CN103110674A - 一种唐古特白刺总酚提取物及其提取方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种唐古特白刺总酚提取物及其提取方法和应用，总酚提取物由以下方法制得：干燥唐古特白刺，酒精回流提取得乙醇提取液和滤渣，回收乙醇得第一粗提物；滤渣用水回流提取数次，得水提液，浓缩，加酒精，减压蒸馏得第二粗提物；分开水溶第一、二粗提物，过大孔吸附树脂柱，进行水洗脱糖后，用酒精洗脱，收集乙醇洗脱液，回收溶剂得第三、四粗提物；再继续对第三、四粗提物进行提取，最终分别获得二氯甲烷部位提取物、乙酸乙酯部位提取物、正丁醇部位提取物、水部位提取物和甲醇部位提取物。该唐古特白刺总酚提取物，提取工艺简单，容易操作，总酚提取物含量高，可工业化规模生产。所制备的提取物，具有较强的抗氧化性及一定的体外肿瘤生长抑制活性。
Description
技术领域
本发明涉及灌木组织提取物及其提取方法和应用，具体涉及一种从唐古特白刺叶和果中提取的总酚提取物及其提取方法和应用。
背景技术
唐古特白刺是蒺藜科(Zygophyllaceae)白刺属(Nitraria L.)中较进化的植物种，也是名贵中药锁阳的寄生灌木，在柴达木盆地的沙漠绿洲边缘，盐碱沙滩地大量分布，生长环境海拔1900~3500m，分布面积约25万km2，盆地相对集中成片具有开发价值的天然唐古特白刺林约50~60万亩。唐古特白刺具有抗高温、抗沙埋、耐干旱、耐盐碱、耐严寒等特殊生物学特性，这些特性与植物体内的生物活性物质息息相关。其生长地还有“白刺死3年不算死，白杨活3年不算活”的谚语。
作为沙生植物中少有的浆果状核果植物，唐古特白刺果实的色、形、味类似于樱桃，有“沙樱桃”之美誉。它是西部蒙、藏、维等少数民族的传统药材，其入药记载于《中国沙漠地区药用植物》，在《中药大辞典》中被称为卡密,以果熟时采收，晒干入药。具有健脾胃、滋补强壮、调经活血的功能，主治身体瘦弱、气血两亏、脾胃不和、消化不良、月经不调、虚寒腰痛等症。唐古特白刺果实在民间还被用于治疗神经衰弱，感冒等症。
现代研究发现唐古特白刺果实富含维生素C、氨基酸、多糖类、黄酮、生物碱等，具有降血脂、降血糖、防治动脉动粥样硬化、抗氧化以及提高SOD酶活力的作用，能够较为显著的提高人体免疫功能、抗疲劳、耐寒冷以及抗缺氧等应激能力。唐古特白刺色素提取物在ORAC(抗氧化能力指数)测定中显示出很强的抗氧化能力，其抗氧化能力指数明显高于宁夏枸杞；有研究指出唐古特白刺果实提取物具有良好的抗氧化性可能与其中含有丰富的多酚类活性物质有关；对唐古特白刺果汁营养成分的研究表明，唐古特白刺果汁中含量最高的营养成分为总酚，其次是原花青素，原花青素在真核细胞内能抑制核线粒体的变异，具有抗氧化活性、酶抑制活性、抗致突变活性、降低毛细血管通透性等功能，可用于抗衰老，抗白内障，抗溃疡及改善视力，已被广泛应用到药物、化妆品和功能性食品等领域。
贾忠建等从唐古特白刺种子中分得6个黄酮类化合物：异鼠李素-7-O-α-L-鼠李糖甙、山奈素-7-O-α-L-鼠李糖甙、异鼠李素-7-O-β-D-葡萄糖甙、榭皮素-7-O-α-L-鼠李糖甙、异鼠李糖、槲皮素，前4个化合物为首次从该属植物中分得。
唐古特白刺叶作为民间药用于治疗痉挛、神经痛和心律不齐等症。段金廒等从唐古特白刺叶中分得8个黄酮类及酚酸类化合物，分别为：3-甲氧基-4-羟基-反式桂皮酸、对-羟基-反式肉桂酸、3-羟基-4-甲氧基-苯甲酸、邻-羟基苯甲酸、3,5-二甲醚-山柰黄素-7-O-β-D-葡萄糖甙、3-甲醚-山柰黄素-7-O-β-D-葡萄糖甙、异鼠李素-7-O-β-D-葡萄糖甙、异鼠李素-3-O-β-D-芸香糖甙。黄酮类化合物具有抗氧化、降低脂质过氧化反应、降低心肌耗氧量、防治血管硬化、降压、抗衰老、抗自由基和抗癌、防癌等作用。合理开发利用唐古特白刺资源，特别是将其叶变废为宝开发成新药物和保健品，并不会对生态环境造成危害，对人类社会也是大有裨益的。
