CN103134884B - 一种中药提取物中聚酰胺残留物的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种中药提取物中的杂质检测方法，特别涉及一种中药提取物中聚酰胺残留物的检测方法。

Description

一种中药提取物中聚酰胺残留物的检测方法

技术领域：

本发明涉及一种中药提取物中的杂质检测方法，特别涉及一种中药提取物中聚酰胺残留物的检测方法。

背景技术：

聚酰胺树脂是由ε-己内酰胺聚合而成的一类高分子化合物，由于ε-己内酰胺的开环聚合是一个复杂的可逆过程，反应平衡后的产物含有一定量的己内酰胺和环状低聚物，大约有2％己内酰胺和己内酰胺环状低聚体存在于聚酰胺树脂中成品中。为了保证安全，使用前进行精制。但生产过程中如果聚酰胺树脂脱落二聚体、三聚体等低聚物，则最后会残留在提取物中。由于己内酰胺环状低聚体也能引起不良反应，所以需对它们进行残留控制。

中药的一些成分需要经过聚酰胺树脂进行分离纯化，如果在分离纯化过程中最终产物含有聚酰胺残片或己内酰胺环状低聚体，则会导致不良后果，为检测中药提取物中聚酰胺残留物，本发明提供了一种便捷快速，灵敏度高的聚酰胺残留物的检测方法。

丹参为唇形科植物丹参(Salvia miltiorrhiza Bge)的干燥根及根茎，性苦、微寒，归心、肝经，具有祛瘀止痛、活血通经、清心除烦之功效，是常用的活血化淤中药^[1]。注射用丹参多酚酸的主要组分是丹参多酚酸，工艺过程中使用了聚酰胺树脂进行分离纯化。例如，专利公开号CN101434590A公开了一种丹参粗粉3kg，加盐酸水溶液15倍量，浸渍15次，每次6小时，过滤，滤液上聚酰胺柱(60-100目，1kg)柱，上完各次酸水浸渍液后，用18-19％乙醇水溶液洗聚酰胺柱除杂质，然后用水洗色谱柱，将醇洗净后，用0.01％碳酸氢钠水溶液洗色谱柱，收集洗脱液，用盐酸调洗脱液使pH值小于2，上大孔吸附树脂(AB-8，2kg)柱，上完大孔树脂柱后，用16％乙醇水溶液洗树脂柱除杂质，再用95％乙醇洗树脂柱，收集95％乙醇洗脱液，回收至干，得干粉A，取干粉A，加丙醇10倍量溶解，过滤，回收滤液至干，得干粉B，取干粉B，加乙酸乙酯10倍量溶解，过滤，回收滤液至干，得干粉C，取干粉C，加60％乙醇水溶液适量溶解，上sephadexLH-20柱，用60％乙醇水溶液洗色谱柱，根据TCL合并洗脱液，回收至干，得干粉丹酚酸B.专利公开号CN101721468A公开了丹参饮片1000g，7000ml80％乙醇回流提取四次，每次1小时，合并提取液，浓缩至无醇味，浓缩液用10％盐酸调PH值到3.2，离心，上清液通过400g聚酰胺，10000ml水冲洗，0.1％碳酸氢钠10000ml，洗脱，洗脱液10％盐酸调pH值到3.2，通过1000Gab-大孔树脂5000ml水冲洗，10000ml 160％乙醇溶液，浓缩乙醇洗脱液，喷雾干燥，得提取物52g，丹酚酸B含量65％，丹参总酚酸86％。

