CN100484955C - 放线菌素d的类似物 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一类新的化合物，具体讲是一类放线菌素D的类似物，以及这类化合物的制备方法。本发明的化合物参见下式。
Description
技术领域
本发明涉及一类新的化合物，具体讲是一类放线菌素D的类似物，以及这类化合物的制备方法。
背景技术
放线菌素D(Actinomycin D，AMD，亦称更生霉素)，是国家基本医疗保险药物品种之一，在临床广泛用于治疗多种恶性肿瘤，如小儿肾母细胞瘤(Wilm’s Tumor)、妊娠绒毛膜上皮癌、恶性葡萄胎、何杰金氏恶性淋巴瘤(Hodgkin’s disease)等多种恶性肿瘤，有显著的疗效。近年来发现放线菌素D有抗HIV病毒作用，并对艾滋病患者易感染的Kaposi’s肿瘤细胞有诱导凋亡作用。
放线菌素D结构如下式所示，分子内含有两个环五肽和平面结构的吩噁嗪酮，其中环五肽中2位氨基酸(Aa2)为D型缬氨酸(D-Valine，D-Val)，5位氨基酸(Aa5)为L型N甲基缬氨酸(L-MeVal)，1位、3位、4位分别是苏氨酸(Threonine，Thr)、脯氨酸(Proline，Pro)和N甲基甘氨酸(Sarcosine，Sar)。其结构参见下式：
放线菌素D通过与DNA结合，抑制DNA的转录过程从而表达一系列的生物活性，放线菌素D与DNA结合的机理是目前研究热点之一，也为该类新药设计提供了理论基础。
但是，放线菌素D很强的毒性大大限制了应用范围，放线菌素D对增殖期细胞的毒性与非增殖细胞毒性的差别说明其选择性的毒性并非完全由RNA的合成被抑制而引起。药理学研究表明放线菌素D在体内代谢缓慢，在宿主细胞核内产生积累，也会直接导致累积毒性，这些都限制了该药物的应用范围。
为解决放线菌D过强的毒性，现有技术中采用了多种方法对其进行改造，例如：在吩噁嗪酮8位进行N取代(J.Am.Chem.Soc.，1994，116：4154)；吩噁嗪酮7位氨基取代类似物(J.Med.Chem.，1983，26：448；J.Med.Chem.，1988，31：1540等)；吩噁嗪酮2位氨基进行修饰改造或引入自由基(Chem.Ber.，1967，100：1051；J.Med.Chem.，1979，22：1051等)；环五肽2、3、4、5位氨基酸分别替换和修饰的类似物(J.Med.Chem.，1991，94：1297；Biochemistry，1996，35：13240等)。通过这些技术措施得到的类似物中，有一些表现出较好的生物活性，偶尔也有一些毒性有所降低，但是作为药物来说，所得产物的毒性仍然较大。
发明内容
本发明提供一类新的经改造的放线菌素D类似物，预期这类的化合物具有更好的药物活性或者更低的毒性。
本发明的第二个目的是提供一种前述新化合物的制备方法。
本发明的化合物参见下式：
其式中的环五肽上的2位氨基酸(Aa2)为D型苯丙氨酸，或者为D型N甲基缬氨酸，或者为D型N甲基苯丙氨酸，而5位氨基酸(Aa5)为N甲基氨基酸。
更为具体的讲：
本发明的化合物，环五肽上2位氨基酸Aa2为D型苯丙氨酸(D-Phenylalanine，D-Phe)时，5位氨基酸Aa5可以是D型N甲基缬氨酸(D-MeVal)，或者是D型N甲基苯丙氨酸(D-MePhe)，或者是L型N甲基苯丙氨酸(L-MePhe)，或者是D型N甲基亮氨酸(D-MeLeu)，或者是L型N甲基亮氨酸(L-MeLeu)，或者是D型N甲基丙氨酸(D-MeAla)，或者是L型N甲基丙氨酸(L-MeAla)，或者是L型N甲基丝氨酸(L-MeSer)，或者是L型N甲基酪氨酸(L-MeTyr)。
