CN101072877A - 小泡运输胁迫相关多肽及在植物中的使用方法 - Google Patents

Abstract

用小泡运输胁迫相关多肽(VTSRP)的编码核酸转化的转基因植物，其中植物中所述核酸序列的表达导致与野生型品种的植物相比，植物增加的生长和/或对环境胁迫的增强的耐受性。本发明还提供了通过该转基因植物产生的农产品，包括种子。本发明还提供了分离的VTSRP、分离的VTSRP编码核酸以及含有所述核酸的载体和宿主细胞。

Description

小泡运输胁迫相关多肽及在植物中的使用方法

相关申请的交叉参考

本申请要求2004年10月29日提交的美国临时专利申请序号60/522,708的优先权，将该申请的全部内容引入本文作为参考。

发明背景

技术领域

本申请一般涉及核酸序列，其编码与植物中非生物胁迫应答和非生物胁迫耐受性有关的多肽。具体地，本发明涉及赋予植物增加的生长和/或增强的干旱、寒冷和/或盐耐受性的多肽的编码核酸序列。

背景技术

非生物环境胁迫，如干旱胁迫、盐度胁迫、热胁迫和冷胁迫是植物生长和生产力的主要限制因素。这些胁迫导致主要作物如大豆、稻、玉米(玉蜀黍)、棉花和小麦的作物损失和作物产量损失代表的重要经济和政治因素，并且导致许多不发达国家的粮食短缺。

通常植物在其生命周期中暴露于环境水含量降低的条件下。多数植物已经进化出保护它们自身对抗这些干燥条件的策略。然而，如果干旱条件太严重性、持续时间太长，那么对多数作物植物的发育、生长和产量的影响是深远的。持续暴露于干旱条件导致植物代谢改变巨大，最终导致细胞死亡和随后的产量损失。

开发胁迫耐受性植物是具有解决或者调解至少部分这些问题的潜力的策略。然而，用来开发表现出对这类胁迫具有抗性(耐受性)的新植物品系的传统植物育种策略相对较慢，并且需要将特定抗性品系与目的品系杂交。胁迫耐受性的有限种质来源和远缘植物物种之间杂交的不相容性代表了常规育种中遇到的主要问题。此外，在模式干旱和/或盐耐受性植物中导致干旱、寒冷和盐耐受性的细胞过程在本质上是复杂的，并且涉及细胞适应的多种机制和许多代谢途径。胁迫耐受性的这种多组分性质不仅使得耐受性育种大多不成功，而且还限制了使用生物技术方法遗传改造胁迫耐受性植物的能力。

因此，需要鉴定参与导致生长增加和/或胁迫耐受性增强的这些多组分过程的基因和蛋白质。阐明在胁迫耐受性植物中表达的基因的功能不仅有助于我们理解植物对环境胁迫的适应和耐受性，而且可以提供设计作物改良新策略的重要信息。

有至少四种不同的信号转导途径在模式植物拟南芥(Arabidopsisthaliana)中导致胁迫耐受性。这些途径在不同的转录因子、蛋白激酶、蛋白质磷酸酶和其他信号转导途径组分的控制下(Shinozaki等人，2000，Curr.Op.Pl. Biol.3：217-23)。这些蛋白质是遗传设计胁迫耐受性的主要目标，因为它们能够发挥主要的开关作用；单个基因的改变可以引起导致胁迫耐受性的整条信号转导链的活化。

细菌和植物中渗透胁迫的感受通过双组分系统进行，所述系统包含感受蛋白和效应蛋白(Wurgler-Murphy SM和Saito S.，1997，Trends inBiochem.Sci.22：172-6；Shinozaki等人，2000，Curr.Op.Pl.Biol.3：217-23)。促分裂原活化蛋白激酶依赖性信号转导途径与这些蛋白质紧密相关。这些信号转导链的另一个主要组分是GTP结合蛋白(G蛋白)。一般而言，至少有三类G蛋白：a)异源三聚G蛋白(α、β和γ亚基)，b)单体(小)蛋白，和c)Dyanins。GTP结合蛋白如此命名是因为为了活化，它们中的每一个必须结合GTP。GTP结合蛋白功能多样，从直接传导外部信号(其中GTP结合蛋白与膜结合受体连接)至参与小泡运输，至将蛋白质输入亚细胞区室。

单体/小G蛋白参与多个不同的细胞过程，并涉及小泡运输/转运系统、细胞周期调控以及蛋白质输入细胞器。至今，已发现超过200种小G蛋白。基于结构和功能相似性，这些蛋白质可以划分为5个超家族：Ras、Rho/Rac/Cda42、Rab、Sar1/Arf和Ran。通常，仅小G蛋白Sar1和Rab家族的成员参与酿酒酵母(S.cerevisiae)和哺乳动物细胞的小泡运输(Takai等人，2001，Phys.Rev.81：153-208)。在植物中，已证明Rab G蛋白以其酵母和哺乳动物对应物相似的方式起作用。Rab G蛋白调节胞吞运输途径和生物合成运输途径。G蛋白的Sar1/Arf家族成员还可帮助募集外被蛋白质(coat protein)至转运小泡(Vernoud等人，2003，Plant.Physiol.131：1191-1208)。

SNARE蛋白质是G蛋白Rab家族的成员。SNARE(可溶N-乙基马来酰亚胺敏感因子吸附蛋白受体，或SNAP受体)蛋白质是胞质来源的膜蛋白，在小泡运输中起主要作用，并且在酵母和哺乳动物中是保守的。细胞器间的蛋白质转运通过转运小泡介导，所述转运小泡具有完整的膜蛋白(v-SNARE)，其选择性的与目的膜上的相似蛋白质(t-SNARE)相互作用，导致小泡停靠。

在胁迫适应中，植物反复利用其自身的组分，例如，将蛋白质从一个膜区室转运到另一个膜区室、在液泡中沉积不用的蛋白质，以及从ER到Golgi加工新合成的蛋白质。已表明小泡运输积极参与不利环境条件下的这种生物再利用过程。例如，Snsyrl，一种ABA相关的SNARE蛋白质，在气孔运动和根生长中起作用(Geelen，D.等人2002，Plant Cell 14：387-406)。

已鉴定了小G蛋白的几个组，与小G蛋白的Rab家族类似，在植物的干燥处理中被诱导(Bolte等人，2000，Plant Mol.Biol.42：923-36；O’Mahony和Oliver，1999，Plant Mol.Biol.39：809-21)。这些研究人员推测小G蛋白参与保持膜的完整，或在胁迫减轻时再构建膜。但是，他们没有制备通过超量表达这些小G蛋白而具有增加的胁迫耐受性的转基因植物。另外，已表明拟南芥AtRab7，小G蛋白Rab家族的另一个成员，在植物由坏死性(necrogenic)病原体感染后被诱导，并且已表明超量表达AtRab7增加转基因植物对盐和渗透胁迫的耐受性(Mazel等人，2004 PlantPhysiol.134：118-128)。

虽然植物中参与胁迫应答和水利用效率的一些基因已表征，赋予胁迫耐受性和水利用效率的植物基因的表征和克隆仍很不完全，很不完整。例如，某些研究已指出在一些植物中干旱和盐胁迫可能是由于累加的基因效应，这与其他研究相反，所述其他研究表明在渗透胁迫条件下，特定基因在植物的营养组织中在转录水平上被激活。虽然通常假定胁迫诱导的蛋白质在耐受性中具有作用，但仍然缺乏直接证据，并且许多胁迫应答基因的功能是未知的。

所有陆生光合生物在CO₂吸收和水损失之间存在基本的理化受限平衡(Taiz和Zeiger，1991，Plant Physiology，Benjamin/Cummings PublishingCo.，94页)。CO₂需要在水溶液中被CO₂固定化酶如Rubisco(核酮糖1，5-二磷酸羧化酶/加氧酶)和PEPC(磷酸烯醇丙酮酸羧化酶)作用。由于CO₂扩散需要湿润的细胞表面，当湿度低于100％时，将不可避免地发生蒸发(Taiz和Zeiger，1991，Plant Physiology，Benjamin/Cummings PublishingCo.，257页)。植物有许多生理学机制来减小水分损失(例如，蜡质表皮、气孔闭合、叶毛、下沉的气孔窝)。由于这些屏障不区分水和CO₂流，所以这些水保持措施将也增加对CO₂摄取的抗性(Kramer，1983，Water Relationsof Plants，Academic Press，305页)。在光能自养植物中光合CO₂吸收绝对是植物生长和生物量积累所需的。水利用效率(WUE)是通常用于估计耗水量和CO₂吸收/生长之间平衡的一个参数(Kramer，1983，Water Relationsof Plants，Academic Press，405页)。已经以多种方式定义和测定WUE。一种方法是计算完整植物干重与植物在其整个生命中消耗的水的重量的比率(Chu等人，1992，Oecologia 89：580)。另一变通方法是当测量生物量积累和水利用时使用较短的时间间隔(Mian等人，1998，Crop Sci.38：390)。常使用从植物的有限部分的测量，例如，仅测量气生生长和水利用(Nienhuis等人，1994，Amer.J.Bot.81：943)。还已经将WUE定义为CO₂摄入与从叶或者叶的部分的水蒸汽损失的比率，通常在非常短的时间段内测量(例如，数秒/分钟)(Kramer，1983，Water Relations of Plants，Academic Press，406页)。使用C₃光合作用，用同位素比率质谱仪测量的植物组织中固定的¹³C/¹²C的比率也已经用于估计植物中的WUE(Martin等人，1999，CropSci.1775)。

WUE的增加提供关于生长和水消耗的相对提高的效率的信息，但是该信息单独不能指出这两种过程中哪一种改变(还是两种都)已经改变。在选择改进作物的性状中，由于水利用的减少而生长没有改变引起的WUE的增加将在灌溉农业系统中尤其有价值，在所述灌溉农业系统中，水输入成本很高。主要由生长的增加而没有对应的水利用上涨导致的WUE增加将可以应用于所有农业系统。在许多水供应不限制的农业系统中，生长的增加，即使该增加是以水利用增加为代价(即WUE没有改变)，也可以增加产量。因此，需要增加WUE和生物量积累的新方法来提高农业生产力。由于WUE结合了与初级代谢和水利用有关的许多生理过程，所以它通常是高度多基因的性状，具有受到环境相互作用的影响的大基因型(Richards等人，2002，Crop Sci.42：111)。由于这些和其他原因，在传统育种程序中很少选择的WUE改变的尝试取得了成功。

因此，需要鉴定在胁迫耐受性植物和/或有效水利用的植物中表达的基因，其能够对宿主植物和其他植物物种赋予胁迫耐受性和水利用效率。以新的方式产生的胁迫耐受性植物将具有许多优点，如通过例如减少植物物种的水需求扩大作物植物的可以栽培范围。其他期望的优点包括对风、雨、害虫或疾病带来的枝条或茎的倒伏、弯曲的抗性。

发明概述

本发明部分满足了鉴定新的独特多肽的需求，所述多肽在超量表达时赋予植物增加的生长和/或增强的胁迫耐受性。本发明描述了一类新的小泡运输蛋白质胁迫相关多肽(VTSRP)和VTSRP编码核酸，其对于调节植物对环境胁迫的应答是重要的。更具体地，植物中这些VTSRP编码核酸的超量表达导致植物增加的生长和/或对环境胁迫的增强的耐受性。

因此，本发明包括包含VTSRP编码核酸的分离的植物细胞，其中植物细胞中该核酸序列的表达导致与野生型品种的植物细胞相比，植物增加的生长和/或对环境胁迫的增强的耐受性。优选地，VTSRP来自展叶剑叶藓(Physcomitrella patens)或者酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。即，本文描述了展叶剑叶藓小泡运输蛋白-1(PpVTP-1或EST 513)、展叶剑叶藓GTP结合蛋白-1(PpGBP-1或EST 203)和酿酒酵母小泡运输蛋白-1(ScVTP-1或ORF 3240)。

在一些实施方案中，本发明提供了在剑叶藓属(Physcomitrella)或酵母属(Saccharomyces)成员中发现的VTSRP和编码核酸。在另一优选实施方案中，所述核酸和多肽来自展叶剑叶藓植物或者酿酒酵母酵母菌。在一个实施方案中，本发明提供了证明了生长增加的超量表达VTSRP的植物。在优选实施方案中，植物生长的增加是由于与植物的野生型品种相比，植物的水利用效率(WUE)的增加。在另一实施方案中，本发明提供超量表达LPKSRP的植物，其与野生型品种的植物相比，证明对环境胁迫的增强的耐受性。本发明提供的环境胁迫可以是盐度、干旱、温度、金属、化学品、病原体和氧化胁迫，或者它们的组合。在优选实施方案中，环境胁迫是干旱胁迫。

本发明还提供了通过VTSRP编码核酸转化的转基因植物产生的种子，其中该植物相对于野生型品种的植物，生长的增加和/或对环境胁迫的增强的耐受性是真实遗传的。

本发明还提供了通过下述转基因植物、植物部分或者种子的任一种产生的农产品。本发明还提供了如下所述的分离的VTSRP。本发明还提供了分离的VTSRP的编码核酸，其中VTSRP编码核酸编码如下所述的VTSRP。

本发明还提供了包含如下所述的VTSRP编码核酸的分离的重组表达载体，其中该载体在宿主细胞中的表达导致与野生型品种的宿主细胞相比，对环境胁迫的增强的耐受性。本发明还提供了含有所述载体的宿主细胞和含有所述宿主细胞的植物。

本发明还提供了用VTSRP编码核酸产生转基因植物的方法，其中与野生型品种的植物相比，植物中所述核酸的表达导致增加的生长和/或对环境胁迫的增强的耐受性，该方法包括：(a)用包含VTSRP编码核酸的表达载体转化植物细胞，和(b)从植物细胞产生转基因植物，其与野生型品种的植物相比，具有增加的生长和/或对环境胁迫的增强的耐受性。在优选实施方案中，该VTSRP和VTSRP编码核酸如下所述。

本发明还提供了鉴定新的VTSRP的方法，其包括(a)如下所述产生抗VTSRP或者其片段的特异抗体；(b)用该抗体筛选推定的VTSRP物质，其中抗体与该物质的特异结合表明存在潜在的新的VTSRP；和(c)与已知的VTSRP相比，从所结合的物质鉴定新的VTSRP。备选地，与如下所述核酸探针的杂交可以用于鉴定新的VTSRP核酸。

本发明还提供了修饰植物的生长或胁迫耐受性的方法，其包括修饰植物中VTSRP核酸的表达，其中VTSRP如下所述。本发明提供可以使得生长和/或胁迫耐受性增加或者降低的方法。优选地，通过增加VTSRP核酸的表达，在植物中增加生长和/或胁迫耐受性。

附图简述

图1显示了公开的展叶剑叶藓PpGBP-1的氨基酸序列(SEQ ID NO：4)和公开的专利申请中公开的8个多肽的氨基酸序列(SEQ ID NO：24-31，分别按照出现的顺序)的比对。每个序列中保守的氨基酸残基标记为黑色阴影，而一些或全部序列中相同或相似的氨基酸残基标记为浅色阴影。

图2显示了公开的展叶剑叶藓PpVTP-1的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)和公开的专利申请中公开的2个氨基酸序列(SEQ ID NO：22-33，分别按照出现的顺序)的比对。每个序列中保守的氨基酸残基标记为阴影，而一些或全部序列中相同或相似的氨基酸残基也标记为阴影。

图3显示了PpVTP、PpGBP-1和ScVTP-1的核苷酸和多肽序列。

发明详述

通过参考下面的本发明的优选实施方案和本发明包括的实施例的详细描述，可以更容易理解本发明。然而，在公开和描述本发明化合物、组合物和方法之前，将理解本发明不限于特定核酸、特定多肽、特定细胞类型、特定宿主细胞、特定条件或者特定方法等，因为这些当然可以改变并且其中的许多修改和变型将是本领域技术人员显而易见的。还理解本文使用的术语仅仅用于描述特定实施方案的目的并且不意在限定。具体地，如多肽“小泡运输胁迫相关多肽”(VTSRP)的氨基酸序列的名称绝不限制那些序列的功能性。

本发明描述了新类别的VTSRP和VTSRP编码核酸，其对于调节植物对环境胁迫的应答是重要的。更具体地，植物中VTSRP编码核酸的超量表达导致植物的生长和/或对环境胁迫的增强的耐受性。VTSRP类别的代表性成员包括但不限于PpGBP-1(Sar1，EST 203)、PpVTP-1(Rab小GTP酶，EST 513)和ScVTP-1(YMR197C，V-SNARE蛋白)。在优选实施方案中，该类别的所有成员是有生物学活性的小泡运输蛋白。

因此，本发明包括VTSRP多核苷酸和多肽序列以及它们用于增强植物对环境胁迫的耐受性的用途。在一个实施方案中，VTSRP序列来自植物，优选剑叶藓属植物或者酵母属酵母，更优选展叶剑叶藓植物或者酿酒酵母酵母菌。在另一实施方案中，VTSRP序列包括PpGBP-1(SEQ ID NO：3和4)、PpVTP-1(SEQ ID NO：1和2)和ScVTP-1(SEQ ID NO：5和6)。公开的展叶剑叶藓VTSRP序列和公开的酿酒酵母VTSRP序列与下述已知的小泡运输具有显著的同一性百分比。

本发明提供了VTSRP编码核酸转化的转基因植物细胞，其中与野生型品种的植物细胞相比，植物细胞中所述核酸序列的表达导致增加的生长和/或对环境胁迫的增强的耐受性。本发明还提供了含有本文描述的植物细胞的转基因植物部分和转基因植物。基于上下文，本文使用的术语“植物”应理解为完整植物、植物细胞和植物部分，包括种子。植物部分包括但不限于茎、根、胚珠、雄蕊、叶、胚、分生组织区、愈伤组织、配子体、孢子体、花粉、小孢子等。在一个实施方案中，转基因植物是雄性不育的。本发明还提供了通过VTSRP编码核酸转化的转基因植物产生的植物种子，其中种子含有VTSRP编码核酸，并且其中植物与野生型品种的植物相比，增加的生长和/或对环境胁迫的增强的耐受性是真实遗传的。本发明还提供了表达VTSRP的转基因植物产生的种子，其中种子含有VTSRP，并且植物与野生型品种的植物相比，增加的生长和/或对环境胁迫的增强的耐受性是真实遗传的。本发明还提供了下述转基因植物、植物部分和植物种子的任一种产生的农产品。农产品包括但不限于，植物提取物、蛋白质、氨基酸、糖类、脂肪、油、聚合物、维生素等。

本文使用的术语“品种”指一个物种内共有恒定特征的一组植物，所述特征将它们与该物种内的典型形式和其他可能的品种分开。尽管具有至少一种不同的性状，但是品种的特征还在于该品种内个体之间的一定变异，主要是基于连续世代的后代中性状的孟德尔分离。认为品种对于特定性状是“真实遗传的”条件是它对于该性状在一定程度上是遗传上纯合的，即当真实遗传的品种自花传粉时，没有观察到后代中该性状的显著量的独立分离。在本发明中，性状由导入植物品种的一种或多种DNA序列的转基因表达产生。

本发明第一次描述了可用于增强植物对环境胁迫的耐受性的展叶剑叶藓VTSRP(包括Sar1小GTP酶(PpGBP-1，EST 203))、Rab小GTP酶(PpVTP-1，EST 513)和酿酒酵母V-SNARE蛋白(ScVTP-1，YMR197C)。本文使用的术语多肽指通过肽键结合的至少四个氨基酸的链。该链可以是线性的、分枝的、环状的或者其组合。因此，本发明提供了选自PpGBP-1、PpVTP-1和ScVTP-1的分离的VTSRP及其同源物。在优选实施方案中，VTSRP选自1)如SEQ ID NO：4定义的PpGBP-1多肽，和2)如SEQ IDNO：2定义的PpVTP-1多肽，和3)如SEQ ID NO：6定义的ScVTP-1多肽，和其同源物和直向同源物。在下文定义氨基酸序列的同源物和直向同源物。

优选通过重组DNA技术产生本发明的VTSRP。例如，将编码多肽的核酸分子克隆到表达载体(如下文描述)中，将表达载体导入宿主细胞(如下文描述)并在宿主细胞中表达VTSRP。然后可以使用标准多肽纯化技术通过合适的纯化方案从细胞分离VTSRP。对于本发明，术语“重组多核苷酸”指已经通过遗传工程改变、重排或者修饰的多核苷酸。实例包括任何克隆的多核苷酸，以及连接或结合到异源序列的多核苷酸。术语“重组的”不是指由于天然发生的事件，如自发突变产生的多核苷酸的改变。作为重组表达的备选方案，可以使用标准肽合成技术，化学合成VTSRP或者其肽。此外，例如，使用抗VTSRP抗体从细胞(例如，展叶剑叶藓和酿酒酵母)分离天然VTSRP，所述VTSRP抗体可以利用VTSRP或者其片段通过标准技术产生。

本文使用的术语“环境胁迫”指与盐度、干旱、温度、金属、化学品、病原体或者氧化胁迫或者其组合有关的亚最优的条件。在优选实施方案中，环境胁迫可以选自盐度、干旱，或者温度或者其组合中的一种或多种，并且具体地可以选自高盐度、低水含量(干旱)或者低温中的一种或多种。在更优选的实施方案中，环境胁迫是干旱胁迫。还如本文所用的，术语“水利用效率”指植物产生的有机物质的量除以植物在产生该有机物质中使用的水的量，即植物的干重相对于植物的水使用。如本文使用的术语“干重”指植物中除了水以外的所有物质，并且包括例如，糖类、蛋白质、油和矿质营养物。还应当理解，如说明书和权利要求书中所用的，“一个”指一个或多个，取决于其使用的上下文。从而例如，对“一个细胞”的引用指可以利用至少一个细胞。

还如本文所用的，术语“核酸”和“多核苷酸”指线性或分枝的、单链或双链RNA或者DNA，或者其杂交体。该术语还包括RNA/DNA杂交体。这些术语还包括位于该基因的编码区的3’和5’端的非翻译序列：编码区的5’端上游序列的至少约1000个核苷酸和该基因的编码区的3’端下游序列的至少约200个核苷酸。较不常见的碱基，如肌苷、5-甲基胞嘧啶、6-甲基腺嘌呤、次黄嘌呤等等也可以用于反义、dsRNA和核酶配对。例如，已经表明含有尿苷和胞苷的C-5丙炔类似物的多核苷酸以高亲和力结合RNA并且将是基因表达的有效反义抑制剂。可以进行其他修饰，如对RNA的磷酸二酯主链或者其核糖基中2’-羟基的修饰。反义多核苷酸和核酶可以完全由核糖核苷酸组成或者可以含有混合的核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸。可以通过任何手段产生本发明的多核苷酸，所述手段包括基因组制备、cDNA制备、体外合成、RT-PCR以及体外或体内转录。

“分离的”核酸分子是基本上与该核酸的天然来源中存在的其他核酸分子(即，编码其他多肽的序列)分离的核酸分子。优选地，“分离的”核酸没有下述序列中的一些，所述序列天然位于该核酸侧翼的天然产生的复制子中(即，位于该核酸的5’和3’端的序列)。例如，认为克隆的核酸是分离的。在多种实施方案中，分离的VTSRP核酸分子可以含有少于约5kb、4kb、3kb、2kb、1kb、0.5kb或0.1kb的核苷酸序列，该核苷酸序列天然位于所述核酸所来源的细胞(例如，展叶剑叶藓细胞和酿酒酵母细胞)的基因组DNA中的核酸分子侧翼。如果已经通过人工干预改变了核酸，或者将其置于不是其天然位置的基因座或位置或者如果通过农杆菌感染将其导入细胞，那么也认为该核酸是分离的。此外，“分离的”核酸分子，如cDNA分子，可以没有与其天然相关的某些其他细胞物质，或者当通过重组技术产生时没有培养基，或者当化学合成时没有化学前体或者其他化学药品。

从“分离的核酸”的定义特别排除：作为体外核酸制备物或者作为转染的/转化的宿主细胞制备物存在的天然产生的染色体(如染色体分散(chromosome spread))、人工染色体文库、基因组文库和cDNA文库，其中宿主细胞是体外异质性制备物或者作为单个菌落的异质性群体平板接种。还特别排除上面的文库，其中所指定的核酸构成载体分子中核酸插入片段的数目的5％以下。还特别排除完整细胞基因组DNA或者完整细胞RNA制备物(包括机械剪接或者酶促消化的完整细胞制备物)。甚至还特别排除作为体外制备物或者作为通过电泳分离的异质性混合物的完整细胞制备物，其中本发明的核酸没有与电泳介质中的异源核酸进一步分离(例如，通过从琼脂糖凝胶或者尼龙印迹中的多条异质性带切出单条带来进一步分离)。

使用标准分子生物学技术和本文提供的序列信息，可以分离本发明的核酸分子，例如，具有SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5的核苷酸序列或者其部分的核酸分子。例如，使用本文公开的序列的全部或者部分可以从展叶剑叶藓文库分离展叶剑叶藓VTSRP cDNA。此外，使用基于该序列设计的寡核苷酸引物通过聚合酶链式反应可以分离包含SEQID NO：1、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5的序列的全部或者部分的核酸分子。例如，可以从植物细胞分离mRNA(例如，通过Chirgwin等人，1979，Biochemistry 18：5294-5299的硫氰酸胍提取步骤)，并且可以使用逆转录酶(例如，可以从Gibco/BRL，Bethesda，MD得到的Moloney MLV逆转录酶，或者可以从Seikagaku America，Inc.，St.Petersburg，FL得到的AMV逆转录酶)制备cDNA。可以基于SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5中所示的核苷酸序列设计用于聚合酶链式反应扩增的合成的寡核苷酸引物。使用cDNA，或者备选地，使用基因组DNA作为模板，和合适的寡核苷酸引物，根据标准PCR扩增技术可以扩增本发明的核酸分子。这样扩增的核酸分子可以克隆到合适的载体并且通过DNA序列分析表征。此外，通过标准合成技术，例如，使用自动化DNA合成仪，可以制备对应于VTSRP核苷酸序列的寡核苷酸。