发明内容
发明目的：针对现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供一种唐古特白刺叶总酚提取物，对唐古特白刺进行合理开发利用。本发明的另一目的是提供一种上述唐古特白刺总酚提取物的提取方法。本发明还有一目的是提供上述唐古特白刺总酚提取物在抗氧化、抗肿瘤方面的应用。
技术方案：为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：
一种唐古特白刺总酚提取物，由以下方法制得：
(1)取唐古特白刺植物材料，干燥，用5~15倍量50~100%乙醇水溶液浸泡后回流提取数次，每次提取1~5h，过滤，得乙醇提取液和滤渣，合并乙醇提取液，静置12~48h，滤去沉淀，回收溶剂得第一粗提物；
(2)将滤渣用5~15倍量水回流提取3次，每次提取1~5h，过滤，合并水提液，水提液经适当浓缩，于冷却后加入50~100%乙醇水溶液，静置12~48h，过滤得滤液，减压蒸馏之得第二粗提物；
(3)水溶第一粗提物，上大孔吸附树脂柱，水洗脱糖后，用50~100%乙醇水溶液洗脱，收集乙醇洗脱液，回收溶剂得第三粗提物；
(4)水溶第二粗提物，上大孔吸附树脂柱，水洗脱糖后，用50~100%乙醇水溶液洗脱，收集乙醇洗脱液，回收溶剂得第四粗提物；
(5)水溶第三粗提物和第四粗提物，合并，依次用10~20倍量二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇萃取；回收溶剂分别得二氯甲烷部位提取物、乙酸乙酯部位提取物、正丁醇部位提取物；浓缩萃取后所剩水相，以甲醇洗至浓缩物不能再被溶解，得水部位提取物，合并甲醇溶解部分、回收溶剂得甲醇部位提取物；
所述总酚提取物包括第一粗提物、第二粗提物、第三粗提物、第四粗提物、二氯甲烷部位提取物、乙酸乙酯部位提取物、正丁醇部位提取物、水部位提取物及甲醇部位提取物。
所述唐古特白刺植物材料为唐古特白刺的果或叶。当为唐古特白刺叶，提取总酚提取物时，优选：先用50~100%乙醇水溶液溶解第四粗提物，过滤，浓缩滤液得到第五粗提物；再将第三粗提物和第五粗提物扩散于水使混悬并合并，沉淀以乙酸乙酯溶解，浓缩溶剂得到第六粗提物，清液则过大孔吸附树脂，水洗脱糖后以50~100%乙醇水溶液洗至无色，浓缩乙醇洗脱液得第七粗提物；将第七粗提物扩散于5~15倍量水，依次用5~15倍量水二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇各萃取三次；回收溶剂分别得二氯甲烷部位提取物、乙酸乙酯部位提取物、正丁醇部位提取物；浓缩萃取后所剩水相，以甲醇洗至浓缩物不能再被溶解，得水部位提取物，合并甲醇溶解部分、回收溶剂得甲醇部位提取物；所述的总酚提取物还包括第六粗提物、第七粗提物。
一种提取唐古特白刺总酚提取物的方法，包括以下步骤：
(1)取唐古特白刺植物材料，干燥，用5~15倍量50~100%乙醇水溶液浸泡后回流提取数次，每次提取1~5h，过滤，得乙醇提取液和滤渣，合并乙醇提取液，静置12~48h，滤去沉淀，回收溶剂得第一粗提物；
(2)将滤渣用5~15倍量水回流提取3次，每次提取1~5h，过滤，合并水提液，水提液经适当浓缩，于冷却后加入50~100%乙醇水溶液，静置12~48h，过滤得滤液，减压蒸馏之得第二粗提物；
(3)水溶第一粗提物，上大孔吸附树脂柱，水洗脱糖后，用50~100%乙醇水溶液洗脱，收集乙醇洗脱液，回收溶剂得第三粗提物；
(4)水溶第二粗提物，上大孔吸附树脂柱，水洗脱糖后，用50~100%乙醇水溶液洗脱，收集乙醇洗脱液，回收溶剂得第四粗提物；