当环五肽上2位氨基酸Aa2是D-MeVal时，其5位氨基酸Aa5可以是L-MeVal，或者是D-MeVal，或者是D-MePhe，或者是L-MePhe，或者是D-MeLeu，或者是L-MeLeu，或者是D-MeAla，或者是L-MeAla，或者是L-MeSer，或者是L-MeTyr。
当环五肽上2位氨基酸Aa2是D-MePhe时，其5位氨基酸Aa5可以是L-MeVal，或者是D-MeVal，或者是D-MePhe，或者是L-MePhe，或者是D-MeLeu，或者是L-MeLeu，或者是D-MeAla，或者是L-MeAla，或者是L-MeSer，或者是L-MeTyr。
本发明的化合物的制备方法是将化合物N-苄氧羰基-N-甲基甘氨酸叔丁酯溶于甲醇中，用10％钯碳催化氢化，脱去Z保护基后，与N-苄氧羰基-脯氨酸(Z-Pro)通过DCC法缩合得到二肽，再经过催化氢化脱去Z保护基后，与2位氨基酸Aa2通过DCC法缩合得到三肽，再经过催化氢化脱去Z保护基后与N-苄氧羰基-苏氨酸(Z-Thr)用DCC/HOBt活化酯法缩合得到四肽：再将四肽与Aa5用DCC法缩合反应得到线性五肽，再用三氟乙酸脱除五肽N端BOC和C端OtBu保护后，用三乙胺将体系调为中性，用BOP-Cl作为缩合剂在二氯甲烷DCM中反应得到环五肽，再经催化氢化脱除Z-Thr的Z保护基后，用DCC/HOBt活化酯法与3-苄氧基-4-甲基-2-硝基-苯甲酸(BMNBA)缩合，产物再经催化氢化后，在磷酸缓冲液中用K3Fe(CN)6氧化得到终产物。
在本发明的放线菌D的类似物的制备方法中，在生成环五肽的反应中所采用二氯甲烷与溶质的比例为0.8～1毫升:1毫克，反应温度保持在25-29℃，这样可以提高目的产物的产率。
研究表明，放线菌素D与DNA发生作用，从而选择性的抑制RNA的合成而表现出抗肿瘤活性。对放线菌素D与DNA作用过程的研究结果表明，放线菌素D吩噁嗪酮部分插入到DNA的5’-GC-3’碱基对中形成氢键，两个环五肽位于DNA的小沟内，通过疏水堆积作用与DNA小沟表面作用。环五肽中2位D-Val的侧链异丙基指向环外侧，并不与DNA作用，而当D-Val被其它一些氨基酸如D-Phe替换后，氨基酸侧链基团与DNA之间可通过某种相互作用(Side binding)而改变DNA结合的选择性。活性实验表明，2位采用D-Phe替换后，对DNA转录的抑制活性有显著提高，而急性毒性相比母体有显著下降。另外，α环与β环的2位D-Val之间形成了两个环内氢键，这两个氢键降低了1位Thr的柔性，进而限制了两个环五肽的构象。而Thr的这种柔性是与DNA的鸟嘌呤形成复合物所必需的，因此用N甲基化的氨基酸D-MeVal、D-MePhe等替换D-Val，破坏或减弱α环与β环D-Val之间的氢键作用，可以提高环五肽的自由度，预计能够提高与DNA的结合作用。
环五肽5位氨基酸侧链基团的方向、体积和极性也直接影响DNA的结合选择性，在DNA小沟中，嘌呤碱基的体积要大于嘧啶碱基，GC碱基对的亲水性要大于AT碱基对，这些决定了5位氨基酸侧链基团、侧链基团的构型(L型与D型侧链所指方向不同)、亲水性还是疏水性都将决定药物与DNA结合的选择性。当5位N甲基缬氨酸(L-MeVal)被D-MeVal替换后，由于侧链基团的朝向变化而改变了结合活性，同样用D-MePhe替换后，D-MePhe的侧链疏水基团与DNA小沟表面疏水区域更易结合而改变了与DNA的结合活性，在生物活性中表现出DNA转录的抑制活性的显著提高，5位D-MePhe放线菌素D类似物，体外抗肿瘤活性六倍于临床使用药物放线菌素D母体，而毒性只有母体的五分之一。实验表明，对小鼠移植P-388淋巴瘤的抑制率达到80.0％以上，小鼠存活时间较放线菌素D母体明显延长。对移植肝腹水瘤的抑制率达到了56.6％；对RNA合成的抑制率达90.8％；K562肿瘤细胞经过药物处理后呈现明显的凋亡状态，凋亡细胞比例达到63.5％。免疫组织化学和原位杂交技术对癌基因和抑癌基因表达的实验结果表明，合成的类似物不同程度的抑制bcl-2，Pan ras和C-erbB-2的mRNA和蛋白的表达，而抑癌基因p53的mRNA和蛋白的表达明显增强。