在优选实施方案中，本发明的分离的核酸分子包含SEQ ID NO：1、SEQID NO：3或SEQ ID NO：5中所示的核苷酸序列。这些cDNA可以包含编码VTSRP的序列(即，“编码区”)，以及5’非翻译序列和3’非翻译序列。备选地，本发明地核酸分子可以仅包含SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3或SEQ IDNO：5中任一个的编码区，或者可以包含从基因组DNA分离的完整基因组片段。本发明还包括VTSRP编码核酸，其编码如本文描述的VTSRP。优选编码如下VTSRP的VTSRP编码核酸：Sar1小GTP酶(PpGBP-1，EST203，SEQ ID NO：4)、Rab小GTP酶(PpVTP-1，EST 513，SEQ ID NO：2)和v-SNARE蛋白(YMR197C，SEQ ID NO：6)。

此外，本发明的核酸分子可以包含SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5的序列之一的编码区的一部分，例如，用作探针或者引物的片段或者编码VTSRP的生物学活性部分的片段。从展叶剑叶藓和酿酒酵母克隆的VTSRP基因确定的核苷酸序列允许产生探针和引物，设计所述探针和引物用于鉴定和/或克隆其他细胞类型和生物中的VTSRP同源物，以及来自其他藓类和相关物种的VTSRP同源物。编码区的部分可以编码VTSRP的生物活性片段。

本文使用的术语VTSRP的“生物活性部分”意在包括VTSRP的部分，例如，结构域/基序，其参与植物的生长和/或胁迫耐受性(更优选为干旱耐受性)的调节。对于本发明，生长和/或胁迫耐受性的调节指与非转基因对照植物的胁迫耐受性相比，包含VTSRP表达盒(或者表达载体)的转基因植物的生长和/或胁迫耐受性增加或减少至少10％、15％、20％、25％或30％，优选至少40％、45％、50％、55％或60％，更优选至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或以上。至少在下面的实施例7中提供了定量生长和/或胁迫耐受性的方法。在优选实施方案中，VTSRP的生物活性部分增加了植物对干旱胁迫的耐受性。

VTSRP的生物活性部分包括包含来自VTSRP的氨基酸序列，例如，SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6的氨基酸序列，或者与VTSRP相同的多肽的氨基酸序列的肽，其包括比全长VTSRP或者与VTSRP相同的全长多肽更少的氨基酸，并且显示出VTSRP的至少一种活性。通常，生物活性部分(例如，长为5、10、15、20、30、35、36、37、38、39、40、50、100或者更多氨基酸的肽)包含具有VTSRP的至少一种活性的结构域或者基序。此外，其中缺失了多肽的其他区域的其他生物活性部分通过重组技术可以制备，并评价本文描述的一种或多种活性。优选地，VTSRP的生物活性部分包括具有小泡运输活性的一种或多种所选的序列结构域/基序或者其部分。

本发明还提供了VTSRP嵌合或融合多肽。本文使用的VTSRP“嵌合多肽”或“融合多肽”包括有效连接非-VTSRP的VTSRP。VTSRP意指具有VTSRP相应的氨基酸序列的多肽，而非-VTSRP意指具有与VTSRP实质上不同的多肽(例如，来自相同或不同的生物体，与VTSRP不同的多肽)相应的氨基酸序列的多肽。关于融合多肽，术语“有效连接”意指VTSRP和非-VTSRP彼此融合，由此两个序列共同执行所用序列所属的提出的功能。非-VTSRP可以融合到VTSRP的N末端或C末端，或备选地，融合到VTSRP的片断上，例如N末端区域(或其片段)、中央结构域(或其片段)、C末端区域(或其片段)，或者N末端区域、中央结构域和C末端区域的组合，或者那些区域/结构域的片段。例如，在一实施方案中，融合多肽是GST-VTSRP融合多肽，其中VTSRP序列融合到GST序列地C末端。这种融合多肽可有助于重组VTSRP的纯化。在另一实施方案中，融合多肽是在其N末端包含异源信号序列的VTSRP。在某些宿主细胞(如哺乳动物细胞)中，通过使用异源信号序列可增加VTSRP的表达和/或分泌。

本发明的VTSRP嵌合或融合多肽优选通过标准重组DNA技术制备。例如，编码不同多肽序列的DNA片段根据常规技术符合读框地连接在一起，如通过使用平端或交错末端连接、限制酶消化以提供合适的末端、装入合适的黏性端、用碱性磷酸酶处理以避免不期望的结合，以及酶连接。在另一实施方案中，可通过包括自动DNA合成仪的常规技术合成融合基因。备选地，基因片段的PCR扩增可使用锚定引物进行，所述锚定引物在两个连续的基因片段间产生互补的突出端，该突出端随后可以退火并再扩增以产生嵌合的基因片段(例如参见Current Protocols in MolecularBiology，Ausubel等人编著，John Wiley & Sons，1992)。并且，许多市售表达载体已编码融合基序(如，GST多肽)。VTSRP编码核酸可克隆进入这类表达载体，这样该融合基序符合读框地与VTSRP连接。

除了此处所述的VTSRP的片段和融合多肽，本发明包括植物中天然产生的VTSRP和VTSRP编码核酸的同源物和类似物。“同源物”在本文中定义为分别具有相似或者“同一”的核苷酸或者氨基酸序列的两种核酸或者多肽。同源物包括如下文定义的VTSRP的等位变体、直向同源物、侧向同源物、激动剂和拮抗剂。术语“同源物”还包括由于遗传密码简并性而与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5中所示的核苷酸序列之一(和其部分)不同的核酸分子，其从而与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3或SEQ IDNO：5中所示的核苷酸序列编码相同的VTSRP。如本文使用的，“天然产生的”VTSRP指自然中发生的VTSRP氨基酸序列。优选地，天然产生的VTSRP包含SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6的氨基酸序列。

VTSRP的激动剂可以基本上保留VTSRP的相同或者部分生物活性。VTSRP的拮抗剂可以抑制天然产生形式的VTSRP的一种或多种活性。

对应于VTSRP cDNA的天然等位变体和类似物、直向同源物和侧向同源物的核酸分子可以基于它们与本文描述的展叶剑叶藓或者酿酒酵母VTSRP核酸的同一性，使用VTSRP cDNA或者其部分作为杂交探针，根据标准杂交技术在严格杂交条件下分离。在备选实施方案中，通过筛选VTSRP的突变体，例如，截短突变体的组合文库来鉴定VTSRP的同源物，用于VTSRP激动剂或者拮抗剂活性。在一个实施方案中，在核酸水平上通过组合诱变产生VTSRP变体的多样化(variegated)文库，并且其由多样化基因文库编码。例如，通过将合成的寡核苷酸的混合物酶促连接到基因序列中，使得简并组的潜在VTSRP序列作为个体多肽表达，或者备选地，作为含有所述VTSRP序列组的一组更大的融合多肽(例如，用于噬菌体展示)，可以产生VTSRP变体的多样化文库。多种方法可以用于从简并寡核苷酸序列产生潜在VTSRP同源物的文库。可以在自动DNA合成仪中进行简并基因序列的化学合成，然后将合成的基因连接到合适的表达载体中。基因的简并组的使用允许在一种混合物中提供编码所希望组的潜在VTSRP序列的所有序列。用于合成简并寡核苷酸的方法是本领域已知的(参见，例如，Narang S.A.，1983，Tetrahedron 39：3；Itakura等人，1984，Annu.Rev.Biochem.53：323；Itakura等人，1984，Science 198：1056；Ike等人，1983，Nucleic Acid Res.11：477)。

此外，VTSRP编码区的片段文库可以用于产生VTSRP片段的多样化群体用于筛选和随后选择VTSRP的同源物。在一个实施方案中，可以如下产生编码序列片段的文库：在其中每个分子发生仅约一次切口的条件下用核酸酶处理VTSRP编码序列的双链PCR片段，变性双链DNA，复性DNA以形成双链DNA，其可以包括来自不同的带切口的产物的有义/反义对，通过用S1核酸酶处理从再形成的双链体除去单链部分，并将所得片段文库连接到表达载体中。通过该方法，可以得到表达文库，其编码不同大小的VTSRP的N-端、C-端和内部片段。

本领域已知一些技术用于筛选通过点突变或者截短制备的组合文库的基因产物，以及筛选cDNA文库的具有所选性质的基因产物。此类技术适于快速筛选通过组合诱变VTSRP同源物产生的基因文库。最广泛使用的用于筛选大基因文库的技术(适于高通量分析)一般包括将基因文库克隆到可复制的表达载体中，用所得载体文库转化合适的细胞，并在一定条件下表达组合基因，在所述条件下，所希望的活性的检测方便载体的分离，所述载体编码检测其产物的基因。循环总体诱变(Recursive ensemblemutagenesis(REM))是增强文库中功能突变体的频率的一种技术，可以与筛选测定法组合使用来鉴定VTSRP同源物(Arkin和Yourvan，1992，PNAS89：7811-7815；Delgrave等人，1993，Polypeptide Engineering 6(3)：327-331)。在另一实施方案中，使用本领域公知的方法，可以用基于细胞的测定法分析多样化VTSRP文库。本发明还提供了鉴定新的VTSRP的方法，其包括(a)如本文所述产生针对VTSRP或者其片段的特异抗体；(b)用所述抗体筛选推定的VTSRP物质，其中抗体对所述物质的特异结合表明存在潜在的新的VTSRP；和(c)与已知的VTSRP相比，分析结合的物质以确定其新颖性。

如上所述，本发明包括VTSRP和其同源物。为了确定两种氨基酸序列(例如，SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：6的序列，及其突变形式)的序列同一性百分数，为了最佳比较目的比对序列(例如，在一个多肽的序列中引入缺口以与另一多肽或者核酸最佳比对)。然后比较对应的氨基酸位置上的氨基酸残基。当一种序列的位置(例如，SEQ ID NO：2、SEQID NO：4和SEQ ID NO：6的序列)被另一种序列(例如，SEQ ID NO：2、SEQID NO：4和SEQ ID NO：6的序列的突变形式)的对应位置上相同的氨基酸残基占据时，那么这两种分子在该位置相同。在两种核酸序列之间可以进行相同类型的比较。

两序列之间的序列同一性百分数是序列共有的相同位置数目的函数(即，序列同一性百分数＝相同位置的数目/位置总数×100)。优选地，本发明中包括的分离的氨基酸同源物与SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4或SEQID NO：6中所示的完整氨基酸序列具有至少约50-60％，优选至少约60-70％，更优选至少约70-75％、75-80％、80-85％、85-90％或90-95％，最优选至少约96％、97％、98％、99％或者更高的同一性。在另一实施方案中，本发明中包括的分离的氨基酸同源物与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5中所示的核酸序列编码的完整氨基酸序列具有至少约50-60％，优选至少约60-70％，更优选至少约70-75％、75-80％、80-85％、85-90％或90-95％，最优选至少约96％、97％、98％、99％或者更高的同一性。在优选实施方案中，多肽包含两个区域，其中第一个区域起始于第1位的天冬氨酸残基，且第2位是色氨酸残基、第3位是苯丙氨酸残基、第4位是酪氨酸残基、第5位是甘氨酸残基、第7位是亮氨酸残基、第8位是丙氨酸残基、第9位是丝氨酸残基、第11位是甘氨酸残基、第12位是亮氨酸残基、第15位是赖氨酸残基、第16位是谷氨酸残基、第17位是丙氨酸残基、第18位是赖氨酸残基、第19位是异亮氨酸残基、第20位是亮氨酸残基、第21位是苯丙氨酸残基、第22位是亮氨酸残基、第24位是亮氨酸残基、第25位是天冬氨酸残基、第26位是天冬酰胺残基、第27位是丙氨酸残基、第28位是甘氨酸残基、第29位是赖氨酸残基、第30位是苏氨酸残基、第31位是苏氨酸残基、第32位是亮氨酸残基、第33位是亮氨酸残基、第34位是组氨酸残基、第35位是甲硫氨酸残基、第36位是亮氨酸残基、第37位是赖氨酸残基、第38位是天冬氨酸残基、第39位是谷氨酸残基、第41位是亮氨酸残基、第43位是谷氨酰胺残基、第44位是组氨酸残基、第45位是谷氨酰胺残基、第46位是脯氨酸残基、第47位是苏氨酸残基、第48位是谷氨酰胺残基、第50位是脯氨酸残基、第51位是苏氨酸残基、第52位是丝氨酸残基、第53位是谷氨酸残基、第54位是谷氨酸残基、第55位是亮氨酸残基、第56位是丝氨酸残基、第57位是异亮氨酸残基、第62位是苯丙氨酸残基、第63位是赖氨酸残基、第64位是丙氨酸残基、第65位是苯丙氨酸残基、第66位是天冬氨酸残基、第67位是亮氨酸残基、第68位是甘氨酸残基、第69位是甘氨酸残基、第70位是组氨酸残基、第72位是异亮氨酸残基、第73位是丙氨酸残基、第74位是精氨酸残基、第77位是色氨酸残基、第79位是天冬氨酸残基、第81位是酪氨酸残基、第82位是丙氨酸残基、第83位是赖氨酸残基、第84位是缬氨酸残基、第85位是天冬氨酸残基、第86位是丙氨酸残基、第88位是缬氨酸残基、第89位是酪氨酸残基、第90位是亮氨酸残基、第91位是缬氨酸残基、第92位是天冬氨酸残基、第93位是丙氨酸残基、第95位是天冬氨酸残基、第98位是精氨酸残基、第99位是苯丙氨酸残基、第101位是谷氨酸残基、第102位是丝氨酸残基、第103位是赖氨酸残基、第105位是谷氨酸残基、第106位是亮氨酸残基、第107位是天冬氨酸残基、第109位是亮氨酸残基、第110位是亮氨酸残基、第111位是丝氨酸残基、第112位是天冬氨酸残基、第115位是亮氨酸残基、第118位是缬氨酸残基、第119位是脯氨酸残基、第121位是亮氨酸残基、第123位是亮氨酸残基、第124位是甘氨酸残基、第125位是天冬酰胺残基、第126位是赖氨酸残基、第127位是异亮氨酸残基、第128位是天冬氨酸残基、第129位是异亮氨酸残基、第130位是脯氨酸残基、第131位是酪氨酸残基、第132位是丙氨酸残基、第134位是丝氨酸残基、第136位是谷氨酸残基、第137位是谷氨酸残基、第138位是亮氨酸残基、第139位是精氨酸残基、第142位是亮氨酸残基、第143位是甘氨酸残基以及第144位是亮氨酸残基；第二个区域在第一个区域的下游，起始于第1位是苏氨酸残基，且第2位是苏氨酸残基、第3位是甘氨酸残基、第4位是赖氨酸残基、第5位是甘氨酸残基、第7位是缬氨酸残基、第9位是亮氨酸残基、第12位是丝氨酸残基、第15位是精氨酸残基、第16位是脯氨酸残基、第18位是谷氨酸残基、第19位是缬氨酸残基、第20位是苯丙氨酸残基、第21位是甲硫氨酸残基、第22位是半胱氨酸残基、第23位是丝氨酸残基、第25位是缬氨酸残基、第26位是精氨酸残基、第27位是赖氨酸残基、第28位是甲硫氨酸残基、第29位是甘氨酸残基、第30位是酪氨酸残基、第31位是甘氨酸残基、第33位是甘氨酸残基、第34位是苯丙氨酸残基、第35位是赖氨酸残基、第36位是色氨酸残基、第39位是谷氨酰胺残基、第40位是酪氨酸残基以及第41位是异亮氨酸。

在另一优选实施方案中，本发明分离的核酸同源物包含与SEQ IDNO：1、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5中所示的核苷酸序列或者与包含其至少60个连续核苷酸的部分具有至少约40-60％，优选至少约60-70％，更优选至少约70-75％、75-80％、80-85％、85-90％或90-95％，甚至更优选至少约95％、96％、97％、98％、99％或者更高同一性的核苷酸序列。用于核酸序列比较的优选长度为至少75个核苷酸，更优选至少100个核苷酸，最优选编码区的全长。甚至更优选地，核酸同源物编码与SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6具有同源性的蛋白质。

还优选本发明的分离的核酸同源物编码VTSRP或者其部分，其与SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6的氨基酸具有至少80％同一性，并且作为植物中生长和/或环境胁迫应答的调节剂。在更优选的实施方案中，植物中核酸同源物的超量表达增加了植物生长和植物对环境胁迫的耐受性。在进一步优选的实施方案中，该核酸同源物编码作为小泡运输蛋白的VTSRP。

对于本发明，使用Vector NTI 6.0(PC)软件包(InforMax，7600Wisconsin Ave.，Bethesda，MD 20814)确定两种核酸或者多肽序列之间的序列同一性百分数。为15的空位开放罚分和为6.66的空位延伸罚分用于确定两种核酸的百分数同一性。为10的空位开放罚分和为0.1的空位延伸罚分用于确定两种多肽的同一性百分数。所有其他参数设置为默认设置。对于多重比对(Clustal W算法)，空位开放罚分为10，空位延伸罚分为0.05，使用blosum62矩阵。将理解为了确定序列同一性，当比较DNA序列与RNA序列时，胸苷核苷酸等同于尿嘧啶核苷酸。

在另一方面，本发明提供了分离的核酸，其包含在严格条件下与SEQID NO：1、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5的多核苷酸杂交的多核苷酸。更具体地，本发明的分离的核酸分子长为至少15个核苷酸并且在严格条件下与包含SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5的核苷酸序列的核酸分子杂交。在其他实施方案中，该核酸长为至少30、50、100、250或者更多核苷酸。优选地，本发明的分离的核酸同源物包含核苷酸序列，该核苷酸序列在高严格条件下与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5中所示的核苷酸序列杂交并且在植物中作为生长和/或胁迫耐受性的调节子。在另一优选实施方案中，植物中该分离的核酸同源物的超量表达增加了植物的生长和/或对环境胁迫的耐受性。在进一步优选的实施方案中，该分离的核酸同源物编码作为小泡运输蛋白的VTSRP。

如本文中关于DNA与DNA印迹的杂交所使用的，术语“严格条件”指在10X Denhart溶液、6X SSC、0.5％SDS和100μg/ml变性鲑精DNA中于60℃杂交过夜。将印迹在62℃下，在3X SSC/0.1％SDS中，接着在1X SSC/0.1％SDS中，最后在0.1X SSC/0.1％SDS中顺序洗涤，每次30分钟。在优选实施方案中，短语“严格条件”指在6X SSC溶液中于65℃杂交。还如本文使用的，“高严格条件”指在10X Denharts溶液、6X SSC、0.5％SDS和100μg/ml变性鲑精DNA中于65℃杂交过夜。将印迹在65℃下，3X SSC/0.1％SDS中，接着在1X SSC/0.1％SDS，最后在0.1XSSC/0.1％SDS中顺序洗涤，每次30分钟。核酸杂交的方法在Meinkoth和Wahl，1984，Anal.Biochem.138：267-284；Current Protocols inMolecular Biology，第2章，Ausubel等人编著，Greene Publishing andWiley-Interscience，New York，1995；和  Tijssen，1993，LaboratoryTechniques in Biochemistry and Molecular Biology：Hybridization withNucleic Acid Probes，第I部分，第2章，Elsevier，New York，1993中描述。优选地，在严格或者高度严格条件下与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5的序列杂交的本发明的分离的核酸分子对应于天然产生的核酸分子。如本文使用的，“天然产生的”核酸分子指具有天然产生的核苷酸序列的RNA或者DNA分子(例如，编码天然多肽)。在一个实施方案中，该核酸编码天然产生的展叶剑叶藓VTSRP或酿酒酵母VTSRP。

使用上述方法和本领域技术人员已知的其他方法，本领域技术人员可以分离包含SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6中所示的氨基酸序列的VTSRP的同源物。这些同源物的一个子集是等位变体。如本文使用的属于“等位变体”指核苷酸序列，其含有导致VTSRP的氨基酸序列改变并且存在于天然群体(例如植物物种或者品种)内的多态性。此类天然等位基因变异通常可导致VTSRP核酸的1-5％变异。通过许多不同植物中目的核酸序列的测序可以鉴定等位变体，通过使用杂交探针鉴定那些植物中相同的VTSRP遗传基因座可以容易地进行鉴定。VTSRP中由于天然等位基因变异的结果并且不改变VTSRP功能活性的任何和所有此类核酸变异和所得氨基酸多态性或者变异都意在本发明的范围内。

此外，编码来自相同或者其他物种的VTSRP的核酸分子，如VTSRP类似物、直向同源物和侧向同源物意在本发明的范围内。如本文使用的术语“类似物”指具有相同或者相似的功能但是在不相关的生物中分别进化的两种核酸。如本文使用的术语“直向同源物”指来自不同物种但是从共同的祖先基因通过物种形成进化的两种核酸。通常，直向同源物编码具有相同或者相似功能的多肽。如本文使用的术语“侧向同源物”指通过基因组内的复制而关联的两种核酸。侧向同源物通常具有不同的功能，但是这些功能是相关的(Tatusov，R.L.等人，1997，Science 278(5338)：631-637)。天然产生的VTSRP的类似物、直向同源物和侧向同源物可以通过翻译后修饰、通过氨基酸序列差异或者通过此两者与天然产生的VTSRP不同。翻译后修饰包括多肽的体内和体外化学衍生，例如，乙酰化、羧基化、磷酸化或者糖基化，并且此类修饰可以在多肽合成或者加工期间或者用分离的修饰酶处理后发生。具体地，本发明的直向同源物将通常显示出与天然产生的VTSRP氨基酸序列的全部或者部分的至少80-85％，更优选85-90％或90-95％，最优选95％、96％、97％、98％或者甚至99％同一性，或者100％的序列同一性，并且显示出类似于VTSRP的功能。优选地，本发明的VTSRP直向同源物作为植物中生长和/或环境胁迫应答的调节剂，和/或作为小泡运输蛋白。更优选地，VTSRP直向同源物增加植物的生长和胁迫耐受性。在一实施方案中，VTSRP直向同源物作为小泡运输蛋白。

除了群体中可能存在的VTSRP序列的天然产生的变体外，技术人员将还明白通过突变可以向SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6的核苷酸序列中导入改变，从而导致所编码的VTSRP的氨基酸序列的改变，而不改变VTSRP的功能活性。例如，可以在SEQ ID NO：1、SEQ IDNO：3或SEQ ID NO：5的序列中产生核苷酸替代，其导致在“非必需”氨基酸残基上的氨基酸替代。“非必需”氨基酸残基是可以从VTSRP之一的野生型序列改变而不改变所述VTSRP的活性的残基，而“必需”氨基酸残基是VTSRP活性所需的。然而，其他氨基酸残基(例如，在具有VTSRP活性的结构域中不保守或者仅仅半保守的那些残基)可以不是活性必需的并且从而可能顺从改变而不改变VTSRP活性。

因此，本发明的另一方面涉及编码VTSRP的核酸分子，其含有氨基酸残基的改变，所述氨基酸残基不是VTSRP活性必需的。此类VTSRP与SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6中所含的序列在氨基酸序列上不同，然而保留至少一种本文描述的VTSRP活性。在一个实施方案中，所分离的核酸分子包含编码多肽的核苷酸序列，其中该多肽包含与SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6的氨基酸序列具有至少约50-60％同一性的氨基酸序列，更优选与SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6的序列具有至少约60-70％的同一性，进一步优选与SEQ IDNO：2、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6的序列具有至少约70-75％、75-80％、80-85％、85-90％、或90-95％的同一性，最优选与SEQ ID NO：2、SEQ IDNO：4或SEQ ID NO：6的序列具有至少约96％、97％、98％或99％的同一性。本发明优选的VTSRP同源物优选参与植物的生长和/或胁迫耐受性应答，或者更具体地，作为小泡运输蛋白。

编码与SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6的多肽序列具有序列同一性的分离的核酸分子可以通过向SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5的核苷酸序列中引入一个或多个核苷酸替代、添加或者缺失来产生，从而向所编码的多肽中引入了一个或多个氨基酸替代、添加或者缺失。通过标准技术，如定点诱变和PCR介导的诱变，可以向SEQ IDNO：1、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5的序列之一中导入突变。优选地，对一个或多个预测的非必需氨基酸残基进行保守氨基酸替代。“保守氨基酸替代”是其中将氨基酸残基用具有相似侧链的氨基酸残基替换的一种替代。

已经在本领域中定义了具有相似侧链的氨基酸残基家族。这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链的氨基酸(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、不带电侧链的氨基酸(例如，谷氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链的氨基酸(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β分枝侧链的氨基酸(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳族侧链的氨基酸(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。从而，VTSRP中预测的非必需氨基酸残基优选用来自相同侧链家族的另一氨基酸残基替换。备选地，在另一实施方案中，可以沿着VTSRP编码序列的全部或者部分随机导入突变，如通过饱和诱变导入，并且可以对所得突变体筛选本文描述的VTSRP活性以鉴定保留VTSRP活性的突变体。SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5之一的序列的诱变后，可以重组表达所编码的多肽，并且可以如实施例7中描述的通过分析表达所述多肽的植物的生长和/或胁迫耐受性来测定该多肽的活性。