本发明以丹参多酚酸为例，选择一种高效液相色谱法检测其中聚酰胺残留物的方法。

发明内容：

本发明涉及的是一种中药提取物中聚酰胺残留物及丹酚酸中聚酰胺残留物的检测方法。

发明人在研究过程中发明发现：聚酰胺树脂通过酸水解生成己内酰胺，进一步被水解生成氨基己酸，其聚酰胺的水解过程如下

聚酰胺水解反应式

水解后，通过高效液相色谱法对聚酰胺树脂水解液进行测定，发现只含有氨基己酸，不含有己内酰胺，说明水解已经完全。利用该水解条件可以对中药提取物进行水解。

本发明的技术方案是这样实现的：

本发明一种中药提取物中聚酰胺残留物的检测方法，包括如下步骤：

步骤1，供试品溶液制备；取中药提取物，加15-25倍量酸水解4-14小时，取水解液调节pH，摇匀，即可；

步骤2，对照品溶液制备；取氨基己酸，加水溶解，定容至容量瓶中，摇匀，即得氨基己酸对照溶液；取己内酰胺，加水溶解，定容至容量瓶中，摇匀，即得己内酰胺对照品溶液。

步骤3，注入高效液相色谱仪，得到色谱图；

步骤4，根据色谱图得到供试品溶液中聚酰胺残留物成分的种类和含量。

上述优选步骤1中所述的酸为强酸，包括但不限于三氟甲磺酸、磺酸、硝酸、三氟乙酸、三氯乙酸、甲磺酸、苯磺酸、草酸、甲酸、盐酸、硫酸、磷酸等，优选盐酸，浓度为20-60％浓硫酸，最佳为浓盐酸或40％浓硫酸。步骤1具体方案为用18-22倍量的硫酸或浓盐酸，酸解时间为4-12小时，pH值为5-8，最佳为20倍量浓盐酸，回流水解，回流12h，pH至6-7。

上述优选步骤2中氨基己酸对照溶液溶液浓度为1.5-2.0mg/ml，己内酰胺对照品溶液浓度为1.5-2.0mg/ml。

上述优选步骤3中所述的高效液相色谱条件：

测定氨基己酸的高效液相色谱条件如下：色谱柱：250×4.6mm，5μm，流动相：甲醇-水梯度洗脱如表1；柱温：30-35℃；检测波长：209nm；流速：0.5-1.0mL.min^-1；进样量为8-15μL；

表1梯度条件

测定己内酰胺的高效液相色谱条件如下：色谱柱：250×4.6mm，5μm；流动相：乙腈-水梯度洗脱；检测波长为209nm；柱温：30-35℃；流速为0.5-1.5mL.min^-1；进样量为10-15μL；

表2梯度条件

进一步优选步骤3中所述的高效液相色谱条件：测定氨基己酸的高效液相色谱条件为色谱柱：T3  250×4.6mm，5μm，；流动相：甲醇-水梯度洗脱见表3，柱温：30℃；检测波长：209nm；流速：0.5mL.min^-1；进样量为10μL，

表3梯度条件

测定己内酰胺的高效液相色谱条件：色谱柱：waters symmetryC₁₈250×4.6mm，5μm柱，流动相：乙腈-水梯度洗脱见表4；检测波长为209nm；柱温：35℃；流速为1.0mL.min^-1；进样量为10μL，

表4梯度条件

本发明中所述的酸用量单位为重量体积比。

本发明所述的中药提取物中聚酰胺残留物的检测方法是对任何一种经过聚酰胺柱层析的中药提取物样品的检测方法，优选所述中药提取物为银杏叶提取物或芦荟提取物或决明子提取物或丹参多酚酸提取物，最佳为丹参多酚酸提取物。

因此，将聚酰胺检测方法应用到具体中药提取物中方法如下

优选本发明的中药提取物聚酰胺残留物的检测方法，包括如下步骤：

步骤1、取丹参多酚酸提取物或银杏叶提取物或芦荟提取物或决明子提取物，加15-25倍量酸水解4-14小时，取水解液调节pH，摇匀，加水定容后，精密量取一定溶液过色谱柱，用水洗脱，收集洗脱液并定于容量瓶中，即可；