本发明所涉及的类似物在不改变类似物整体结构的基础上，同时在环五肽2、5位进行替换，改变了药物环五肽中2位与5位氨基酸位点的微观结构：2位D-Phe替换以增加与DNA之间的结合强度及选择性；2位N甲基氨基酸替换以降低肽环的刚性；5位用不同种类、不同构型的N甲基氨基酸替换以提高DNA结合的选择性，预计能够有效地降低毒性并提高抗肿瘤活性。本发明的类似物的初步抗肿瘤活性已证实，类似物的体外抗肿瘤活性接近或优于AMD，如[D-Phe2，D-MeVal5]2AMD对体外肿瘤细胞HL-60的抑制活性明显优于放线菌素D。
具体实施方式
实施例1：[D-Phe2，D-MeVal5]2AMD的合成
I 取化合物N-苄氧羰基-N-甲基甘氨酸叔丁酯0.63g(2.26mmol)溶于6ml无水甲醇(MeOH)中，加入80mg10％Pd/C，加氢搅拌2小时后过滤，浓缩，向残渣中加入Z-Pro 0.535g(2.15mmol)，用干燥的二氯甲烷(DCM)溶解并冷却到-10℃，加入0.44g(2.15mmol)DCC的二氯甲烷溶液，在-10℃反应2小时后，室温反应过夜。过滤掉反应生成的DCU，浓缩滤液，残渣溶于乙酸乙酯(EtOAc)，依次用10％柠檬酸水溶液，10％碳酸氢钠(NaHCO3)水溶液，饱和氯化钠(NaCl)水溶液洗涤，并用无水硫酸钠(Na2SO4)干燥。过滤，减压蒸除溶剂，粗产物经硅胶柱层析(EtOAc:石油醚PE2:1)，得到无色油状产物N-苄氧羰基-脯氨酰-N甲基甘氨酸叔丁酯；
II 取化合物N-苄氧羰基-脯氨酰-N甲基甘氨酸叔丁酯2.87g(7.63mmol)溶于50ml无水MeOH中，加入300mg 10％Pd/C，氢化2小时后过滤，浓缩，向残渣中加入Z-D-Phe 3.38g(11.30mmol)，用干燥的DCM溶解并冷却到-10℃，加入2.34g(11.34mmol)DCC的DCM溶液，-10℃反应2小时后，室温反应过夜。后处理过程同上，粗产物经硅胶柱层析(EtOAc:PE 2:1)，得到无色油状产物N-苄氧羰基-D-苯丙氨酰-脯氨酰-N甲基甘氨酸叔丁酯；
III 取化合物N-苄氧羰基-D-苯丙氨酰-脯氨酰-N甲基甘氨酸叔丁酯300mg(0.57mmol)溶于10ml无水MeOH中，加入20mg 10％Pd/C，氢化2小时后过滤，浓缩得到脱保护三肽。Z-Thr 170mg，(0.67mmol)与HOBt 102mg(0.75mmol)溶于DCM中，并加入少量DMF至HOBt溶解，将反应液冷却到-10℃，加入152mg(0.74mmol)DCC的DCM溶液，-10℃反应15分钟后，室温反应一小时，将反应混合液转入脱保护三肽中，室温反应过夜，后处理过程同上，粗产物经硅胶柱层析(EtOAc)，得到白色粉末状的N-苄氧羰基-苏氨酰-D-苯丙氨酰-脯氨酰-N甲基甘氨酸叔丁酯；
IV 取化合物N-苄氧羰基-苏氨酰-D-苯丙氨酰-脯氨酰-N甲基甘氨酸叔丁酯561.7mg(0.90mmol)与Boc-D-MeVal 270.3mg(1.17mmol)，用干燥的DCM溶解并冷却到-10℃，加入241.4mg(1.17mmol)DCC的DCM溶液，以及二甲基氨基吡啶(DMAP)55mg(0.45mmol)，室温反应过夜，后处理过程同上，粗产物经硅胶柱层析(EtOAc∶PE 2∶1)，得到白色粉末状N-叔丁氧羰基-D-N甲基缬氨酰-N-苄氧羰基-苏氨酰-D-苯丙氨酰-脯氨酰-N甲基甘氨酸叔丁酯；