额外地，可以产生优化的VTSRP核酸。优选地，优化的VTSRP核酸编码VTSRP，其调节植物对生长和/或环境胁迫的耐受性，更优选地当其在植物中超量表达时增加植物的生长和对环境胁迫的耐受性。如本文所用的“优化的”指遗传工程化的核酸，以增加其在给定植物或者动物中的表达。为了对植物提供优化的VTSRP核酸，可以修饰该基因的DNA序列以：1)包含高水平表达植物基因优选的密码子；2)包含在植物中大量发现的核苷酸碱基组成的A+T含量；3)形成植物起始序列；或4)去除导致RNA的不稳定、不正确的多腺苷酸化、降解和终止，或形成二级结构发卡或RNA剪接位点的序列。通过利用一般植物或者具体植物中密码子选择的分布频率可以实现植物中VTSRP核酸的表达增加。优化植物中核酸表达的方法可见于EPA 0359472；EPA 0385962；PCT申请号WO 91/16432；美国专利号5,380,831；美国专利号5,436,391；Perlack等人，1991，Proc.Natl.Acad.Sci.美国，88：3324-3328；和Murray等人，1989，Nucleic Acids Res.17：477-498。

本文使用的“优选密码子使用的频率”意指特定宿主细胞在给定氨基酸表达的核苷酸密码子使用上所表现出的优先选择。为了确定基因中特定密码子的使用频率，用该密码子在基因中出现的次数除以该基因中表达同一氨基酸的全部密码子出现的总次数。类似地，可以通过将宿主细胞表达的大量基因中优选密码子使用的频率平均化而计算宿主细胞所显示出的优选密码子的使用频率。该分析优选限制在宿主细胞高表达的基因中。首先测定宿主细胞中单密码子使用频率的偏差百分数，然后得到全部密码子的平均偏差，从而计算宿主细胞使用的合成基因优选密码子使用频率的偏差百分数的计算。如本文所定义，计算包括唯一密码子(即ATG和TGG)。一般来说，使用等式1A＝n＝1ZX_n-Y_nX_n乘以100Z计算宿主细胞中优化基因的密码子使用的总体平均偏差，其中X_n＝宿主细胞中密码子n的使用频率；Y_n＝合成基因中密码子n的使用频率；n代表指定氨基酸的单个密码子；总密码子数为Z。密码子使用频率的总体偏差——A对于全部氨基酸应优选小于约25％，更优选小于约10％。

可以优化VTSRP核酸以使密码子使用分布频率与高表达植物基因的偏差优选不大于25％、更优选不大于约10％。另外，需要考虑简并的第三碱基的G+C含量百分数(单子叶植物在该位置表现出对G+C的偏好，而双子叶植物则不然)。还已知双子叶植物中XCG(其中X为A、T、C或G)是最不优选的密码子，而XTA在单子叶植物和双子叶植物中都应该避免。优化的本发明VTSRP核酸同样优选与选定宿主植物(即展叶剑叶藓、欧洲油菜(Brassica napus)、大豆(Glycine max)或稻(Oryza sativa))接近的CG和TA二联子回避指数。更优选与宿主偏差不超过约10-15％的指数。

除了编码前述VTSRP的核酸分子以外，本发明的另一方面与其反义核酸分子相关。反义多核苷酸被认为通过与靶多核苷酸特异结合并干扰靶多核苷酸的转录、剪接、转运、翻译和/或稳定性而抑制靶多核苷酸的基因表达。现有技术中已描述了将反义多核苷酸靶向染色体DNA、初级RNA转录物或加工的mRNA的方法。优选的靶区域包括剪接位点、翻译起始密码子、翻译终止密码子和可读框内的其他序列。

本发明的术语“反义”指含有足以与基因的全部或部分、初级转录物或加工的mRNA互补以干扰内源基因表达的多核苷酸的核酸。“互补”多核苷酸能够根据标准Watson-Crick互补原则形成碱基配对。具体地，嘌呤与嘧啶碱基配对形成组合，其中鸟嘌呤与胞嘧啶配对(G:C)而腺嘌呤与胸腺嘧啶(在DNA中)(A:T)或尿嘧啶(在RNA中)(A:U)配对。应该理解，只要两个多核苷酸各含有至少一个与另一多核苷酸基本互补的区域，即使它们彼此并不完全互补也可以互相杂交。术语“反义核酸”包括单链RNA以及可转录产生反义RNA的双链DNA表达盒。“活性”反义核酸是能够与初级转录物或编码多肽的mRNA选择性杂交的反义RNA分子，所述初级转录物或者mRNA编码与SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6的多肽具有至少80％序列同一性的多肽。

反义核酸可以与完整VTSRP编码链互补或只与其一部分互补。在一个实施方案中，反义核酸分子与编码VTSRP的核苷酸序列的编码链的“编码区”反义。术语“编码区”指含有翻译成氨基酸残基的密码子的核苷酸序列区。在另一实施方案中，反义核酸分子与编码VTSRP的核苷酸序列编码链的“非编码区”反义。术语“非编码区”指编码区两侧不翻译成氨基酸的5’和3’序列(即也称为5’和3’非翻译区)。反义核酸分子可以与VTSRP mRNA的完整编码区互补，但更优选为只与VTSRP mRNA编码区或非编码区的一部分反义的寡核苷酸。例如，反义寡核苷酸可以与VTSRP mRNA翻译起始位点周围的区域互补。反义寡核苷酸的长度可以例如为约5、10、15、20、25、30、35、40、45或50个核苷酸。通常，本发明的反义分子包含与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5或者编码SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6的多肽的多核苷酸的至少14个连续核苷酸具有60-100％序列同一性的RNA。优选地，序列同一性将为至少70％，更优选为至少75％、80％、85％、90％、95％或98％，最优选为99％。

可以使用本领域已知的方法，利用化学合成和酶连接反应构建本发明的反义核酸。例如，可以使用天然存在的核苷酸或各种修饰的核苷酸化学合成反义核酸(例如反义寡核苷酸)，设计所述修饰的核苷酸是为了提高分子的生物稳定性或提高反义和有义核酸间形成的双链体的物理稳定性，例如可以使用硫代磷酸衍生物和吖啶替换的核苷酸。可以用于产生反义核酸的修饰的核苷酸实例包括5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、4-乙酰胞嘧啶、5-(羧基羟基甲基)尿嘧啶、5-羧基甲基氨基甲基-2-硫尿苷、5-羧基甲基氨基甲基尿嘧啶、双氢尿嘧啶、β-D-半乳糖基queosine、次黄苷、N6-异戊烯腺嘌呤、1-甲基鸟嘌呤、1-甲基次黄苷、2，2-二甲基鸟嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、5-甲基氨基甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨基甲基-2-硫尿嘧啶、β-D-甘露糖基queosine、5’-甲氧基羧基甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲硫基-N6-异戊烯腺嘌呤、尿嘧啶-5-氧基乙酸(v)、wybutoxosine、假尿嘧啶、queosine、2-硫代胞嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-氧乙酸甲基酯、尿嘧啶-5-氧乙酸(v)、5-甲基-2-硫尿嘧啶、3-(3-氨基-3-N-2-羧基丙基)尿嘧啶、(acp3)w及2，6-二氨基嘌呤。另外，可以使用以反义方向(即从插入核酸转录产生的RNA将为目的靶核酸的反义方向，下文有具体描述)将核酸亚克隆到表达载体中来生物产生反义核酸。

在另一实施方案中，本发明的反义核酸分子为α-端基异构核酸分子。α-端基异构核酸分子与互补RNA形成特异双链杂合体，其中与常规β-单元相反，两条链为互相平行(Gautier等人，1987，Nucleic Acids.Res.15：6625-6641)。反义核酸分子也可以包含2’-O-甲基核糖核苷酸(Inoue等人，1987，Nucleic Acids Res.15：6131-6148)或嵌合RNA-DNA类似物(Inoue等人，1987，FEBS Lett 215：327-330)。

本发明的反义核酸分子一般施用于细胞或原位产生，以使其与编码VTSRP的细胞mRNA和/或基因组DNA杂交或结合，由此例如通过抑制转录和/或翻译抑制多肽的表达。可以通过常规核苷酸互补形成稳定的双链体，或者例如对于与DNA双链体结合的反义核酸分子，通过在双螺旋的大沟中的特异相互作用进行杂交。可以修饰反义分子以使其与所选细胞表面表达的受体或抗原特异结合，例如通过将与细胞表面受体或抗原结合的多肽或抗体连接到反义核酸分子上。反义核酸分子也可以使用本文所述的载体递送到细胞。为使反义分子达到足够的胞内浓度，优选将载体构建体中的反义核酸分子置于强原核、病毒或真核(包括植物)启动子控制下。

作为反义多核苷酸的代替，可以使用核酶、有义多核苷酸或双链RNA(dsRNA)来降低VTSRP多肽的表达。本文使用的术语“核酶”是指具有核酸酶活性的基于RNA的催化性酶，其能够切割与其具有互补区的单链核酸(如mRNA)。核酶(例如Haselhoff和Gerlach，1988，Nature 334：585-591中描述的锤头状核酶)可用于催化性切割VTSRP mRNA转录物以抑制VTSRP mRNA的翻译。可以在如本文公开的VTSRP cDNA核苷酸序列(即SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5)的基础上，或在根据本文教导的方法分离的异源序列的基础上设计对VTSRP编码核酸具有特异性的核酶。例如，可以构建四膜虫(Tetrahymena)L-19 IVS RNA的衍生物，其中活性位点的核苷酸序列与将切割的VTSRP编码mRNA中的核苷酸序列互补。参阅例如Cech等人的美国专利第4,987,071号和第5,116,742号。另外，VTSRP mRNA可以用于从RNA分子库中选出具有特异的核酸酶活性的催化性RNA。参阅例如Bartel，D.和Szostak，J.W.，1993，Science 261：1411-1418。在优选的实施方案中，核酶含有与靶RNA的一部分具有100％互补性的至少7、8、9、10、12、14、16、18或20个核苷酸的部分，更优选7或8个核苷酸的部分。产生核酶的方法为本领域技术人员所公知。参阅例如美国专利第6,025,167号、第5,773,260号和第5,496,698号。

本文使用的术语“dsRNA”指含有两条RNA链的RNA杂合体。dsRNA的结构可以是线性或环形。在优选的实施方案中，dsRNA特异于编码SEQID NO：2、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6的多肽，或与SEQ ID NO：2、SEQID NO：4或SEQ ID NO：6的多肽具有至少80％序列同一性的多肽的多核苷酸。杂交的RNA可以是基本或完全互补的。“基本互补”指当两条杂交的RNA如前述使用BLAST程序最佳匹配时，杂交部分至少95％互补。优选的dsRNA长度为至少100个碱基对。一般地，杂交的RNA应为同样长度，没有突出的5’或3’末端和缺口。然而，本发明的方法中也可以使用具有长至100个核苷酸的5’或3’突出的dsRNA。

dsRNA可以含有核糖核苷酸或核糖核苷酸类似物(如2’-O-甲基核糖基残基)或其组合。参阅例如美国专利第4,130,641号和4,024,222号。美国专利4,283,393号中描述了dsRNA多核糖次黄苷酸：多核糖胞苷酸。产生和使用dsRNA的方法为本领域所公知。一种方法包括在体内或在单一体外反应混合物中同时转录两条互补的DNA链。参阅例如美国专利第5,795,715号。在一个实施方案中，可以通过标准转化方法直接将dsRNA引入植物或植物细胞。另外，可以通过转录两条互补的RNA，在植物细胞中表达dsRNA。

抑制内源基因表达的其他方法为本领域所公知，如形成三螺旋(Moser等，1987，Science 238：645-650和Cooney等，1988，Science 241：456-459)和共抑制(Napoli等，1990，The Plant Cell 2：279-289)。局部和全长cDNA已经用于内源植物基因的共抑制。参阅例如美国专利第4,801,340号、第5,034,323号、第5,231,020号和第5,283,184号；Van der Kroll等人，1990，The Plant Cell 2：291-299；Smith等人，1990，Mol.Gen.Genetics 224：477-481和Napoli等人，1990，The Plant Cell 2：279-289。

对于有义抑制，认为引入有义多核苷酸能阻断相应靶基因的转录。有义多核苷酸与靶植物基因或RNA具有至少65％的序列同一性。优选的同一性百分数为至少80％、90％、95％或更高。引入的有义多核苷酸不需要对应于靶基因或转录物的全长。有义多核苷酸优选与SEQ ID NO：1、SEQID NO：3或SEQ ID NO：5具有至少100个连续核苷酸的至少65％序列同一性。鉴定区域可以含有内含子和/或外显子和非翻译区。引入的有义多核苷酸可以在植物细胞中瞬时存在，或稳定整合进植物染色体或外染色体复制子。

备选地，通过靶定与VTSRP核苷酸序列的调节区(例如，VTSRP启动子和/或增强子)互补的核苷酸序列以形成三螺旋结构，阻止靶细胞中VTSRP基因转录以抑制VTSRP基因表达。一般参见，Helene，C.，1991，Anticancer Drug Des.6(6)：569-84；Helene，C.，等人，1992，Ann.N.Y.Acad.Sci.660：27-36；和Maher，1992，Bioassays 14(12)：807-15。

除了上述VTSRP核酸和多肽，本发明包括附着到部分的这些核酸和多肽。这些部分包括，但不限于，检测部分、杂交部分、纯化部分、递送部分、反应部分、结合部分等。一组典型的具有附着部分的核酸是探针和引物。探针和引物通常包含基本上分离的寡核苷酸。该寡核苷酸通常包含核苷酸序列区，其在严格条件下与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3或SEQ IDNO：5之一所示的序列的有义链或者SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3或SEQID NO：5之一所示的序列的反义序列或者其天然产生的突变体的至少约12个，优选约25个，更优选约40、50或者75个连续核苷酸杂交。基于SEQID NO：1、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5的核苷酸序列的引物可以用于PCR反应，以克隆VTSRP同源物。基于VTSRP核苷酸序列的探针可以用于检测编码相同或者基本上相同的多肽的转录物或者基因组序列。在优选实施方案中，探针还包含附着的标记物，例如，标记物可以是放射性同位素、荧光化合物、酶或者酶辅因子。此类探针可以用作基因组标记检测试剂盒的部分，用于鉴定表达VTSRP的细胞，例如，通过测量细胞样品中VTSRP编码核酸的水平，例如，检测VTSRP mRNA水平或者确定基因组VTSRP基因是否已经突变或者缺失。

具体地，用于确定基因的转录水平(指示可以用于翻译成基因产物的mRNA的量)的有用方法是进行RNA印迹(参考文献参见例如，Ausubel等人，1988，Current Protocols in Molecular Biology，Wiley：New York)。来自RNA印迹的信息至少部分表明了所转化的基因的转录程度。可以通过本领域公知的一些方法，如Bormann，E.R.等人，1992，Mol.Microbiol.6：317-326中描述的方法，从细胞、组织或者器官制备细胞总RNA。为了评估从该mRNA翻译的多肽的存在或者相对量，可以使用标准技术，如Western印迹。这些技术是本领域普通技术人员公知的。(参见例如，Ausubel等人，1988，Current Protocols in Molecular Biology，Wiley：New York)。

本发明还提供了包含如上述VTSRP核酸的分离的重组表达载体，其中该载体在宿主细胞中的表达导致与野生型品种的宿主细胞相比对环境胁迫的增强的耐受性。如本文使用的术语“载体”指能够转运其连接的另一核酸的核酸分子。一种类型的载体是“质粒”，其指环状双链DNA环，其中可以连接额外的DNA区段。另一类型的载体是病毒载体，其中可以将额外的DNA区段连接到病毒基因组。某些载体能够在它们所导入的宿主细胞中自主复制(例如，具有细菌复制起点的细菌载体和附加型哺乳动物载体)。其他载体(例如，非附加型哺乳动物载体)当导入宿主细胞时整合到宿主细胞的基因组中，从而随着宿主基因组一起复制。此外，某些载体能够指导它们有效连接的基因的表达。此类载体在本文中称作“表达载体”。通常，在重组DNA技术中利用的表达载体一般为质粒的形式。在本说明书中，“质粒”和“载体”可以互换使用，因为质粒是载体的最常用形式。然而，本发明意在包括其他形式的表达载体，如病毒载体(例如，复制缺陷反转录病毒、腺病毒和腺伴随病毒)，它们发挥等同功能。

本发明的重组表达载体包含本发明的核酸，其为适合在宿主细胞中表达的形式，这表示重组表达载体包括基于用于表达的宿主细胞选择的一种或多种调节序列，其与待表达的核酸序列有效连接。如本文关于重组表达载体使用的，“有效连接的”意在指目的核苷酸序列以允许该核苷酸序列表达的方式连接到一个或多个调节序列(例如，在体外转录/翻译系统中，或者当载体导入宿主细胞时在宿主细胞中)。术语“调节序列”意在包括启动子、增强子和其他表达控制元件(例如，多腺苷酸化信号)。此类调节序列例如在Goeddel，1990，Gene Expression Technology：Methods inEnzymology 185，Academic Press，San Diego，CA and Gruber and Crosby，in：Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology，Glick和Thompson编著，第7章，89-108，CRC Press：Boca Raton，Florida中描述，包括其中引用的参考文献。调节序列包括指导核苷酸序列在许多类型的宿主细胞中组成型表达的调节序列和指导核苷酸序列仅在某些宿主细胞或者在某些条件下表达的调节序列。本领域技术人将理解表达载体的设计可以取决于诸如待转化的宿主细胞、所希望的多肽的表达水平等的选择这类因素。可以将本发明的表达载体导入宿主细胞，从而产生本文描述的核酸编码的多肽或者肽，包括融合多肽或者肽(例如，VTSRP、VTSRP的突变形式、融合多肽等等)。

可以设计本发明的重组表达载体以在原核或者真核细胞中表达VTSRP。例如，可以在细菌细胞，如谷氨酸棒杆菌(C.glutamicum)、昆虫细胞(使用杆状病毒表达载体)、酵母和其他真菌细胞(参见Romanos，M.A.等人，1992，Foreign gene expression in yeast：a review，Yeast 8：423-488；van den Hondel，C.A.M.J.J.等人，1991，Heterologous gene expression infilamentous fungi，in：More Gene Manipulations in Fungi，J.M.，Bennet &Lasure编著，396-428页：Academic Press：San Diego；和van den Hondel，C.A.M.J.J.& Punt，P.J.，1991，Gene transfer systems and vectordevelopment for filamentous fungi，in：Applied Molecular Genetics ofFungi，Peberdy，j.F.等人编著，1-28页，Cambridge University Press：Cambridge)、藻类(Falciatore等人，1999，Marine Biotechnology 1(3)：239-251)、如下类型的纤毛虫：Holotrichia、缘毛亚纲(Peritrichia)、旋毛亚纲(Spirotrichia)、吸管亚纲(Suctoria)、四膜虫(Tetrahymena)、草履虫(Paramecium)、豆形虫(Colpidium)、瞬目虫(Glaucoma)、匙口虫(Platyophrya)、Potomacus、Pseudocohnilembus、游仆虫(Euplotes)、Engelmaniella和Stylonychia，尤其是按照PCT申请号WO 98/01572中所述转化方法的具有载体的尾棘虫(Stylonychia lemnae)，和在多细胞植物细胞中(参见Schmidt和Willmitzer，1988，High efficiency Agrobacteriumtumefaciens-mediated transformation of Arabidopsis thaliana leaf andcotyledon explants，Plant Cell Rep.583-586；Plant Molecular Biology andBiotechnology，C Press，Boca Raton，Florida，第6/7章，S.71-119，1993；F.F.White，B.Jenes等人，1993，Techniques for Gene Transfer，in：Transgenic Plants，第1卷，Engineering和Utilization，Kung und R.Wu编著，128-43，Academic Press；Potrykus，1991，Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Molec.Biol.42：205-225和其中引用的参考文献)，或者在哺乳动物细胞中表达VTSRP基因。合适的宿主细胞在Goeddel，Gene ExpressionTechnology：Methods in Enzymology 185，Academic Press：San Diego，CA(1990)中进一步讨论。备选地，重组表达载体可例如使用T7-启动子调节序列和T7-聚合酶体外转录和翻译。

原核生物中多肽的表达最常用载体进行，该载体含有指导融合或者非融合多肽表达的组成型或者诱导型启动子。融合载体向其中编码的多肽加上许多氨基酸，通常加到重组多肽的氨基端，但是也加到C-端或者融合在多肽中合适的区域内。此类融合载体通常用于三个目的：1)增加重组多肽的表达；2)增加重组多肽的溶解度；和3)通过作为亲和纯化中的配体帮助纯化重组多肽。通常，在融合表达载体中，在融合部分和重组多肽的接点导入蛋白酶解切割位点，以使得能够在纯化融合多肽后能够从融合部分分离重组多肽。此类酶和它们的相关识别序列包括因子Xa、凝血酶和肠激酶。

典型的融合表达载体包括pGEX(Pharmacia Biotech Inc；Smith，D.B.和Johnson，K.S.，1988，Gene 67：31-40)、pMAL(New England Biolabs，Beverly，MA)，和pRIT5(Pharmacia，Piscataway，NJ)，其分别将谷胱甘肽S转移酶(GST)、麦芽糖E结合多肽或者多肽A融合到靶重组多肽。在一个实施方案中，将VTSRP的编码序列克隆到pGEX表达载体中，以产生编码融合多肽的载体，该融合多肽从N-端到C-端包含GST-凝血酶切割位点-X多肽。使用谷胱甘肽-琼脂糖树脂，通过亲和层析可以纯化融合多肽。通过用凝血酶切割融合多肽可以回收不与GST融合的重组VTSRP。

合适的可诱导的非融合大肠杆菌表达载体的实例包括pTrc(Amann等人，1988，Gene 69：301-315)和pET 11d(Studier等人，1990，GeneExpression Technology：Methods in Enzymology 185：60-89，AcademicPress，San Diego，California(1990)，60-89)。从pTrc载体的靶基因表达依赖于从杂合的trp-lac融合启动子的宿主RNA聚合酶转录。从pET 11d载体的靶基因表达依赖于共表达的病毒RNA聚合酶(T7 gn1)介导的从T7gn10-lac融合启动子的转录。该病毒聚合酶由宿主菌株BL21(DE3)或者HMS174(DE3)从固有的λ原噬菌体提供，所述原噬菌体含有处于lacUV 5启动子的转录控制下的T7 gn1基因。

最大化重组多肽表达的一种策略是在蛋白酶解切割重组多肽的能力受损的宿主细菌中表达该多肽(Gottesman，S.，1990，Gene ExpressionTechnology：Methods in Enzymology 185：119-28，Academic Press，SanDiego，California(1990)119-128)。另一种策略是改变将插入表达载体的核酸的序列，从而每个氨基酸的个体密码子是在所选的表达细菌如谷氨酸棒杆菌中优先利用的那些密码子(Wada等人，1992，Nucleic Acids Res.20：2111-2118)。可以通过标准DNA合成技术进行本发明的核酸序列的此类改变。

在另一实施方案中，VTSRP表达载体是酵母表达载体。用于在酿酒酵母酵母菌中表达的载体的实例包括pYepSec1(Baldari，等人，1987，EMBOJ.6：229-234)、pMFa(Kurjan和Herskowitz，1982，Cell 30：933-943)、pJRY88(Schultz等人，1987，Gene 54：113-123)和pYES2(InvitrogenCorporation，San Diego，CA)。载体和用于构建适合在其他真菌，如丝状真菌中使用的载体的方法包括在van den Hondel，C.A.M.J.J.和Punt，P.J.，1991，“Gene transfer systems and vector development for filamentousfungi，”in：Applied Molecular Genetics of Fungi，J.F.Peberdy，等人编著，1-28页，Cambridge University Press：Cambridge中详述的那些。

备选地，使用杆状病毒表达载体，本发明的VTSRP可以在昆虫细胞中表达。可在培养的昆虫细胞(如Sf9细胞)中表达多肽的杆状病毒载体包括pAc系列(Smith等人，1983，Mol.Cell Biol.3：2156-2165)和pVL系列(Lucklow和Summers(1989)Virology 170：31-39)。

在另一实施方案中，使用哺乳动物表达载体，本发明的VTSRP核酸在哺乳动物细胞中表达。哺乳动物表达载体的实例包括pCDM8(Seed，B.，1987，Nature 329：840)和pMT2PC(Kaufman等人，1987，EMBO J.6：187-195)。当用于哺乳动物细胞中时，表达载体的控制功能一般由病毒调控元件提供。例如，通常使用的启动子来自多瘤、腺病毒2、巨细胞病毒或猴病毒40。原核和真核细胞的其他合适表达系统参见Sambrook，J.，Fritsh，E.F.和Maniatis，T.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，最新版，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，Cold Spring Harbor，NY，1989的16和17章。

在另一实施方案中，重组哺乳动物表达载体能够优先在特定细胞类型(例如，使用组织特异性调节元件表达核酸)中直接表达核酸。组织特异性调节元件在本领域中是已知的。合适的组织特异性启动子的非限定性实例包括白蛋白启动子(肝特异性；Pinkert等人，1987，Genes Dev.1：268-277)、淋巴特异性启动子(Calame和Eaton，1988，Adv.Immunol.43：235-275)，特别是T细胞受体启动子(Winoto和Baltimore，1989，EMBOJ.8：729-733)和免疫球蛋白启动子(Banerji等人，1983，Cell 33：729-740；Queen和Baltimore，1983，Cell 33：741-748)、神经元特异性启动子(例如，神经丝启动子，Byrne和Ruddle，1989，PNAS 86：5473-5477)、胰特异性启动子(Edlund等人，1985，Science 230：912-916)和乳腺特异性启动子(例如，乳清启动子，美国专利No.4,873,316和欧洲专利公开No.264,166)。还包括发育调节启动子，例如小鼠hox启动子(Kessel和Gruss，1990，Science 249：374-379)和甲胎多肽启动子(Campes和Tilghman，1989，Genes Dev.3：537-546)。

