CN106350484B - 一种提高骨髓间充质干细胞成脂分化效率的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种提高骨髓间充质干细胞成脂分化效率的方法，包括MSC的提取及原代培养、MSC的传代培养和MSC的成脂分化表征。该方法控制细胞传代培养时培养液的更换量以及细胞的培养周期，得到不同数量的脂肪细胞，从而在不含有诱导因子的情况下仍能在聚苯乙烯细胞培养基底表面获得很高的MSC成脂分化效率。该方法具有体系简单、不含有额外生物因子、无细胞毒性、重复性高等特点。此方法能满足干细胞的体外培养以及临床应用的需求。

Description

一种提高骨髓间充质干细胞成脂分化效率的方法
技术领域
本发明涉及一种提高骨髓间充质干细胞成脂分化效率的方法，具体涉及一种在不添加诱导剂的情况下，通过改变细胞培养液的更换方式来提高商品化的细胞培养基底表面的骨髓间充质干细胞的成脂分化效率的方法。本发明属于干细胞分化与生物医学领域。
背景技术
干细胞是一类具有很强的自我更新能力以及多向分化潜能的细胞，且在一定的条件下可以分化成为不同的组织细胞类型。因此，干细胞已成为组织修复中的一种理想的种子细胞类型，在组织工程研究中发挥着举足轻重的作用(Nature, 2009, 462: 433)。按照发生学来源，干细胞可分为胚胎干细胞和成体干细胞，而后者又主要包括造血干细胞、骨髓间充质干细胞、神经干细胞、表皮干细胞等。其中，骨髓间充质干细胞(MSC)来源广泛，容易提取并进行体外培养和增殖，且能够向成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞、神经细胞、内皮细胞等方向进行分化，因此被认为是再生医学研究中应用前景最好的干细胞类型(Nat. Rev. Immunol., 2008, 8: 726)。
在调控干细胞分化时，比较传统的做法是向细胞培养体系中添加一些生物分子来作为诱导剂以促进干细胞的定向分化。比如，MSC成骨分化的诱导因子一般包括地塞米松、â-甘油磷酸钠、抗坏血酸盐等，而成脂分化的诱导因子一般包括地塞米松、吲哚美辛、胰岛素、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤等(Science, 1999, 284: 143)。在MSC进行成骨分化的过程中，碱性磷酸酶(ALP)、I型胶原(Col I)、骨钙蛋白(OCN)、骨桥蛋白(OPN)的表达上调，同时伴随着大量钙磷盐的沉积以及钙结节的形成和成熟；在MSC向脂肪细胞分化的过程中，细胞内的脂肪滴大量积聚，脂蛋白脂肪酶(LPL)、过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)等表达随之增强。
目前，干细胞领域的工作者们普遍使用的商品化的细胞培养基底主要为聚苯乙烯材质的细胞培养板、培养瓶、培养皿等。众所周知，这些基底的硬度较大，力学性能与骨组织较为接近，而基底的硬度对干细胞分化有着显著的影响(Cell, 2006, 126: 677)。因此，这就造成了MSC在这些基底表面容易发生成骨分化，即便在基础培养基中也有自发成骨的趋势；相反，向脂肪细胞的分化则变得极其困难，即便是在添加诱导因子并延长诱导时间的情况下，成脂分化的细胞比例仍然微乎其微(Nat. Mater., 2014, 13: 645)。这是商品化的细胞培养基底在干细胞分化的研究中存在的一个不可忽视的“缺陷”。
经过足够多的干细胞培养之后，我们总结出一个不成文的经验：当营养物质充足、细胞状态较好时，MSC会倾向于成骨分化；而当营养物质耗尽、细胞状态相对较差时，成脂分化却得到了促进。基于这个经验，如果从MSC培养时的换液方式入手，或许可以找到一系列提高MSC在聚苯乙烯细胞培养基底表面的成脂分化效率的方法。这对于干细胞生物学的发展以及干细胞在临床上的应用都将具有重大的推动作用。
发明内容
本发明的目的在于针对MSC在商品化的细胞培养基底表面的成脂分化效率低下的不足，通过改变细胞培养液的更换方式，提供一种能大幅度提高MSC成脂分化比例的方法。该方法控制细胞传代培养时培养液的更换量以及细胞的培养周期，得到不同数量的脂肪细胞，从而在不含有诱导因子的情况下仍能获得很高的MSC成脂分化效率。该方法具有体系简单、不含有额外生物因子、无细胞毒性、重复性高等特点。此方法能满足干细胞的体外培养以及临床应用的需求。
为实现上述目的，本发明的具体技术方案如下：
一种提高骨髓间充质干细胞成脂分化效率的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1) MSC的提取及原代培养
