CN103103213B - 一种抑制间充质干细胞分化为脂肪细胞的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种抑制间充质干细胞分化为脂肪细胞的方法。通过构建含ICAM-1基因的重组逆转录病毒质粒，连同包装质粒共同转染包装细胞，收相关病毒上清并感染间充质干细胞，达到抑制间充质干细胞分化为脂肪细胞的目的。本发明分离方法操作简单、方便实用，转染间充质干细胞的效率高（可高表达ICAM-1达90%以上）、所得到的间充质干细胞体外增殖旺盛、可多次传代（大于50代）。因此，本发明建立了抑制间充质干细胞分化为脂肪细胞的方法和培养技术体系，为间充质干细胞的研究应用奠定了基础。
Description
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种抑制间充质干细胞分化为脂肪细胞的方法。
背景技术
间充质干细胞（mesenchymal stem cells, MSCs）是一种具有多向分化潜能的成体干细胞，在适宜的条件下可以分化成为成骨细胞，软骨细胞和脂肪细胞等多种组织类型的细胞。在生理条件下，间充质干细胞通过分化为多种子代细胞参与机体生长发育和新陈代谢，在病理条件下，参与组织修复。但是值得关注的是，当强烈的损伤因素持续存在，超过了机体的调节范围之后，间充质干细胞也会参与疾病的病理过程，加重组织损伤。如肝脏疾病时，间充质干细胞分化为成纤维细胞，参与肝脏的纤维化，加重了肝硬化。当机体糖脂肪代谢紊乱时，间充质干细胞持续分化为脂肪细胞，引发肥胖和相关并发症。因此，如何调节间充质干细胞的分化方向，使之符合机体生理需要，避免加重疾病，是相关领域的重要科学问题和技术难题。
间充质干细胞表面表达多种细胞间粘附分子，以往的研究多关注于其参与细胞间的信号传递和间充质干细胞的免疫调节作用。然而，我们最新的研究发现其中一种细胞间粘附分子即细胞间粘附分子1(intercellular cell adhesion molecule, ICAM-1)能够调节间充质干细胞的分化方向。ICAM-1属粘附分子免疫球蛋白超家族(IgSF)，通过与淋巴细胞功能相关抗原-1(lymphocyte function associated antigen-1, LFA-1)、巨噬细胞分化抗原-1(macrophage 1 antigen,Mac-1)等受体结合，介导淋巴细胞粘附与迁移，在机体免疫过程和炎性反应中起重要作用。近来有研究表明ICAM-1是MSCs发挥免疫抑制作用的关键分子。然而，关于ICAM-1对于MSCs的分化能力是否具有调节作用及其作用机制却未见报道。本发明通过构建ICAM-1逆转录病毒表达载体，转染MSCs获得稳定过表达ICAM-1的MSCs，结果表明表达ICAM-1基因可显著抑制间充质干细胞分化为脂肪细胞，该发现为开展间质干细胞相关基因治疗及开发相关的药品奠定了基础。
发明内容
本发明的目的在于提供一种抑制间充质干细胞分化为脂肪细胞的方法。
一种抑制间充质干细胞分化为脂肪细胞的方法，构建含有ICAM-1基因的重组逆转录病毒表达质粒，然后加入包装质粒后共同转染包装细胞，收病毒上清并感染间充质干细胞，间充质干细胞中ICAM-1过表达抑制间充质干细胞分化为脂肪细胞；所述ICAM-1基因的DNA序列为SEQID NO:1所示核酸序列。
所述重组逆转录病毒表达质粒中原始的逆转录病毒表达质粒为MIGR1质粒。
所述包装质粒为ECOS质粒。
所述包装细胞为T293细胞。
所述间充质干细胞为人、小鼠、大鼠、兔、狗或猴间充质干细胞。
本发明分离方法操作简单、方便实用，转染间充质干细胞的效率高（可高表达ICAM-1达90%以上）、所得到的间充质干细胞体外增殖旺盛、可多次传代（传代培养50代后，仍然生长良好），并且具有极低地向脂肪细胞分化的能力。因此，本发明建立了稳定的抑制间充质干细胞分化为脂肪细胞的培养技术体系，为间充质干细胞的研究应用奠定了基础。