众所周知，为了稳定转染哺乳动物细胞，基于使用的表达载体和转染技术，只有小部分细胞可将外源DNA结合进其基因组。为了确定和选择这些整合体，一般将编码选择标记的基因和目的基因导入宿主细胞。优选的选择标记包括那些赋予药物抗性的那些，例如G418、潮霉素和氨甲蝶呤，或者在植物中赋予除草剂(例如N-膦酰甲基甘氨酸、固杀草(glufosinate)或咪唑啉酮)抗性的那些。编码选择标记的核酸分子可导入宿主细胞中编码VTSRP的相同载体上，或可导入不同的载体。稳定转染导入的核酸分子的细胞可例如通过除草剂选择鉴定(例如，掺入选择标记基因的细胞将存活，而其他细胞死亡)。

在本发明的优选实施方案中，VTSRP在植物和植物细胞，如单细胞植物细胞(例如，藻类)(参见Falciatore等人，1999，Marine Biotechnology1(3)：239-251和其中引用的参考文献)和来自高等植物(例如，种子植物，如农作物植物)的植物细胞中表达。可以通过任何方法将VTSRP“导入”植物细胞，所述方法包括转染、转化或者转导、电穿孔、微粒轰击、农杆菌感染等等。本领域技术人员已知的一种转化方法是将开花植物浸入农杆菌溶液中，其中农杆菌含有VTSRP核酸，然后培育所转化的配子。

用于转化或者转染宿主细胞(包括植物细胞)的其他合适的方法可以参见Sambrook，等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual.latest ed.，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，1989和其他实验室手册，如Methods inMolecular Biology，1995，44卷，Agrobacterium protocols，Gartland andDavey编著，Humana Press，Totowa，New Jersey。由于生长增加生物和非生物胁迫耐受性的增强是希望遗传到多种植物，像玉米、小麦、黑麦、燕麦、黑小麦(triticale)、稻、大麦、大豆、花生、棉花、油菜籽(rapeseed)、油菜(canola)、木薯、胡椒、向日葵、万寿菊、茄科植物，像马铃薯、烟草、茄子、番茄、蚕豆物种、豌豆、苜蓿、灌木植物(咖啡、可可、茶)、柳属物种、树(油棕榈树、椰子)、多年生草及饲料作物的一般性状，所以这些作物植物也是如本发明的另一实施方案的遗传工程的优选靶植物。饲料作物包括但不限于，虉草、雀麦、披碱草(Wildrye Grass)、早熟禾(Bluegrass)、鸭茅、苜蓿、Salfoin、角果百脉根(Birdsfoot Trefoil)、杂种车轴草、红车轴草和草木樨(Sweet Clover)。

在本发明的一个实施方案中，通过农杆菌介导的基因转移实现VTSRP向植物的转染。用例如GV3101(pMP90)(Koncz和Schell，1986，Mol.Gen.Genet.204：383-396)或LBA4404(Clontech)根瘤农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)菌株可以进行农杆菌介导的植物转化。通过标准转化和再生技术可以进行转化(Deblaere等人，1994，Nucl.Acids.Res.13：4777-4788；Gelvin Stanton B.和Schilperoort，Robert A，1995，Plant MolecularBiology Manual，第2版-Dordrecht：Kluwer Academic Publ.，-in Sect.，Ringbuc Zentrale Signatur：BT11-P ISBN 0-7923-2731-4；Glick Stanton B.和Schilperoort，Robert A，Methods in Plant Molecular Biology andBiotechnology，Boca Raton：CRC Press，1993，360 S.，ISBN0-8493-5164-2)。例如，通过子叶或者下胚轴转化可以转化油菜籽(Moloney等人，1989，Plant Cell Report 8：238-242；De Block等人，1989，PlantPhysiol.91：694-701)。用于农杆菌和植物选择的抗生素的使用可以取决于用于转化的双元载体和农杆菌菌株。通常用卡那霉素作为选择性植物标记进行油菜籽选择。可以用例如，Mlynarova等人，1994，Plant Cell Report13：282-285描述的技术进行农杆菌介导的基因向亚麻的转移。此外，使用例如欧洲专利号0424 047、美国专利号5,322,783、欧洲专利号0397 687、美国专利号5,376,543或美国专利号5,169,770中描述的技术进行大豆的转化。通过微粒轰击、聚乙二醇介导的DNA摄入或者通过碳化硅纤维技术实现玉米的转化。(参见例如，Freeling和Walbot，“The maize handbook”Springer Verlag：New York(1993)，ISBN 3-540-97826-7)。玉米转化的特定实例参见美国专利号5,990,387，小麦转化的特定实例参见PCT申请号WO 93/07256。

根据本发明，所导入的VTSRP如果整合到非染色体自主复制子或者整合到植物基因组中，那么可以在植物细胞中稳定保持。备选地，所导入的VTSRP可以存在于染色体外非复制的载体中并且可以瞬时表达或者是暂时有活性的。

在一个实施方案中，可以产生同源重组微生物，其中VTSRP整合到染色体，制备载体，其含有已经导入缺失、添加或者替代的VTSRP基因的至少一部分，从而改变例如，功能性破坏VTSRP基因。优选地，VTSRP基因是展叶剑叶藓和酿酒酵母VTSRP基因，但是可以是来自相关植物或酵母，或者甚至来自哺乳动物或者昆虫来源的同源物。在一个实施方案中，设计载体使得当同源重组时，内源VTSRP基因被功能性破坏(即，不再编码功能多肽；也称作敲除载体)。备选地，可以设计载体使得当同源重组时，内源VTSRP基因被突变或者改变，但是仍然编码功能多肽(例如，可以改变上游调节区从而改变内源VTSRP的表达)。为了通过同源重组产生点突变，可以在称作chimeraplasty的技术中使用DNA-RNA杂交体(Cole-Strauss等人，1999，Nucleic Acids Research 27(5)：1323-1330和Kmiec，1999，Gene Therapy American Scientist 87(3)：240-247)。展叶剑叶藓中的同源重组步骤也是本领域公知的并且计划用于本文。

而在同源重组载体中，VTSRP基因的改变的部分在其5’和3’端侧翼是VTSRP基因的额外的核酸分子以允许在微生物或植物中，载体携带的外源VTSRP基因和内源VTSRP基因之间发生同源重组。额外的侧翼VTSRP核酸分子具有足够长度以与内源基因进行成功的同源重组。通常，在载体中包括侧翼DNA的几百碱基对到几千个碱基(都在5’和3’端)(参见例如，Thomas，K.R.和Capecchi，M.R.1987，Cell 51：503关于同源重组载体的描述或者Strepp等人，1998，PNAS，95(8)：4368-4373关于展叶剑叶藓中基于cDNA的重组的描述)。将载体导入微生物或者植物细胞(例如，通过聚乙二醇介导的DNA)，并且使用本领域已知的技术选择其中所导入的VTSRP基因已经与内源VTSRP基因同源重组的细胞。

在另一实施方案中，可以产生重组微生物，其含有允许所导入的基因受调节表达的所选系统。例如，在载体中包括VTSRP基因，将其置于lac操纵子的控制下，允许仅在IPTG的存在下表达VTSRP基因。此类调节系统是本领域公知的。

当存在于染色体外非复制载体中或者整合到染色体的载体中时，VTSRP多核苷酸优选位于植物表达盒中。植物表达盒优选含有能够驱动植物细胞中基因表达的有效连接的调节序列，从而每个序列完成其功能，例如，通过多腺苷酸化信号终止转录。优选的多腺苷酸化信号为源于根瘤农杆菌t-DNA的序列，例如已知为Ti-质粒pTiACH5的章鱼碱合酶的基因3(Gielen等，1984，EMBO J.3：835)或其功能性等效物，但是所有其他在植物中有功能活性的终止子也是合适的。由于植物基因表达通常不局限于转录水平，植物表达盒优选包含其他有效连接的序列，如翻译增强子，例如包含来自烟草花叶病毒的5’非翻译前导序列、提高多肽/RNA比率的超驱动序列(Gallie等，1987，Nucl.Acids Research 15：8693-8711)。植物表达载体的实例包括在Beckerl，D.，Kemper，E.，Schell，J.和Masterson，R，1992，New plant binary vectors with selectable markers located proximal to theleft border，Plant Mol.Biol.20：1195-1197；和Bevan，M.W.，1984，BinaryAgrobacterium vectors for plant transformation，Nucl.Acid.Res.12：8711-8721；Vectors for Gene Transfer in Higher Plants；in：TransgenicPlants，第1卷，Engineering and Utilization，Kung和R.Wu编著，1993，Academic Press，S.15-38中详述的那些。

植物基因表达应该有效连接到合适的启动子，其赋予时间、细胞特异性或组织特异性方式的基因表达。用于本发明的表达盒的启动子包括能够在植物细胞中启动转录的任何启动子。此类启动子包括，但不限于，可以从植物、植物病毒和含有在植物中表达的基因的细菌，如农杆菌和根瘤菌(Rhizobium)得到的启动子。

启动子可以是组成型的、诱导型的、发育阶段优选的、细胞类型优选的、组织优选的或者器官优选的。组成型启动子在多数条件下有活性。组成型启动子的实例包括CaMV 19S和35S启动子(Odell等人，1985，Nature313：810-812)、sX CaMV 35S启动子(Kay等人，1987，Science236：1299-1302)、Sep1启动子、稻肌动蛋白启动子(McElroy等人，1990，Plant Cell2：163-171)、拟南芥肌动蛋白启动子、泛蛋白启动子(Christensen等人，1989，Plant Molec.Biol.18：675-689)、pEmu(Last等人，1991，Theor.Appl.Genet.81：581-588)、玄参花叶病毒35S启动子、Smas启动子(Velten等人，1984，EMBO J 3：2723-2730)、GRP1-8启动子、肉桂醇脱氢酶启动子(美国专利号5,683,439)、来自农杆菌的T-DNA的启动子，如甘露碱合酶、胭脂氨酸合酶和章鱼碱合酶、核酮糖二磷酸羧化酶的小亚基(ssuRUBISCO)启动子等。

诱导型启动子在某些环境条件，如存在或不存在营养物或者代谢物、热或者冷、光、病原体攻击、缺氧条件等等下优先活化。例如通过热休克诱导来自芸苔属(Brassica)的hsp80启动子；通过光诱导PPDK启动子；通过病原体感染可诱导来自烟草、拟南芥和玉米的PR-1启动子；通过缺氧和冷胁迫诱导Adh1启动子。通过诱导型启动子还可以促进植物基因表达(综述见Gatz，1997，Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Mol.Biol.48：89-108)。如果希望以时间特异的方式进行基因表达，那么化学诱导启动子特别合适。此类启动子的实例是水杨酸诱导启动子(PCT申请号WO95/19443)、四环素诱导启动子(Gatz等人，1992，Plant J.2：397-404)，和乙醇诱导启动子(PCT申请号WO 93/21334)。

在本发明的一个优选实施方案中，诱导型启动子是胁迫诱导型启动子。对于本发明，胁迫诱导型启动子在一种或多种下面的胁迫下优先具有活性：与盐度、干旱、温度、金属、化学品、病原体和氧化胁迫有关的非最优条件。胁迫诱导型启动子包括，但不限于Cor78(Chak等人，2000，Planta210：875-883；Hovath等人，1993，Plant Physiol.103：1047-1053)、Cor15a(Artus等人，1996，PNAS 93(23)：13404-09)、Rci2A(Medina等人，2001，Plant Physiol.125：1655-66；Nylander等人，2001，Plant Mol.Biol.45：341-52；Navarre和Goffeau，2000，EMBO J.19：2515-24；Capel等人，1997，Plant Physiol.115：569-76)、Rd22(Xiong等人，2001，Plant Cell13：2063-83；Abe等人，1997，Plant Cell 9：1859-68；Iwasaki等人，1995，Mol.Gen.Genet.247：391-8)、cDet6(Lang和Palve，1992，Plant Mol.Biol.20：951-62)、ADH1(Hoeren等人，1998，Genetics 149：479-90)、KAT1(Nakamura等人，1995，Plant Physiol.109：371-4)、KST1(Müller-Rber等人，1995，EMBO 14：2409-16)、Rha1(Terryn等人，1993，Plant Cell5：1761-9；Terryn等人，1992，FEBS Lett.299(3)：287-90)、ARSK1(Atkinson等人，1997，GenBank登录号L22302，和PCT申请号WO 97/20057)、PtxA(Plesch等人，GenBank登录号X67427)、SbHRGP3(Ahn等人，1996，Plant Cell 8：1477-90)、GH3(Liu等人，1994，Plant Cell 6：645-57)、病原体诱导PRP1-基因启动子(Ward等人，1993，Plant.Mol.Biol.22：361-366)、来自番茄的热诱导hsp80启动子(美国专利号5187267)、来自马铃薯的冷诱导α-淀粉酶启动子(PCT申请号WO 96/12814)，或者创伤诱导pinII-启动子(欧洲专利号375091)。关于干旱、寒冷、盐诱导启动子的其他实例，如RD29A启动子，参见Yamaguchi-Shinozalei等人，1993，Mol.Gen.Genet.236：331-340。

发育阶段优选的启动子在某些发育阶段优先表达。组织和器官优选的启动子包括在某些组织或者器官，如叶、根、种子或者木质部中优先表达的启动子。组织优选的和器官优选的启动子的实例包括，但不限于果实优选的、胚珠优选的、雄性组织优选的、种子优选的、珠被优选的、块茎优选的、茎优选的、果皮优选的和叶优选的、气孔优选的、花粉优选的、花药优选的、花瓣优选的、萼片优选的、花梗优选的、长角果优选的、茎干优选的、根优选的启动子等。种子优选的启动子在种子发育和/或萌发期间优先表达。例如，种子优选的启动子可以是胚胎优选的、胚乳优选的和种皮优选的。参见Thompson等人，1989，BioEssays 10：108。种子优选的启动子的实例包括，但不限于，纤维素合酶(celA)、Cim1、γ-玉米醇溶蛋白、球蛋白-1、玉米19kD玉米醇溶蛋白(cZ19B1)等。

其他合适的组织优选的或者器官优选的启动子包括来自油菜籽的油菜籽蛋白基因启动子(美国专利号5,608,152)、来自蚕豆(Vicia faba)的USP启动子(Baeumlein等人，1991，Mol.Gen.Genet.225(3)：459-67)、来自拟南芥的油质蛋白启动子(PCT申请号WO 98/45461)、来自菜豆(Phaseolusvulgaris)的菜豆蛋白启动子(美国专利号5,504,200)、来自芸苔的Bce4启动子(PCT申请号WO 91/13980)，或者豆球蛋白B4启动子(LeB4；Baeumlein等人，1992，Plant Journal，2(2)：233-9)，以及赋予在单子叶植物(像玉米、大麦、小麦、黑麦、稻等)种子特异表达的启动子。将提到的合适的启动子是来自大麦的lpt2或lpt1基因启动子(PCT申请号WO 95/15389和PCT申请号WO 95/23230)或者在PCT申请号WO 99/16890中描述的那些(来自大麦的大麦醇溶蛋白、稻谷蛋白基因、稻水稻素基因、稻谷醇溶蛋白基因、小麦醇溶蛋白基因、小麦谷蛋白基因、燕麦谷蛋白基因、高粱kasirin基因，和黑麦裸麦醇溶蛋白基因的启动子)。

用于本发明的表达盒中的其他启动子包括，但不限于，主要叶绿素a/b结合蛋白启动子、组蛋白启动子、Ap3启动子、β-conglycin启动子、油菜籽蛋白启动子、大豆凝集素启动子、玉米15kD玉米醇溶蛋白启动子、22kD玉米醇溶蛋白启动子、27kD玉米醇溶蛋白启动子、g-玉米醇溶蛋白启动子、waxy、shrunken1、shrunken2和bronze启动子、Zm13启动子(美国专利号5,086,169)、玉米多聚半乳糖醛酸酶启动子(PG)(美国专利号5,412,085和5,545,546)和SGB6启动子(美国专利号5,470,359)，以及合成的或者其他天然启动子。

通过使用异源DNA结合结构域和应答元件(例如，来自非植物来源的DNA结合结构域)可以得到控制植物中异源基因表达的额外的灵活性。这种异源DNA结合结构域的一个实例是LexA DNA结合结构域(Brent和Ptashne，1985，Cell 43：729-736)。

本发明还提供了重组表达载体，其包含以反义方向克隆到该表达载体的本发明的VTSRP DNA分子。即，该DNA分子以允许与VTSRP mRNA反义的RNA分子表达(通过DNA分子的转录)的方式有效连接到调节序列。可以选择有效连接到以反义方向克隆的核酸分子的调节序列，其指导反义RNA分子在多种细胞类型中持续表达。例如，可以选择指导反义RNA的组成型、组织特异性或者细胞类型特异性表达的病毒启动子和/或增强子，或者调节序列。反义表达载体可以是重组质粒、噬菌粒或者减毒病毒的形式，其中在高效调节区的控制下产生反义核酸。可以通过载体所导入的细胞类型确定调节区的活性。关于使用反义基因调节基因表达的讨论，见Weintraub，H.等人，1986，Antisense RNA as a molecular tool for geneticanalysis，Reviews-Trends in Genetics，第1(1)卷，和Mol等人，1990，FEBS Letters 268：427-430。

本发明的另一方面涉及本发明的重组表达载体所导入的宿主细胞。术语“宿主细胞”和“重组宿主细胞”在本文中互换使用。可以理解此类术语不仅指具体的受体细胞，而且它们也应用于这种细胞的后代或者潜在后代。因为由于突变或者环境影响，在连续世代中可以发生某些修饰，这些后代实际上可能与亲本细胞不同，但是仍然包括在本文使用的该术语的范围内。宿主细胞可以是任何原核或者真核细胞。例如，VTSRP可以在细菌细胞，如谷氨酸棒杆菌、昆虫细胞、真菌细胞或者哺乳动物细胞(如中国仓鼠卵巢细胞(CHO)或者COS细胞)、藻类、纤毛虫、植物细胞、真菌或者其他微生物，像谷氨酸棒杆菌中表达。其他合适的宿主细胞是本领域技术人员已知的。

本发明的宿主细胞(如培养的原核或真核宿主细胞)可用于产生(即表达)VTSRP。因此本发明另外提供使用本发明的宿主细胞产生VTSRP的方法。在一个实施方案中，该方法包括在合适的培养基中培养本发明的宿主细胞(引入了编码VTSRP的重组表达载体、或其基因组引入了编码野生型或改变的VTSRP基因)直至产生VTSRP。在另一个实施方案中，该方法还包括从培养基或宿主细胞中分离VTSRP。

本发明另一方面涉及分离的VTSRP及其生物活性部分。“分离的”或“纯化的”多肽或其生物活性部分不合有通过重组DNA技术产生时的某些细胞物质或化学合成时的化学前体或其他化学物质。“基本不含有细胞物质”的术语包括VTSRP的制备物，其中多肽从天然或重组产生它的细胞的某些细胞物质中分离。在一个实施方案中，“基本不含有细胞物质”的说法包括含有低于约30％(干重)非VTSRP物质(本文也称为“污染多肽”)，更优选低于约20％的非VTSRP物质、还更优选低于约10％的非VTSRP物质、并最优选低于约5％的非VTSRP物质的VTSRP制备物。

重组产生VTSRP或其生物活性部分时，还优选基本不含有培养基，即培养基小于多肽制剂体积的约20％、更优选小于约10％并最优选小于约5％。“基本不含有化学前体或其他化学物质”的术语包括VTSRP的制备物，其中多肽从多肽合成中相关的化学前体或其他化学物质中分离。在一个实施方案中，术语“基本不含有化学前体或其他化学物质”包括含有低于约30％(干重)的前体或非VTSRP化学物质的VTSRP制备物，更优选低于约20％的化学前体或非VTSRP化学物质、还更优选低于约10％的化学前体或非VTSRP化学物质、并最优选低于约5％的化学前体或非VTSRP化学物质。在优选的实施方案中，分离的多肽或其生物活性部分没有来自VTSRP来源的同一生物的污染多肽。通常，通过在其他植物或微生物(如谷氨酸棒杆菌、纤毛虫、藻类或真菌)中而不是在展叶剑叶藓或酿酒酵母中重组表达展叶剑叶藓或酿酒酵母的VTSRP，来产生这些多肽。

本文描述的核酸分子、多肽、多肽同源物、融合多肽、引物、载体和宿主细胞可以用于一种或多种下面的方法中：鉴定展叶剑叶藓或者酿酒酵母和相关生物；与展叶剑叶藓或者酿酒酵母有关的生物的基因组作图；鉴定和定位展叶剑叶藓或者酿酒酵母目的序列；进化研究；确定功能所需的VTSRP区；调节VTSRP活性；调节一种或多种细胞功能的代谢；调节一种或多种化合物的跨膜运输；调节胁迫抗性；和调节VTSRP核酸的表达。在这些方法的一个实施方案中，VTSRP发挥活性植物转录因子的功能。在这些方法的另一个实施方案中，VTSRP发挥小泡运输蛋白的功能。

藓类展叶剑叶藓与其他藓类如能够在无光的条件下生长的角齿藓台湾变种(Ceratodon purpureus)有关。藓类像角齿藓属(Ceratodon)和剑叶藓属在DNA序列和多肽水平上具有高度的序列同一性，允许使用从其他藓类或者生物设计的探针对DNA分子进行异源筛选，从而使得能够得到适于异源筛选或者功能注解以及预测第三个物种中的基因功能的共有序列。因此，鉴定此类功能的能力具有重要相关性，例如，预测酶的底物特异性。此外，这些核酸分子可以作为藓类基因组或者相关生物基因组作图的参照点。

本发明的VTSRP核酸分子具有多种用途。最重要地，本发明的核酸和氨基酸序列可以用于转化植物，从而诱导对胁迫如干旱、高盐度和寒冷的耐受性。本发明因此提供了用VTSRP核酸转化的转基因植物，其中核酸序列在植物中的表达导致与野生型品种的植物相比，该转基因植物增强对环境胁迫的耐受性。转基因植物可以是单子叶植物或者双子叶植物。本发明还提供了转基因植物，其可以选自例如玉米、小麦、黑麦、燕麦、黑小麦、稻、大麦、大豆、花生、棉花、油菜籽、油菜、木薯、胡椒、向日葵、万寿菊、茄科植物、马铃薯、烟草、茄子、番茄、蚕豆物种、豌豆、苜蓿、咖啡、可可、茶、柳属物种、油棕榈树、椰子、多年生草及饲料作物。

具体地，本发明描述了使用展叶剑叶藓的Sar1小GTP酶(PpGBP-1，EST203)和Rab小GTP酶(PpVTP-1，EST513)；和酿酒酵母的v-SNARE蛋白(ScVTP-1，YMR197C，ORF3240)的表达来工程化的植物，所述植物具有增加的生长和植物干旱耐受性、盐耐受性和/或寒冷耐受性，和/或具有改变的水利用效率的植物，特别是具有增加的水利用效率的植物。本文使用的术语和短语“耐受性”、“效率”、“植物耐受性”和“胁迫耐受性”可包括水利用效率，并不限于例如寒冷耐受性、热耐受性、盐耐受性和干旱耐受性。以拟南芥阐明了本文描述的该策略，但是它的应用不局限于该植物。因此，本发明提供了含有VTSRP，如SEQ ID NO：4中定义的sar1小GTP酶(PpGBP-1，EST203)、SEQ ID NO：2中定义的Rab小GTP酶(PpVTP-1，EST513)，或SEQ ID NO：6中定义的V-SNARE蛋白(ScVTP-1，YMR197C，ORF3240)的转基因植物，其中该植物具有增加的生长和/或对选自干旱、增加的盐度，或者降低或者升高的温度的一种或多种的环境胁迫的增强的耐受性。在优选实施方案中，环境胁迫是干旱。

因此，本发明提供了用VTSRP编码核酸产生转基因植物的方法，其中所述核酸在植物中的表达导致与野生型品种的植物相比对环境胁迫的增强的耐受性，所述方法包括：(a)向植物细胞导入包含VTSRP核酸的表达载体，和(b)从植物细胞产生转基因植物，该转基因植物与野生型品种的植物相比具有增加的生长和对环境胁迫的增强的耐受性。植物细胞包括，但不限于，原生质体、产生配子的细胞和再生成完整植物的细胞。如本文使用的术语“转基因的”指含有至少一种重组多核苷酸的任何植物、植物细胞、愈伤组织、植物组织或者植物部分的全部或者部分。在许多情况中，重组多核苷酸的全部或者部分稳定整合到染色体或者稳定的染色体外元件中，从而其传递到连续世代。在优选实施方案中，VTSRP核酸编码包含SEQ IDNO：2、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6的多肽的蛋白质。

本发明还提供了调节植物的生长和/或对环境胁迫的耐受性的方法，其包括修饰植物中VTSRP编码核酸的表达。如通过增加或者减少VTSRP的表达可以分别实现增加或者减少植物的生长和/或对环境胁迫的耐受性。优选地，通过增加VTSRP的表达增加植物的生长和/或对环境胁迫的耐受性。通过本领域技术人员已知的任一方法可以修饰VTSRP的表达。可以使用增加VTSRP的表达的方法，其中植物是转基因的或非转基因的。对于植物是转基因的情况，可以用含有上述VTSRP编码核酸的任一种的载体转化植物，或者可以例如用指导植物中天然VTSRP表达的启动子转化植物。本发明提供的这种启动子可以是组织优选的、发育调节的、胁迫诱导型的或者其组合。备选地，非转基因植物可以具有通过诱导天然启动子修饰的天然VTSRP表达。靶植物中如SEQ ID NO：4中定义的sar1小GTP酶(PpGBP-1，EST203)、SEQ ID NO：2中定义的Rab小GTP酶(PpVTP-1，EST513)，或SEQ ID NO：6中定义的V-SNARE蛋白(ScVTP-1，YMR197C，ORF3240)的表达可以通过但不限于如下实例之一实现：(a)组成型启动子，(b)胁迫诱导型启动子，(c)化学品诱导的启动子，和(d)用例如锌指衍生的转录因子工程化的启动子超量表达(Greisman和Pabo，1997，Science 275：657)。

