涤，合并收集的洗脱液并减压浓缩。将该粗品烷基化产物通过另外的硅胶柱(产物/硅胶 = 1:50)并用13% EtOAc/石油醚洗脱，除去残留的原料，得到5.7 g产物3 (2步，收率76%)。
三肽4的合成
将烷基化二肽3 (4.3g, 7.0 mmol)、N-甲基哌啶-2-甲酸酯(MEP) (4.0g, 28.0 mmol, 4 equiv)和五氟苯酚(5.7g, 30.8 mmol. 4.4 equiv)加入到烧瓶中。将N-甲基吡咯烷酮(NMP, 86mL)加入到该混合物中。向混合物中加入二异丙基碳二亚胺(DIC, 4.77 mL, 30.8 mmol, 4.4 equiv)。室温下，将混合物搅拌1h。加入Pd/C (10%, 干燥，1.7g)。将烧瓶在氢气下(30-35 psi)振摇5小时。反应混合物经HPLC分析。发现原料低于3%。将混合物通过硅藻土过滤。将硅藻土用200 mL乙酸乙酯提取。合并滤液和乙酸乙酯提取液，然后转移至分液漏斗中，用1% NaHCO3/ 10% NaCl溶液洗涤(200 mL x 4)。分离有机层并在旋转蒸发器上减压蒸发。将粗产物溶解于40 mL的MeOH/H2O (3:1)中。将该粗品溶液装载于Biotage C18柱(Flash 65i, 350g, 450mL, 65 x 200 mm)上，用缓冲液A [10mM NH4OAc/ACN (1:1)]和B (CAN，乙腈)洗脱。收集部分，将有机溶剂在旋转蒸发器上蒸发。将100 mL 10% NaCl溶液和100 mL甲基叔丁基醚(MTBE)加入到烧瓶中，并将该混合物转移至分液漏斗中。分离有机层，经无水Na2SO4干燥，过滤，在旋转蒸发器上蒸发至干。得到2.5g三肽中间体4 (收率50%)。
三肽酸6的合成
30℃下，向2 L 0.05 M磷酸盐(pH=7.4)中加入3.6 g猪肝酯酶(17单位/mg)。将3.0 g甲基酯4溶解于100 mL DMSO中。以1.1 mL/h的速率加入第一份50 mL该溶液，通过注射器以1.2 mL/h速率加入第二份50 mL该溶液。加入完成后，将反应混合液在30℃下搅拌数小时。反应混合物的EtOAc提取液的HPLC表明反应完成。将反应混合物从反应器中排出1 L部分，并用EtOAc提取(3 x 1 L)。将合并的有机提取液用盐水洗涤，经Mg2SO4干燥并减压浓缩。回收2.8 g产物6 (95%)。UPLC分析表明产物是纯净的，除去了先前反应中残留的五氟苯酚。
中间体6光谱数据：
微管蛋白细胞溶素B的合成
将1.4 g (2.01 mmol)三肽6溶解于8.4 mL THF中，加入327.4 μL (2.01 mmol)的3HF·NEt3，将反应混合物搅拌30分钟。LC-MS分析(10%-100%乙腈，pH 7缓冲液)确认TES基团脱保护完成。减压除去THF。将残留物高真空干燥5分钟。将粗产物溶解于8.4 mL无水吡啶中。在0℃下加入2.85 mL (30.15 mmol, 15 equiv)的Ac2O。将得到的澄清溶液室温下搅拌3.5小时。LC-MS分析(10%-100%乙腈，pH 7.0)表明转化>98%。加入56 mL二氧六环/H2O，将得到的混合液室温下搅拌1小时。减压浓缩混合物。残留物与甲苯共蒸发(3 x)，高真空干燥过夜。将粗产物7直接用于下一步反应中。
中间体7光谱数据：
方法A. 将粗品三肽酸7溶解于28 mL EtOAc (无水)中，加入740 mg (4.02 mmol, 2.0 equiv)五氟苯酚，接着加入1.04 g (5.03 mmol, 2.5 equiv)的DCC。将得到的反应混合物室温下搅拌1小时。LC-MS (5% - 80%乙腈，pH=2.0，甲酸)分析表明转化率>95%。滤除脲副产物，减压除去EtOAc，将残留物高真空干燥5分钟。将残留物溶解于8.4 mL DMF中，加入酪氨酸微管蛋白(tubutyrosine)盐酸盐(Tut-HCl, 678.7 mg, 2.61 mmol, 1.3 equiv)，接着加入DIPEA (2.28 mL, 13.07 mmol, 6.5 equiv)。将得到的澄清溶液室温下搅拌10分钟。将反应混合物用DMSO稀释，经制备-HPLC纯化(X-bridge柱, 10 mM NH4OAc, pH=6.3, 25%-100%乙腈)。合并纯的部分，减压除去乙腈，用EtOAc提取(3 x)，干燥Na2SO4。减压除去EtOAc，残留物在高真空下干燥1小时，得到513 mg所要求的产物(从6计合并收率31%)。