步骤2，对照品溶液的制备：对照品溶液制备：取氨基己酸，加水溶解，定容至容量瓶中，摇匀，即可；取己内酰胺，加水溶解，定容至容量瓶中，摇匀，即得己内酰胺对照品溶液；

步骤3，注入色谱仪，得到色谱图；

步骤4，根据色谱图得到供试品溶液中聚酰胺残留物成分的种类和含量。

上述检测方法中还增加测定检测限步骤，其中最低检测量为4.4-4.6ng，最低检测浓度为4.4-4.5μg.mL^-1。

上述优选步骤1中所述的酸为强酸，包括但不限于三氟甲磺酸、磺酸、硝酸、三氟乙酸、三氯乙酸、甲磺酸、苯磺酸、草酸、甲酸、盐酸、硫酸、磷酸等，优选盐酸，浓度为20-60％浓硫酸，最佳为浓盐酸或40％浓硫酸。步骤1具体方案为用18-22倍量的硫酸或浓盐酸，酸解时间为4-12小时，pH值为5-8，最佳为20倍量浓盐酸，回流水解，回流12h，pH至6-7。步骤1中所述的色谱柱为固相萃取柱SPE柱，包括但不限于C18柱、C8柱、C2柱、硅胶Silica柱、苯基Phenyl柱、氨基Amino-NH2柱、氨基Amino-NH2柱等，

上述优选步骤2中氨基己酸对照溶液溶液浓度为1.5-2.0mg/ml，己内酰胺对照品溶液浓度为1.5-2.0mg/ml。

上述优选步骤3中所述的高效液相色谱条件：

测定氨基己酸的高效液相色谱条件如下：色谱柱：250×4.6mm，5μm，流动相：甲醇-水梯度洗脱如表1；柱温：30-35℃；检测波长：209nm；流速：0.5-1.0mL.min^-1；进样量为8-15μL；

表1梯度条件

进一步优选步骤3中所述的高效液相色谱条件：测定氨基己酸的高效液相色谱条件为色谱柱：T3  250×4.6mm，5μm，；流动相：甲醇-水梯度洗脱见表1，柱温：30℃；检测波长：209nm；流速：0.5mL.min^-1；进样量为10μL，

表1梯度条件

本发明最佳检测方法，包括如下步骤：

步骤1，供试品溶液的制备：取丹参多酚酸提取物，加入20倍量浓盐酸，加热回流水解12h，将水解液过滤，加水定容至50mL，摇匀。精密量取上述水解液10mL，加入氢氧化钠溶液调节pH至6-7，加水定容至25mL容量瓶中，摇匀，备用。精密量取上述溶液10mL，上已处理好的SPE商品柱，流速约1.0mL·min^-1，用水15mL洗脱，收集洗脱液于25mL量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，

步骤2，对照品溶液的制备：取氨基己酸89.87mg，加水溶解，定容至50mL容量瓶中，摇匀，即可。

步骤3，注入色谱仪，得到色谱图；

步骤4，根据色谱图得到供试品溶液中聚酰胺残留物成分的种类和含量；其中氨基己酸液相色谱条件

色谱柱：T3(250×4.6mm，5μm，美国Waters公司)；流动相：甲醇-水梯度洗脱见表3；柱温：30℃；检测波长：209nm；流速：0.5mL.min^-1；进样量为10μL。

表3梯度条件

本发明中所述的酸用量倍数单位为重量体积比。

本发明的检测方法，是经过筛选获得的，筛选过程如下

试验例一聚酰胺水解试验

1.仪器和材料

Waters 2695高效液相制备色谱仪，配Waters 2998双波长检测器(美国Waters公司)；AL 204型万分之一电子分析天平，XS 105型十万分之一电子分析天平(瑞士METTLER公司)；HI 9025便携式pH计，EMS-10型磁力搅拌器(天津欧诺仪器仪表有限公司)；DGG-101-1BS型电热鼓风干燥箱(天津市天宇实验仪器有限公司)；KQ-500DE型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；色谱柱：T3(250×4.6mm，5μm，美国waters公司)；DIKMA ProElut^TMSPE小柱(北京迪马科技有限公司)。