在优选实施方案中，用如Greisman和Pabo，1997，Science 275：657中描述的并由Sangamo Biosciences，Inc生产的锌指衍生的转录因子(ZFP)调节VTSRP的转录。这些ZFP包含DNA识别结构域和功能结构域，其导致靶核酸如VTSRP核酸的活化或者抑制。因此，可以产生活化和抑制的ZFP，其特异识别上述VTSRP启动子并且用以增加或减少植物中VTSRP的表达，从而调节植物的生长和/或胁迫耐受性。本发明还包括靶植物中如SEQ ID NO：4中定义的sar1小GTP酶(PpGBP-1，EST203)、SEQ IDNO：2中定义的Rab小GTP酶(PpVTP-1，EST513)，和SEQ ID NO：6中定义的V-SNARE蛋白(ScVTP-1，YMR197C，ORF3240)的同源物以及该同源物的启动子的鉴定。本发明还提供了与野生型品种的宿主细胞相比，增加宿主细胞内目的基因的表达的方法，其中目的基因应答VTSRP而转录，所述方法包括：(a)用包含VTSRP编码核酸的表达载体转化宿主细胞，和(b)在宿主细胞中表达VTSRP，从而与野生型品种的宿主细胞相比，增加应答VTSRP所转录的基因的表达。

除了向转基因植物中导入VTSRP核酸序列外，这些序列还可以用于鉴定生物为展叶剑叶藓、酿酒酵母或者其近亲。而且，它们还可以用于鉴定微生物的混合群体中展叶剑叶藓、酿酒酵母或者其近亲的存在。本发明提供了大量展叶剑叶藓和酿酒酵母基因的核酸序列；通过用跨越展叶剑叶藓或酿酒酵母基因的该生物独特的区域的探针，在严格调节下探测微生物的唯一或者混合群体的培养物的所提取的基因组DNA，可以确定该生物是否存在。

此外，本发明的核酸和多肽分子可以用作基因组的特异区域的标记。这不仅可以用于基因组的作图，而且用于展叶剑叶藓或酿酒酵母多肽的功能研究。例如，为了鉴定特定展叶剑叶藓DNA结合多肽所结合的基因组区域，可以消化展叶剑叶藓基因组，并用DNA结合多肽温育该片段。结合所述多肽的那些片段还可以用本发明的核酸分子探测，本发明的核酸分子优选具有容易检测的标记。这种核酸分子与基因组片段的结合使得可以将片段定位到展叶剑叶藓的基因组图谱，并且当用不同的酶进行多次时，方便了快速确定该多肽结合的核酸序列。此外，本发明的核酸分子可以与相关物种的序列足够一致，使得这些核酸分子可以作为构建相关藓类中的基因组图谱的标记。

本发明的VTSRP核酸分子还可用于进化和多肽结构研究。本发明的分子参与的小泡运输过程被多种原核和真核细胞利用；通过比较本发明的核酸分子与编码来自其他生物的相似酶的那些核酸分子的序列，可以评估生物的进化亲缘关系。类似地，这种比较允许评估序列的哪些区域是保守的，哪些不保守，哪些可以帮助确定多肽的酶功能必需的那些区域。该类型的确定对于多肽工程化研究是有价值的并且可以给出哪种多肽可以耐受诱变而不丧失功能的指征。

操作本发明的VTSRP核酸分子可以导致产生具有与野生型VTSRP不同功能的VTSRP。这些多肽可以在效率或活性上提高，可以在细胞中具有比通常更多的数目，或者可以具有降低的效率或活性。

本发明的VTSRP的改变可以借助多种机理来直接影响生长和/或胁迫应答和/或胁迫耐受性。对于表达VTSRP的植物，增强的小泡运输活性可以导致蛋白质细胞运输的改变，这引起植物水使用效率的提高。

通过将经修饰的微生物或者植物在不太合适的调节下生长，然后分析植物的生长特征和/或代谢，可以评估植物、谷氨酸棒杆菌、真菌、藻类或者纤毛虫的遗传修饰对生长和/或胁迫耐受性的影响。此类分析技术是本领域技术人员已知的，并且包括干重、湿重、多肽合成、糖类合成、脂类合成、蒸发蒸腾速率、植物和/或作物的总产量、开花、繁殖、结籽、根生长、呼吸率、光合作用速率等等(Applications of HPLC in Biochemistry in：Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology，第17卷；Rehm等人，1993 Biotechnology，第3卷，第III章：Product recoveryand purification，469-714页，VCH：Weinheim；Belter，P.A.等人，1988，Bioseparations：downstream processing for biotechnology，John Wiley和Sons；Kennedy，J.F.和Cabral，J.M.S.，1992，Recovery processes forbiological materials，John Wiley和Sons；Shaeiwitz，J.A.和Henry，J.D.，1988，Biochemical separations，in：Ulmann’s Encyclopedia of IndustrialChemistry，第B3卷，第11章，1-27页，VCH：Weinheim；和Dechow，F.J.，1989，Separation and purification techniques in biotechnology，NoyesPublications)。

例如，使用标准方案，可以构建包含本文公开的核酸或者其片段的酵母表达载体并将其转化到酿酒酵母中。然后测定所得转基因细胞对其生长的增加和/或对干旱、盐和温度胁迫的耐受性的不足或者改变。类似地，使用标准方案，可以构建包含本文公开的核酸或者其片段的植物表达载体并将其转化到合适的植物细胞，如拟南芥、大豆、油菜、玉米、小麦、Medicagotruncatula等等中。然后测定所得转基因细胞和/或植物生长增加和/或对干旱、盐和温度胁迫的耐受性的不足或者改变。

此外，本文公开的序列或者其片段可以用于在多种生物，如细菌、哺乳动物细胞、酵母细胞和植物细胞的基因组中产生敲除突变(Girke，T.，1998，The Plant Journal 15：39-48)。然后可以评估所得敲除细胞耐受多种胁迫条件的能力或才能、它们对多种胁迫条件的应答，和对突变的表型和/或基因型的影响。对于其他基因失活方法，参见美国专利号6,004,804“Non-Chimeric Mutational Vectors”和Puttaraju等人，1999，Spliceosome-mediated RNA trans-splicing as a tool for gene therapy，Nature Biotechnology 17：246-252。

上述导致生长增加和胁迫耐受性的VTSRP的诱变策略不意在限制；这些策略的变通方案将是本领域技术人员显而易见的。使用此类策略，并结合本文公开的机理，本发明的核酸和多肽分子可以用于产生表达突变的VTSRP核酸和多肽分子的藻类、纤毛虫、植物、真菌或者其他微生物像谷氨酸棒杆菌，从而提高了生长和/或胁迫耐受性。

本发明还提供了特异结合如本文描述的核酸编码的VTSRP或者其部分的抗体。可以通过多种公知的方法制备抗体(参见，例如，Harlow和Lane，“Antibodies；A Laboratory Manual，”Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，[00131]New York，(1988)).简言之，可以将纯化的抗原以足以引发免疫反应的剂量和间隔注射进动物中。可以直接纯化抗体或从动物中获得脾细胞。然后将细胞与永生细胞系融合并筛选抗体分泌。该抗体可以用于从核酸克隆文库中筛选分泌抗原的细胞。接着可以对阳性克隆进行测序(参见，例如Kelly等人，1992，Bio/Technology 10：163-167；Bebbington等人，1992，Bio/Technology 10：169-175)。

短语与多肽“选择性结合”和“特异性结合”指由异源多肽群和其他生物制品中存在的多肽决定的结合反应。因此，在指定的免疫测定条件下，与特定多肽结合的特异性抗体不与样品中存在的其他多肽大量结合。这种条件下抗体的选择性结合可能需要根据对特定多肽的特异性选出的抗体。可以使用多种免疫测定形式选择与特定多肽选择性结合的抗体。例如，通常固相ELISA免疫测定用于选择与多肽选择性免疫反应的抗体。对于可用于测定选择性结合的免疫测定形式和条件的描述，可参阅Harlow和Lane，Antibodies，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Publications，NewYork，(1988)。

在某些情况下，需要从不同的宿主中制备单克隆抗体。制备这种单克隆抗体的技术的描述可以见Stites等人编著，“Basic and ClinicalImmunology，”(Lange Medical Publications，Los Altos，Calif.，第4版)及其引用的参考文献，以及Harlow和Lane，“Antibodies，A LaboratoryManual”Cold Spring Harbor Publications，New York，1988。

本申请全文中引用了多种出版物。所有这些出版物的公开内容以及这些出版物中引用的参考文献以其全文引入本申请中作为参考，以更详细的描述本发明所属领域的状况。

还应该理解前文涉及本发明优选的实施方案，可以在不脱离本发明范围的情况下产生众多的变化和改变。本发明通过以下实施例进一步说明，所述实施例不应以任何方式解释为限制性的。相反，应该清楚的理解，在阅读本文的描述后，可以在不脱离本发明的精神和/或权利说明书的范围的情况下提示本领域技术人员多种其他实施方案、改变和其等效方案。

实施例

实施例1展叶剑叶藓培养物的生长

对于该研究，使用来自University of Hamburg的遗传学研究组的保藏中心的物种植物展叶剑叶藓(Hedw.)B.S.G.。它们来自Gransden Wood，Huntingdonshire(英国)的H.L.K.Whitehouse收集的菌株16/14，其由Engel从孢子传代培养(1968，Am.J.Bot.55：438-446)。通过孢子和配子体的再生进行植株的繁殖。原丝体从单倍体孢子发育为富含叶绿体的原丝体和低叶绿体的茎原丝，在约12天后从富含叶绿体的原丝体和低叶绿体的茎原丝形成芽。这些芽生长产生具有精子器和茎卵器的配子托。受精后，得到具有短的刚毛和孢子荚膜的二倍体孢子体，其中减数孢子成熟。

在气候室中，大气温度为25℃和光强度为55微摩尔m² s^-1(白光；Philips TL 65W/25荧光管)和16/8小时的光/黑暗转变下进行培养。使用根据Reski和Abel的Knop培养基(1985，Planta 165：354-358)在液体培养中修饰该苔藓或者使用1％oxoid琼脂(Unipath，Basingstoke，英格兰)将该苔藓培养在Knop固体培养基上。在通气的液体培养物中培养用于RNA和DNA分离的原丝体。每9天将原丝体捣碎并转移到新鲜培养基中。

实施例2从植株分离总DNA

关于总DNA分离的细节涉及使用1克鲜重的植物材料。所用的材料包括下面的缓冲液：CTAB缓冲液：2％(w/v)N-十六烷基-N，N，N-三甲基溴化铵(CTAB)；100mM Tris HCl pH8.0；1.4M NaCl；20mM EDTA；N-十二烷基肌氨酸缓冲液：10％(w/v)N-十二烷基肌氨酸；100mM Tris HCl pH8.0和20mM EDTA。

研钵中在液氮下研磨植物材料得到细粉末并转移到2ml Eppendorf容器中。然后用一层1ml的分解缓冲液(1ml CTAB缓冲液、100μl N-十二烷基肌氨酸缓冲液、20μlβ-巯基乙醇和10μl蛋白酶K溶液，10mg/ml)覆盖冷冻的植物材料并在60℃连续摇动下温育1小时。将所得匀浆物置于两个Eppendorf容器(2ml)中并用相同体积的氯仿/异戊醇(24∶1)摇动萃取两次。为了分相，在每种情况下以8000×g室温离心15分钟。然后用冰预冷的异丙醇在-70℃下沉淀DNA 30分钟。在4℃和10,000g下沉降所沉淀的DNA 30分钟并重悬浮在180μl TE缓冲液中(Sambrook等人，1989，ColdSpring Harbor Laboratory Press：ISBN 0-87969-309-6)。为了进一步沉淀，将该DNA用NaCl(1.2M终浓度)处理并在-70℃用两倍体积的无水乙醇再次沉淀30分钟。70％乙醇的洗涤步骤后，干燥DNA并随后加入50μl H₂O+RNA酶(50mg/ml终浓度)。将DNA在4℃下溶解过夜，并随后在37℃下用RNA酶消化1小时。将该DNA在4℃保存。

实施例3从展叶剑叶藓分离总RNA、聚腺苷酸化RNA和cDNA文库构建

为了研究转录物，分离总RNA和聚腺苷酸化RNA。按照GTC方法(Reski等人，1994，Mol.Gen.Genet.，244：352-359)从野生型9天龄的原丝体得到总RNA。按照生产商的方案，使用Dyna Beads^R(Dynal，Oslo，Norway)分离聚腺苷酸化RNA。测定RNA或者聚腺苷酸化RNA的浓度后，通过加入1/10体积pH4.6的3M乙酸钠和2体积的乙醇沉淀RNA，并在-70℃保存。

为了构建cDNA文库，用小鼠白血病病毒逆转录酶(Roche，Mannheim，德国)和寡聚d(T)引物实现第一链合成，通过在12℃(2小时)、16℃(1小时)和在22℃(1小时)，用DNA聚合酶I、Klenow酶温育和RNA酶H消化合成第二链。通过在65℃温育(10分钟)终止反应并随后转移到冰上。通过T4-DNA-聚合酶(Roche，Mannheim)在37℃(30分钟)下补平双链DNA分子。通过苯酚/氯仿萃取和Sephadex G50旋转柱除去核苷酸。通过T4-DNA-连接酶(Roche，12℃，过夜)将EcoRI接头(Pharmacia，Freiburg，德国)连接到cDNA末端并与多核苷酸激酶(Roche，37℃，30分钟)温育进行磷酸化。将混合物在低熔点琼脂糖凝胶上分离。从凝胶洗脱大于300个碱基对的DNA分子，苯酚萃取，并在Elutip-D-柱(Schleicher和Schuell，Dassel，德国)上浓缩，使用Gigapack Gold Kit(Stratagene，Amsterdam，荷兰)，用生产商的材料和按照其说明书，连接到载体臂并包装成λZAPII噬菌体或者λZAP-表达噬菌体。

实施例4展叶剑叶藓EST的测序和功能注解

如实施例3中描述的cDNA文库用于根据标准方法，尤其通过链终止方法，使用ABI PRISM Big Dye Terminator Cycle Sequencing ReadyReaction Kit(Perkin-Elmer，Weiterstadt，德国)进行DNA测序。通过体内大量切除、再转化和随后在琼脂板上接种DH10B(材料和方案细节来自Stratagene，Amsterdam，荷兰)从cDNA文库进行制备性质粒回收，然后进行随机测序。用Qiagene DNA制备自动设备(Qiagen，Hilden)，按照生产商的方案从在含有氨苄青霉素的LB培养基上过夜生长的大肠杆菌(E.coli)培养物制备质粒DNA(参见Sambrook等人，1989，Cold Spring HarborLaboratory Press：ISBN 0-87969-309-6)。使用具有下列核苷酸序列的测序引物：

5′-CAGGAAACAGCTATGACC-3′     SEQ ID NO：7

5′-CTAAAGGGAACAAAAGCTG-3′    SEQ ID NO：8

5′-TGTAAAACGACGGCCAGT-3′     SEQ ID NO：9

用Bio-Max(Munich，德国)市售的软件包EST-MAX处理和注解序列。该程序整合了对于蛋白质序列的功能和结构表征重要的几乎所有生物信息学方法。参考文献见网站pedant.mips.biochem.mpg.de。结合到EST-MAX的最重要的算法是：FASTA(Very sensitive sequence databasesearches with estimates of statistical significance；Pearson W.R.，1990，Rapid and sensitive sequence comparison with FASTP and FASTA，Methods Enzymol.183：63-98)；BLAST(Very sensitive sequence databasesearches with estimates of statistical significance；Altschul S.F.等人，Basiclocal alignment search tool，Journal of Molecular Biology 215：403-10)；PREDATOR(High-accuracy secondary structure prediction from singleand multiple sequences；Frishman，D.和Argos，P.，1997，75％accuracy inprotein secondary structure prediction.Proteins 27：329-335)；CLUSTALW(Multiple sequence alignment；Thompson J.D.等人，1994，CLUSTALW(improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignmentthrough sequence weighting，position-specific gap penalties and weightmatrix choice，Nucleic Acids Research 22：4673-4680)；TMAP(Transmembrane region prediction from multiply aligned sequences；Persson，B.和Argos，P.，1994，Prediction of transmembrane segments inproteins utilizing multiple sequence alignments.J.Mol.Biol.237：182-192)；ALOM2(Transmembrane region prediction from single sequences；Klein，P.等人，Prediction of protein function from sequence properties：Adiscriminate analysis of a database.Biochim.Biophys.Acta 787：221-226(1984).K.Nakai博士，第2版)；PROSEARCH(Detection of PROSITEprotein sequence patterns；Kolakowski L.F.Jr.，Leunissen J.A.M.，SmithJ.E.，1992，ProSearch：fast searching of protein sequences with regularexpression patterns related to protein structure and function.Biotechniques 13，919-921)；BLIMPS(Similarity searches against adatabase of ungapped blocks，J.C.Wallace和Henikoff S.，1992)；PATMAT(a searching and extraction  program for sequence，pattern and blockqueries and databases，CABIOS 8：249-254.Bill Alford著)。

实施例5鉴定对应于PpGBP-1、PpVTP-1和ScVTP-1的ORF

使用程序EST-MAX，通过BLAST分析在展叶剑叶藓EST测序程序中鉴定了为部分sar1小GTP酶(PpGBP-1，EST 203)和Rab小GTP酶(PpVTP-1，EST 513)的展叶剑叶藓部分cDNA(EST)。选择发现编码小泡运输蛋白的这些特定克隆用于进一步的研究。

表1——PpGBP-1和其他小泡运输蛋白的氨基酸同一性和相似性程度(使用配对比较：空位罚分为10；空位延伸罚分为0.1；得分矩阵为blosum62)；PpGBP-1和其他同源蛋白质的氨基酸同一性和相似性程度(使用配对比较程序：空位罚分为10；空位延伸罚分为0.1；得分矩阵为blosum 62)

Swiss-Prot编号	Q9SDQ5	P52884	O04834	O24110	Q01474
						蛋白质名称	小GTP结合蛋白Sar1BNT	GTP结合蛋白Sar2	GTP结合蛋白Sar1A	小GTP结合蛋白	GTP结合蛋白Sar1B
物种	烟草(Nicotianatabacum)(普通烟草)	番茄(Lycopersiconesculentum)(番茄)	拟南芥(拟南芥(Mouse-earcress))	白花丹叶烟草(Nicotianaplumbaginifolia)(白花丹叶烟草)	拟南芥
						同一性％	84％	84％	83％	83％	82％
相似性％	94％	93％	93％	93％	92％

PpGBP-1氨基酸序列与表2中所示的公开的专利申请中公开的一些序列也具有显著的同源性。

表2

名称	大麦01	拟南芥02	拟南芥03	拟南芥04	玉蜀黍05	玉蜀黍06	玉蜀黍07	玉蜀黍08
									专利	WO03/057877	EP1033405 A2
物种	大麦	拟南芥	拟南芥	拟南芥	玉蜀黍	玉蜀黍	玉蜀黍	玉蜀黍
									同一性％	82	82	82	81	81	81	81	80
相似性％	92	92	92	91	91	91	91	90

表3——Rab小GTP酶(PpVTP-1，EST 513)和其他小泡运输蛋白的氨基酸同一性和相似性程度(使用配对比较：空位罚分为10；空位延伸罚分为0.1；得分矩阵为blosum62)

多肽名称	拟南芥01	拟南芥02
			专利	EP1033405-A2	EP1033405-A2
物种	拟南芥	拟南芥
			同一性％	83	83
相似性％	90	90

来自酿酒酵母，编码vSNARE多肽的ORF3240基因第一次描述于Metanomics，Inc.2003年9月30日提交的欧洲专利申请No.03022225.1。该Metanomics的专利申请在此全部引入作为参考。使用用于扩增过程的Pfu DNA聚合酶或PfuITaq DNA聚合酶混合物(Herculase)的标准方案分离ORF3240基因。通过凝胶电泳分析扩增的ORF片段。每一引物由通用5’端和ORF具体的3’端组成，由此通用序列与正向和反相引物不同(正向引物序列包含酵母的EcoRI或大肠杆菌的SmaI，而反相引物序列包含酵母的SmaI或大肠杆菌的SacI)，这允许单项克隆。用于扩增的PCR反应包括：1x PCR缓冲液、0.2mM dNTP、100ng酿酒酵母基因组DNA(S288C)或60ng大肠杆菌K-12(MG1655)基因组DNA、25pmol反相引物、2.5uPfu或Herculase DNA聚合酶。条件由94℃3分钟的一个循环；接着是94℃30秒、55℃30秒和72℃5-6秒的25个循环；接着是72℃610秒的一个循环，然后4℃无限长时间组成。ScVTP-1(ORF 3240)的正向序列是5’-GGAATTCCAGCTGACCACCATGAGTTCCCTATTAATATCATACGA-3’(SEQ ID NO：10)。ScVTP-1(ORF 3240)的反向序列是5’-gatccccgggaattgccatgctatt gattgtttgttccacggact-3’(SEQ ID NO：11)。实施例6编码PpGBP-1和PpVTP-1的展叶剑叶藓全长cDNA的克隆

为了从展叶剑叶藓分离编码Sar1小GTP酶(PpGBP-1，EST 203)(SEQ ID NO：3)和Rab小GTP酶(PpVTP-1，EST 513)(SEQ ID NO：1)的全长克隆，用SMART RACE cDNA扩增试剂盒(Clontech Laboratories)按照生产商的使用说明书产生cDNA文库。

为了从展叶剑叶藓分离编码PpGBP-1(SEQ ID NO：4)和PpVTP-1(SEQ ID NO：2)的克隆，用SMART RACE cDNA扩增试剂盒(ClontechLaboratories)按照生产商的使用说明书产生cDNA文库。如实施例3中描述的分离的总RNA用作模板。在RNA分离前如下处理培养物：盐胁迫：用补充1M NaCl的培养基处理2、6、12、24、48小时；冷胁迫：4℃下处理与盐胁迫相同的时间点；干旱胁迫：将培养物在干燥滤纸上培育如上相同的时间点。然后获得RNA并用于分离。

5’RACE方案

如实施例5所述，从数据库检索鉴定的PpGBP-1和PpVTP-1EST序列用于设计RACE的寡核苷酸(oligos)(参见表4)。用Advantage 2 PCR试剂盒(Clontech Laboratories)和SMART RACE cDNA扩增试剂盒(Clontech Laboratories)，使用Biometra T3循环变温器按照生产商的使用说明，通过进行cDNA末端的快速扩增聚合酶链式反应(RACE PCR)得到这些基因的延长的序列。

从RACE反应得到的序列含有PpGBP-1和PpVTP-1全长编码区的5’端，并且用于设计各自基因的全长克隆的寡核苷酸(参见下面的全长扩增)。

全长扩增

用基因特异引物(参见表4)和最初的EST作为模板，通过进行聚合酶链式反应(PCR)得到对应于PpGBP-1(SEQ ID NO：3)和PpVTP-1(SEQID NO：1)的全长克隆。反应条件是使用PWO DNA聚合酶(Roche)的标准条件。根据标准条件和生产商的方案进行PCR(Sambrook等人，1989，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，第2版，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，Biometra T3 Thermocycler)。反应的参数为：94℃下5分钟，接着是94℃1分钟，50℃1分钟和72℃4分钟的5个循环。接着是94℃1分钟，65℃1分钟和72℃1.5分钟的25个循环。通过重复RACE方法，但使用表4给出的基因特异引物分离PpGBP-1(SEQ ID NO：3)和PpVTP-1(SEQ ID NO：1)的全长克隆。

用QIAquick Gel Extraction Kit(Qiagen)从琼脂糖凝胶提取扩增的片段并按照生产商的使用说明连接到TOPO pCR 2.1载体中(Invitrogen)。用标准条件将重组载体转化到Top10细胞(Invitrogen)中(Sambrook等人，1989，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，第2版，Cold SpringHarbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY)。在含有100μg/ml羧苄青霉素、0.8mg X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-半乳糖苷)和0.8mgIPTG(异丙基硫代-β-D-半乳糖苷)的LB琼脂上37℃下过夜生长来选择转化的细胞。选择白色菌落并用于接种含有100μg/ml氨苄青霉素的3ml液体LB，在37℃下过夜生长。用QIAprep Spin Miniprep Kit(Qiagen)按照生产商的使用说明提取质粒DNA。根据标准分子生物学技术(Sambrook等人，1989，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，第2版，Cold SpringHarbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY)进行得到的克隆的分析和限制酶切作图。

表4

用于克隆全长克隆的方案和引物

基因	终产物中的位点	分离方法	引物Race	引物全长PCT
					PpGBP-1	XmaI/HpaI	用于全长克隆的5’RACE和RT-PCR	(SEQ ID NO：12)TGCCAGCATTGTCGAGACCCAGAAA	RC586(SEQ ID NO：13)ATCCCGGGTCCGTAGATACCAAGGCTGGTRC587(SEQ ID NO：14)GCGTTAACTCGTCGCTCTTAAACACCGAGCTAAG
PpVTP-1	XmaI/SacI	用于全长克隆的5’RACE和RT-PCR	(SEQ ID NO：12)TGCCAGCATTGTCGAGACCCAGAAA	RC693(SEQ ID NO：23)ATCCCGGGAGATAGCCCAGAAGGCCGATCCRC694(SEQ ID NO：22)GCGAGCTCCACACCAATCTCCAGACTCCACCA