V取化合物N-叔丁氧羰基-D-N甲基缬氨酰-N-苄氧羰基-苏氨酰-D-苯丙氨酰-脯氨酰-N甲基甘氨酸叔丁酯683.7mg(0.82mmol)溶于3ml TFA中，在0℃搅拌4小时，蒸除TFA，用无水乙醚沉淀出产物的TFA盐，用50ml无水DCM溶解后，于0℃加TEA调pH至7，用500ml DCM稀释反应体系，加入BOP-Cl 313mg(1.23mmol)，27-29℃反应5天，后处理过程同上，粗产物经硅胶柱层析(EtOAc∶MeOH 12∶1)，得到白色粉末N-苄氧羰基-苏氨酰-D-苯丙氨酰-脯氨酰-N甲基甘氨酰-D-N甲基缬氨酰内酯；
VI 取化合物N-苄氧羰基-苏氨酰-D-苯丙氨酰-脯氨酰-N甲基甘氨酰-D-N甲基缬氨酰内酯30mg(0.045mmol)溶于10ml无水MeOH中，加入10mg 10％Pd/C，氢化2小时后过滤，浓缩得到脱保护环五肽。BMNBA 16mg(0.055mmol)与HOBt 8.3mg(0.061mmol)溶于DCM中，并加入少量DMF至HOBt溶解，将反应液冷却到-10℃，加入12mg(0.058mmol)DCC的DCM溶液，-10℃避光反应15分钟后，室温避光反应一小时，将反应混合液转入脱保护环五肽中，室温避光反应过夜，后处理过程同上，粗产物经硅胶柱层析(EtOAc∶MeOH 12∶1)，得到白色粉末状的3-苄氧基-4-甲基-2-硝基-苯甲酰-苏氨酰-D-苯丙氨酰-脯氨酰-N甲基甘氨酰-D-N甲基缬氨酰内酯；
VII 取化合物3-苄氧基-4-甲基-2-硝基-苯甲酰-苏氨酰-D-苯丙氨酰-脯氨酰-N甲基甘氨酰-D-N甲基缬氨酰内酯33mg(0.041mmol)溶于9ml无水MeOH中，加入20mg 10％Pd/C，避光氢化2小时后过滤，滤液加至等体积的含有39.62mg(0.12mmol)K3Fe(CN)6的pH 7.12的0.067M磷酸缓冲液中，空气中搅拌反应20分钟，用水稀释反应体系，EtOAc萃取产物，产物用饱和NaHCO3溶液洗涤三次，10％盐酸洗涤三次，饱和NaCl洗涤，无水Na2SO4干燥。过滤，减压蒸除溶剂，粗产物经硅胶柱层析(EtOAc:MeOH 5:1)，得到红色固体[D-Phe2，D-MeVal5]2AMD，[α]D 20＝-43°(c＝0.295，MeOH)；1H、NMR(CDCl3，400M)：8.66(2H，d，NH)，8.11(2H，dd，NH)，7.56(1H，d，8-H)，7.27(1H，d，7-H)，2.95(3H，s，N-CH3)，2.93(3H，s，N-CH3)，2.82(3H，s，N-CH3)，2.76(3H，s，N-CH3)，2.54(3H，s，6-CH3)，2.24(3H，s，4-CH3)，1.26(3H，d，Thr-CH3)，1.17(3H，d，Thr-CH3)，0.95(3H，d，MeVal-CH3)，0.86(3H，d，MeVal-CH3)；ESI-MS：m/z1351.4(M+H)，1373.4(M+Na+)；高分辨质谱(ESI-MS)：m/z 1373.6166(M+Na+)，C70H86N12O16Na，计算值：1373.6182；
实施例2：[D-Phe2，D-MePhe5]2AMD的合成
本实施例中反应步骤I至III和合成过程与实施例1相同；
IV 取化合物N-苄氧羰基-苏氨酰-D-苯丙氨酰-脯氨酰-N甲基甘氨酸叔丁酯423mg(0.68mmol)与Boc-D-Me Val 264.8mmg(0.95mmol)，用干燥的DCM溶解并冷却到-10℃，加入195.5mg(0.95mmol)DCC的DCM溶液，以及DMAP 82.7mg(0.68mmol)，室温反应过夜，过滤掉反应生成的DCU，浓缩滤液，残渣溶于EtOAc，依次用10％柠檬酸水溶液，10％ NaHCO3溶液，饱和NaCl洗涤，并用无水Na2SO4干燥。过滤，减压蒸除溶剂，粗产物经硅胶柱层析(EtOAc:PE 2:1)，得到白色粉末N-叔丁氧羰基-D-N甲基苯丙氨酰-N-苄氧羰基-苏氨酰-D-苯丙氨酰-脯氨酰-N甲基甘氨酸叔丁酯；
