CN103131781A - 中成药中生物类伪品dna的pcr检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及分析检测技术领域，公开了一种利用聚合酶链式反应（PCR）检测中成药中生物类伪品DNA的方法。具体包括中成药中生物类样品DNA的提取、PCR反应和PCR扩增产物分析。本发明在普通PCR的基础上，建立巢式PCR反应方法，可快速、准确、灵敏地检测中成药中的生物类伪品DNA，为中成药的质量控制提供简单快速有效的方法。

Description

中成药中生物类伪品DNA的PCR检测方法

技术领域

本发明属于中成药真伪性的鉴定方法，具体地说是利用PCR技术检测中成药中生物类伪品DNA的一种方法。

背景技术

传统的中成药的质量控制仅限于对药品性状上的鉴别以及化合物的含量测定。中药材制成中成药，原药材经多种制剂工艺制成中成药时其本身的性状已难以辨别；而中药本身成分复杂，一味药就含有几十甚至数百个化合物，一个由多种中药组成的中成药，其中化学成分就更多了，目前仅选择有限的几种化学成分的鉴定来控制中成药的质量，就为中成药造假者提供了很大的空间，某些厂家为了降低成本，对于某些价格昂贵的药材，常常以其他价格更低的药材以假充真。本方法通过PCR的扩增，对经过高度工业加工的中成药仍可以检测出其中生物类样品及其伪品的DNA,克服了现有技术的不足，可以简便、快速、准确地判断出中成药中是否掺假，并且需要的样品量极少，而且对几乎所有生物类中成药都适用。

发明内容

本发明的目的是提供一种PCR检测中成药中伪品DNA的方法。

本发明上述方法是利用聚合酶链式反应（PCR）扩增中成药中伪品特异性的DNA来检测中成药中伪品的DNA。

本发明的一种中成药中生物类伪品DNA的PCR检测方法是利用PCR扩增中成药中生物类伪品特异性的DNA来检测中成药中生物类伪品的DNA，从而达到鉴定中成药真伪性的目的。

本发明上述方法中，所检测对象为中成药，即含有生物类样品的中成药。

本发明的一种PCR检测中成药中生物类伪品DNA的方法包括下列步骤：

1）中成药中生物类伪品DNA的提取；

2）PCR反应；

3）PCR扩增产物分析。

上述方法中，步骤1）中对于固体剂型的中成药采用改良的CTAB法提取DNA；对于液体剂型的中成药采用乙醇重结晶的方法提取。

上述方法中，步骤2）中对于DNA含量较高的中成药采用普通PCR，对于DNA含量较低的中成药采用巢式PCR。

具体地，本发明提供的一种中成药中生物类伪品DNA的PCR检测方法包括下列步骤：

1.中成药中生物类伪品DNA的提取：

固体剂型的中成药采用改良的CTAB法提取。①药品适量在研钵中研磨成细粉取粉末少量(1.5mL EP管的最小刻度0.1mL处)于1.5mL EP管中，加入65℃预热的CTAB提取缓冲液700μl，充分振荡混匀，65℃温浴2h;②样品冷却至室温后加氯仿-异戊醇(24:1)600μl，颠倒混匀5分钟;③7500r.min^-1离心10分钟，转移上清液至一新的EP管中;④加入等体积-20℃预冷的异丙醇，混匀，20℃放置30分钟;⑤10,000r.min^-1离心15分钟，弃上清液;⑥沉淀用70%乙醇、无水乙醇各洗涤一次，10,000r.min^-1离心3分钟，弃上清液，室温挥干乙醇，无菌高纯水溶解DNA，备用。所述CTAB提取缓冲液含有：2%CTAB（十六烷基三甲基溴化铵），100mM Tris(pH8.0)，20mM EDTA(pH8.0)，2.5M NaCl。

液体剂型的中成药采用乙醇重结晶的方法提取。①10mL药液加入1mL3M醋酸钠（pH=5.2）,30mL无水乙醇，30μl糖原（glycogen）,-20℃放置1.5h。②14,000r.min^-1离心10分钟，弃上清。③70%乙醇洗涤，16,000r.min^-1离心5分钟，弃上清。④挥干乙醇，无菌高纯水溶解DNA，备用。

2.普通PCR反应体系及条件：

10×Taq buffer5μl;Taq酶5个单位；

正向引物1μM;反向引物1μM；

dNTPs0.2mM；DNA提取液1μl.

95℃解链3分钟；94℃变性30秒，50-65℃复性30秒，72℃延伸30秒，循环30次；72℃延伸5分钟，得扩增样品。

3.巢式PCR反应体系及条件：

第一轮PCR：

10×Taq buffer5μl;Taq酶5个单位；

正向引物0.25μM;反向引物0.25μM；

dNTPs0.2mM；DNA提取液5μl.