实施例7通过超量表达PpGBP-1、PpVTP-1或ScVTP-1基因工程化胁迫耐受性拟南芥植株—— 构建双元载体：pBPS-JH001

根据生产商的使用说明，使用HindIII(Roche)消化质粒构建物pLMNC53(Mankin，2000，博士论文，University of North Carolina)，并用Klenow酶和0.1mM dNTP补平末端。该片段用琼脂糖凝胶纯化，并用QIAquick Gel Extraction Kit(Qiagen)根据生产商的使用说明提取。然后纯化的片段用EcoRI(Roche)消化、琼脂糖凝胶纯化、用QIAquick GelExtraction Kit(Qiagen)根据生产商的使用说明提取。得到1.4千碱基的片段，即庆大霉素盒，包括nos启动子、aacCI基因和g7终止子。

根据生产商的使用说明，使用EcoRI和SmaI(Roche)消化载体pBlueScript，且用QIAquick Gel Extraction Kit(Qiagen)根据生产商的使用说明从琼脂糖凝胶提取所得的片段。根据生产商的使用说明用T4 DNA连接酶(Roche)连接消化的pBlueScript载体和庆大霉素盒片段，连接两个相应的EcoRI位点以及连接平端HindIII位点和SmaI位点。

使用标准条件将重组载体(pGMBS)转化进入Top10细胞(Invitrogen)。在含有100μg/ml羧苄青霉素、0.8mg X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-半乳糖苷)和0.8mg IPTG(异丙基硫代-β-D-半乳糖苷)的LB琼脂上37℃下过夜生长来选择转化的细胞。选择白色菌落并用于接种含有100μg/ml氨苄青霉素的3ml液体LB，在37℃下过夜生长。用QIAprep SpinMiniprep Kit(Qiagen)按照生产商的使用说明提取质粒DNA。根据标准分子生物学技术(Sambrook等人，1989，Molecular Cloning，A LaboratoryManual，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold SpringHarbor，NY)进行得到的克隆的分析和限制酶切作图。

根据生产商的使用说明，使用XbaI和KpnI(Roche)消化pGMBS载体和p1bxSuperGUS载体，从pGMBS切除庆大霉素盒并从p1bxSuperGUS载体产生主链。用QIAquick Gel Extraction Kit(Qiagen)根据生产商的使用说明从琼脂糖凝胶提取所得的片段。根据生产商的使用说明用T4 DNA连接酶(Roche)连接这两个片段。

使用标准条件将得到的重组载体(pBPS-JH001)转化进入Top10细胞(Invitrogen)。在含有100μg/ml羧苄青霉素、0.8mg X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-半乳糖苷)和0.8mg IPTG(异丙基硫代-β-D-半乳糖苷)的LB琼脂上37℃下过夜生长来选择转化的细胞。选择白色菌落并用于接种含有100μg/ml氨苄青霉素的3ml液体LB，在37℃下过夜生长。用QIAprep SpinMiniprep Kit(Qiagen)按照生产商的使用说明提取质粒DNA。根据标准分子生物学技术(Sambrook等人，1989，Molecular Cloning，A LaboratoryManual，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold SpringHarbor，NY)进行得到的克隆的分析和限制酶切作图。

将PpGBP-1和PpVTP-1亚克隆进入双元载体

按照生产商的使用说明用限制酶双消化(参见表5)从重组PCR2.1TOPO载体切出含有不同展叶剑叶藓小泡运输蛋白的片段。用QIAquickGel Extraction Kit(Qiagen)根据生产商的使用说明从琼脂糖凝胶提取得到的片段、连接进入双元载体、用合适的酶(参见表5)切割，并在连接前去磷酸化。得到的重组载体含有在组成型超级启动子(章鱼碱和甘露碱合酶的融合mas启动子/激活物(Ni等人，1995，Plant J.7：661-676))控制下，正义方向的相应的小泡运输蛋白。

表5——列出用于植物转化的展叶剑叶藓小泡运输蛋白构建体的名称

基因	用于产生基因片段的酶	用于限制载体的酶	双元载体构建物
				PpGBP-1	XmaI/HpaI	XmaI/Ecl136	pBPSLVM162
PpVTP-1	XamI/SacI	XamI/SacI	pBPSSY020

ScVTP-1亚克隆进入双元载体

ScVTP-1基因(YMR 197C，ORF 3240)亚克隆进入双元载体1bxbigResgen，该载体基于修饰的pPZP双元载体主链。该载体包含用于细菌筛选的选择性标记基因(Hajukeiwicz等人，1994，Plant Mol.Biol.25：989-994)和在其T-DNA上由mas1启动子驱动的bar基因(Velten等人，1984，EMBO J.3：2723-2730；Mengiste等人，1997，Plant J.，12：945-948)。另外，该the T-DNA在克隆盒之前含有启动子(Kay等人，1987，Science236：1299-1302)，之后是nos终止子(Depicker等人，J.Mol. Appl.Gen.1(6)：561-573)。该克隆盒由序列5’-GGAATTCCAGCTGACCACCATGGCAATTCCCGGGGATC-3’(SEQ ID NO：17)组成。其他选择系统和启动子是本领域已知的，同样能用于本发明(例如，AHAS标记、泛素启动子(Callis等人，J.Biol.Chem.1990，265：12486-12493；美国5,510,474；美国6,020,190；Kawalleck等人，1993，Plant Mol. Biol.21：673-684)，34S启动子(GenBank登录号M59930和X16673)。

使用厂商(MBI Fermentas，德国)提供的标准方案，用EcoRI和SmaI消化该双元载体和ScVTP-1基因(100ng)。使用Qiagen柱(Qiagen，Hilden，德国)纯化ScVTP-1基因，并使用标准步骤(Maniatis等人)与限制性消化的双元载体(30ng)连接。

农杆菌转化

根据标准条件(Hoefgen和Willmitzer，1990；Koncz和Schell，1986，Mol.Gen.Genet.204：383-396)将重组载体转化到根瘤农杆菌C58C1和PMP90中。

植物转化

培养拟南芥生态型C24并根据标准条件转化(Bechtold，1993，Acad.Sci.Paris.316：1194-1199；Bent等人，1994，Science 265：1856-1860)。

包含剑叶藓属基因的转化植株的筛选

根据标准方案(Xiong等人，1999，Plant Molecular Biology Reporter17：159-170)将T1种子消毒。将种子在Murashige和Skoog培养基(MS)(Sigma-Aldrich)上选择，该培养基含有0.6％琼脂并补加1％蔗糖、2μg/ml苯菌灵(benomyl)(Sigma-Aldrich)。将平板上的种子在4℃下春化4天。种子在22℃的气温和40微摩尔m²s^-1光强度(白光；Philips TL 65W/25荧光管)以及16小时亮和8小时暗的日长周期下，在气候室中萌发。14天后选择转化的幼苗并转移到含有0.6％琼脂、1％蔗糖的MS培养基中并且允许恢复5至7天。

包含剑叶藓属或酵母属基因的转化植株的干旱耐受性筛选

T1幼苗转移到培养皿中干燥无菌的滤纸上，允许在Sanyo GrowthCabinet中80％RH(相对湿度)、MLR-350H、微摩尔m²s^-1(白光；PhilipsTL 65W/25荧光管)下干燥2小时。然后将RH降低至60％，并将幼苗再干燥8小时。之后移出幼苗并置于补充有2μg/ml苯菌灵(Sigma-Aldrich)含0.6％琼脂的MS平板上，且在5天后记分。然后筛选转基因植株的提高的干旱耐受性。

在干旱胁迫条件下，相对于未转化的对照植株表现出的28％的存活率(57株胁迫植株中16株存活)，PpGBP-1(sar1，EST 203)超量表达的拟南芥植株对干旱胁迫表现出45％的存活率(20株胁迫植株中9株存活)。

在三个独立的实验中筛选包含ScVTP-1(ORF 3240，YMR197C)基因的转基因拟南芥植株对干旱的耐受性。在第一个实验中，植株经历了12天的干旱条件时期。在这12天之后，筛选转基因植株提高的干旱耐受性。包含ScVTP-1转基因的转基因植株(14株植株)保持存活，其比未转化的野生型对照植株表现为饱满的外观并保持绿色平均多0.57天。

在第二个实验中，使用一株来自几个独立转基因株系的植株。包含ScVTP-1转基因的3周龄转基因植株经历干旱胁迫条件。包含ScVTP-1转基因的转基因植株(9株植株)保持存活，其比未转化的野生型对照植株表现为饱满的外观并保持绿色平均多1.22天。

在第三个实验中，使用来自一个独立转基因株系的若干植株。包含ScVTP-1转基因的3周龄转基因植株经历干旱胁迫条件。结果示于表6。相对于未转化的野生型对照植株，包含ScVTP-1转基因的转基因植株保持很高的光合产量。对于ScVTP-1，列出5个重复植株的平均结果；对于野生型植株，列出20-25株植株的平均结果。

表6

	光合产量(最后浇水后6天)	光合产量(最后浇水后10天)	光合产量(最后浇水后14天)
				ScVTP-1	751	723	63
野生型	736	709	20

包含剑叶藓属基因的转化植株的冷冻耐受性筛选

幼苗转移到含有补充有2％蔗糖和2μg/ml苯菌灵含0.6％琼脂的MS的培养皿中。4天后，在4℃下温育幼苗1小时，然后覆盖碎冰。然后将种子置于Environmental Specialist ES2000 Environmental Chamber中，并以-1.0℃开始，每小时降低-1℃温育3.5小时。之后将幼苗在-5℃温育24小时，接着在5℃解冻12小时。倒出水，且幼苗在5天后记分。

筛选转基因植株的提高的寒冷耐受性，证明转基因的表达赋予寒冷耐受性。在冷冻胁迫条件下，相对于未转化的对照植株表现出的2％存活率(48株胁迫植株中1株存活)，PpGBP-1-超量表达的拟南芥植株表现出对冷冻胁迫60％的存活率(25株胁迫植株中15株存活)。

表7——冷冻胁迫测试总结

基因名称	冷冻胁迫测试
				存活者数目	植株总数	存活百分比
	PpGBP-1	15	25				60％
对照				1	48	2％

盐耐受性筛选

在盐耐受性筛选之前的晚上，将幼苗转移至吸收了MS的滤纸上，并置于补充有2μg/ml苯菌灵含0.6％琼脂的MS上。为了盐耐受性筛选，将上有幼苗的滤纸移至培养皿中吸收有50mM NaCl的一叠无菌滤纸上。2小时后，将上有幼苗的滤纸移至培养皿中吸收有200mM NaCl的一叠无菌滤纸上。2小时后，将上有幼苗的滤纸移至培养皿中吸收有600mM NaCl的一叠无菌滤纸上。10小时后，将幼苗移至含有补充有2μg/ml苯菌灵含0.6％琼脂的MS的培养皿中。幼苗在5天后记分。

筛选超量表达转基因的转基因植株的提高的盐耐受性，证明转基因的表达赋予盐耐受性。

水受限的条件下的生长筛选

PpGBP-1、PpVTP-1和ScVTP-1基因在上述组成型超级启动子(Ni等人，1995，Plant J.7：661-676)控制下，在拟南芥中超量表达。转基因株系在约50％最大持水量的土壤中，在生长室中生长3周。测量该时间内植株的总水量损失(蒸腾)。3周后，收集完整的地上植株材料，在65℃干燥2天并称重。地上植株干重与植株用水的比例为水利用效率(WUE)。下面的表8显示了这三个基因中的每一个的转基因植株的WUE和地上植株干重(DW)结果与野生型对照植株结果的差异百分比。

对于PpGBP-1和PpVTP-1，数据是每个基因型约50株植株的单个测试的平均值，10个独立株系中每个5株植株。包含ScVTP-1的植株的数据来自19株转基因和野生型植株个体。所有3个转基因株系均具有显著增加的干重和水利用效率。对于每个转基因，均值相对于每个参数的对照均增加，WUE增加8-30％，DW增加17-68％。基因之间表型的差异可解释为转基因表达水平和转基因插入位点的不同。

表8

BPS基因名称	共有结构域中的基因名称	WUE增加(％)	DW增加(％)
				PpGBP-1	Sar1小GTP酶	25	29
PpVTP-1	Rab小GTP酶	8	17
				ScVTP-1	V-SNARE蛋白	30	68

实施例8——转基因拟南芥株系中GBP-1转基因的检测

来自野生型植株和转基因拟南芥植株的一片叶子在250μl十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)缓冲液(2％CTAB、1.4M NaCl、8mM EDTA和20mM Tris HCl pH8.0)和1μlβ-巯基乙醇中均浆。样品在60-65℃温育30分钟，然后在每个样品中加入250μl氯仿。将样品涡旋3分钟，并以18,000×g离心5分钟。取得每个样品的上清，并加入150μl异丙醇。室温温育样品15分钟，并以18,000×g离心10分钟。每个沉淀以70％乙醇洗涤、干燥并重悬于20μl TE。根据生产商的使用说明，在使用Taq DNA聚合酶(Roche Molecular Biochemicals)的20μlPCR反应中使用4μl上述悬浮液。在PCR反应中，克隆了每个基因的双元载体质粒用作阳性对照，野生型C24基因组DNA用作阴性对照。在0.8％琼脂糖/溴化乙锭凝胶上分析10μl PCR反应物。使用以下PCR程序：94℃1分钟、62℃1分钟和70℃4分钟，30个循环；接着是72℃10分钟。

5’引物如下：5’GCTGACACGCCAAGCCTCGCTAGTC3’(SEQ IDNO：18)。基因特异性引物和扩增条带的大小(Gene Product Size)如下：

PpGBP-1：引物：RC587：GCGTTAACTCGTCGCTCTTAAACACCGAGCTAAG(SEQ ID NO：19)

Gene产物：700bp。

从T1转基因株系，而不是野生型C24成功扩增转基因。这个结果表明T1转基因植株包含至少一个拷贝的转基因。没有迹象表明，在未转化的拟南芥对照中存在能通过该方法扩增的相同或极相似的基因。

实施例9——转基因拟南芥株系中PpGBP-1转基因mRNA的检测

使用RT-PCR检测转基因的表达。使用自(Verwoerd等人，1989 NAR17：2362)改进的步骤从胁迫处理的植株中分离总RNA。收集叶片样品(50-100mg)，并在液氮中研磨成细粉。研磨的组织重悬在80℃的500μl苯酚和提取缓冲液(100mM LiCl、100mM Tris pH8、10mM EDTA、1％SDS)的1∶1混合物中，接着短暂涡旋混合。加入250μl氯仿后，短暂涡旋每个样品。然后将样品以12,000×g离心5分钟。将上面的水相移至一个新的eppendorf管中。加入1/10体积的3M乙酸钠和2体积的95％乙醇沉淀RNA。颠倒混合样品，置于冰上30分钟。12,000×g离心10分钟沉淀RNA。移去上清，短暂空气干燥沉淀。在DEPC处理过的10μl水中重悬RNA样品沉淀。根据生产商的建议，每个样品用无RNA酶的DNA酶(Roche)处理，从中除去污染的DNA。根据生产商的建议，使用单链cDNA合成试剂盒(Boehringer Mannheim)从总RNA合成cDNA。

使用Taq DNA聚合酶(Roche)和基因特异性引物(引物参见表9)，在下列反应中从合成的cDNA PCR扩增基因特异性片段：1X PCR缓冲液、1.5mM MgCl₂、每种引物0.2μM、0.2μM dNTP、1单位聚合酶、5μl来自合成反应的cDNA。在下列条件下进行扩增：95℃变性1分钟、62℃退火30秒、72℃延伸1分钟，35个循环；72℃延伸5分钟；一直保持在4℃。PCR产物在1％琼脂糖凝胶上电泳，以溴化乙锭染色，并使用Quantity-One凝胶成像系统(Bio-Rad)在UV光下显现。在T1转基因株系中检测到转基因的表达。这些结果表明转基因在转基因株系中表达，并强烈暗示其基因产物增强转基因株系中植物胁迫耐受性。于之前的陈述一致，通过该方法没有检测到相同或极相似的内源基因的表达，这些结果于实施例8的数据符合。

表9——在使用分离自转基因拟南芥植株的RNA作为模板的PCR中，用于扩增不同的转基因mRNA的引物

基因	5’引物	3’引物
			PpGBP-1	RC586：(SEQ ID NO：20)ATCCCGGGTCCGTAGATACCAAGGCTGGT	RC587：(SEQ ID NO：21)GCGTTAACTCGTCGCTCTTAAACACCGAGCTAAG

实施例10——通过超量表达PpGBP-1、PpVTP-1或ScVTP-1基因工程化胁迫耐受性大豆植株

室温下用70％乙醇持续摇动4分钟，接着用补充0.05％(v/v)Tween的20％(v/v)Clorox持续摇动20分钟以表面消毒大豆种子。接着这些种子用蒸馏水洗涤4次，并在室温下置于培养皿中的湿润的无菌滤纸上6至39小时。剥去种皮，并从胚轴上分离子叶。检查胚轴以确保分生组织区未损伤。将切下的胚轴收集在半开放的无菌培养皿中，并空气干燥至水份含量低于20％(鲜重)，在密封的培养皿中至将来使用。

在加有合适的选择剂的LB固体培养基中，从单克隆制备根瘤农杆菌培养物，接着在液体LB培养基中将该单克隆培养至600nm的光密度为0.8。然后，该细菌培养物在室温下以7000转/分钟沉淀7分钟，并重悬于补充有100μM乙酰丁香酮的MS(Murashige和Skoog，1962)培养基中。使用前，细菌培养物在该预诱导培养基中室温培养2小时。水份含量约为15％的大豆种子合子胚轴在室温下用该预诱导的农杆菌悬浮培养物吸胀2小时。从吸胀培养基移出胚，转移至含有补充了2％蔗糖的固体MS培养基的培养皿中，并在室温下暗培养2天。或者，将胚置于培养皿中湿润(液体MS培养基)的无菌滤纸上，在上述相同条件下培养。这段时间后，将胚转移至添加有500mg/L羧苄青霉素或300mg/L头孢氨噻的固体或液体MS培养基中以杀死农杆菌。使用该液体培养基润湿无菌滤纸。在150μmolm^-2sec^-1和12小时光周期下，25℃培养该胚4周。一旦这些幼苗产生了根，就将其转移到无菌metromix土壤。将植株转移到土壤之前洗去植株的体外培养基。将植株在塑料盖下放置一周以促进适应过程。然后将植株转移到生长室，其中它们培养在150μmolm^-2sec^-1光强度和12小时光周期下，25℃培养约80天。

根据实施例7描述的筛选方法，筛选这些转基因植株提高的生长和/或胁迫耐受性，证明转基因的表达赋予胁迫耐受性和/或增加的水利用效率。

实施例11——通过超量表达PpGBP-1、PpVTP-1或ScVTP-1基因工程化胁迫耐受性油菜籽/油菜植株

4天幼龄幼苗的子叶柄(Cotyledonary petiole)用作组织培养和根据专利EP1566443转化的外植体。市售栽培种Westar(Agriculture Canada)是用于转化的标准品种，但是也可以使用其他品种。

用含有双元载体的根瘤农杆菌GV3101:pMP90RK转化油菜。转化使用的标准双元载体是pSUN(专利WO02/00900)，但是已描述了许多不同的用于植株转化的双元载体系统(例如An，G.在AgrobacteriumProtocols.Methods，Molecular Biology第44卷，47-62页，Gartland KMA和MR Davey编著，Humana Press，Totowa，New Jersey)。植物基因表达盒由至少两个基因组成——选择标记基因和调节性状基因的cDNA或基因组DNA转录的植物启动子。可使用包括编码突变型乙酰羟酸合酶(AHAS)酶(US专利57673666和6225105)的拟南芥基因在内的多种选择标记基因。类似地，多种启动子可用于调节性状基因以提供组成型、发育、组织或环境调节的基因转录。在本实施例中，使用34S启动子(GenBank登录号M59930和X16673)以提供性状基因的组成型表达。

在70％乙醇中表面消毒油菜种子2分钟，在55℃的温自来水中温育15分钟，接着在1.5％次氯酸钠中温育10分钟，然后用无菌蒸馏水漂洗3次。之后将种子置于无激素、含有Gamborg B5维生素、3％蔗糖和0.8％Oxoidagar的MS培养基上。种子在16小时照射弱光(＜50μMol/m2s)下，24℃萌发4天。从体外种子上切下连接子叶的子叶柄外植体，并将子叶外植体的切口末端浸入细菌悬液来接种农杆菌。然后这些外植体在包含维生素，含有3.75mg/l BAP、3％蔗糖、0.5g/l MES，pH5.2、0.5mg/l GA3、0.8％Oxoidagar的MS培养基上24℃，16小时光照培养3天。与农杆菌共培养3天后，将子叶外植体转移到含有3.75mg/l BAP、0.5mg/l GA3、0.5g/l MES，pH5.2、300mg/l泰门汀和选择剂的再生培养基上直至枝条再生。当外植体开始长枝条时将它们转移到枝条伸长培养基(A6，含有全浓度(full strength)MS培养基，其包含维生素、2％蔗糖、0.5％Oxoidagar、100mg/l肌醇、40mg/l硫酸腺嘌呤、0.5g/l MES，pH5.8、0.0025mg/l BAP、0.1mg/l IBA、300mg/l泰门汀和选择剂)。

使用TaqMan探针，利用qPCR分析来自原代转基因植株(T0)的体外和温室材料的样品，确认T-DNA的存在并确定T-DNA整合的数量。

原代转基因植株通过自花传粉产生种子。第二代植株在温室条件下生长，自花传粉。使用TaqMan探针，利用qPCR分析植株，确认T-DNA的存在并确定T-DNA整合的数量。比较纯合转基因植株、杂合转基因植株和不成对(无效转基因)植株的生长特征和产量。

实施例12——通过超量表达PpGBP-1、PpVTP-1或ScVTP-1基因工程化胁迫耐受性玉蜀黍植株

在补充合适抗生素的YP培养基中培养在同一质粒上含有所述基因和玉米ahas基因的农杆菌细胞1-3天。收集菌环量的农杆菌细胞并悬浮在2ml M-LS-002培养基(LS-inf)中，将含有农杆菌细胞的试管在摇床上以1,200转/分钟摇动1-3小时。

授粉后7-12天收获玉米芯[基因型J553x(HIIIAxA188)]。将玉米芯在20％Clorox溶液中消毒15分钟，然后用无菌水充分冲洗。将0.8-2.0mm大小的不成熟胚解剖到含有LS-inf溶液中的农杆菌细胞的试管中。

在层流超净台上将试管在室温下水平保持30分钟进行农杆菌感染。将农杆菌感染混合物倒在含有共培养培养基(M-LS-011)的平板上。吸出液体农杆菌溶液后，将胚接种在共培养培养基上，schutellum边朝上，并在黑暗中22℃培养2-4天。

将胚转移到没有选择剂的M-MS-101培养基上。7-10天后，将胚转移到含有0.75μM imazethapyr的M-LS-401培养基上并生长4周以选择转化的愈伤组织细胞。

将抗性愈伤组织转移到补充了0.75μM imazethapyr的M-LS-504培养基上，并在26℃下光照生长2到3周启动植株再生。然后将再生的枝条转移到含有M-MS-607培养基(0.5μM imazethapyr)的生根盒中。

将具有根的小植株转移到盆栽混合物中并在生长室中生长一周，然后移植到更大的盆中并在温室中保持直到成熟。

实施例13——通过超量表达PpGBP-1、PpVTP-1或ScVTP-1基因工程化胁迫耐受性小麦植株

用Ishida等人，1996，Nature Biotech.14745-50描述的方法进行小麦目的基因的转化。用携带“超级双元”载体的根瘤农杆菌共培养未成熟的胚，转基因植株通过器官形成来恢复。该方法提供的转化效率在2.5％-20％之间。根据实施例7描述的筛选方法，筛选转基因植株提高的生长和/或胁迫耐受性，证明转基因的表达赋予胁迫耐受性和/或增加的水利用效率。

实施例14——同源和异源基因的鉴定

可使用基因序列从cDNA或基因组文库中鉴定同源或异源基因。同源基因(如全长cDNA克隆)可使用例如cDNA文库通过核酸杂交来分离。根据目的基因的丰度，涂布100,000至1,000,000的重组噬菌体并转移至尼龙膜。用碱变性后，通过例如UV交联将DNA固定在膜上。在高严格条件下进行杂交。在水溶液中，在1M NaCl的离子强度和68℃的温度下实施杂交和洗涤。通过例如放射性(³²P)切口转录标记(High Prime，Roche，Mannheim，德国)产生杂交探针。通过放射自显影技术检测信号。

可以通过类似于前述使用低严格杂交和洗涤条件的方法的方式来鉴定相关但不相同的部分同源或异源基因。对于水溶液中杂交，离子强度通常控制在1M NaCl，而温度从68℃逐渐降低至42℃。

可通过使用合成的放射性标记寡核苷酸探针来分离只在特殊结构域(例如10-20氨基酸)具有同源性(或序列同一性/相似性)的基因序列。通过用T4多核苷酸激酶将两条互补的寡核苷酸5’引物端磷酸化来制备放射性标记的寡核苷酸。互补的寡核苷酸退火并连接形成多联体。然后通过例如切口转录来放射性标记双链多联体。通常在低严格条件下使用高浓度寡核苷酸进行杂交。

寡核苷酸杂交溶液：

6xSSC

0.01M磷酸钠

1mM EDTA(pH8)

0.5％SDS

100μg/ml变性的鲑精DNA

0.1％脱脂奶粉

杂交过程中，逐渐降低温度至低于预计的寡核苷酸T_m5-10℃或者低至室温，然后进行洗涤步骤和放射自显影。以低严格性(如使用4xSSC的3个洗涤步骤)实施洗涤。进一步的细节在Sambrook，J.等人，1989，“Molecular Cloning：A Laboratory Manual”，Cold Spring HarborLaboratory Press或Ausubel，F.M.等人，1994，“Current Protocols inMolecularBiology”，JohnWiley Sons中有所描述。