(5)水溶第三粗提物和第四粗提物，合并，依次用10~20倍量二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇萃取；回收溶剂分别得二氯甲烷部位提取物、乙酸乙酯部位提取物、正丁醇部位提取物；浓缩萃取后所剩水相，以甲醇洗至浓缩物不能再被溶解，得水部位提取物，合并甲醇溶解部分、回收溶剂得甲醇部位提取物。
所述唐古特白刺植物材料为唐古特白刺的果或叶。当为唐古特白刺叶，提取总酚提取物时，优选：先用50~100%乙醇水溶液溶解第四粗提物，过滤，浓缩滤液得到第五粗提物；再将第三粗提物和第五粗提物扩散于水使混悬并合并，沉淀以乙酸乙酯溶解，浓缩溶剂得到第六粗提物，清液则过大孔吸附树脂，水洗脱糖后以50~100%乙醇水溶液洗至无色，浓缩乙醇洗脱液得第七粗提物；将第七粗提物扩散于5~15倍量水，依次用5~15倍量水二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇各萃取三次；回收溶剂分别得二氯甲烷部位提取物、乙酸乙酯部位提取物、正丁醇部位提取物；浓缩萃取后所剩水相，以甲醇洗至浓缩物不能再被溶解，得水部位提取物，合并甲醇溶解部分、回收溶剂得甲醇部位提取物。
所述的唐古特白刺总酚提取物在抗氧化中的应用。所述的抗氧化评价方法包括DPPH自由基法和ORAC分析。
所述的唐古特白刺总酚提取物在制备抗肿瘤药物中的应用。所述的肿瘤为白血病、肝癌、肺癌、乳腺癌和结肠癌。应用中涉及的肿瘤细胞株包括白血病细胞HL-60、肝癌细胞SMMC-7721、肺癌细胞A-549、乳腺癌细胞MCF-7、结肠癌细胞SW480。
有益效果：与现有技术相比，本发明的唐古特白刺总酚提取物，提取工艺简单，容易操作，所制备的提取物，具有较强的抗氧化性及一定的体外肿瘤生长抑制活性，具有很好的实用性。可对唐古特白刺进行合理开发利用，为植物资源化，提供了可靠的技术支持。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明。
以下实施例所使用的材料为：唐古特白刺叶、果实均由中国林科院收集，所有收集的标本进行系统鉴定，干燥标本保存于南京理工大学。白血病细胞HL-60、肝癌细胞SMMC-7721、肺癌细胞A-549、乳腺癌细胞MCF-7、结肠癌细胞SW480均来自昆明植物所。
以下实施例所使用的药品为：AAPH(2,2′-偶氮二(2-脒基丙烷)二盐酸盐)购于Wako化学品有限公司，Trolox(6-羟基-2,5,7,8-四甲基苯并二氢吡喃-2-羧酸)、Folin–Ciocalteu reagent(福林酚试剂)、FL(磷酸氢二钠荧光素)、没食子酸，以上试剂购于Fisher Scientific公司，DPPH(1,1-二苯基-2-三硝基苯肼)购于阿拉丁试剂公司，其他所有化学品为分析试剂。
实施例1
取731.5g唐古特白刺叶于40℃烘干，用95%乙醇水溶液回流提取，第一次提取3h、第二次和第三次各1h，乙醇总用量为19.25L；过滤，得滤液和第一滤渣，合并滤液静置24h，滤去沉淀，回收溶剂得第一粗提物MH-Y-1；将前步得到的第一滤渣用水回流提取3次，第一次提取3h、第二次和第三次各1h；过滤，合并水提液，水提液经适当浓缩，于冷却后加入乙醇，静置24h，过滤得滤液，减压蒸馏之得第二粗提物MH-Y-2；将第一粗提物MH-Y-1扩散于水中，过HPD-600大孔吸附树脂，水洗脱糖后，弃去此水洗脱液，用95%乙醇水溶液洗脱，收集此乙醇洗脱液，回收乙醇得75.1g第三粗提物；将第二粗提物MH-Y-2扩散于水中，过HPD-600大孔吸附树脂，水洗脱糖后，弃去此水洗脱液，用95%乙醇水溶液洗脱，收集此乙醇洗脱液，回收乙醇得32.1g第四粗提物；用95%乙醇水溶液溶解第四粗提物，过滤，浓缩滤液得到0.419g第五粗提物；将第三粗提物和第五粗提物合并扩散于水成混悬液，沉淀以乙酸乙酯溶解，浓缩溶剂得到11g第六粗提物MH-3，清液则过HPD-600大孔吸附树脂，水洗脱糖后以95%乙醇水溶液洗至无色，浓缩乙醇洗脱液得第七粗提物MH-4。将第七粗提物MH-4扩散于100mL水依次用100mL二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇各萃取三次。回收溶剂分别得14.345g二氯甲烷部位提取物MH-a、0.560g乙酸乙酯部位提取物MH-b、0.932g正丁醇部位提取物MH-c。浓缩萃取后所剩水相，以甲醇洗至浓缩物不能再被溶解，得水部位提取物MH-e，合并甲醇溶解部分、回收溶剂得2.047g甲醇部位提取物MH-d。