附图说明
图1为MIGR1-ICAM-1逆转录病毒载体的构建结果；
图1A为小鼠ICAM-1基因的PCR产物凝胶电泳结果：M: DNA MarkerIV；1: ICAM-1基因；
图1B为重组质粒pMD19-T-ICAM-1双酶切产物凝胶电泳结果：M: DNAMarker IV；1: MIGR1双酶切前；2: MIGR1双酶切后；3: pMD19-T-ICAM-1双酶切后；4: pMD19-T-ICAM-1双酶切前；
图1C为重组逆转录病毒表达质粒MIGR1-ICAM-1双酶切及PCR产物凝胶电泳结果：M: DNA Marker IV；1: MIGR1-ICAM-1双酶切后；2: MIGR1-ICAM-1双酶切前；3: 质粒MIGR1-ICAM-1为模板的PCR。
图2为高表达ICAM-1的MSCs细胞（C3H10T 1/2- MIGR1-ICAM-1）的建立；
图2A为MIGR1及MIGR1-ICAM-1病毒上清感染C3H10T 1/2细胞48h后荧光表达（标尺代表500μm）；
图2B为qPCR检测ICAM-1基因在MIGR1及MIGR1-ICAM-1病毒上清感染后C3H10T 1/2细胞中的表达；
图2C为流式检测ICAM-1蛋白在MIGR1及MIGR1-ICAM-1病毒上清感染后C3H10T 1/2细胞中的表达。
图3为高表达ICAM-1对MSC自然分化成脂功能的影响；
图3A为qPCR检测过表达ICAM-1对C3H10T 1/2细胞 C/EBPα和PPARγ表达水平的影响；
图3B为自分化14天后，油红O染色检测MIGR1及MIGR1-ICAM-1组脂肪滴的形成（标尺代表250μm）；
图3C为MIGR1及MIGR1-ICAM-1组相对脂滴数的统计。
图4为高表达ICAM-1对MSC受诱导分化成脂功能的影响；
图4A为qPCR检测过表达ICAM-1对C3H10T 1/2细胞 C/EBPα和PPARγ表达水平的影响；
图4B为诱导分化14天后，油红O染色检测MIGR1及MIGR1-ICAM-1组脂肪滴的形成（标尺代表250μm）；
图4C为MIGR1及MIGR1-ICAM-1组相对脂滴数的统计。
注：MIGR1代表MIGR1空载体病毒上清感染C3H10T 1/2，MIGR1-ICAM-1代表MIGR1-ICAM-1重组载体病毒上清感染C3H10T 1/2 。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明均为常规方法。
实施例1
MIGR1-ICAM-1逆转录病毒载体的构建
本实验中从Clonetech购买得到逆转录病毒载体（MIGR1）。
本实验中用到的原料如下：α-MEM培养基（Gibco，）、胎牛血清（Hyclone）、小鼠(军事医学科学院实验动物中心)、Trizol（Invitrogen）、PrimeScript逆转录试剂盒（Invitrogen）、TaqDNA聚合酶（Invitrogen）、mouse ICAM-1引物（上海生工）、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒（天根生化）、pMD19-T Simple Vector（大连宝生物）、大肠杆菌感受态细菌DH5α（Invitrogen）。
一、ICAM-1全长DNA片段的扩增
无菌分离小鼠脾脏，经碾磨、裂解红细胞，获得单个核细胞。取1×107小鼠脾脏单个核细胞于1.5ml EP管中，用Trizol法提取总RNA，根据PrimeScript逆转录试剂盒说明书，将脾细胞总RNA逆转录为cDNA，以mouse ICAM-1-F和mouse ICAM-1-R为引物并在TaqDNA聚合酶作用下进行PCR扩增。上游引物mouse ICAM-1-F：5’-GTTTAGATCTTCGCTGCTACCTGCACTTTG-3’；下游引物mouse ICAM-1-R：5’- GGAATTCTGGCTGAGGGTAAATGCTGTCTA-3’。