实施例15——通过用抗体筛选表达文库来鉴定同源基因

可使用cDNA克隆在例如大肠杆菌中(例如Qiagen QIAexpress pQE系统中)制备重组蛋白。然后一般通过Ni-NTA亲和层析(Qiagen)来亲和纯化重组蛋白。然后通过例如使用兔免疫接种标准技术，用重组蛋白制备特定的抗体。如Gu等人，1994，BioTechniques 17：257-262中所述使用以重组抗原饱和的Ni-NTA柱亲和纯化抗体。然后可以通过免疫筛选，使用该抗体筛选表达cDNA文库来鉴定同源或异源基因(Sambrook，J.等人，1989，“Molecular Cloning：A Laboratory Manual”，Cold Spring HarborLaboratory Press或Ausubel，F.M.等人，1994，“Current Protocols inMolecular Biology”，John Wiley & Sons)。

实施例16—体内诱变

可以通过将质粒(或其他载体)DNA转入保持自身遗传信息完整性能力受损的大肠杆菌或其他微生物(例如芽孢杆菌属物种或酵母如酿酒酵母)来实施微生物体内诱变。典型增变株在DNA修复系统的基因中含有突变(如mutHLS、mutD、mutT等；参考可见Escherichia coli and Salmonella，Rupp，W.D.，1996，ASM：Washington.中2277-2294页的DNA repairmechanisms)。这些株系为本领域技术人员所熟知。这些株系的使用在例如Greener，A.和Callahan，M.，1994，Strategies 7：32-34中有所说明。优选在微生物中进行选择和测试后再将突变的DNA分子转入植株。根据本文件范例中的各实施例制备转基因植株。

实施例17——体外分析转基因植株中剑叶藓属或酵母属基因的功能

酶的活性和动力学参数的确定在本领域非常成熟。确定任何给定改变的酶活性的实验必须改变本领域技术人员已知的野生型酶的特定活性。酶的一般综述、以及涉及结构、动力学、原理、方法、应用的具体细节，以及确定多种酶活性的实例可参见以下参考文献：Dixon，M.和Webb，E.C.，1979，Enzymes.Longmans：London；Fersht，1985，Enzyme Structure andMechanism.Freeman：New York；Walsh，1979，Enzymatic ReactionMechanisms.Freeman：San Francisco；Price，N.C.，Stevens，L.，1982，Fundamentals of Enzymology.Oxford Univ.Press：Oxford；Boyer博士编著，1983，The Enzymes，第3版，Academic Press：New York；Bisswanger，H.，1994，Enzymkinetik，第2版，VCH：Weinheim(ISBN 3527300325)；Bergmeyer，H.U.，Bergmeyer，J.，Graβl，M.编著，1983-1986，Methods ofEnzymatic Analysis，第3版，I-XII卷，Verlag Chemie：Weinheim；和Ullmann’s Encyclopedia of Industrial Chemistry，1987，A9卷，Enzymes.VCH：Weinheim，352-363页。

蛋白质结合DNA的活性可以通过几个非常成熟的方法测定，如DNA条带移位分析(又称作凝胶阻滞分析)。这类蛋白质对其他分子表达的影响可以使用报告基因分析测定(例如Kolmar，H.等人，1995，EMBO J.14：3895-3904和其中引用的参考文献所述)。使用诸如β-半乳糖苷酶、绿色荧光蛋白等酶的受体基因检测系统是众所周知的，并且可用于原核细胞和真核细胞。

可以根据Gennis，R.B.，1989，Pores，Channels和Transporters，Biomembranes，Molecular Structure and Function，85-137页、199-234页和270-322页，Springer：Heidelberg描述的那类技术测定膜转运蛋白的活性。

实施例18——从转化的生物体纯化目的产物

通过本领域已知的多种方法从用本文描述的核酸序列转化的植物材料(即，展叶剑叶藓和酿酒酵母)、真菌、藻类、纤毛虫、谷氨酸棒杆菌细胞或其他细菌细胞，或者上述培养物的上清回收目的产物。如果细胞不分泌目的产物，则通过低速离心从培养物收获该细胞，并通过标准技术(例如机械力或超声处理(sonification))裂解该细胞。植株的器官可以从其他组织或器官机械分离。匀浆后离心除去细胞碎片，保留含有可溶蛋白质的上清级分用于目的化合物的进一步纯化。如果目的细胞分泌产物，则通过低速离心从培养物分离该细胞，并保留上清级分用于进一步纯化。

任一纯化方法得到的上清级分用合适的树脂进行层析，其中目的分子留在层析树脂上而样品中的一些杂质不在层析树脂上，或者杂质保留在树脂上而样品不在树脂上。有必要使用相同或不同的层析树脂重复这类层析步骤。本领域的技术人员将很精通合适层析树脂的选择，并将它们最有效的用于具体分子的纯化。可通过过滤或超滤来浓缩纯化的产品，并储存在该产品的稳定性最高的温度下。

本领域已知的纯化方法有多种，并不限定进行前述的纯化方法。这类纯化技术的描述例如在Bailey，J.E.& Ollis，1986，D.F.BiochemicalEngineering Fundamentals，McGraw-Hill：New York。另外，分离化合物的确认和纯化可通过本领域的标准技术测定。这些技术包括高效液相层析(HPLC)、光谱学方法、染色方法、薄层层析、NIRS、酶分析或微生物分析。这些测定方法评论于Patek等人，1994，Appl.Environ.Microbiol.60：133-140；Malakhova等人，1996，Biotekhnologiya 11：27-32；和Schmidt等人，1998，Bioprocess Engineer.19：67-70；Ulmann’s Encyclopedia ofIndustrial Chemistry，1996，A27卷，VCH：Weinheim，89-90页、521-540页、540-547页、559-566页、575-581页和581-587页；Michal，G.，1999，Biochemical Pathways：An Atlas of Biochemistry and Molecular Biology，John Wiley和Sons；Fallon，A.等人，1987，Applications of HPLC inBiochemistry in：Laboratory Techniques in Biochemistry and MolecularBiology，17卷。

实施例9——温室筛选胁迫耐受性植株

来自转基因玉蜀黍植株的种子种植在预置于盘子上的4”平方纸盆中。该盆装有混合石膏肥料和osomocote的Metro Mix(Metro Mix 360)。播种种子、充分浇水，在正常温室条件下培养(光周期：14小时、温度：白天82，夜晚：65)。植株冒出地面7天后取样检测转基因。

将植株移植到含有4公斤Metro Mix 360的Classic 1200盆中。3株转基因植株和3株无效同胞植株等距种植在Metro Mix中，相同基因型的植株在该盆的同一侧。无效同胞植株是分离自其转基因原代植株的植株。其不含有质粒。每行移植4个平行盆。在盆上再加上1公斤的Metro Mix来盖住纸盆并填充植株之间的区域。

通过16天中的每周一、周三和周五向PVC管中加水，使植株移植后在50％田间持水量或30％田间持水量下连续生长19天。田间持水量定义为土壤水含量对土壤最大水含量的百分比。实验的最后一天收获植株。来自同一盆的相同基因型的植株分为一组，结果每行每个基因型有4个重复，每行总共有8个样品(4个转基因、4个无效同胞)。每个样品的鲜重相加。每个样品在65℃的烘箱中干燥6天。然后将干重相加。

在干旱条件下所有三个基因均表现出增加的生物量。5个PpGBP-1事件表现出7.3％-16.3％(表10)之间的生物量增加。PpVTP-1植株在50％田间持水量下表现出5.9-16.4％之间的生物量增加(表11)。含有ScVTP-1的转基因植株在30％田间持水量下表现出5.3-6.1％之间的生物量增加(表12)。

表10——在50％田间持水量下PpGBP-1转基因植株的竞争性测试

事件	数值		平均数		％变化
						无	转基因	无	转基因
	ERG067M0008	12	12	46.0						49.3	7.3
ERG067M0001					13	11	53.7	57.8	7.6
	ERG067M0006	12	12	45.9						49.4	7.7
ERG067M0020					12	12	46.4	51.4	10.7
	ERG067M0013	4	4	51.5						60.0	16.3

表11——在50％田间持水量下PpVTP-1转基因植株的竞争性测试

事件	数值		平均数		％变化
						无	转基因	无	转基因
	J553/ERG072M0001	11	13	61.0						64.7	5.9
J553/ERG072M0005					13	13	64.7	69.2	7.0
	J553/ERG072M0007	12	12	66.8						72.5	8.6
J553/ERG072M0008					12	12	62.1	68.4	10.0
	J553/ERG072M0010	12	12	59.6						66.9	12.1
J553/ERG072M0011					12	11	59.8	69.6	16.4

表12——在30％田间持水量下ScVTP-1转基因植株的竞争性测试

事件	数值		平均数		％变化
						无	转基因	无	转基因
	YMR197CM0014	12	12	56.9						59.9	5.3
YMR197CM0001					8	8	66.8	70.4	5.3
	YMR197CM0007	12	12	77.4						82.0	5.9
YMR197CM0011					8	8	65.2	69.2	6.1

实施例20——田间筛选胁迫耐受性植株

转基因玉蜀黍植株生长在无降雨的田间条件下，通过控制灌溉量实施干旱胁迫处理。种植后所有的植株接受4周的最佳灌溉。此后直至收获，实施3种灌溉方案。100％处理条件定义为保持最佳灌溉量。中度干旱条件定义为由80％最佳量组成，而严重干旱条件定义为由29％最佳量组成。每个独立事件的单畦种植在每个灌溉处理区域。转基因植株与其在该畦内的无效分离子比较。对严重干旱条件下的植株生长进行植株高度测量。对中度干旱或最佳灌溉条件下的植株生长进行植物颗粒产量测量。

在灌溉良好和干旱条件下，PpGBP-1和PpVTP-1表现出颗粒产量增加。在田间最佳灌溉条件下(100％)，PpVTP-1转基因植株表现出12％-115％之间的产量增加(表13)。在田间中度干旱条件下(80％灌溉)，PpVTP-1转基因植株表现21％-115％之间的产量增加(表14)。

表13——田间最佳灌溉条件下(100％)

PpVTP-1转基因植株的粒重/植株测试

事件名称	平均粒重(g/植株)		标准误		植株数量		％变化(转基因/无)
								无	转基因	无	转基因	无	转基因
	106921	4.8	10.4	2.1	2.8	10								32	115
102051							12.1	24.8	3.7	6.2	21	21	105
	106831	15.4	27.4	4.5	4.6	20								17	78
1011131							6.9	11.5	2.6	2.5	20	20	67
	106971	9.7	11.0	3.2	3.3	21								21	13
1010651							52.3	58.8	7.6	5.9	19	23	12

表14——田间中度干旱条件下(80％灌溉)

PpVTP-1转基因植株的粒重/植株测试

事件名称	平均粒重(g/植株)		标准误		植株数量		％变化(转基因/无)
								无	转基因	无	转基因	无	转基因
	101631	0.4	4.5	0.3	1.9	20								22	1156
1010651							0.2	2.2	0.2	2.2	24	19	1021
	106831	0.2	1.0	0.2	0.6	20								21	393
101701							2.6	8.5	1.1	2.8	42	42	230
	106921	0.0	0.1	0.0	0.1	12								31	109
1011131							6.1	11.9	3.4	3.1	15	27	93
	102051	0.9	1.7	0.4	0.9	23								18	82
1011121							0.1	0.1	0.1	0.1	23	19	21

在田间最佳灌溉条件下(100％)，PpGBP-1转基因植株表现出27-249％之间的产量增加(表15)。在田间中度干旱条件下(80％灌溉)，产量增加范围是50-175％(表16)。

表15——田间最佳灌溉条件下(100％)

PpGBP-1转基因植株的粒重/植株测试

事件名称	平均粒重(g/植株)		标准误		植株数量		％变化(转基因/无)
								无	转基因	无	转基因	无	转基因
	107551	3.9	13.6	1.8	4.0	15								27	249
1011131							6.9	11.5	2.6	2.5	20	20	67
	107631	28.4	42.5	5.0	11.4	29								12	50
1019171							36.5	48.3	7.6	6.4	19	22	32
	107681	40.6	51.8	11.3	6.7	13								29	27

表16——田间中度干旱条件下(80％灌溉)

PpGBP-1转基因植株的粒重/值株测试

事件名称	平均粒重(g/植株)		标准误		植株数量		％变化(转基因/无)
								无	转基因	无	转基因	无	转基因
	107631	0.3	0.9	0.2	0.8	24								18	175
1011711							10.0	16.5	4.0	5.0	20	19	64
	107551	1.0	1.6	0.6	0.8	21								21	50

序列表

<110>巴斯福植物科学有限公司

<120>小泡运输胁迫相关多肽及在植物中的使用方法

<130>PF 15077

<150>US 60/522,708

<151>2004-10-29

<160>33

<170>PatentIn版本3.3

<210>1

<211>642

<212>DNA

<213>展叶剑叶藓(Physcomitrella patens)

<400>1

cccagaaggc cgatccgaaa gaaaggcacc atgaatcccg aatatgatta ccttttcaag 60

ctgttgctga tcggagactc cggtgttgga aagagttgcc ttctgctacg atttgcagac 120

gactcgtacc tggagagcta catcagcaca atcggtgtgg actttaaaat acgtacggtg 180

gagctggacg ggaagaccat caagttgcag atttgggata ctgctggtca ggagaggttc 240

cggaccatca caagcagcta ctatcgtgga gcgcacggga tcattgttgt gtacgacgtg 300

acagaccagg agagcttcaa caacgtgaag caatggttga gtgagatcga ccggtacgcg 360

agcgagaacg tgaacaagct gctggtgggc aacaagtcag atctggcgtc gaagaaggtg 420

gtggattatg caactgcaaa ggcatttgcg gacgagattg ggattccgtt tttggagacg 480

agtgcgaaga atgctacgaa cgtggagcag gcgtttatga caatggcagc ggagatcaag 540

aacaggatgg cgagtcagcc cgcgttgagc agcacaagca ggccgaacaa tgtgacgaac 600

ctgcgaggac aggctattcc gcagaagagt gggtgctgct ca                    642

<210>2

<211>204

<212>PRT

<213>展叶剑叶藓

<400>2

Met Asn Pro Glu Tyr Asp Tyr Leu Phe Lys Leu Leu Leu Ile Gly Asp

  1               5                  10                  15

Ser Gly Val Gly Lys Ser Cys Leu Leu Leu Arg Phe Ala Asp Asp Ser

            20                   25                  30

Tyr Leu Glu Ser Tyr Ile Ser Thr Ile Gly Val Asp Phe Lys Ile Arg

         35                  40                  45

Thr Val Glu Leu Asp Gly Lys Thr Ile Lys Leu Gln Ile Trp Asp Thr

     50                  55                  60

Ala Gly Gln Glu Arg Phe Arg Thr Ile Thr Ser Ser Tyr Tyr Arg Gly

 65                  70                  75                  80

Ala His Gly Ile Ile Val Val Tyr Asp Val Thr Asp Gln Glu Ser Phe

                 85                  90                  95

Asn Asn Val Lys Gln Trp Leu Ser Glu Ile Asp Arg Tyr Ala Ser Glu

            100                  105                 110

Asn Val Asn Lys Leu Leu Val Gly Asn Lys  Ser Asp Leu Ala Ser Lys

        115                 120                  125

Lys Val Val Asp Tyr Ala Thr Ala Lys Ala Phe Ala Asp Glu Ile Gly

    130                 135                 140

Ile Pro Phe Leu Glu Thr Ser Ala Lys Asn Ala Thr Asn Val Glu Gln

145                 150                 155                 160

Ala Phe Met Thr Met Ala Ala Glu Ile Lys Asn Arg Met Ala Ser Gln

                165                 170                 175

Pro Ala Leu Ser Ser Thr Ser Arg Pro Asn Asn Val Thr Asn Leu Arg

            180                 185                 190

Gly Gln Ala Ile Pro Gln Lys Ser Gly Cys Cys Ser

        195                 200

<210>3

<211>606

<212>DNA

<213>展叶剑叶藓

<400>3

cccgggtccg tagataccaa ggctggtacc atgtttcttg tagattggtt ttacggcttt  60

cttgcgagca tagggctgtg gcagaaggag gccaaaatcc tgtttctggg tctcgacaat  120

gctggcaaga ctactcttct gcacatgctc aaggatgaga aactggggca acatcaacca  180

acgcagtatc caacgtcaga ggagttgagt atcaacagag tgaagttcaa agcattcgat  240

ctgggtggcc acacaatcgc tcgacgcgtg tggagggact actatgctaa ggtggatgct  300

atagtgtatc tcgtcgacgc agtagacagg gagagatttg ctgagtcaaa gaaagagctc  360

gattctcttc tctccgacga ttctctgtcc caagttcctg tgctcgtcct gggaaacaag  420

attgatatcc cgtacgcttc ttctgaagac gagttgcggt tcacacttgg gttgaccatg  480

accactggta aaggaacggt gaacctggga gatagcaaca ttcggcccat tgaggttttc  540

atgtgcagta ttgtgcgcaa aatggggtac ggtgaaggtt tcaagtggat gacccagtac  600

atcaag                                                             606

<210>4

<211>192

<212>PRT

<213>展叶剑叶藓

<400>4

Met Phe Leu Val Asp Trp Phe Tyr Gly Phe Leu Ala Ser Ile Gly Leu

  1               5                  10                  15

Trp Gln Lys Glu Ala Lys Ile Leu Phe Leu Gly Leu Asp Asn Ala Gly

             20                  25                  30

Lys Thr Thr Leu Leu His Met Leu Lys Asp Glu Lys Leu Gly Gln His

         35                  40                  45

Gln Pro Thr Gln Tyr Pro Thr Ser Glu Glu Leu Ser Ile Asn Arg Val

     50                  55                  60

Lys Phe Lys Ala Phe Asp Leu Gly Gly His Thr Ile Ala Arg Arg Val

 65                  70                  75                  80

Trp Arg Asp Tyr Tyr Ala Lys Val Asp Ala Ile Val Tyr Leu Val Asp

                 85                  90                  95

Ala Val Asp Arg Glu Arg Phe Ala Glu Ser Lys Lys Glu Leu Asp Ser

            100                  105                110

Leu Leu Ser Asp Asp Ser Leu Ser Gln Val Pro Val Leu Val Leu Gly

        115                 120                 125

Asn Lys Ile Asp Ile Pro Tyr Ala Ser Ser Glu Asp Glu Leu Arg Phe

    130                 135                 140

Thr Leu Gly Leu Thr Met Thr Thr Gly Lys Gly Thr Val Asn Leu Gly

145                 150                 155                 160

Asp Ser Asn Ile Arg Pro Ile Glu Val Phe Met Cys Ser Ile Val Arg

                165                 170                 175

Lys Met Gly Tyr Gly Glu Gly Phe Lys Trp Met Thr Gln Tyr Ile  Lys

            180                 185                 190

<210>5

<211>654

<212>DNA

<213>saccharomyces cerevisiae(酿酒酵母)

<400>5

atgagttccc tattaatatc atacgaatct gacttcaaaa caaccttaga acaagccaaa  60

gcgagcttag cagaggcccc ctcacaaccg ttatcacaga gaaatactac actgaagcac  120

gtagaacagc aacaagatga gttgtttgac ctgctagatc agatggatgt agaagttaat  180

aacagcatag gcgatgcctc agaacgtgct acgtacaagg cgaagttaag agaatggaag  240

aagactatac agagcgatat caaacgacca ctgcaatcct tagtagactc aggcgatcgt  300

gatagacttt ttggagatct taacgcatct aatattgacg atgaccaaag gcaacagttg  360

ttgagcaacc atgcaatctt acagaaatcg ggagatagac taaaagatgc cagtagaata  420

gcaaatgaaa ctgaaggaat agggtcacaa ataatgatgg atttaaggtc acagagagaa  480

actttggaaa atgcaagaca gaccttgttt caagcggatt catatgtgga taaaagtata  540

aagacactaa aaacaatgac tagaaggcta gttgctaata aattcataag ctatgccatt  600

atcgcagtcc ttatattatt gattttgcta gttttgttct caaagtttaa ataa        654

<210>6

<211>217

<212>PRT

<213>酿酒酵母

<400>6

Met Ser Ser Leu Leu Ile Ser Tyr Glu Ser Asp Phe Lys Thr Thr Leu

  1               5                  10                  15

Glu Gln Ala Lys Ala Ser Leu Ala Glu Ala Pro Ser Gln Pro Leu Ser

             20                  25                  30

Gln Arg Asn Thr Thr Leu Lys His Val Glu Gln Gln Gln Asp Glu Leu

         35                  40                  45

Phe Asp Leu Leu Asp Gln Met Asp Val Glu Val Asn Asn Ser Ile Gly

     50                  55                  60

Asp Ala Ser Glu Arg Ala Thr Tyr Lys Ala Lys Leu Arg Glu Trp Lys

 65                  70                  75                  80

Lys Thr Ile Gln Ser Asp Ile Lys Arg Pro Leu Gln Ser Leu Val Asp

                 85                  90                  95

Ser Gly Asp Arg Asp Arg Leu Phe Gly Asp Leu Asn Ala Ser Asn Ile

            100                 105                 110

Asp Asp Asp Gln Arg Gln Gln Leu Leu Ser Asn His Ala Ile Leu Gln

        115                 120                 125

Lys Ser Gly Asp Arg Leu Lys Asp Ala Ser Arg Ile Ala Asn Glu Thr

    130                 135                 140

Glu Gly Ile Gly Ser Gln Ile Met Met Asp Leu Arg Ser Gln Arg Glu

145                 150                 155                 160

Thr Leu Glu Asn Ala Arg Gln Thr Leu Phe Gln Ala Asp Ser Tyr Val

                165                 170                 175

Asp Lys Ser Ile Lys Thr Leu Lys Thr Met Thr Arg Arg Leu Val Ala

            180                 185                 190

Asn Lys Phe Ile Ser Tyr Ala Ile Ile Ala Val Leu Ile Leu Leu Ile

        195                 200                 205

Leu Leu Val Leu Phe Ser Lys Phe Lys

    210                 215

<210>7

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(18)

<223>人工序列的描述：合成的引物

<400>7

caggaaacag ctatgacc                                                              18

<210>8

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(19)

<223>人工序列的描述：合成的引物

<400>8

ctaaagggaa caaaagctg                                                            19

<210>9

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(18)

<223>人工序列的描述：合成的引物

<400>9

tgtaaaacga cggccagt                                                             18

<210>10

<211>45

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(45)

<223>人工序列的描述：合成的寡核苷酸

<400>10

ggaattccag ctgaccacca tgagttccct attaatatca tacga                               45

<210>11

<211>45

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(45)

<223>人工序列的描述：合成的寡核苷酸

<400>11

gatccccggg aattgccatg ctattgattg tttgttccac ggact                               45

<210>12

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(25)

<223>人工序列的描述：合成的引物

<400>12

tgccagcatt  gtcgagaccc  agaaa                                                    25

<210>13

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(29)

<223>人工序列的描述：合成的引物

<400>13

atcccgggtc cgtagatacc aaggctggt                                                  29

<210>14

<211>34

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(34)

<223>人工序列的描述：合成的引物

<400>14

gcgttaactc gtcgctctta aacaccgagc taag                                            34

<210>15

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(30)

<223>人工序列的描述：合成的引物

<400>15

gcgctgcaga tttcatttgg agaggacacg                                                 30

<210>16

<211>35

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(35)

<223>人工序列的描述：合成的引物

<400>16

cgcggccggc  ctcagaagaa  ctcgtcaaga  aggcg                                        35

<210>17

<211>38

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(38)

<223>人工序列的描述：合成的寡核苷酸

<400>17

ggaattccag ctgaccacca  tggcaattcc cggggatc                                       38

<210>18

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(25)

<223>人工序列的描述：合成的引物

<400>18

gctgacacgc caagcctcgc tagtc                                                      25

<210>19

<211>34

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(34)

<223>人工序列的描述：合成的引物

<400>19

gcgttaactc gtcgctctta aacaccgagc taag                                            34

<210>20

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(29)

<223>人工序列的描述：合成的引物

<400>20

atcccgggtc  cgtagatacc  aaggctggt                                                29

<210>21

<211>34

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(34)

<223>人工序列的描述：合成的引物

<400>21

gcgttaactc gtcgctctta aacaccgagc taag                                            34

<210>22

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(32)

<223>人工序列的描述：合成的引物

<400>22

gcgagctcca  caccaatctc cagactccac ca                                             32

<210>23

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(30)

<223>人工序列的描述：合成的引物

<400>23

atcccgggag  atagcccaga aggccgatcc                                                30

<210>24

<211>193

<212>PRT

<213>大麦(Hordeum vulgare)