总酚测定方法：以去离子水溶解提取物并配制成工作标准浓度为0、10、25、50、100、250和500μg/mL(ppm)的样品溶液；将50μL的样品溶液或标准品转移至规格为13mm×100mm的硼硅管中，向其中加入430μL的去离子水和20μL的Folin-Ciocalteu试剂，混匀，待反应5min后再加入50μL的20%碳酸钠和450μL的去离子水，室温避光静置60min后在725nm处测定吸光度。根据标准曲线计算总酚含量。唐古特白刺叶的总酚提取物的总酚含量表示为每1g唐古特白刺叶的总酚提取物相当于没食子酸的微克数。
部分唐古特白刺叶的总酚提取物总酚含量测定结叶如表1所示。
表1从植物叶中抽提出的提取物中总酚含量
注：表中数据表示为三次平行试验的平均值±标准偏差。
实施例2
用无水乙醇作溶剂将提取物配制成浓度为0.078125、0.15625、0.3125、0.625、1.25、2.5、5和10mg/mL的系列样品溶液；用无水乙醇作溶剂将抗坏血酸配制成浓度为0.0078125、0.015625、0.03125、0.0625、0.125、0.25、0.5和1mg/mL的系列标准品溶液；准确称取2mg的DPPH，用无水乙醇溶解定容至20mL配成浓度为180μg/mL的DPPH自由基溶液；吸取20uL的样品溶液或标准品溶液及180uL的DPPH自由基溶液于96孔板，避光放置30min，于517nm分别测其吸光度。依下式计算DPPH自由基清除率：
清除率=(1-(Ai-Aj)/A0〕×100％
式中：A0-空白对照液的吸光度(用无水乙醇代替待测液)；Ai-待测液的吸光度(用无水乙醇代替待测液)；Aj-待测液本身的吸光度(用无水乙醇代替显色剂)。
每个质量浓度组平行测定3次，取其平均值。样品溶液清除自由基能力采用清除DPPH自由基的IC50值表示，即DPPH自由基清除率为50%时所对应的抗氧化剂溶液浓度。部分唐古特白刺叶的总酚提取物(实施例1提取)清除DPPH自由基能力如表2所示。
表2从植物叶中抽提出的提取物清除DPPH自由基能力
| 提取物 | MH-Y-1 | MH-b | MH-c | MH-d |
| IC50/(mg/mL) | 1.64 | 0.26 | 0.67 | 0.86 |
实验测得标准品抗坏血酸的IC50值为0.089mg/mL。唐古特白刺叶的总酚提取物抗氧化活性小于标准品，但具有较强的清除DPPH自由基的能力。
实施例3
唐古特白刺叶的总酚提取物(实施例1提取)在ORAC分析中的应用。ORAC分析是目前抗氧化研究领域中最受关注的一个评价方法。该方法以偶氮类化合物AAPH作为过氧自由基来源，以合成荧光素FL为荧光指示剂，维生素E水溶性类似物Trolox为抗氧化性能定量标准对照，反应在37℃恒温条件下，磷酸缓冲液(pH=7.0)环境中进行。向96孔板中添加50μL的标准品溶液或样品液，再加入100μL的荧光溶液，混合完全；37℃下培养7min后加入50μL的AAPH启动反应，并将微孔板置于荧光分析仪中于37℃下以激发波长485nm，发射波长530nm进行连续测定，每1min测定一次各孔荧光强度，测定时间为40min。ORAC实验需设定两种对照，即没有添加自由基的FL荧光自然衰减对照(-AAPH)和没有抗氧化剂存在时的自由基作用对照(+AAPH)。唐古特白刺叶的总酚提取物的抗氧化能力表示为每1g唐古特白刺叶的总酚提取物相当于Trolox的微摩尔数。部分唐古特白刺叶的总酚提取物抗氧化能力测定结叶如表3所示。