根据GeneBank数据库ICAM-1 mRNA序列(GI:30172560)，如SEQ IDNO:1所示。
在上下游引物的 5’端分别引入Bgl II与EcoR I的酶切位点，并加入保护碱基，由上海生工生物技术有限公司成。下划线部分分别为Bgl II和 EcoR I的酶切位点（如上所示），片段长度为1756bp。
反应条件：94℃预变性5min； 94℃变性40s、58℃退火40s、72℃延伸1min，循环40次；72℃延伸5min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定后按照普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒说明书对目的基因片段处理，获得纯化小鼠 ICAM-1基因全长DNA片段。
根据小鼠 ICAM-1 mRNA序列设计特异性的上游引物和下游引物，通过RT-PCR进行扩增，行1%琼脂糖凝胶电泳检测反应产物。所产生的条带与ICAM-1基因片段大小（1700bp ）一致，且条带清晰，无非特异性杂带，与预期结果一致（图1A）。
二、重组逆转录病毒表达载体MIGR1-ICAM-1的构建
按照pMD19-T Simple Vector说明书，将纯化的小鼠 ICAM-1全长DNA片段与pMD19-T连接，转化大肠杆菌感受态细菌DH5α，挑取单克隆扩增后，对重组质粒进行双酶切及DNA测序鉴定。对序列正确的重组质粒 pMD19-T-ICAM-1及逆转录病毒质粒MIGR1进一步酶切回收，构建重组逆转录病毒表达质粒MIGR1-ICAM-1。将连接产物转化大肠杆菌感受态细菌DH5α，挑取单克隆扩增后进行双酶切、PCR及DNA测序鉴定。取序列正确的重组质粒进行下一步研究，并命名为MIGR1-ICAM-1，-20℃保存备用。
根据pMD19-T Simple Vector说明书，将纯化的ICAM-1基因片段克隆到pMD19-T 载体上，对重组质粒进行双酶切，所得条带与预期结果一致（图1B），且DNA测序分析完全正确。质粒pMD19-T-ICAM-1与MIGR1经双酶切、连接、转化及Amp抗性筛选，从菌液中提取重组逆转录病毒表达质粒MIGR1-ICAM-1。对其进行双酶切，电泳显示获得目的片段1700bp和6200bp；以此质粒为模板加ICAM-1特异引物进行PCR，所得产物电泳条带与ICAM-1基因片段大小一致（图1C），表明目的片段已正确插入表达载体。为进一步验证实验结果的准确性，对双酶切及PCR鉴定结果均正确的质粒进行DNA测序分析。结果表明与基因文库中报道的小鼠ICAM-1基因序列完全相同，且插入方向正确，未改变小鼠ICAM-1基因的阅读框，保证了编码氨基酸序列的正确表达。由此证明重组逆转录病毒表达质粒MIGR1-ICAM-1构建成功。
实施例2
重组逆转录病毒表达质粒MIGR1-ICAM-1及空质粒MIGR1转染包装细胞293T和目的细胞间充质干细胞（ C3H10T 1/2）及ICAM-1表达效率的鉴定
本实验中从ATCC购买得到包装细胞（293T）和间充质干细胞（C3H10T1/2）。
本实验中用到的原料如下：包装质粒ECOS（Clonetech）、α-MEM培养基（Gibco）、胎牛血清（Hyclone）、LipofectamineTM 2000（Invitrogen）、Polybrene（Sigma）、SYBR Green JumpStartTM TaqReadyMixTM 试剂盒（Sigma）、PE标记的抗小鼠ICAM-1(anti-mouse ICAM-1 )和相应的同型对照抗体(IgG2a PE)（ebioscience）。
一、 重组逆转录病毒表达质粒MIGR1-ICAM-1及空质粒MIGR1转染293T细胞
