CN103114097A - β微管蛋白-8基因片段的构建获得方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种β微管蛋白-8基因片段的构建获得方法，步骤包括：对棉花雄性花药的总DNA的提取，设计引物对靶序列进行PCR扩增，目的片段的回收；上述引物与靶序列间的Tm值在63.6~65.4℃，上述引物无发夹结构，上述引物内部链无二级结构。本发明的优点在于，提出了棉花核雄性不育系花药中高质量的总DNA提取方法以及β微管蛋白-8基因片段引物的设计，首次在棉花核雄性不育系中克隆了β微管蛋白-8基因片段，首次通过比较一个不育相关基因的片段在不育株与可育株中的DNA序列差异，从而进一步探讨其与不育性状的关系。
Description
技术领域
本发明涉及一种β微管蛋白-8基因片段的构建获得方法。
背景技术
花粉发育是一个十分复杂的过程。在这个过程中,涉及近万种花药特异基因的协同表达。Stinson等从重组cDNA文库中第一次分离出植物的花药、花粉特异性基因以来,迄今所发现并得到鉴定的花粉发育特异基因也不过几十种。这些花粉特异基因在植物发育过程中的表达受时间和空间调节。微管是细胞骨架的主要结构元件，参与细胞分裂，细胞内运输和细胞形态发生，在细胞壁合成中起着重要的作用，引导纤维素微纤丝的沉积，并且参与花粉管的生长与发育 。α微管蛋白（TUA）和β微管蛋白(TUB)被认为在植物细胞壁合成中引导纤维素的微纤丝的沉积。已发现许多微管蛋白基因只在花粉中特异表达，拟南芥TUAs中ArathTUA1在花粉中特异表达，而其他的仅在营养组织中表达；TUBs中，Arath-TUB1和5在根和叶中优先表达，而ArathTUB9则只在花粉中积累。水稻种也有花粉特异的亚型。在TUB基因第39位氨基酸残基插入一个或三个氨基酸残基可能与花粉发育有关。Oakley等发现，在胡杨中，TUB19和TUB20可能参与花粉发育，对于花粉管的生长和发育也是必不可少的。本因此，推测微管蛋白可能参与了不育的发生。马小定在以花粉为材料利用cDNA-AFLP分析核雄性不育系可育与不育花药差异表达基因时，找出了17个差异表达的基因，其相应的基因可能参与了信号转导，转录，能量代谢，和植物细胞壁的发展过程。其中包括一个β微管蛋白的同源基因其编号为EG036041，经过BLAST比对，得到与其片段同源性最高的是beta-tubulin-8基因。本研究以β微管蛋白-8基因为研究对象，通过分析其在可育株与不育株DNA序列的差异性，研究其对蛋白表达的影响，进而分析该基因对植株育性的调控。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种β微管蛋白-8基因片段的构建获得方法。
本发明是通过以下技术方案来实现的。
一种β微管蛋白-8基因片段的构建获得方法，步骤包括：对棉花雄性花药的总DNA的提取，设计引物对靶序列进行PCR扩增，目的片段的回收；上述引物与靶序列间的Tm值在63.6~65.4℃，上述引物无发夹结构，上述引物内部链无二级结构。
进一步地，上述对棉花雄性花药的总DNA的提取使用CTAB法。
进一步地，上述引物与非扩增区域无同源性，上下游引物间无同源序列。
进一步地，上述引物长度为24或25bp。
进一步地，上述引物为上游403bp和下游1047bp处长度分别为24bp和25bp的一对引物。
进一步地，上述引物为：
上游引物：5’ GGCTTCCAGGTATGCCATTCACTTG3’；
下游引物：5’ GGGAATCCACTCCACGAAGTATGA3’。
本发明的有益效果：
提出了棉花核雄性不育系花药中高质量的总DNA提取方法以及β微管蛋白-8基因片段引物的设计，首次在棉花核雄性不育系中克隆了β微管蛋白-8基因片段，首次通过比较一个不育相关基因的片段在不育株与可育株中的DNA序列差异，从而进一步探讨其与不育性状的关系。
具体实施方式
下面根据实施例对本发明作进一步详细说明。
1. 材料的选取。
取棉花核雄性不育系ms5ms6不育与可育株的花蕾，根据花蕾大小，取不育株和可育株各时期的花蕾(取样时间为上午6: 00-6: 30),结合花药涂片法、三酸法镜检，将花药整个发育时期划分为6个时期: 幼花药发育期（现蕾1-5天，直径1-3mm），花粉母细胞发育期（现蕾6-7天，直径3-4mm），花粉母细胞减数分裂期（现蕾8-9天，直径4-5mm），花粉粒发育期（现蕾10-11天，直径5-6mm），纤维层发育期（现蕾12-15天，直径6-7mm）和成熟花粉期（现蕾16-20天，直径7-8mm）。取100个单株的花药，包括50株可育株和50株不育株，保存于-70℃冰箱备用。