方法B. 将三肽7 (229 mg, 0.367 mmol)溶解于EtOAc (无水)中，加入134.9 mg (0.733 mmol, 2.0 equiv)五氟苯酚，接着加入970 mg (1.84 mmol, 5.0 equiv) DCC树脂。将得到的反应混合物室温下搅拌16小时。LC-MS分析表明转化率>96%。将反应混合物过滤并浓缩至干，在高真空下干燥5分钟。将残留物溶解于3.5 mL DMF中，加入Tut-HCl (123.9 mg, 0.477 mmol, 1.3 equiv)，接着加入DIPEA (0.42 mL, 2.386 mmole, 6.5 equiv)。将得到的澄清溶液室温下搅拌10分钟。将反应混合物用DMSO稀释，在制备-HPLC上纯化(X-bridge柱，10 mM NH4OAc, 25%-100%乙腈，两轮)。合并纯的部分，减压除去乙腈，将残留物用EtOAc提取(2 x)，合并的EtOAc提取液经Na2SO4干燥。减压除去EtOAc。残留物在高真空下干燥1小时，得到175 mg所要求的产物(从6计合并收率58%)。
二肽3的大规模合成
将10.2 g二肽1 (25.6 mmol)溶解于130 mL二氯甲烷中，在0℃下，向得到的溶液中加入咪唑(1.9g, 28.1 mmol)。将反应混合物稍稍温热以溶解所有的固体，然后再冷却至0℃。在0℃下，滴加入TESCl (4.5 mL, 26.8 mmol)，将反应混合物在氩气下搅拌并用2小时温热至室温。TLC (3:1己烷/EtOAc)表明完成转化。过滤反应液以除去咪唑HCl盐，用去离子水提取，将水相用二氯甲烷回洗涤，将合并的有机相用盐水洗涤，经Na2SO4干燥，过滤以除去Na2SO4，减压浓缩，与甲苯共蒸发，然后在高真空下干燥过夜，得到12.2 g产物2。
将粗产物2与甲苯再次共蒸发，并不经进一步纯化而使用。将TES保护的二肽溶解于80 mL THF (无水，无抑制剂)并冷却至-45℃，搅拌15分钟，然后滴加入KHMDS (0.5 M在甲苯中, 50 mL, 25.0 mmol, 1.05 equiv)。加入KHMDS完毕后，将反应混合物在-45℃下搅拌15分钟，加入丁酸氯甲酯(3.6 mL, 1.2 equiv, 28.3 mmol)。反应混合物由浅黄色变为青色。TLC (20% EtOAc/石油醚)表明反应完成。将反应物通过加入20 mL MeOH猝灭，将混合物温热至室温并在减压下浓缩至油状残留物。将残留物溶解于石油醚中，然后通过短硅胶柱除去钾盐。将柱用13% EtOAc/石油醚洗涤，合并收集的洗脱液并减压浓缩，得到12.1 g产物3 (2步，收率76%)。
三肽4的大规模合成
将烷基化二肽3 (7.6g, 12.4 mmol)、N-甲基哌啶-2-甲酸酯(MEP) (7.0g, 48.9 mmol, 4 equiv)和五氟苯酚(10.0 g, 54.3 mmol. 4.4 equiv)加入到烧瓶中。将N-甲基吡咯烷酮(NMP, 152 mL)加入到该混合物中。向混合物中加入二异丙基碳二亚胺(DIC, 8.43 mL, 54.4 mmol, 4.4 equiv)。室温下，将混合物于室温下搅拌1h。加入Pd/C (10%, 干燥, 3.0g)。将烧瓶在氢气下(30-35 psi)振摇5小时。反应混合物经HPLC分析。反应完成。将混合物通过硅藻土过滤。将硅藻土用500 mL乙酸乙酯洗涤。将溶液合并并转移至分液漏斗中，用1% NaHCO3/ 10% NaCl溶液洗涤(250 mL x 4)。分离有机层并在旋转蒸发器上减压蒸发。将粗产物溶解于二氯甲烷中，然后过滤脲。将该粗品溶液装载于Teledyne Redisep硅胶柱(330g)上，用EtOAc/石油醚在CombiFlash快速色谱系统上纯化。收集部分，有机溶剂经蒸发除去，得到5.0g三肽(收率61%)。NMR和质谱数据与该实施例测定的那些一致。