转染前24h，消化293T细胞并计数，以1.5×106接种于6孔板中，使其转染时细胞融合率达80%~90%。按照LipofectamineTM 2000说明书的步骤，将重组逆转录病毒表达质粒MIGR1-ICAM-1及逆转录病毒表达质粒MIGR1分别加入包装质粒ECOS后转染293T细胞，所述MIGR1-ICAM-1重组逆转录病毒质粒浓度为1-5μg/ml，优选为2μg/ml；所述转染的时间为4-12hours，优选为6hours。
二、 重组逆转录病毒MIGR1-ICAM-1及逆转录病毒MIGR1感染C3H10T 1/2细胞
转染48h后，收获包装细胞T293产生的病毒上清，经0.45μm滤膜过滤并进行病毒滴度检测，筛选获得目的病毒留用于感染C3H10T 1/2细胞。消化C3H10T 1/2细胞并计数，以1.0×105密度接种于6孔板中，将病毒上清及Polybrene（终浓度为8μg/ml）加入6孔板中。感染48h后荧光倒置显微镜下观察C3H10T 1/2细胞中绿色荧光蛋白表达情况。
所述感染过程中使用的间充质干细胞培养基是向α-MEM培养基中添加胎牛血清，使胎牛血清的终浓度为5-20%（体积百分含量）得到的培养基；优选终浓度为10%，培养过程中，每隔24h，换一次新鲜的上述细胞培养基。
将收集的MIGR1-ICAM-1与MIGR1病毒上清分别感染C3H10T 1/2细胞，48h后在488nm波长激发光荧光倒置显微镜下观察，可见绝大多数细胞发出绿色荧光（图2A）。
三、 C3H10T 1/2感染后ICAM-1基因的表达鉴定
C3H10T 1/2细胞养基是向α-MEM培养基中添加胎牛血清，使胎牛血清的终浓度为10%（体积百分含量）得到的培养基，培养过程中，每隔24h，换一次新鲜的上述细胞培养基。
培养的条件为：温度为35-38℃、CO2浓度为5-15%（体积百分含量）、饱和湿度。
分别收集感染MIGR1-ICAM-1与MIGR1病毒上清且连续传15代以上的C3H10T 1/2细胞进行qPCR分析。
分别收集1.0×106对照空载体病毒及重组载体病毒感染后的C3H10T1/2细胞， Trizol法提取总RNA，根据PrimeScript逆转录试剂盒说明书，将总RNA逆转录为cDNA，以mouse ICAM-1-F：5’-GCTTCACACTTCACAGTTACTT-3’ 和mouse ICAM-1-R：5’- AGAGGACCTTAACAGTCTACAAC-3’为引物，利用SYBR Green JumpStartTM Taq ReadyMixTM 试剂盒并以60℃为退火温度进行real-time PCR。再收集4×105细胞/EP管（1.5ml），按照说明书要求， 加入PE标记的抗小鼠ICAM-1(anti-mouse ICAM-1 )和相应的同型对照抗体(IgG2a PE)，4℃避光孵育30分钟。用PBS洗细胞两遍，4℃离心机300g转速，流式细胞术上机分析。
结果显示：相比转染空载体MIGR1对照组，重组载体MIGR1-ICAM-1病毒感染后的C3H10T 1/2细胞ICAM-1mRNA表达水平显著提高19倍以上（图2B）。同时ICAM-1流式标记检测结果表明，转入MIGR1空载体的C3H10T 1/2细胞基本不表达ICAM-1， 而感染MIGR1-ICAM-1病毒上清的C3H10T 1/2细胞表面ICAM-1阳性率高达90%以上（图2C）。由此可知，在mRNA水平及蛋白水平的检测均证实重组载体MIGR1-ICAM-1病毒感染C3H10T 1/2细胞效果良好，可使其稳定过表达ICAM-1。
实施例3
检测高表达ICAM-1的间充质干细胞分化成为成脂肪细胞的功能
本实验中用到的原料如下：地塞米松（Sigma）、IBMX （Sigma）、胰岛素（Sigma）、高糖DMEM培养基（Gibco）、胎牛血清（Hyclone）、青霉素（Sigma）、链霉素（Sigma）、油红O（Sigma）、mouse C/EBPα和PPARγ引物（上海生工）。