V 取化合物N-叔丁氧羰基-D-N甲基苯丙氨酰-N-苄氧羰基-苏氨酰-D-苯丙氨酰-脯氨酰-N甲基甘氨酸叔丁酯937.8mg(1.06mmol)溶于4ml TFA中，在0℃搅拌4小时，蒸除TFA，用无水乙醚沉淀出产物的TFA盐，用50ml无水DCM溶解后，于0℃加TEA调pH至7，用600ml DCM稀释反应体系，加入BOP-Cl 404.7mg(1.59mmol)，27-29℃反应5天，后处理过程同上，粗产物经硅胶柱层析(EtOAc:MeOH 12:1)，得到白色粉末N-苄氧羰基-苏氨酰-D-苯丙氨酰-脯氨酰-N甲基甘氨酰-D-N甲基苯丙氨酰内酯；
VI 取化合物N-苄氧羰基-苏氨酰-D-苯丙氨酰-脯氨酰-N甲基甘氨酰-D-N甲基苯丙氨酰内酯409.2mg(0.58mmol)溶于10ml无水MeOH中，加入30mg 10％Pd/C，氢化2小时后过滤，浓缩得到脱保护环五肽。BMNBA 214.7mg(0.75mmol)与HOBt 101mg(0.75mmol)溶于DCM中，并加入少量DMF至HOBt溶解，将反应液冷却到-10℃，加入154.2mg(0.75mmol)DCC的DCM溶液，-10℃避光反应15分钟后，室温避光反应一小时，将反应混合液转入脱保护环五肽中，室温避光反应过夜，后处理过程同上，粗产物经硅胶柱层析(EtOAc:MeOH 12:1)，得到白色粉末3-苄氧基-4-甲基-2-硝基-苯甲酰-苏氨酰-D-苯丙氨酰-脯氨酰-N甲基甘氨酰-D-N甲基苯丙氨酰内酯；
VII 取化合物3-苄氧基-4-甲基-2-硝基-苯甲酰-苏氨酰-D-苯丙氨酰-脯氨酰-N甲基甘氨酰-D-N甲基苯丙氨酰内酯247.2mg(0.29mmol)溶于10ml无水MeOH中，加入30mg 10％Pd/C，避光氢化2小时后过滤，滤液加至等体积的含有279.8mg(0.85mmol)K3Fe(CN)6的pH 7.12的0.067M磷酸缓冲液中，空气中搅拌反应20分钟，用水稀释反应体系，EtOAc萃取产物，产物用饱和NaHCO3水溶液洗涤三次，10％盐酸洗涤三次，饱和NaCl洗涤，无水Na2SO4干燥。过滤，减压蒸除溶剂，粗产物经硅胶柱层析(EtOAc:MeOH 5:1)，得到红色固体[D-Phe2，D-MePhe5]2AMD，[α]D 20＝-40°(c 0.226，MeOH)；1H NMR：8.71(2H，d，NH)，8.24(2H，dd，NH)，7.56(1H，d，8-H)，7.12(1H，d，7-H)，2.83(3H，s，N-CH3)，2.82(3H，s，N-CH3)，2.71(3H，s，N-CH3)，2.69(3H，s，N-CH3)，2.54(3H，s，6-CH3)，2.24(3H，s，4-CH3)，1.30(3H，d，Thr-CH3)，1.19(3H，d，Thr-CH3)；高分辨质谱(ESI-MS)m/z：1447.6344(MH+)，C78H87N12O16，计算值：1447.6363。
实施例3：[D-MeVal2]2AMD的合成
本实施例中反应步骤I和合成过程与实施例1相同；
II 取化合物N-苄氧羰基-脯氨酰-N甲基甘氨酸叔丁酯1.90g(5.05mmol)溶于25ml无水MeOH中，加入212mg 10％Pd/C，氢化2小时后过滤，浓缩，向残渣中加入Z-D-MeVal 1.47g(5.56mmol)，用干燥的DCM溶解并冷却到-10℃，加入1.15g(5.56mmol)DCC的DCM溶液，-10℃反应2小时后，室温反应过夜，过滤掉反应生成的DCU，浓缩滤液，残渣溶于EtOAc，依次用10％柠檬酸水溶液，10％ NaHCO3溶液，饱和NaCI洗涤，并用无水Na2SO4干燥。过滤，减压蒸除溶剂，粗产物经硅胶柱层析(EtOAc:PE 2:1)，得到无色油状产物N-苄氧羰基-D-N甲基缬氨酰-脯氨酰-N甲基甘氨酸叔丁酯；