三肽酸6的大规模合成
30℃下，向2 L 0.05 M磷酸盐(pH=7.4)中加入3.6 g猪肝酯酶(17单位/mg)。将3.0 g甲基酯4溶解于100 mL DMSO中。以1.1 mL/h的速率加入第一份50 mL该溶液，然后通过注射器以1.2 mL/h速率加入第二份50 mL该溶液。加入完成后，将反应混合液在30℃下搅拌数小时。反应混合物的EtOAc提取液的HPLC表明反应完成。将反应混合物从反应器中排出1 L部分，并用94% EtOAc-6% MeOH (vol./vol.)溶液提取(3 x 1 L)。将合并的提取液用盐水洗涤，经Na2SO4干燥并减压浓缩。回收2.8 g产物6 (95%)。UPLC分析表明产物是纯净的，除去了先前反应中残留的五氟苯酚。
微管蛋白细胞溶素B的大规模合成
将3.0 g (4.30 mmol)三肽6溶解于18 mL THF中，加入0.70 mL (4.30 mmol)的3HF·NEt3，将反应混合物搅拌30分钟。LC-MS分析(10%-100%乙腈，pH 7缓冲液)确认TES基团脱保护完成。减压除去THF。将残留物高真空干燥5分钟。将粗产物溶解于18 mL无水吡啶中。在0℃下加入6.11 mL (64.50 mmol, 15 equiv)的Ac2O。将得到的澄清溶液室温下搅拌5小时。LC-MS分析(10%-100%乙腈，pH 7.0)表明转化>98%。加入117 mL二氧六环/H2O，将得到的混合液室温下搅拌1小时。减压浓缩混合物。将残留物与甲苯共蒸发(3 x)，高真空下干燥过夜。将粗产物7直接用于下一步反应中。LCMS (ESI) [M+H]+ 625.2；NMR光谱数据与结构7一致。
方法B. 将粗品三肽酸7 (2.67 g, 4.30 mmol)溶解于43 mL DCM (无水)中，加入1.59 g (8.6 mmol, 2.0 equiv)五氟苯酚，接着加入9.33 g (21.5 mmol, 5.0 equiv)树脂上的DCC。将得到的反应混合物室温下搅拌16小时。LC-MS分析表明转化率>96%。将反应混合物过滤并浓缩至干，在高真空下干燥5分钟。将残留物溶解于16.5 mL DMF中，加入Tut-HCl (1.45 g, 5.59 mmol, 1.3 equiv)，接着加入DIPEA (4.88 mL, 27.95 mmol, 6.5 equiv)。将得到的澄清溶液室温下搅拌10分钟。将反应混合物在制备-HPLC上纯化(X-bridge柱，50 mM NH4HCO3, 25% - 100%乙腈，6轮)。合并纯的部分，减压除去乙腈，将残留物用EtOAc提取(2 x)，合并的EtOAc提取液经Na2SO4干燥。减压除去EtOAc。残留物在高真空下干燥1小时，得到1.35 g所要求的产物(从4计合并收率38%)。NMR光谱数据与微管蛋白细胞溶素B一致。

Claims (29)

1.一种制备式T的化合物或其药学上可接受的盐的方法，
其中
Ar1是任选取代的芳基；
R1是氢、烷基、芳基烷基或形成前体药物的基团；
R2选自任选取代的烷基和任选取代的环烷基；
R3是任选取代的烷基；
R4是任选取代的烷基或任选取代的环烷基；
R5和R6各自独立地选自任选取代的烷基和任选取代的环烷基；
R7是任选取代的烷基；和
n是1、2、3或4；
其中该方法包括：
用水解酶处理化合物D的步骤，其中R8是C1-C6非支链烷基
然后
用非碱性氟化物试剂处理化合物F的甲硅烷基醚的步骤
2.权利要求1的方法，其还包括在非质子溶剂中，用三乙基甲硅烷基氯和咪唑处理式A化合物的步骤，其中R8是C1-C6非支链烷基
3.权利要求1的方法，其还包括在-78℃至0℃的温度下，在非质子溶剂中，用碱和式ClCH2OC(O)R2化合物处理式B化合物的步骤；其中式ClCH2OC(O)R2化合物与式B化合物的摩尔比为1-1.5，其中R8是C1-C6非支链烷基
4.权利要求1的方法，其还包括以下步骤：
a)由式E化合物制备式(E1)化合物，其中X1是离去基团
和