丹参多酚酸(10批：20051102批、20051201批、20051202批、20051204批、20090601批、20090602批、20090603批、20100201批、20100301批、20100801批，天津天士力之骄药业有限公司提供)；聚酰胺树脂(台州台州市路桥四甲生化塑料厂，目数：30～60目，批号：20050510)；氨基己酸(国药集团化学试剂公司，批号：F20110112)；甲醇(色谱纯)；其它试剂(分析纯)。

2.聚酰胺树脂的水解

2.1液相条件

2.1.1氨基己酸液相色谱条件

色谱柱：T3(250×4.6mm，5μm，美国Waters公司)；流动相：甲醇-水梯度洗脱(梯度洗脱程序见表1)；柱温：30℃；检测波长：209nm；流速：0.5mL.min^-1；进样量为10μL。

2.1.2己内酰胺液相色谱条件

色谱柱：(250×4.6mm，5μm柱，美国Waters公司)；流动相：乙腈-水梯度洗脱(梯度洗脱程序见表2)；检测波长为209nm；柱温：35℃；流速为1ml.min^-1；进样量为10μL。

2.2聚酰胺树脂水解液的制备

2.2.1聚酰胺树脂盐酸水解液的制备

称取聚酰胺树脂10.0g，加入200mL浓盐酸，回流水解，分别回流4h、6h、8h、10h、12h。最后将水解液加水定容至250mL，摇匀，备用。精密量取50mL水解液，调节pH至6～7，加水定容至100mL容量瓶中，摇匀，即可。

2.2.2聚酰胺树脂40％硫酸水解液的制备

称取聚酰胺树脂10.0g，加入200mL40％硫酸，按照“2.2.1操作步骤制备水解4h、6h、8h、10h的水解液”。

2.2.3聚酰胺树脂甲酸水解液的制备

称取聚酰胺树脂10.0g，加入200mL甲酸，按照“2.2.1操作步骤制备水解4h、6h、8h、10h的水解液”。

2.3氨基己酸标准溶液的制备

取氨基己酸89.87mg，加水溶解，定容至50mL容量瓶中，摇匀，即可。

2.4聚酰胺树脂的水解实验结果

将聚酰胺树脂盐酸水解液、40％硫酸水解液、甲酸水解液和氨基己酸溶液，按照“2.1.1和2.1.2色谱条件”进样测定，实验结果见下表4-6。

表4盐酸水解聚酰胺树脂水解率

表540％硫酸水解聚酰胺树脂水解率

2.5结果讨论

聚酰胺树脂在酸性条件下能被水解，首先水解成己内酰胺，进一步被水解成氨基己酸。通过考察浓盐酸、40％硫酸、甲酸和不同水解时间对聚酰胺树脂水解程度的影响，发现甲酸能溶解聚酰胺树脂，但是不能完全水解聚酰胺树脂；40％硫酸水解聚酰胺树脂10h后，水解率达到98％，但是稳定性不好；浓盐酸水解12小时后，聚酰胺树脂的水解率达到98％，而且稳定性好。水解过程中通过GC-MS检测，发现己内酰胺和二聚体存在，进一步证实聚酰胺树脂被逐步水解。

试验例二丹参多酚酸水解实验方法学验证

1.1样品的制备

取丹参多酚酸提取物约2.0g，加入40mL浓盐酸，加热回流水解12h。将水解液过滤，加水定容至50mL，摇匀。精密量取上述水解液10mL，加入氢氧化钠溶液调节pH至6～7，加水定容至25mL容量瓶中，摇匀，备用。精密量取上述溶液10mL，上已处理好的SPE商品柱，流速约1.0mL·min^-1，用水15mL洗脱，收集洗脱液于25mL量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀。