III 取化合物N-苄氧羰基-D-N甲基缬氨酰-脯氨酰-N甲基甘氨酸叔丁酯3.80g(7.77mmol)溶于50ml无水MeOH中，加入310mg 10％Pd/C，氢化2小时后过滤，浓缩得到脱保护三肽。Z-Thr 2.16g(8.53mmol)与HOBt 1.21g(8.97mmol)溶于DCM中，并加入少量DMF至HOBt溶解，将反应液冷却到-10℃，加入1.85g(8.96mmol)DCC的DCM溶液，-t0℃反应15分钟后，室温反应一小时，将反应混合液转入脱保护三肽中，室温反应过夜，后处理过程同上，粗产物经硅胶柱层析(EtOAc)，得到白色粉末N-苄氧羰基-苏氨酰-D-N甲基缬氨酰-脯氨酰-N甲基甘氨酸叔丁酯；
IV 取化合物N-苄氧羰基-苏氨酰-D-N甲基缬氨酰-脯氨酰-N甲基甘氨酸叔丁酯182.9mg(0.31mmol)与Boc-L-Me Val 78.5mg(0.34mmol)，用干燥的DCM溶解并冷却到-10℃，加入66.0mg(0.32mmol)DCC的DCM溶液，以及DMAP 18.9mg(0.15mmol)，室温反应过夜，后处理过程同上，粗产物经硅胶柱层析(EtOAc:PE 2:1)，得到白色粉末N-叔丁氧羰基-N甲基缬氨酰-N-苄氧羰基-苏氨酰-D-N甲基缬氨酰-脯氨酰-N甲基甘氨酸叔丁酯；
V 取化合物N-叔丁氧羰基-N甲基缬氨酰-N-苄氧羰基-苏氨酰-D-N甲基缬氨酰-脯氨酰-N甲基甘氨酸叔丁酯176.7mg(0.22mmol)溶于3ml TFA中，在0℃搅拌4小时，蒸除TFA，用无水乙醚沉淀出产物的TFA盐，用50ml无水DCM中溶解后，于0℃加TEA调pH至7，用200ml DCM稀释反应体系，加入BOP-Cl 112.0mg(0.44mmol)，25-29℃反应5天，后处理过程同上，粗产物经硅胶柱层析(EtOAc:MeOH 10:1)，得到白色粉末N-苄氧羰基-苏氨酰-D-N甲基缬氨酰-脯氨酰-N甲基甘氨酰-N甲基缬氨酰内酯；
VI 取化合物N-苄氧羰基-苏氨酰-D-N甲基缬氨酰-脯氨酰-N甲基甘氨酰-N甲基缬氨酰内酯25.2mg(0.04mmol)溶于5ml无水MeOH中，加入5mg 10％Pd/C，氢化2小时后过滤，浓缩得到脱保护环五肽。BMNBA 12mg(0.044mmol)与HOBt 7.0mg(0.051mmol)溶于DCM中，并加入少量DMF至HOBt溶解，将反应液冷却到-10℃，加入9.5mmg(0.046mm0l)DCC的DCM溶液，-10℃避光反应15分钟后，室温避光反应一小时，将反应混合液转入脱保护环五肽中，室温避光反应过夜，后处理过程同上，粗产物经硅胶柱层析(EtOAc:MeOH 12:1)，得到白色粉末3-苄氧基-4-甲基-2-硝基-苯甲酰-苏氨酰-D-N甲基缬氨酰-脯氨酰-N甲基甘氨酰-N甲基缬氨酰内酯；
VII 取化合物3-苄氧基-4-甲基-2-硝基-苯甲酰-苏氨酰-D-N甲基缬氨酰-脯氨酰-N甲基甘氨酰-N甲基缬氨酰内酯15mg(0.02mmol)溶于6ml无水MeOH中，加入15mg 10％Pd/C，避光氢化2小时后过滤，滤液加至等体积的含有20mmg(0.06mmmol)K3Fe(CN)6的pH7.12的0.067M磷酸缓冲液中，空气中搅拌反应20分钟，用水稀释反应体系，EtOAc萃取产物，产物用饱和NaHCO3水溶液洗涤三次，10％盐酸洗涤三次，饱和NaCl洗涤，无水Na2SO4干燥。