表3从植物叶中抽提出的提取物抗氧化能力
注：表中数据表示为三次平行试验的平均值±标准偏差。
实施例4
采用MTS检测细胞活性法衡量实施例1的提取物对5种肿瘤细胞的杀伤作用。实验原理、方法等简述如下：
实验方法：MTS为一种全新的MTT类似物，全称为3-(4，5-dimethylthiazol-2-yl)-5(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfopheny)-2H-tetrazolium，是一种黄颜色的染料。活细胞线粒体中琥珀酸脱氢酶能够代谢还原MTS，生成可溶性的的甲臜(Formazan)化合物，甲臜的含量可以用酶标仪在490nm处进行测定。在通常情况下，甲臜生成量与活细胞数成正比，因此可根据光密度OD值推测出活细胞的数目。
实验方法：用含10%胎牛血清的培养液(DMEM或者RMPI1640)配成单个细胞悬液，以每孔5000-10000个细胞接种到96孔板，每孔体积100μL，贴壁细胞提前12h接种培养；加入待测提取物样品溶液(固定浓度40μM初筛，在该浓度对肿瘤细胞生长抑制在50%附近的提取物样品设5个浓度进入梯度复筛)，每孔终体积200μL，每种处理均设3个复孔；37℃培养48h后，吸弃孔内培养上清液，每孔加MTS溶液20μL以及培养液100μL。继续孵育1-4h，使反应充分进行；选择490nm波长，酶联免疫检测仪(Bio-Rad680)读取各孔光吸收值，记录结叶，以浓度为横坐标，细胞存活率为纵坐标绘制细胞生长曲线，应用两点法(Reed and Muench法)计算样品的IC50值。
表4植物提取物对5种肿瘤细胞株的半数生长抑制浓度(IC50，μg/mL)
| 提取物 | MH-Y-1 | MH-a | MH-b | MH-c | MH-d |
| HL-60 | ＞100 | 27.74 | 31.58 | ＞100 | ＞100 |
| SMMC-7721 | ＞100 | 58.62 | 80.31 | ＞100 | ＞100 |
| A-549 | ＞100 | 22.34 | 51.57 | ＞100 | ＞100 |
| MCF-7 | ＞100 | 12.24 | 31.02 | 47.24 | ＞100 |
| SW480 | ＞100 | 63.02 | 94.91 | ＞100 | ＞100 |
从表4可明显看出提取物MH-c具有一定的MCF-7生长抑制活性，提取物MH-a、MH-b具有一定的体外肿瘤生长抑制活性。
实施例5
取2.03kg新鲜唐古特白刺果实于40℃烘干，用95%乙醇水溶液回流提取，第一次提取3h、第二次和第三次各1h，乙醇总用量为12L；过滤，得滤液和第一滤渣，合并滤液静置24h，滤去沉淀，回收溶剂得312.9g第一粗提物MH-G-1；将前步得到的第一滤渣用水回流提取3次，第一次提取3h、第二次和第三次各1h，总用水量为12L；过滤，合并水提液，水提液经适当浓缩，于冷却后加入乙醇，静置24h，过滤得滤液，减压蒸馏之得203.5g第二粗提物MH-G-2；将第一粗提物MH-G-1扩散于2L水中，过HPD-600大孔吸附树脂，水洗脱糖后，弃去此水洗脱液，用95%乙醇水溶液洗脱，收集此乙醇洗脱液，回收乙醇得22.7g第三粗提物MH-1；将第二粗提物MH-G-2扩散于2L水中，过HPD-600大孔吸附树脂，水洗脱糖后，弃去此水洗脱液，用95%乙醇水溶液洗脱，收集此乙醇洗脱液，回收乙醇得12.7g第四粗提物MH-2；于第三粗提物MH-1和第四粗提物MH-2合并共加700mL水使成混悬液，依次用500mL二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇各萃取三次。回收溶剂分别得7.267g二氯甲烷部位提取物MH-A、2.744g乙酸乙酯部位提取物MH-B、15.572g正丁醇部位提取物MH-C。浓缩萃取后所剩水相，以甲醇洗至浓缩物不能再被溶解，得8.299g水部位提取物MH-E，合并甲醇溶解部分、回收溶剂得1.518g甲醇部位提取物MH-D。