成脂肪分化检测参照本实验室先前发表的方法进行（Zhu H, GuoZ K, Jiang X X, et al. A protocol for isolation and culture of mesenchymal stem cells from mouse compact bone. Nat Protoc, 2010, 5(3): 550-560.）。
收获过表达ICAM-1的细胞C3H10T 1/2- MIGR1-ICAM-1/MSC及对照细胞C3H10T 1/2- MIGR1/MSC，分别按照2×104/孔及1.0×106/孔种于48孔培养板和6孔培养板内，其中自分化组培养体系为高糖DMEM、10%FBS、100U/mL青霉素、100U/mL 链霉素。诱导分化组培养体系为在自分化组体培养体系中添加诱导剂（地塞米松10 ? 6 M、IBMX 0.5 μM、胰岛素10 ng/mL）；每2-3天半量换液，诱导7天后收集6孔板内的细胞，分别以小鼠C/EBPα-F：5’-TTGCGTTFTTTGGCTTTATCT-3； 小鼠C/EBPα-R：5-AGAAGTCGGTGGACAAGAAC-3’及小鼠PPARγ-F: 5-CAGCAGGTTGTCTTGGATGT-3； 小鼠PPARγ-R: 5-GAATTAGATGAC AGTGACTTGGCTA-3’为引物，采用SYBR Green JumpStartTM Taq ReadyMixTM 试剂盒并以60℃为退火温度进行real-time PCR检测。对48孔板内培养的细胞诱导14天后原位油红O染色。结果以平均数±标准差表示，组间比较采用Student’s t test。
C/EBPα和PPARγ是MSCs向脂肪细胞分化过程中的两个关键转录因子，它们的表达受到抑制可以直接抑制成脂分化。分别收集6孔板中的自分化组和诱导组细胞，行real-time PCR，结果显示C/EBPα及PPARγ在重组载体MIGR1-ICAM-1病毒上清感染后的C3H10T 1/2细胞中的表达水平均较空载体MIGR1感染组下调（图3A，4A），且具有显著差异性，其中C/EBPα，P﹤0.01；PPARγ，P﹤0.05。
油红O是一种特异性与脂滴结合的染料，可直观地显示细胞内脂滴的形态和数量。对C3H10T 1/2- MIGR1-ICAM-1/MSC和C3H10T 1/2- MIGR1/MSC成脂肪诱导14天后进行原位油红O染色，显微镜下观察脂滴的形态和数量。结果表明，无论是自分化组还是诱导分化组，C3H10T1/2- MIGR1-ICAM -1/MSC中脂滴明显比C3H10T 1/2- MIGR1/MSC中脂滴小（图3B，4B）。对其单个培养孔内的脂肪细胞数目计数，并进行统计学分析，结果显示MIGR1-ICAM-1/MSC脂滴数显著低于C3H10T1/2- MIGR1/MSC（图3C，4C），且差异具有统计学意义（P﹤0.01）。
以上结果表明过表达ICAM-1基因可抑制C3H10T 1/2细胞向脂肪细胞分化，其作用机制可能是通过下调关键转录因子C/EBPα和PPARγ完成的。
Claims (1)
1.一种抑制间充质干细胞分化为脂肪细胞的方法，其特征在于，构建含有ICAM-1基因的重组逆转录病毒表达质粒，然后加入包装质粒后共同转染包装细胞，收病毒上清并感染间充质干细胞，间充质干细胞中ICAM-1过表达抑制间充质干细胞分化为脂肪细胞；所述ICAM-1基因的DNA序列为SEQ ID NO:1所示核酸序列；所述重组逆转录病毒表达质粒中原始的逆转录病毒表达质粒为MIGR1质粒；所述包装质粒为ECOS质粒；所述包装细胞为T293细胞；所述间充质干细胞为小鼠间充质干细胞。
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