过滤，减压蒸除溶剂，粗产物经硅胶柱层析(EtOAc:MeOH 12:1)，得到红色固体[D-MeVal2]2AMD，[α]D 20＝-244°(c 0.5，MeOH)；1H NMR：6.35(1H，d，8-H)，6.20(1H，d，7-H)，2.95(6H，d，N-CH3)，2.85(6H，d，N-CH3)，2.62(6H，d，N-CH3)，2.54(3H，s，6-CH3)，2.30(3H，s，4-CH3)，1.25(6H，m，Thr-CH3)，0.64-0.92(24H，m，Val-CH3)；高分辨质谱(ESI-MS)m/z：1283.6665(MH+)，C64H91N12O16，计算值：1283.6676。
实施例4：[D-MePhe2]2AMD的合成
本实施例中反应步骤I和合成过程与实施例1相同；
II 取化合物N-苄氧羰基-脯氨酰-N甲基甘氨酸叔丁酯1.01g(2.69mmol)溶于20ml无水MeOH中，加入100mg 10％Pd/C，氢化2小时后过滤，浓缩，向残渣中加入Z-D-MePhe 1.17g(3.73mmol)，用干燥的DCM溶解并冷却到-10℃，加入0.77g(3.73mmol)DCC的DCM溶液，-10℃反应2小时后，室温反应过夜，过滤掉反应生成的DCU，浓缩滤液，残渣溶于EtOAc，依次用10％柠檬酸水溶液，10％ NaHCO3溶液，饱和NaCl洗涤，并用无水Na2SO4干燥。过滤，减压蒸除溶剂，粗产物经硅胶柱层析(EtOAc:PE 2:1)，得到白色固体产物N-苄氧羰基-D-N甲基苯丙氨酰-脯氨酰-N甲基甘氨酸叔丁酯；
III 取化合物N-苄氧羰基-D-N甲基苯丙氨酰-脯氨酰-N甲基甘氨酸叔丁酯932.3mg(1.74mmol)溶于30ml无水MeOH中，加入70mg 10％Pd/C，氢化2小时后过滤，浓缩得到脱保护三肽。Z-Thr 658.9mg(2.60mmol)与HOBt 351.6mg(2.60mmol)溶于DCM中，并加入少量DMF至HOBt溶解，将反应液冷却到-10℃，加入536.5mg(2.60mmol)DCC的DCM溶液，-10℃反应15分钟后，室温反应一小时，将反应混合液转入脱保护三肽中，室温反应过夜，后处理过程同上，粗产物经硅胶柱层析(EtOAc)，得到白色粉末N-苄氧羰基-苏氨酰-D-N甲基苯丙氨酰-脯氨酰-N甲基甘氨酸叔丁酯；
IV 取化合物N-苄氧羰基-苏氨酰-D-N甲基苯丙氨酰-脯氨酰-N甲基甘氨酸叔丁酯636.7mg(1.00mmol)与Boc-L-MeVal 343.5mg(1.49mmol)，用干燥的DCM溶解并冷却到-10℃，加入306.3mg(1.48mmol)DCC的DCM溶液，以及DMAP 72.6mg，(0.60mmol)，室温反应过夜，后处理过程同上，粗产物经硅胶柱层析(EtOAc:PE 2:1)，得到白色粉末N-叔丁氧羰基-N甲基缬氨酰-N-苄氧羰基-苏氨酰-D-N甲基苯丙氨酰-脯氨酰-N甲基甘氨酸叔丁酯；
V 取化合物N-叔丁氧羰基-N甲基缬氨酰-N-苄氧羰基-苏氨酰-D-N甲基苯丙氨酰-脯氨酰-N甲基甘氨酸叔丁酯151.2mg(0.18mmol)溶于2ml TFA中，在0℃搅拌4小时，蒸除TFA，用无水乙醚沉淀出产物的TFA盐，用30ml无水DCM中溶解后，于0℃加TEA调pH至7，用200ml DCM稀释反应体系，加入BOP-Cl 67.9mg(0.27mmol)，25-29℃反应5天，后处理过程同上，粗产物经硅胶柱层析(EtOAc:MeOH 10:1)，得到白色粉末N-苄氧羰基-苏氨酰-D-N甲基苯丙氨酰-脯氨酰-N甲基甘氨酰-N甲基缬氨酰内酯；