95℃解链3分钟；94℃变性30秒，50-65℃复性30秒，72℃延伸30秒，循环25次；72℃延伸5分钟，得扩增样品。

第二轮PCR同普通PCR操作。

4.PCR扩增产物分析：

取5μl扩增后的样品，与1μl6倍DNA上样缓冲液混合，在含有Gelview核酸染料的琼脂糖胶上进行电泳和显色，在透射紫外灯下观察，样品孔含有一条目的条带的为含有伪品或污染的阳性样品。

本发明原理为：通过CTAB法或者乙醇重结晶的方法可以提取出中成药中生物类样品的DNA，PCR反应试剂管中含有多聚酶链式反应试剂，可对试剂管中伪品的DNA进行特异的扩增，由于所使用的引物为特定伪品所特有，因此，如果样品中含有该伪品，那么它的DNA特异片段在经过扩增后，在含有Gelview核酸染料的琼脂糖胶上进行电泳和显色，紫外光检测就可以探测到一定长度片段的目的条带，如果没有该伪品，则不能扩增到同样长度片段的目的条带。

本发明具有明显优于现有技术的优点，其主要优点包括：

新颖性。本方法是首次将PCR检测DNA的方法应用到中成药的真伪性的鉴别上。

灵敏性。由于DNA本身的稳定性，通过各种制剂工艺的加工之后仍然不会被完全破坏，再通过PCR（聚合酶链式反应）指数型的扩增，以及巢式PCR作为辅助手段可以检测到极微量的DNA。

实用性。采用本发明方法控制中成药的质量成本低廉，无需昂贵的检测设备，且检测十分快速，4-6小时即可得知检测结果。

附图说明

图1是藿香正气水中水半夏（水半夏为半夏的伪品）DNA的PCR检测结果，其中1表示阴性对照，2表示藿香正气水，3表示阳性对照（以水半夏药材DNA提取液作为模板）

具体实施方式

下面结合附图，通过实例进一步说明本发明。本领域的技术人员应理解，这些实例仅用于说明本发明，而不用于限制本发明的范围。

实施例1、

藿香正气水中水半夏（水半夏为半夏的伪品）DNA的PCR检测。

（1）中成药中生物类伪品DNA的提取：

①10mL药液加入1mL3M醋酸钠（pH=5.2）,30mL无水乙醇，30μl糖原（glycogen）,-20℃放置1.5h。②14,000r.min^-1离心10分钟，弃上清。③70%乙醇洗涤，16,000r.min^-1离心5分钟，弃上清。④挥干乙醇，无菌高纯水溶解DNA，备用。

（2）PCR反应：

因为样品中DNA含量较少，采用巢式PCR反应扩增DNA。

第一轮PCR：

10×Taq buffer5μl;Taq酶5个单位；

正向引物0.25μM;反向引物0.25μM；

dNTPs0.2mM；DNA提取液1μl。

95℃解链3分钟；94℃变性30秒，56℃复性45秒，72℃延伸45秒，循环40次；72℃延伸5分钟，得扩增样品。

第二轮PCR：

10×Taq buffer5μl;Taq酶5个单位；

正向引物0.25μM;反向引物0.25μM；

dNTPs0.2mM；第一轮PCR产物5μl。

95℃解链3分钟；94℃变性30秒，62℃复性30秒，72℃延伸30秒，循环40次；72℃延伸5分钟，得扩增样品。

（3）PCR扩增产物分析：

将水半夏对照药材PCR产物送测序公司测序，序列正确。

取5μl扩增后的样品，与1μl6倍DNA上样缓冲液混合，在含有Gelview核酸染料的琼脂糖胶上进行电泳和显色，在透射紫外灯下观察，藿香正气水样品孔含有一条与阳性对照相同位置相同的条带，表明该藿香正气水掺有水半夏伪品，参见附图1。

本发明原理为：通过柱吸附方法可以提取出中成药中植物的DNA，PCR反应试剂管中含有聚合酶链式反应试剂，可对试剂管中生物类伪品DNA进行特异的扩增，由于本发明的引物为水半夏所特有，因此，如果样品中含有水半夏，那么它的DNA特异片段在经过扩增后，在含有Gelview核酸染料的琼脂糖胶上进行电泳和显色，紫外光检测就可以探测到一定长度片段的目的条带，如果没有水半夏，则不能扩增到同样长度片段的目的条带。

Claims (4)

1.一种中成药中生物类伪品DNA的PCR检测方法，其特征在于，所述方法是利用PCR扩增中成药中生物类伪品特异性的DNA来检测含有生物类样品的中成药中生物类伪品的DNA，从而达到鉴定中成药真伪性的目的。

2.根据权利要求1或2所述的检测方法，其特征在于，所述方法包括下列步骤：

1）中成药中生物类伪品DNA的提取；

2）PCR反应；

3）PCR扩增产物分析。

3.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤1）中对于固体剂型的中成药采用改良的CTAB法提取DNA；对于液体剂型的中成药采用乙醇重结晶的方法提取。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，对于DNA含量较高的中成药采用普通PCR，对于DNA含量较低的中成药采用巢式PCR。

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