2. 总DNA的提取
用CTAB法提取DNA。
(1) 取适量棉花核雄性不育系和可育系的花药，加入适量的PVP，加液氮充分研磨至粉末状，转移至2ml离心管中，加入20-30μl β-巯基乙醇和1ml 65℃预热的提取缓冲液，轻轻混匀，65℃温浴30min；
(2) 于4℃ 12 000 rpm 离心10min，将上清液转移至另一新的2ml离心管中；
(3) 加入等体积酚（pH 8.0）：氯仿：异戊醇（25:24:1），轻轻混匀，于4℃12 000 rpm 离心10min，将上清液转移至另一新的2ml离心管中；
(4) 加入等体积的氯仿：异戊醇（24:1），于4℃ 12 000 rpm离心10min，将上清液转移至另一新的2ml离心管中（重复此步骤，直至界面干净）；
(5) 加入1/10体积的NaAc，2倍体积的无水乙醇，混匀，静止半小时，使絮状DNA充分析出，于4℃12 000 rpm 离心10min，弃去上清；
(6) 用75％乙醇洗沉淀2次，沉淀于室温风干，加入50μL TE充分溶解后，于-20℃保存备用。
3. β微管蛋白-8基因特异性引物的设计
利用DNAMAN软件，根据GenBank上已登录的棉花中beta-tubulin-8（β微管蛋白-8）基因全长cDNA序列，利用Primer Premier5.0软件设计一对简并引物，采用手动设计的方法，设定引物长度为24或25bp，分别寻找上游和下游引物，并将其进行组合，选取了综合评价分数值较高高的且扩增片段长度较为适合的一对引物组合如图。寻找到引物按以下原则：引物与靶序列间的Tm值不应过低，不要有发夹结构、引物内部链避免二级结构，引物不应与非扩增区域有同源性，上下游引物间不应有同源序列。最后取的引物组合为上游403bp和下游1047bp处长度分别为24bp和25bp的一对引物。
委托上海生物工程有限公司合成。
上游引物：5’ GGCTTCCAGGTATGCCATTCACTTG3’
下游引物：5’ GGGAATCCACTCCACGAAGTATGA3’
4. beta-tubulin-8基因DNA片段的PCR扩增
（1）PCR反应体系
在PCR管中依次加入：ddH2O 17.5μl，DNA模板1 μl，上游引物（10μmol/L）1μl，下游引物（10μmol/L）1μl，Taq酶 (5U) 0.5μl，dNTP (10 mmol/L) 2 μl，10×PCR Buffer 2.5μl。
（2）PCR反应条件
PCR反应条件为：94℃预热3min，94℃变性30s，62℃退火30s，72℃延伸2min，30个循环，72℃延伸10min。PCR产物于4℃保存。
上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此领域技术的人士能够了解本发明内容并加以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围内。
Claims (6)
1.一种β微管蛋白-8基因片段的构建获得方法，其特征在于，步骤包括：对棉花雄性花药的总DNA的提取，设计引物对靶序列进行PCR扩增，目的片段的回收；所述引物与靶序列间的Tm值在63.6~65.4℃，所述引物无发夹结构，所述引物内部链无二级结构。
2.根据权利要求1所述的β微管蛋白-8基因片段的构建获得方法，其特征在于，所述对棉花雄性花药的总DNA的提取使用CTAB法。
3.根据权利要求1所述的β微管蛋白-8基因片段的构建获得方法，其特征在于，所述引物与非扩增区域无同源性，上下游引物间无同源序列。
4.根据权利要求1或3所述的β微管蛋白-8基因片段的构建获得方法，其特征在于，所述引物长度为24或25bp。
5.根据权利要求4所述的β微管蛋白-8基因片段的构建获得方法，其特征在于，所述引物为上游403bp和下游1047bp处长度分别为25bp和24bp的一对引物。
6.根据权利要求5所述的β微管蛋白-8基因片段的构建获得方法，其特征在于，所述引物为：
上游引物：5’ GGCTTCCAGGTATGCCATTCACTTG3’；
下游引物：5’ GGGAATCCACTCCACGAAGTATGA3’。
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