1.2检测限

取氨基己酸11.25mg，定容至50mL容量瓶中，摇匀即可。然后逐步稀释，并进行高效液相色谱检测，直到信噪比(S∶N)为1∶3时，测得浓度为4.5223μg.mL^-1，即最低检测量为4.5223ng，最低检测浓度为4.5223μg.mL^-1。

1.3线性关系的考察

取氨基己酸350.63mg，加水充分溶解后，定容至50mL容量瓶中，摇匀，即可。然后逐步稀释得到五个浓度梯度，分别7.0126mg.mL^-1，1.7974mg.mL^-1，0.2250mg.mL^-1，0.0843mg.mL^-1，0.0045mg.mL^-1，“按2.1.1项色谱条件测定”，记录色谱图及峰面积。以峰面积对照品浓度进行回归处理，计算氨基己酸的线性回归方程及线性范围。结果r＝0.9995，在7.0126～0.0045mg.mL^-1.范围内，线性关系良好，实验结果见表7。

表7氨基己酸线性回归方程和线性范围

1.4精密度实验

精密吸取氨基己酸溶液10μL，“按2.1.1项色谱条件”连续进样6次，测得氨基己酸峰面积RSD依次为1.14％，表明仪器精密度良好。

1.5回收率实验

1.5.1氨基己酸回收率实验

取多酚酸提取物约1.0g，添加氨基己酸约1.0g，加入40mL盐酸，加热回流水解12h。将水解液过滤，加水定容至50mL量瓶中，摇匀，备用。精密量取上述水解液10mL，加入氢氧化钠溶液调节pH至6～7之间，最后定容至25mL容量瓶中，摇匀，备用。精密量取上述溶液10mL，上已处理好的SPE商品柱，流速约1.0mL·min^-1，用水15mL洗脱，收集洗脱液于25mL量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，平行6份，“按2.1.1项色谱条件”，测得氨基己酸回收率为96.62％，其RSD值为1.17％，表明该方法回收率良好，实验结果见下表8。

表8加样回收率实验结果(n＝6)

1.5.2聚酰胺树脂回收率实验

取丹参多酚酸提取物约1.0g，添加聚酰胺树脂约1.0g，加入40mL盐酸，加热回流水解12h，将水解液过滤，加水定容至50mL量瓶中，摇匀，备用。精密量取上述水解液10mL，加入氢氧化钠溶液调节pH至6～7之间，最后定容至25mL容量瓶中，摇匀，备用。精密量取上述溶液10mL，上已处理好的SPE商品柱，流速约1.0mL·min^-1，用水15mL洗脱，收集洗脱液于25mL量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，平行6份，“按2.1.1项色谱条件”，测得聚酰胺树脂的回收率为101.27％，RSD％值为4.33％，表明该方法回收率良好，实验结果见表9。

表9加样回收率实验结果(n＝6)

综上可知，在添加氨基己酸和聚酰胺树脂的回收率实验中能达到满意的实验结果，表明该方法回收率良好。

目前对聚酰胺树脂残留测定的研究还没有见过相关报道，本实验将水解聚酰胺树脂的方法应用于丹参多酚酸水解，然后使用SPE固体萃取小柱富集纯化建立测定检测己内酰胺和低聚物残留的方法。由于丹参多酚酸中成分复杂，在使用浓盐酸水解过程中可能会产生很多未知产物。同时氨基己酸极性很强，出峰时间早，容易被丹参多酚酸水解液中的物质所掩盖。所以本次实验使用SPE固体萃取小柱，对样品进行除杂净化和对氨基己酸进行富集。回收率实验采用在样品中添加氨基己酸和添加聚酰胺树脂两种方法，并进行了方法学验证，证明方法学良好。

氨基己酸含量测定的方法研究相对较少，本次实验对洗脱溶剂、色谱柱和液相条件分别进行了摸索。经过多次实验发现使用甲醇梯度洗脱与乙腈相比，氨基己酸的分离度更好；通过在样品中添加氨基己酸的方法，对液相条件和色谱柱进行的摸索，发现普使用T3色谱柱能使氨基己酸得到很好的分离，能够满足定量测定的要求。