VI 取化合物N-苄氧羰基-苏氨酰-D-N甲基苯丙氨酰-脯氨酰-N甲基甘氨酰-N甲基缬氨酰内酯80.3mg(0.12mmol)溶于10ml无水MeOH中，加入10mg 10％Pd/C，氢化2小时后过滤，浓缩得到脱保护环五肽。BMNBA 51.0mg，(0.18mmol)与HOBt 24.0mg(0.18mmol)溶于DCM中，并加入少量DMF至HOBt溶解，将反应液冷却到-10℃，加入36.7mg(0.18mmol)DCC的DCM溶液，-10℃避光反应15分钟后，室温避光反应一小时，将反应混合液转入脱保护环五肽中，室温避光反应过夜，后处理过程同上，粗产物经硅胶柱层析(EtOAc:MeOH 12:1)，得到白色粉末3-苄氧基-4-甲基-2-硝基-苯甲酰-苏氨酰-D-N甲基苯丙氨酰-脯氨酰-N甲基甘氨酰-N甲基缬氨酰内酯；
VII 取化合物3-苄氧基-4-甲基-2-硝基-苯甲酰-苏氨酰-D-N甲基苯丙氨酰-脯氨酰-N甲基甘氨酰-N甲基缬氨酰内酯46.2mg(0.057mmol)溶于8ml无水MeOH中，加入20mg 10％Pd/C，避光氢化2小时后过滤，滤液加至等体积的含有54.5mg(0.17mmol)K3Fe(CN)6的pH7.12的0.067M磷酸缓冲液中，空气中搅拌反应20分钟，用水稀释反应体系，EtOAc萃取产物，产物用饱和NaHCO3水溶液洗涤三次，10％盐酸洗涤三次，饱和NaCl洗涤，无水Na2SO4干燥。过滤，减压蒸除溶剂，粗产物经硅胶柱层析(EtOAc:MeOH 5:1)，得到红色固体[D-MePhe2]2AMD，1H NMR：7.54(1H，d，8-H)，7.72(1H，d，7-H)，7.26(10H，s，Phe-ArH)，3.09(6H，d，N-CH3)，3.00(6H，d，N-CH3)，2.80(6H，d，N-CH3)，2.56(3H，s，6-CH3)，2.27(3H，s，4-CH3)，1.25(6H，d，Thr-CH3)，0.88-0.99(12H，m，Val-CH3)；质谱(ESI-MS)m/z：1379、6549(MH+)，C72H91N12O16，计算值：1379.6676。
本发明的其他类似物的全合成过程与以上实施例相同并能得到类似的结果。
Claims (3)
1、如下式的放线菌素D的类似物，
其特征在于环五肽上的2位氨基酸Aa2为D型苯丙氨酸(D-Phe)，环五肽上5位氨基酸Aa5是D型N甲基缬氨酸(D-MeVal)。
2、权利要求1所述的放线菌素D的类似物的制备方法，其特征是将化合物N-苄氧羰基-N-甲基甘氨酸叔丁酯溶于甲醇中，用10％钯碳催化氢化，脱去Z保护基后，与N-苄氧羰基-脯氨酸(Z-Pro)通过DCC缩合得到二肽，再经过催化氢化脱去Z保护基后，与2位氨基酸Aa2通过DCC缩合得到三肽，再经过催化氢化脱去Z保护基后与N-苄氧羰基-苏氨酸(Z-Thr)用DCC/HOBt活化酯法缩合得到四肽；再将四肽与Aa5用DCC缩合，并用DMAP催化反应得到线性五肽，再用三氟乙酸脱除五肽N端BOC和C端O1Bu保护后，用三乙胺将体系调为中性，用BOP-Cl作为缩合剂在二氯甲烷(DCM)中反应得到环五肽，再经催化氢化脱除Z-Thr的Z保护基后，用DCC/HOBt活化酯法与3-苄氧基-4-甲基-2-硝基-苯甲酸(BMNBA)缩合，产物再经催化氢化后，在磷酸缓冲液中用K3Fe(CN)6氧化得到终产物。
3、根据权利要求2所述的放线菌D的类似物的制备方法，其特征在于生成环五肽的反应中所采用二氯甲烷与溶质的比例为0.8～1毫升∶1毫克，反应温度保持在25-29℃。
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| 抗癌药物放线菌素D 类似物的全合成及生物活性研究. 倪京满等.高等学校化学学报，第19卷第2期. 1998 |
| 抗癌药物放线菌素D 类似物的全合成及生物活性研究. 倪京满等.高等学校化学学报，第19卷第2期. 1998 * |
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