总酚测定方法：以去离子水溶解提取物并配制成工作标准浓度为0、10、25、50、100、250和500μg/mL(ppm)的样品溶液；将50μL的样品溶液或标准品转移至规格为13mm×100mm的硼硅管中，向其中加入430μL的去离子水和20μL的Folin-Ciocalteu试剂，混匀，待反应5min后再加入50μL的20%碳酸钠和450μL的去离子水，室温避光静置60min后在725nm处测定吸光度。根据标准曲线计算总酚含量。唐古特白刺果的总酚提取物的总酚含量表示为每1g唐古特白刺果的总酚提取物相当于没食子酸的微克数。
部分唐古特白刺果的总酚提取物总酚含量测定结果如表5所示。
表5从果实中抽提出的提取物中总酚含量
注：表中数据表示为三次平行试验的平均值±标准偏差。
实施例6
用无水乙醇作溶剂将提取物配制成浓度为0.078125、0.15625、0.3125、0.625、1.25、2.5、5和10mg/mL的系列样品溶液；用无水乙醇作溶剂将抗坏血酸配制成浓度为0.0078125、0.015625、0.03125、0.0625、0.125、0.25、0.5和1mg/mL的系列标准品溶液；准确称取2mg的DPPH，用无水乙醇溶解定容至20mL配成浓度为180μg/mL的DPPH自由基溶液；吸取20uL的样品溶液或标准品溶液及180uL的DPPH自由基溶液于96孔板，避光放置30min，于517nm分别测其吸光度。依下式计算DPPH自由基清除率：
清除率=(1-(Ai-Aj)/A0〕×100％
式中：A0-空白对照液的吸光度(用无水乙醇代替待测液)；Ai-待测液的吸光度(用无水乙醇代替待测液)；Aj-待测液本身的吸光度(用无水乙醇代替显色剂)。
每个质量浓度组平行测定3次，取其平均值。样品溶液清除自由基能力采用清除DPPH自由基的IC50值表示，即DPPH自由基清除率为50%时所对应的抗氧化剂溶液浓度。部分唐古特白刺果的总酚提取物(实施例5提取)清除DPPH自由基能力如表6所示。
表6从植物果实中抽提出的提取物清除DPPH自由基能力
| 提取物 | MH-G-1 | MH-A | MH-B | MH-D |
| IC50/(mg/mL) | 0.466 | 0.490 | 0.177 | 0.295 |
实验测得标准品抗坏血酸的IC50值为0.089mg/mL。唐古特白刺果的总酚提取物抗氧化活性略小于标准品，但仍表现出很好的清除DPPH自由基的能力。
实施例7
唐古特白刺果的总酚提取物(实施例5提取)在ORAC分析中的应用。ORAC分析是目前抗氧化研究领域中最受关注的一个评价方法。该方法以偶氮类化合物AAPH作为过氧自由基来源，以合成荧光素FL为荧光指示剂，维生素E水溶性类似物Trolox为抗氧化性能定量标准对照，反应在37℃恒温条件下，磷酸缓冲液(pH=7.0)环境中进行。向96孔板中添加50μL的标准品溶液或样品液，再加入100μL的荧光溶液，混合完全；37℃下培养7min后加入50μL的AAPH启动反应，并将微孔板置于荧光分析仪中于37℃下以激发波长485nm，发射波长530nm进行连续测定，每1min测定一次各孔荧光强度，测定时间为40min。ORAC实验需设定两种对照，即没有添加自由基的FL荧光自然衰减对照(-AAPH)和没有抗氧化剂存在时的自由基作用对照(+AAPH)。唐古特白刺果的总酚提取物的抗氧化能力表示为每1g唐古特白刺果的总酚提取物相当于Trolox的微摩尔数。部分唐古特白刺果的总酚提取物(实施例5提取)抗氧化能力测定结果如表7所示。