<400>24

Met Phe Leu Val Asp Trp Phe Tyr Gly Val Leu Ala Ser Leu Gly Leu

  1               5                  10                  15

Trp Gln Lys Glu Ala Lys Ile Leu Phe Leu Gly Leu Asp Asn Ala Gly

             20                  25                  30

Lys Thr Thr Leu Leu His Met Leu Lys Asp Glu Arg Leu Val Gln His

         35                  40                  45

Gln Pro Thr Gln Tyr Pro Thr Ser Glu Glu Leu Ser Ile Gly Lys Ile

      50                  55                  60

Lys Phe Lys Ala Phe Asp Leu Gly Gly His Gln Ile Ala Arg Arg Val

 65                  70                  75                  80

Trp Lys Asp Tyr Tyr Ala Lys Val Asp Ala Val Val Tyr Leu Val Asp

                 85                  90                  95

Ala Tyr Asp Lys Glu Arg Phe Ala Glu Ser Lys Lys Glu Leu Asp Ala

            100                 105                 110

Leu Leu Ser Asp Asp Ser Leu Ala Thr Val Pro Phe Leu Ile Leu Gly

        115                 120                 125

Asn Lys Ile Asp Ile Pro Tyr Ala Ala Ser Glu Glu Glu Leu Arg Tyr

    130                 135                 140

His Leu Gly Leu Ser Asn Phe Thr Thr  Gly Lys Gly Lys Val Ser Leu

145                 150                  155                 160

Ser Glu Ser Asn Val Arg Pro Leu Glu Val Phe Met Cys Ser Ile Val

                165                 170                 175

Arg Lys Met Gly Tyr Gly Glu Gly Phe Lys Trp Met Ser Gln Tyr Ile

            180                 185                 190

Lys

<210>25

<211>193

<212>PRT

<213>拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400>25

Met Phe Met Ile Asp Trp  Phe Tyr Gly Val Leu Ala Ser Leu Gly Leu

  1               5                   10                  15

Trp Gln Lys Glu Ala Lys Ile Leu Phe Leu Gly Leu Asp Asn Ala Gly

             20                  25                  30

Lys Thr Thr Leu Leu His Met Leu Lys Asp Glu Arg Leu Val Gln His

         35                  40                  45

Gln Pro Thr Gln His Pro Thr Ser Glu Glu Leu Ser Ile Gly Lys Ile

     50                  55                  60

Lys Phe Lys Ala Phe Asp Leu Gly Gly His Gln Ile Ala Arg Arg Val

 65                  70                  75                  80

Trp Lys Asp Tyr Tyr Ala Lys Val Asp Ala Val Val Tyr Leu Val Asp

                 85                  90                  95

Ala Tyr Asp Lys Glu Arg Phe Ala Glu Ser Lys Lys Glu Leu Asp Ala

            100                 105                110

Leu Leu Ser Asp Glu Ser Leu Ala Ser Val Pro Phe Leu Ile Leu Gly

        115                 120                 125

Asn Lys Ile Asp Ile Pro Tyr Ala Ala Ser Glu Asp Glu Leu Arg Tyr

    130                 135                 140

His Leu Gly Leu Ser Asn Phe Thr Thr Gly Lys Gly Lys Val Asn Leu

145                 150                 155                 160

Thr Asp Ser Asn Val Arg Pro Leu Glu Val Phe Met Cys Ser Ile Val

                165                 170                 175

Arg Lys Met Gly Tyr Gly Glu Gly Phe Lys Trp Val Ser Gln Tyr Ile

            180                 185                 190

Lys

<210>26

<211>193

<212>PRT

<213>拟南芥

<400>26

Met Phe Leu Phe Asp Trp Phe Tyr Gly Ile Leu Ala Ser Leu Gly Leu

  1               5                  10                  15

Trp Gln Lys Glu Ala Lys Ile Leu Phe Leu Gly Leu Asp Asn Ala Gly

             20                  25                  30

Lys Thr Thr Leu Leu His Met Leu Lys Asp Glu Arg Leu Val Gln His

         35                  40                  45

Gln Pro Thr Gln His Pro Thr Ser Glu Glu Leu Ser Ile Gly Lys Ile

     50                  55                  60

Lys Phe Lys Ala Phe Asp Leu Gly Gly His Gln Ile Ala Arg Arg Val

 65                  70                  75                  80

Trp Lys Asp Tyr Tyr Ala Lys Val Asp Ala Val Val Tyr Leu Val Asp

                 85                  90                  95

Ala Tyr Asp Lys Glu Arg Phe Ala Glu Ser Lys Arg Glu Leu Asp Ala

            100                 105                 110

Leu Leu Ser Asp Glu Ala Leu Ala Thr Val Pro Phe Leu Ile Leu Gly

        115                 120                 125

Asn Lys Ile Asp Ile Pro Tyr Ala Ala Ser Glu Asp Glu Leu Arg Tyr

    130                 135                 140

His Leu Gly Leu Thr Asn Phe Thr Thr Gly Lys Gly Lys Val Thr Leu

145                 150                 155                 160

Gly Asp Ser Gly Val Arg Pro Leu Glu Val Phe Met Cys Ser Ile Val

                165                 170                 175

Arg Lys Met Gly Tyr Gly Glu Gly Phe Lys Trp Leu Ser Gln Tyr Ile

            180                 185                 190

Asn

<210>27

<211>191

<212>PRT

<213>拟南芥

<400>27

Met Ile Asp Trp Phe Tyr Gly Val Leu Ala Ser Leu Gly Leu Trp Gln

  1               5                  10                  15

Lys Glu Ala Lys Ile Leu Phe Leu Gly Leu Asp Asn Ala Gly Lys Thr

             20                  25                  30

Thr Leu Leu His Met Leu Lys Asp Glu Arg Leu Val Gln His Gln Pro

         35                  40                  45

Thr Gln His Pro Thr Ser Glu Glu Leu Ser Ile Gly Lys Ile Lys Phe

     50                  55                  60

Lys Ala Phe Asp Leu Gly Gly His Gln Ile Ala Arg Arg Val Trp Lys

 65                  70                  75                  80

Asp Tyr Tyr Ala Lys Val Asp Ala Val Val Tyr Leu Val Asp Ala Tyr

                 85                  90                  95

Asp Lys Glu Arg Phe Ala Glu Ser Lys Lys Glu Leu Asp Ala Leu Leu

            100                 105                 110

Ser Asp Glu Ser Leu Ala Ser Val Pro Phe Leu Ile Leu Gly Asn Lys

        115                 120                 125

Ile Asp Ile Pro Tyr Ala Ala Ser Glu Asp Glu Leu Arg Tyr His Leu

130                     135                 140

Gly Leu Ser Asn Phe Thr Thr Gly Lys Gly Lys Val Asn Leu Thr Asp

145                 150                 155                 160

Ser Asn Val Arg Pro Leu Glu Val Phe Met Cys Ser Ile Val Arg Lys

                165                 170                 175

Met Gly Tyr Gly Glu Gly Phe Lys Trp Val Ser Gln Tyr Ile Lys

            180                 185                 190

<210>28

<211>300

<212>PRT

<213>玉蜀黍

<220>

<221>MOD_RES

<222>(186)..(187)

<223>可变的氨基酸

<400>28

Met Val Gln Ser Lys Arg Val Tyr Met Gln His Ser Leu Ala Ser Leu

  1               5                  10                  15

Arg Leu Glu Trp Ser Arg His Pro Asp Pro Ala Ala Ala Val Asn Arg

             20                  25                  30

His Ala Pro Ile Leu Pro Gln Gln Thr Gln His Lys Gln Thr Gly Arg

         35                  40                  45

Asp Ser Asp Pro Leu Val Thr His Pro Arg Tyr Pro Leu Ser Leu Gly

     50                  55                  60

Phe Leu Ser His His Gln Pro Pro Ser Arg Leu Ser Pro Pro Pro Pro

 65                  70                  75                  80

Ala Leu Gly Arg Arg Asp Glu Gly Arg Arg Glu Ala Pro Ala Gly Arg

                 85                  90                  95

Gly Gly Lys Arg Ser Ser Arg Ala Gly Gly Glu Met Phe Leu Trp Asp

            100                 105                 110

Trp Phe Tyr Gly Val Leu Ala Ser Leu Gly Leu Trp Gln Lys Glu Ala

        115                 120                 125

Lys Ile Leu Phe Leu Cys Leu Asp Asn Ala Gly Lys Thr Thr Leu Leu

    130                 135                 140

His Met Leu Lys Asp Glu Arg Leu Val Gln His Gln Pro Thr Gln His

145                 150                 155                 160

Pro Thr Ser Glu Glu Leu Ser Ile Gly Lys Ile Lys Phe Lys Ala Phe

                165                 170                 175

Asp Leu Gly Gly His Gln Ile Ala Arg Xaa Xaa Trp Lys Asp Tyr Tyr

            180                 185                 190

Ala Lys Val Asp Ala Val Val Tyr Leu Val Asp Ala Tyr Asp Lys Glu

        195                 200                 205

Arg Phe Ala Glu Ser Lys Lys Glu Leu Asp Ala Leu Leu Ser Asp Asp

    210                 215                 220

Ser Leu Ala Asn Val Pro Phe Leu Ile Leu Gly Asn Lys Ile Asp Ile

225                 230                 235                 240

Pro Tyr Ala Ala Ser Glu Glu Glu Leu Arg Tyr His Leu Gly Leu Ser

                245                 250                 255

Asn Phe Thr Thr Gly Lys Gly Lys Val Asn Leu Gly Asp Ser Asn Val

            260                 265                 270

Arg Pro Leu Glu Val Phe Met Cys Ser Val Val Arg Lys Met Gly Tyr

        275                 280                 285

Gly Asp Gly Phe Lys Trp Val Ser Gln Tyr Ile Lys

    290                 295                 300

<210>29

<211>305

<212>PRT

<213>玉蜀黍

<220>

<221>MOD_RES

<222>(191)..(192)

<223>可变的氨基酸

<400>29

Phe Ser Ile Asp Thr Met Val Gln Ser Lys Arg Val Tyr Met Gln His

  1               5                  10                  15

Ser Leu Ala Ser Leu Arg Leu Glu Trp Ser Arg His Pro Asp Pro Ala

             20                  25                  30

Ala Ala Val Asn Arg His Ala Pro Ile Leu Pro Gln Gln Thr Gln His

         35                  40                  45

Lys Gln Thr Gly Arg Asp Ser Asp Pro Leu Val Thr His Pro Arg Tyr

     50                  55                  60

Pro Leu Ser Leu Gly Phe Leu Ser His His Gln Pro Pro Ser Arg Leu

 65                  70                  75                  80

Ser Pro Pro Pro Pro Ala Leu Gly Arg Arg Asp Glu Gly Arg Arg Glu

                 85                  90                  95

Ala Pro Ala Gly Arg Gly Gly Lys Arg Ser Ser Arg Ala Gly Gly Glu

            100                 105                 110

Met Phe Leu Trp Asp Trp Phe Tyr Gly Val Leu Ala Ser Leu Gly Leu

        115                 120                 125

Trp Gln Lys Glu Ala Lys Ile Leu Phe Leu Cys Leu Asp Asn Ala Gly

    130                 135                 140

Lys Thr Thr Leu Leu His Met Leu Lys Asp Glu Arg Leu Val Gln His

145                 150                 155                 160

Gln Pro Thr Gln His Pro Thr Ser Glu Glu Leu Ser Ile Gly Lys Ile

                165                 170                 175

Lys Phe Lys Ala Phe Asp Leu Gly Gly His Gln Ile Ala Arg Xaa Xaa

            180                 185                 190

Trp Lys Asp Tyr Tyr Ala Lys Val Asp Ala Val Val Tyr Leu Val Asp

        195                 200                 205

Ala Tyr Asp Lys Glu Arg Phe Ala Glu Ser Lys Lys Glu Leu Asp Ala

    210                 215                 220

Leu Leu Ser Asp Asp Ser Leu Ala Asn Val Pro Phe Leu Ile Leu Gly

225                 230                 235                 240

Asn Lys Ile Asp Ile Pro Tyr Ala Ala Ser Glu Glu Glu Leu Arg Tyr

                245                 250                 255

His Leu Gly Leu Ser Asn Phe Thr Thr Gly Lys Gly Lys Val Asn Leu

            260                 265                 270

Gly Asp Ser Asn Val Arg Pro Leu Glu Val Phe Met Cys Ser Val Val

        275                 280                 285

Arg Lys Met Gly Tyr Gly Asp Gly Phe Lys Trp Val Ser Gln Tyr Ile

    290                 295                 300

Lys

305

<210>30

<211>292

<212>PRT

<213>玉蜀黍

<220>

<221>MOD_RES

<222>(178)..(179)

<223>可变的氨基酸

<400>30

Met Gln His Ser Leu Ala Ser Leu Arg Leu Glu Trp Ser Arg His Pro

  1               5                  10                  15

Asp Pro Ala Ala Ala Val Asn Arg His Ala Pro Ile Leu Pro Gln Gln

            20                  25                  30

Thr Gln His Lys Gln Thr Gly Arg Asp Ser Asp Pro Leu Val Thr His

        35                  40                  45

Pro Arg Tyr Pro Leu Ser Leu Gly Phe Leu Ser His His Gln Pro Pro

     50                  55                  60

Ser Arg Leu Ser Pro Pro Pro Pro Ala Leu Gly Arg Arg Asp Glu Gly

 65                  70                  75                  80

Arg Arg Glu Ala Pro Ala Gly Arg Gly Gly Lys Arg Ser Ser Arg Ala

                 85                  90                  95

Gly Gly Glu Met Phe Leu Trp Asp Trp Phe Tyr Gly Val Leu Ala Ser

            100                 105                 110

Leu Gly Leu Trp Gln Lys Glu Ala Lys Ile Leu Phe Leu Cys Leu Asp

        115                 120                 125

Asn Ala Gly Lys Thr Thr Leu Leu His Met Leu Lys Asp Glu Arg Leu

    130                 135                 140

Val Gln His Gln Pro Thr Gln His Pro Thr Ser Glu Glu Leu Ser Ile

145                 150                 155                 160

Gly Lys Ile Lys Phe Lys Ala Phe Asp Leu Gly Gly His Gln Ile Ala

                165                 170                 175

Arg Xaa Xaa Trp Lys Asp Tyr Tyr Ala Lys Val Asp Ala Val Val Tyr

            180                 185                 190

Leu Val Asp Ala Tyr Asp Lys Glu Arg Phe Ala Glu Ser Lys Lys Glu

        195                 200                 205

Leu Asp Ala Leu Leu Ser Asp Asp Ser Leu Ala Asn Val Pro Phe Leu

    210                 215                 220

Ile Leu Gly Asn Lys Ile Asp Ile Pro Tyr Ala Ala Ser Glu Glu Glu

225                 230                 235                 240

Leu Arg Tyr His Leu Gly Leu Ser Asn Phe Thr Thr Gly Lys Gly Lys

                245                 250                 255

Val Asn Leu Gly Asp Ser Asn Val Arg Pro Leu Glu Val Phe Met Cys

            260                 265                 270

Ser Val Val Arg Lys Met Gly Tyr Gly Asp Gly Phe Lys Trp Val Ser

        275                 280                 285

Gln Tyr Ile Lys

    290

<210>31

<211>193

<212>PRT

<213>拟南芥

<400>31

Met Phe Leu Phe Asp Trp Phe Tyr Gly Ile Leu Ala Ser Leu Gly Leu

  1               5                  10                  15

Cys Lys Lys Glu Ala Lys Ile Leu Phe Leu Gly Leu Asp Asn Ala Gly

             20                  25                  30

Lys Thr Thr Leu Leu His Met Leu Lys Asp Glu Arg Leu Val Gln His

         35                  40                  45

Gln Pro Thr Gln His Pro Thr Ser Glu Glu Leu Ser Ile Gly Lys Ile

     50                  55                  60

Asn Phe Lys Ala Phe Asp Leu Gly Gly His Gln Ile Ala Arg Arg Val

 65                  70                  75                  80

Trp Lys Asp Cys Tyr Ala Lys Val Asp Ala Val Val Tyr Leu Val Asp

                 85                  90                  95

Ala Tyr Asp Arg Asp Arg Phe Val Glu Ser Lys Arg Glu Leu Asp Ala

            100                 105                 110

Leu Leu Ser Asp Glu Ala Leu Ala Asn Val Pro Cys Leu Ile Leu Gly

        115                 120                 125

Asn Lys Ile Asp Ile Pro Tyr Ala Ser Ser Glu Asp Glu Leu Arg Tyr

    130                 135                 140

Tyr Leu Gly Leu Thr Asn Phe Thr Thr Gly Lys Gly Ile Val Asn Leu

145                 150                 155                 160

Glu Asp Ser Gly Val Arg Pro Leu Glu Val Phe Met Cys Ser Ile Val

                165                 170                 175

Arg Lys Met Gly Tyr Gly Glu Gly Phe Lys Trp Leu Ser Gln Tyr Ile

            180                 185                 190

Lys

<210>32

<211>258

<212>PRT

<213>拟南芥

<400>32

Met Asn Phe Asn Leu Leu His Tyr Trp Ala Phe Ala His Ile Ile Ile

  1               5                  10                  15

Gln Gly Pro Asn Thr Glu Ser Pro Pro Leu Val Asn Arg Glu Arg Lys

             20                  25                  30

Ser Glu Lys Arg Glu Arg Asp Leu Trp Leu Cys Ile Ala Arg Cys Ser

         35                  40                  45

Ser Ser His Arg Ser Lys Thr Met Asn Pro Glu Tyr Asp Tyr Leu Phe

     50                  55                  60

Lys Leu Leu Leu Ile Gly Asp Ser Gly Val Gly Lys Ser Cys Leu Leu

 65                  70                  75                  80

Leu Arg Phe Ser Asp Asp Ser Tyr Val Glu Ser Tyr Ile Ser Thr Ile

                 85                  90                  95

Gly Val Asp Phe Lys Ile Arg Thr Val Glu Gln Asp Gly Lys Thr Ile

            100                 105                 110

Lys Leu Gln Ile Trp Asp Thr Ala Gly Gln Glu Arg Phe Arg Thr Ile

        115                 120                 125

Thr Ser Ser Tyr Tyr Arg Gly Ala His Gly Ile Ile Ile Val Tyr Asp

    130                 135                 140

Val Thr Asp Glu Glu Ser Phe Asn Asn Val Lys Gln Trp Leu Ser Glu

145                 150                 155                 160

Ile Asp Arg Tyr Ala Ser Asp Asn Val Asn Lys Leu Leu Val Gly Asn

                165                 170                 175

Lys Ser Asp Leu Thr Glu Asn Arg Ala Ile Pro Tyr Glu Thr Ala Lys

            180                 185                 190

Ala Phe Ala Asp Glu Ile Gly Ile Pro Phe Met Glu Thr Ser Ala Lys

        195                 200                 205

Asp Ala Thr Asn Val Glu Gln Ala Phe Met Ala Met Ser Ala Ser Ile

    210                 215             220

Lys Glu Arg Met Ala Ser Gln Pro Ala Gly Asn Asn Ala Arg Pro Pro

225                 230                 235                 240

Thr Val Gln Ile Arg Gly Gln Pro Val Ala Gln Lys Asn Gly Cys Cys

                245                 250                 255

Ser Thr

<210>33

<211>203

<212>PRT

<213>拟南芥

<400>33

Met Asn Pro Glu Tyr Asp Tyr Leu Phe Lys Leu Leu Leu Ile Gly Asp

  1               5                  10                  15

Ser Gly Val Gly Lys Ser Cys Leu Leu Leu Arg Phe Ser Asp Asp Ser

             20                  25                  30

Tyr Val Glu Ser Tyr Ile Ser Thr Ile Gly Val Asp Phe Lys Ile Arg

         35                  40                  45

Thr Val Glu Gln Asp Gly Lys Thr Ile Lys Leu Gln Ile Trp Asp Thr

     50                  55                  60

Ala Gly Gln Glu Arg Phe Arg Thr Ile Thr Ser Ser Tyr Tyr Arg Gly

 65                  70                  75                  80

Ala His Gly Ile Ile Ile Val Tyr Asp Val Thr Asp Glu Glu Ser Phe

                 85                  90                  95

Asn Asn Val Lys Gln Trp Leu Ser Glu Ile Asp Arg Tyr Ala Ser Asp

            100                 105                 110

Asn Val Asn Lys Leu Leu Val Gly Asn Lys Ser Asp Leu Thr Glu Asn

        115                 120                 125

Arg Ala Ile Pro Tyr Glu Thr Ala Lys Ala Phe Ala Asp Glu Ile Gly

    130                 135                 140

Ile Pro Phe Met Glu Thr Ser Ala Lys Asp Ala Thr Asn Val Glu Gln

145                 150                 155                 160

Ala Phe Met Ala Met Ser Ala Ser Ile Lys Glu Arg Met Ala Ser Gln

                165                 170                 175

Pro Ala Gly Asn Asn Ala Arg Pro Pro Thr Val Gln Ile Arg Gly Gln

            180                 185                 190

Pro Val Ala Gln Lys Asn Gly Cys Cys Ser Thr

        195                 200

Claims (27)

1.分离的核酸，其中所述核酸包含选自如下的多核苷酸：

a)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5中定义的多核苷酸；

b)SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6中定义的多肽的编码多核苷酸；

c)与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5的核苷酸序列具有至少90％序列同一性的多核苷酸；

d)与SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6的多肽具有至少60％序列同一性的多肽的编码多核苷酸；和

e)与选自上述a)至d)的多核苷酸序列中的至少一个序列在严格条件下杂交的多核苷酸序列，其中所述严格条件包括65℃下在6X氯化钠/柠檬酸钠(SSC)溶液中杂交；

其中植物中所述多核苷酸的表达赋予对环境胁迫的增强的耐受性。

2.重组载体，其包含权利要求1的分离的核酸。

3.根据权利要求2的重组载体，所述重组载体是进一步包含一个或多个调节序列的表达载体。

4.根据权利要求1的分离的核酸，其中植物中所述核酸的表达导致所述植物在水受限条件下生长增加。

5.多肽的编码核酸转化的转基因植物细胞，其中所述核酸包含选自如下的多核苷酸序列：

a)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5中定义的多核苷酸；

b)SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6中定义的多肽的编码多核苷酸；

c)与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5的核苷酸序列具有至少90％序列同一性的多核苷酸；

d)与SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6的多肽具有至少60％序列同一性的多肽的编码多核苷酸；和

e)与选自上述a)至d)的多核苷酸序列中的至少一个序列在严格条件下杂交的多核苷酸序列，其中所述严格条件包括65℃下在6X氯化钠/柠檬酸钠(SSC)溶液中杂交；

其中植物中所述多核苷酸的表达赋予所述植物对环境胁迫的增强的耐受性。

6.根据权利要求5的转基因植物细胞，其中所述植物是单子叶植物。

7.根据权利要求5的转基因植物细胞，其中所述植物是双子叶植物。

8.根据权利要求5的转基因植物，其中所述植物是完整植物、植物细胞、植物部分或者植物种子。

9.根据权利要求5的转基因植物细胞，其中植物中所述多核苷酸的表达导致所述植物在水受限条件下生长增加。

10.根据权利要求9的转基因植物，其中所述水受限条件下生长增加是由于植物增加的水利用效率(WUE)。

11.根据权利要求10的转基因植物，其中所述增加的WUE是由于植物增加的干重。

12.根据权利要求9的转基因植物，其中所述植物是完整植物、植物细胞、植物部分或者植物种子。

13.根据权利要求10的转基因植物，其中所述植物是完整植物、植物细胞、植物部分或者植物种子。

14.根据权利要求11的转基因植物，其中所述植物是完整植物、植物细胞、植物部分或者植物种子。

15.根据权利要求5的转基因植物细胞，其中所述植物选自玉米、小麦、黑麦、燕麦、黑小麦、稻、大麦、大豆、花生、棉花、油菜籽、油菜、木薯、胡椒、向日葵、万寿菊、茄科植物、马铃薯、烟草、茄子、番茄、蚕豆物种、豌豆、苜蓿、咖啡、可可、茶、柳属物种、油棕榈树、椰子、多年生草及饲料作物。

16.在水受限条件下改变植物生长的方法，其包括改变植物中核酸的表达，其中所述核酸选自：

a)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5中定义的多核苷酸；

b)SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6中定义的多肽的编码多核苷酸；

c)与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5的核苷酸序列具有至少90％序列同一性的多核苷酸；

d)与SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6的多肽具有至少60％序列同一性的多肽的编码多核苷酸；和

e)与选自上述a)至d)的多核苷酸序列中的至少一个序列在严格条件下杂交的多核苷酸序列，其中所述严格条件包括65℃下在6X氯化钠/柠檬酸钠(SSC)溶液中杂交。

17.根据权利要求16的方法，其中与野生型品种的植物或无效植物相比，所述植物的生长在水受限条件下增加。

18.根据权利要求16的方法，其中所述植物是转基因的。

19.根据权利要求16的方法，其中所述植物包含指导所述核酸表达的启动子。

20.根据权利要求19的方法，其中所述启动子是组织特异性的。

21.根据权利要求19的方法，其中所述启动子是发育调节的。

22.制备转基因植物的方法，所述植物包含多肽的编码核酸，并与野生型品种的植物相比在水受限条件下生长增加，其中所述方法包括用包含所述核酸的表达载体转化植物细胞，并从植物细胞产生表达所述多肽的转基因植物，其中所述核酸包含选自如下的多核苷酸序列：

a)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5中定义的多核苷酸；

b)SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6中定义的多肽的编码多核苷酸；

c)与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5的核苷酸序列具有至少90％序列同一性的多核苷酸；

d)与SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6的多肽具有至少60％序列同一性的多肽的编码多核苷酸；和

e)与选自上述a)至d)的多核苷酸序列中的至少一个序列在严格条件下杂交的多核苷酸序列，其中所述严格条件包括65℃下在6X氯化钠/柠檬酸钠(SSC)溶液中杂交。

23.根据权利要求22的方法，其中所述植物是单子叶植物。

24.根据权利要求22的方法，其中所述植物是双子叶植物。

25.根据权利要求22的方法，其中所述植物选自玉米、小麦、黑麦、燕麦、黑小麦、稻、大麦、大豆、花生、棉花、油菜籽、油菜、木薯、胡椒、向日葵、万寿菊、茄科植物、马铃薯、烟草、茄子、番茄、蚕豆物种、豌豆、苜蓿、咖啡、可可、茶、柳属物种、油棕榈树、椰子、多年生草及饲料作物。

26.在农业场所种植植物的方法，其中所述方法包括获得根据权利要求5所述的转基因植物，并在农业场所种植所述植物。

27.由权利要求5的转基因植物制备的动物饲料、粮食、化妆品或者药物。

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