附图说明：

图1丹参多酚酸、氨基己酸和阴性对照HPLC叠加图(图中从下到上依次为1.20051102批；2.20051201批；3.20051202批；4.20051204批；5.20090601批；6.20090602批；7.20090603批；8.20100201批；9.20100301批；10.20100801批；11.氨基己酸；12.阴性对照)

具体实施方式：

为了更好的了解本发明，以下通过实施例进一步说明本发明，但不作为对本发明的限制。

实施例1

(1)供试品溶液的制备：取10批丹参多酚酸提取物约2.0g，加入40mL浓盐酸，加热回流水解12h。将水解液过滤，加水定容至50mL，摇匀。精密量取上述水解液10mL，加入氢氧化钠溶液调节pH至6～7，加水定容至25mL容量瓶中，摇匀，备用。精密量取上述溶液10mL，上已处理好的SPE商品柱，流速约1.0mL·min^-1，用水15mL洗脱，收集洗脱液于25mL量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀。

(2)检测限设定：取氨基己酸11.25mg，定容至50mL容量瓶中，摇匀即可。然后逐步稀释，并进行高效液相色谱检测，直到信噪比(S∶N)为1∶3时，测得浓度为4.5223μg.mL^-1，即最低检测量为4.5223ng，最低检测浓度为4.5223μg.mL^-1。

(3)对照品溶液的制备：取氨基己酸89.87mg，加水溶解，定容至50mL容量瓶中，摇匀，即可；利用空白溶剂作为阴性对照

(4)测定：色谱柱：T3(250×4.6mm，5μm，美国Waters公司)；流动相：甲醇-水梯度洗脱(梯度洗脱程序见下表1)；柱温：30℃；检测波长：209nm；流速：0.5mL.min^-1；进样量为10μL。

(5)测定结果：10批丹参多酚酸提取物中都没有检测到氨基己酸，说明丹参多酚酸提取物中不存在聚酰胺树脂中残留的己内酰胺和低聚物，HPLC叠加图见图1。

实施例2

供试品溶液的制备：取银杏叶提取物约3.0g，加入40mL浓盐酸，加热回流水解10h。将水解液过滤，加水定容至50mL，摇匀。精密量取上述水解液10mL，加入氢氧化钠溶液调节pH至6～7，加水定容至25mL容量瓶中，摇匀，备用。精密量取上述溶液10mL，上已处理好的SPE商品柱，流速约1.0mL·min^-1，用水15mL洗脱，收集洗脱液于25mL量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀。按照实施例一的色谱条件测定，结果银杏叶提取物中没有检测到氨基己酸，说明银杏叶提取物中不存在聚酰胺树脂中残留的己内酰胺和低聚物。

实施例3

步骤1，供试品溶液的制备：取芦荟提取物约2.5g，加入40mL浓盐酸，加热回流水解12h。将水解液过滤，加水定容至50mL，摇匀。精密量取上述水解液10mL，加入氢氧化钠溶液调节pH至6～7，加水定容至25mL容量瓶中，摇匀，备用。精密量取上述溶液10mL，上已处理好的SPE商品柱，流速约1.0mL·min^-1，用水15mL洗脱，收集洗脱液于25mL量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀。

按照实施例一的色谱条件测定，结果银杏叶提取物中没有检测到氨基己酸，说明银杏叶提取物中不存在聚酰胺树脂中残留的己内酰胺和低聚物。

实施例4

步骤1，供试品溶液的制备：取决明子提取物约4.0g，加入40mL浓盐酸，加热回流水解14h。将水解液过滤，加水定容至50mL，摇匀。精密量取上述水解液10mL，加入氢氧化钠溶液调节pH至6～7，加水定容至25mL容量瓶中，摇匀，备用。精密量取上述溶液10mL，上已处理好的SPE商品柱，流速约1.0mL·min^-1，用水15mL洗脱，收集洗脱液于25mL量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀。