b)在还原条件下，在式E1化合物存在下，处理式C化合物，其中R8是C1-C6非支链烷基
5.权利要求1的方法，其还包括用式R4C(O)X2的酰化剂处理式G化合物的步骤，其中X2是离去基团
6.权利要求1的方法，其还包括以下步骤：
c)由式H化合物形成活性酯中间体
和
d)使所述活性酯中间体与式I化合物反应
7.权利要求1-6中任一项的方法，其中R1是氢、苄基或C1-C4烷基。
8.权利要求1-6中任一项的方法，其中R1是氢。
9.权利要求1-6中任一项的方法，其中R2是C1-C8烷基或C3-C8环烷基。
10.权利要求1-6中任一项的方法，其中R2是正丙基。
11.权利要求1-6中任一项的方法，其中R3是C1-C4烷基。
12.权利要求1-6中任一项的方法，其中R3是甲基。
13.权利要求1-6中任一项的方法，其中Ar1是苯基或羟基苯基。
14.权利要求1-6中任一项的方法，其中Ar1是4-羟基苯基。
15.权利要求1-6中任一项的方法，其中R4是C1-C8烷基或C3-C8环烷基。
16.权利要求1-6中任一项的方法，其中R4是甲基。
17.权利要求1-6中任一项的方法，其中R5是支链C3-C6或C3-C8环烷基。
18.权利要求1-6中任一项的方法，其中R5是异丙基。
19.权利要求1-6中任一项的方法，其中R6是支链C3-C6或C3-C8环烷基。
20.权利要求1-6中任一项的方法，其中R5是仲丁基。
21.权利要求1-6中任一项的方法，其中R7是C1-C6烷基。
22.权利要求1-6中任一项的方法，其中R7是甲基。
23.权利要求1的方法，其中所述方法包括：
用水解酶处理化合物D的步骤，其中R8是C1-C6非支链烷基
然后
用非碱性氟化物试剂处理化合物F的甲硅烷基醚的步骤
然后
用式R4C(O)X2的酰化剂处理式G化合物的步骤，其中X2是离去基团
然后
以下步骤
c)由式H化合物形成活性酯中间体
和
d)使活性酯中间体与式I化合物反应
24.权利要求1的方法，其中所述方法包括：
在非质子溶剂中，用三乙基甲硅烷基氯和咪唑处理式A化合物的步骤，其中R8是C1-C6非支链烷基，
然后
在温度-78℃至0℃下，在非质子溶剂中，用碱和式ClCH2OC(O)R2化合物处理式B化合物的步骤；其中式ClCH2OC(O)R2化合物与式B化合物的摩尔比为1-1.5，其中R8是C1-C6非支链烷基，
然后
以下步骤
a)由式E化合物制备式(E1)化合物，其中X1是离去基团
和
b)在还原条件下，在式E1化合物存在下，处理式C化合物，其中R8是C1-C6非支链烷基
然后
用水解酶处理化合物D的步骤，其中R8是C1-C6非支链烷基
然后
用非碱性氟化物试剂处理化合物F的甲硅烷基醚的步骤
然后
用式R4C(O)X2的酰化剂处理式G化合物的步骤，其中X2是离去基团
然后
以下步骤
c)由式H化合物形成活性酯中间体
和
d)使活性酯中间体与式I化合物反应
25.权利要求1的方法，其中所述方法包括：
a)通过使式E化合物与五氟苯酚在二异丙基碳二亚胺反应1小时由式E化合物制备式(E1)化合物，其中X1是离去基团
和
b)在式E1化合物和干燥的10％Pd/C存在下，处理式C化合物，其中R8是C1-C6非支链烷基
26.权利要求23-25中任一项的方法，其中Ar1是4-羟基苯基。
27.权利要求1-6或23-25中任一项的方法，其中R1是氢，R2是C1-C8烷基或C3-C8环烷基，R3是C1-C4烷基，R4是C1-C8烷基或C3-C8环烷基，R5是支链C3-C6或C3-C8环烷基，R6是支链C3-C6或C3-C8环烷基，R7是C1-C6烷基，Ar1是苯基或羟基苯基。
28.权利要求27的方法，其中R1是氢，R2是C1-C8烷基或C3-C8环烷基，R3是C1-C4烷基，R4是C1-C8烷基或C3-C8环烷基，R5是支链C3-C6或C3-C8环烷基，R6是支链C3-C6或C3-C8环烷基和R7是C1-C6烷基。
29.权利要求1-6或23-25中任一项的方法，其中所述式T化合物是下式化合物或其盐
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