表7从植物果实中抽提出的提取物抗氧化能力
注：表中数据表示为三次平行试验的平均值±标准偏差。
实施例8
采用MTS检测细胞活性法衡量实施例5的提取物对5种肿瘤细胞的杀伤作用。实验原理、方法等简述如下：
MTS为一种全新的MTT类似物，全称为3-(4，5-dimethylthiazol-2-yl)-5(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfopheny)-2H-tetrazolium，是一种黄颜色的染料。活细胞线粒体中琥珀酸脱氢酶能够代谢还原MTS，生成可溶性的的甲臜(Formazan)化合物，甲臜的含量可以用酶标仪在490nm处进行测定。在通常情况下，甲臜生成量与活细胞数成正比，因此可根据光密度OD值推测出活细胞的数目。
实验方法：用含10%胎牛血清的培养液(DMEM或者RMPI1640)配成单个细胞悬液，以每孔5000-10000个细胞接种到96孔板，每孔体积100μL，贴壁细胞提前12h接种培养；加入待测提取物样品溶液(固定浓度40μM初筛，在该浓度对肿瘤细胞生长抑制在50%附近的提取物样品设5个浓度进入梯度复筛)，每孔终体积200μL，每种处理均设3个复孔；37℃培养48h后，吸弃孔内培养上清液，每孔加MTS溶液20μL以及培养液100μL。继续孵育1-4h，使反应充分进行；选择490nm波长，酶联免疫检测仪(Bio-Rad680)读取各孔光吸收值，记录结果，以浓度为横坐标，细胞存活率为纵坐标绘制细胞生长曲线，应用两点法(Reed and Muench法)计算样品的IC50值。
表8植物提取物对5种肿瘤细胞株的半数生长抑制浓度(IC50，μg/mL)
| fraction | MH-G-1 | MH-A | MH-B | MH-C | MH-D |
| HL-60 | ＞100 | ＞100 | ＞100 | ＞100 | ＞100 |
| SMMC-7721 | ＞100 | ＞100 | ＞100 | ＞100 | ＞100 |
| A-549 | ＞100 | 50.44 | ＞100 | ＞100 | ＞100 |
| MCF-7 | ＞100 | ＞100 | ＞100 | ＞100 | ＞100 |
| SW480 | ＞100 | ＞100 | ＞100 | ＞100 | ＞100 |
从表8可明显看出提取物MH-A具有一定的A-549生长抑制活性。
Claims (9)
1.一种唐古特白刺总酚提取物，其特征在于，由以下方法制得：
（1）取唐古特白刺植物材料，干燥，用5~15倍量50~100%乙醇水溶液浸泡后回流提取数次，每次提取1~5h，过滤，得乙醇提取液和滤渣，合并乙醇提取液，静置12~48h，滤去沉淀，回收溶剂得第一粗提物；
（2）将滤渣用5~15倍量水回流提取3次，每次提取1~5h，过滤，合并水提液，水提液经适当浓缩，于冷却后加入50~100%乙醇水溶液，静置12~48h，过滤得滤液，减压蒸馏之得第二粗提物；
（3）水溶第一粗提物，上大孔吸附树脂柱，水洗脱糖后，用50~100%乙醇水溶液洗脱，收集乙醇洗脱液，回收溶剂得第三粗提物；
（4）水溶第二粗提物，上大孔吸附树脂柱，水洗脱糖后，用50~100%乙醇水溶液洗脱，收集乙醇洗脱液，回收溶剂得第四粗提物；
（5）水溶第三粗提物和第四粗提物，合并，依次用10~20倍量二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇萃取；回收溶剂分别得二氯甲烷部位提取物、乙酸乙酯部位提取物、正丁醇部位提取物；浓缩萃取后所剩水相，以甲醇洗至浓缩物不能再被溶解，得水部位提取物，合并甲醇溶解部分、回收溶剂得甲醇部位提取物；
所述总酚提取物包括第一粗提物、第二粗提物、第三粗提物、第四粗提物、二氯甲烷部位提取物、乙酸乙酯部位提取物、正丁醇部位提取物、水部位提取物及甲醇部位提取物。