实施例5

(1)供试品溶液的制备：取丹参多酚酸提取物约2.0g，加入40mL40％硫酸，加热回流水解10h。将水解液过滤，加水定容至50mL，摇匀。精密量取上述水解液10mL，加入氢氧化钠溶液调节pH至5～6，加水定容至25mL容量瓶中，摇匀，备用。精密量取上述溶液10mL，上已处理好的SPE商品柱，流速约1.0mL·min^-1，用水15mL洗脱，收集洗脱液于25mL量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀。按照实施例一的色谱条件测定，结果银杏叶提取物中没有检测到氨基己酸，说明银杏叶提取物中不存在聚酰胺树脂中残留的己内酰胺和低聚物。

实施例6

取丹参多酚酸提取物约2.0g，加入40mL50％硫酸，加热回流水解9h。将水解液过滤，加水定容至50mL，摇匀。精密量取上述水解液10mL，加入氢氧化钠溶液调节pH至5～6，加水定容至25mL容量瓶中，摇匀，备用。精密量取上述溶液10mL，上已处理好的SPE商品柱，流速约1.0mL·min^-1，用水15mL洗脱，收集洗脱液于25mL量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀。按照实施例一的色谱条件测定，结果银杏叶提取物中没有检测到氨基己酸，说明银杏叶提取物中不存在聚酰胺树脂中残留的己内酰胺和低聚物。

实施例7

取丹参多酚酸提取物约3.0g，加入45mL60％硫酸，加热回流水解10h。将水解液过滤，加水定容至50mL，摇匀。精密量取上述水解液10mL，加入氢氧化钠溶液调节pH至5～6，加水定容至25mL容量瓶中，摇匀，备用。精密量取上述溶液10mL，上已处理好的SPE商品柱，流速约1.0mL·min^-1，用水15mL洗脱，收集洗脱液于25mL量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀。按照实施例一的色谱条件测定，结果银杏叶提取物中没有检测到氨基己酸，说明银杏叶提取物中不存在聚酰胺树脂中残留的己内酰胺和低聚物。

实施例8

(1)供试品溶液的制备：取10批丹参多酚酸提取物约2.0g，加入40mL浓盐酸，加热回流水解12h。将水解液过滤，加水定容至50mL，摇匀。精密量取上述水解液10mL，加入氢氧化钠溶液调节pH至6～7，加水定容至25mL容量瓶中，摇匀，备用。精密量取上述溶液10mL，上已处理好的SPE商品柱，流速约1.0mL·min^-1，用水15mL洗脱，收集洗脱液于25mL量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀。

(2)检测限设定：取氨基己酸11.25mg，定容至50mL容量瓶中，摇匀即可。然后逐步稀释，并进行高效液相色谱检测，直到信噪比(S∶N)为1∶3时，测得浓度为4.5223μg.mL^-1，即最低检测量为4.5223ng，最低检测浓度为4.5223μg.mL^-1。

(3)对照品溶液的制备：取氨基己酸89.87mg，加水溶解，定容至50mL容量瓶中，摇匀，即可；利用空白溶剂作为阴性对照

(4)测定：色谱柱：T3(250×4.6mm，5μm，美国Waters公司)；流动相：甲醇-水梯度洗脱(梯度洗脱程序见下表1)；柱温：35℃；检测波长：209nm；流速：1.0mL.min^-1；进样量为15μL。

(5)测定结果：10批丹参多酚酸提取物中都没有检测到氨基己酸，说明丹参多酚酸提取物中不存在聚酰胺树脂中残留的己内酰胺和低聚物。

参考文献

[1].柴瑞震.丹参的药理研究近况[J].中国中药科技，2003，10(6)：390～392.

[2].毛新华，李卓志.提高蒸馏残渣中己内酰胺的回收率[J].合成纤维工业，1995，18(5)：51～53.

[3].徐贻萍，马伯，王湘苏，等.低浓度己内酰胺对作业工人的健康影响的调查[J].中国工业医学杂志，1997，5：290.

[4].林加锋.己内酰胺中毒10例分析[J].急救医学分杂志，1999，8(40)：268.

[5].彭治汉，施祖培.塑料工业手册聚酰胺[M].化学工业出版社，2001：85～89.

[6].崔焕茹.利用己内酰胺制取氨基己酸[J].河北化工，2003，4：24～25.

Claims (6)

1.一种中药提取物中聚酰胺残留物的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤1、取丹参多酚酸提取物或银杏叶提取物或芦荟提取物或决明子提取物，加15-25倍量酸水解4-14小时，取水解液调节pH，摇匀，加水定容后，精密量取一定溶液过色谱柱，用水洗脱，收集洗脱液并定于容量瓶中，即可；

步骤2，对照品溶液的制备：取氨基己酸，加水溶解，定容至容量瓶中，摇匀，即得氨基己酸对照品浓度为1.5-2.0mg/ml，取己内酰胺，加水溶解，定容至容量瓶中，摇匀，即得己内酰胺对照品溶液浓度为1.5-2.0mg/ml；

步骤3，注入高效液相色谱仪，得到色谱图，所述的高效液相色谱条件：测定氨基己酸的高效液相色谱条件如下：色谱柱：250×4.6mm，5μm，流动相：甲醇-水梯度洗脱；柱温：30-35℃；检测波长：209nm；流速：0.5-1.0mL.min^-1；进样量为8-15μL；

梯度条件

测定己内酰胺的高效液相色谱条件如下：色谱柱：250×4.6mm，5μm；流动相：乙腈-水梯度洗脱；检测波长为209nm；柱温：30-35℃；流速为0.5-1.5mL.min^-1；进样量为10-15μL；

梯度条件

步骤4，根据色谱图得到供试品溶液中聚酰胺残留物成分的种类和含量。

2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤1中所述的酸为18-22倍量的硫酸或浓盐酸，酸解时间为4-12小时，pH值为5-8。

3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述步骤1中的酸为20倍量浓盐酸，回流12h，pH至6-7。

4.根据权利要求1的检测方法，其特征在于，步骤3中所述的高效液相色谱条件：测定氨基己酸的高效液相色谱条件为色谱柱：T3 250×4.6mm，5μm；流动相：甲醇-水梯度洗脱，柱温：30℃；检测波长：209nm；流速：0.5mL.min^-1；进样量为10μL，

梯度条件

测定己内酰胺的高效液相色谱条件：色谱柱：watersC₁₈250×4.6mm，5μm柱，流动相：乙腈-水梯度洗脱；检测波长为209nm；柱温：35℃；流速为1.0mL.min^-1；进样量为10μL，

梯度条件

5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，还增加测定检测限步骤，其中最低检测量为4.4-4.6ng，最低检测浓度为4.4-4.5μg.mL^-1。

6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤1，供试品溶液的制备：取丹参多酚酸提取物2.0g，加入40ml浓盐酸，加热回流水解12h，将水解液过滤，加水定容至50mL，摇匀，精密量取10mL，加入氢氧化钠溶液调节pH至6-7，加水定容至25mL容量瓶中，摇匀，备用，精密量取10mL，上已处理好的SPE商品柱，流速1.0mL·min^-1，用水15mL洗脱，收集洗脱液于25mL量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀；

步骤2，对照品溶液的制备：取氨基己酸89.87mg，加水溶解，定容至50mL容量瓶中，摇匀，即可；

步骤3，注入色谱仪，得到色谱图；

步骤4，根据色谱图得到供试品溶液中聚酰胺残留物成分的种类和含量；其中氨基己酸液相色谱条件

色谱柱：T3 250×4.6mm，5μm；流动相：甲醇-水梯度洗脱；柱温：30℃；检测波长：209nm；流速：0.5mL.min^-1；进样量为10μL，

梯度条件