2.根据权利要求1所述的唐古特白刺总酚提取物，其特征在于：所述唐古特白刺植物材料为唐古特白刺的果或叶。
3.根据权利要求1所述的唐古特白刺总酚提取物，其特征在于：所述的唐古特白刺植物材料为唐古特白刺叶，提取总酚提取物时，先用50~100%乙醇水溶液溶解第四粗提物，过滤，浓缩滤液得到第五粗提物；再将第三粗提物和第五粗提物扩散于水使混悬并合并，沉淀以乙酸乙酯溶解，浓缩溶剂得到第六粗提物，清液则过大孔吸附树脂，水洗脱糖后以50~100%乙醇水溶液洗至无色，浓缩乙醇洗脱液得第七粗提物；将第七粗提物扩散于5~15倍量水，依次用5~15倍量水二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇各萃取三次；回收溶剂分别得二氯甲烷部位提取物、乙酸乙酯部位提取物、正丁醇部位提取物；浓缩萃取后所剩水相，以甲醇洗至浓缩物不能再被溶解，得水部位提取物，合并甲醇溶解部分、回收溶剂得甲醇部位提取物；所述的总酚提取物还包括第六粗提物、第七粗提物。
4.一种提取唐古特白刺总酚提取物的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）取唐古特白刺植物材料，干燥，用5~15倍量50~100%乙醇水溶液浸泡后回流提取数次，每次提取1~5h，过滤，得乙醇提取液和滤渣，合并乙醇提取液，静置12~48h，滤去沉淀，回收溶剂得第一粗提物；
（2）将滤渣用5~15倍量水回流提取3次，每次提取1~5h，过滤，合并水提液，水提液经适当浓缩，于冷却后加入50~100%乙醇水溶液，静置12~48h，过滤得滤液，减压蒸馏之得第二粗提物；
（3）水溶第一粗提物，上大孔吸附树脂柱，水洗脱糖后，用50~100%乙醇水溶液洗脱，收集乙醇洗脱液，回收溶剂得第三粗提物；
（4）水溶第二粗提物，上大孔吸附树脂柱，水洗脱糖后，用50~100%乙醇水溶液洗脱，收集乙醇洗脱液，回收溶剂得第四粗提物；
（5）水溶第三粗提物和第四粗提物，合并，依次用10~20倍量二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇萃取；回收溶剂分别得二氯甲烷部位提取物、乙酸乙酯部位提取物、正丁醇部位提取物；浓缩萃取后所剩水相，以甲醇洗至浓缩物不能再被溶解，得水部位提取物，合并甲醇溶解部分、回收溶剂得甲醇部位提取物。
5.根据权利要求4所述的提取唐古特白刺总酚提取物的方法，其特征在于：所述唐古特白刺植物材料为唐古特白刺的果或叶。
6.根据权利要求5所述的唐古特白刺总酚提取物，其特征在于：所述的唐古特白刺植物材料为唐古特白刺叶，提取总酚提取物时，先用50~100%乙醇水溶液溶解第四粗提物，过滤，浓缩滤液得到第五粗提物；再将第三粗提物和第五粗提物扩散于水使混悬并合并，沉淀以乙酸乙酯溶解，浓缩溶剂得到第六粗提物，清液则过大孔吸附树脂，水洗脱糖后以50~100%乙醇水溶液洗至无色，浓缩乙醇洗脱液得第七粗提物；将第七粗提物扩散于5~15倍量水，依次用5~15倍量水二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇各萃取三次；回收溶剂分别得二氯甲烷部位提取物、乙酸乙酯部位提取物、正丁醇部位提取物；浓缩萃取后所剩水相，以甲醇洗至浓缩物不能再被溶解，得水部位提取物，合并甲醇溶解部分、回收溶剂得甲醇部位提取物。
7.权利要求1所述的唐古特白刺总酚提取物在抗氧化中的应用。
8.权利要求1所述的唐古特白刺总酚提取物在制备抗肿瘤药物中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述的肿瘤为白血病、肝癌、肺癌、乳腺癌和结肠癌。
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