选取大鼠骨髓间充质干细胞作为细胞模型，利用全骨髓贴壁法从新生SD大鼠的胫骨和股骨骨髓腔中提取MSC并进行培养，MSC的培养液为含有体积比10%胎牛血清(FBS)、100U/mL青霉素、100g/mL链霉素以及2mM L-谷氨酰胺的低糖DMEM培养基，MSC提取后置于37℃、5% CO2的培养箱中进行原代培养，每2-3天进行更换一次新的培养液，直至MSC基本铺满培养瓶底，然后进行传代培养，传代时间不需要过早；
(2) MSC的传代培养
在进行细胞传代时，首先进行消化和离心操作，在离心结束后，吸出上层清液，即原先的细胞培养液，并不丢弃，而是将其与新配制的细胞培养液按一定的体积比进行混合，然后重新加入离心管后进行重悬，并将MSC接种在聚苯乙烯细胞培养基底表面，继续在37℃和5% CO2的条件下进行MSC培养，待MSC接近长满后重复进行传代操作；
(3) MSC的成脂分化表征
经过一段时间的培养之后，对MSC进行油红染色来检测脂肪细胞特异性表达物脂肪滴的产生和积聚以表征MSC成脂分化程度，首先用4%多聚甲醛对细胞进行固定，然后用3mg/mL油红/异丙醇溶液进行脂肪滴染色，最后以2 g/mL的DAPI溶液进行细胞核染色，于倒置荧光显微镜下进行观察和分析，统计出成脂分化的细胞数占细胞总数的百分比。
所述的传代时原先的细胞培养液与新配制的细胞培养液的混合体积比为20:80-80:20。
所述的所述的传代操作可进行2-8次。
所述的聚苯乙烯细胞培养基底可以为细胞培养板、细胞培养瓶、细胞培养皿。本发明的优点在于：
(1) 本发明在不添加任何生物因子的情况下，仅通过细胞培养液的更换方式的改变来提高MSC在细胞培养基底表面的成脂分化效率。培养体系生物安全性高，培养基为商业化产品。
(2) 本发明方法所涉及的细胞培养体系简单、无细胞毒性，且此方法的重复性高。
(3) 本发明方法工艺简单，可操作性强，能进一步满足干细胞的临床应用需求。
附图说明
图1为实施例1中经过培养和油红染色后的细胞在倒置荧光显微镜下的明场图片。
图2为实施例2中经过培养和油红染色后的细胞在倒置荧光显微镜下的明场图片。
图3为实施例3中经过培养和油红染色后的细胞在倒置荧光显微镜下的明场图片。
具体实施方式
以下通过具体的实施例对本发明的技术方案作进一步描述。以下的实施例是对本发明的进一步说明，而不限制本发明的范围。
实施例1
选取大鼠骨髓间充质干细胞作为细胞模型，利用全骨髓贴壁法从新生SD大鼠的胫骨和股骨骨髓腔中提取MSC并进行培养。MSC的培养液为含有10%（体积比）胎牛血清(FBS)、100 U/mL青霉素、100微克/毫升链霉素以及2 mM L-谷氨酰胺的低糖DMEM培养基。MSC提取后置于37 °C、5% CO2的培养箱中进行原代培养，每2~3天进行更换一次新的培养液，直至MSC基本铺满培养瓶底，然后进行传代培养。传代时间不需要过早。
在进行细胞传代时，首先进行消化和离心操作，在离心结束后，吸出上层清液，即原先的细胞培养液，并不丢弃，而是将其与新配制的细胞培养液按80:20的体积比进行混合，然后重新加入离心管后进行重悬，并将MSC接种在细胞培养瓶表面，继续在37 °C和5%CO2的条件下进行MSC培养。待MSC接近长满后重复进行传代操作。
经过3次传代培养之后，对MSC进行油红染色来检测脂肪细胞特异性表达物脂肪滴的产生和积聚以表征MSC成脂分化程度。首先用4%多聚甲醛对细胞进行固定，然后用3 mg/mL油红/异丙醇溶液进行脂肪滴染色，最后以2微克/毫升的DAPI溶液进行细胞核染色，于倒置荧光显微镜下进行观察和分析。统计出成脂分化的细胞数占细胞总数的百分比。
实施例2
选取大鼠骨髓间充质干细胞作为细胞模型，利用全骨髓贴壁法从新生SD大鼠的胫骨和股骨骨髓腔中提取MSC并进行培养。MSC的培养液为含有10%（体积比）胎牛血清(FBS)、100 U/mL青霉素、100微克/毫升链霉素以及2 mM L-谷氨酰胺的低糖DMEM培养基。MSC提取后置于37 °C、5% CO2的培养箱中进行原代培养，每2~3天进行更换一次新的培养液，直至MSC基本铺满培养瓶底，然后进行传代培养。传代时间不需要过早。
在进行细胞传代时，首先进行消化和离心操作，在离心结束后，吸出上层清液，即原先的细胞培养液，并不丢弃，而是将其与新配制的细胞培养液按50:50的体积比进行混合，然后重新加入离心管后进行重悬，并将MSC接种在细胞培养皿表面，继续在37 °C和5%CO2的条件下进行MSC培养。待MSC接近长满后重复进行传代操作。
经过5次传代培养之后，对MSC进行油红染色来检测脂肪细胞特异性表达物脂肪滴的产生和积聚以表征MSC成脂分化程度。首先用4%多聚甲醛对细胞进行固定，然后用3 mg/mL油红/异丙醇溶液进行脂肪滴染色，最后以2微克/毫升的DAPI溶液进行细胞核染色，于倒置荧光显微镜下进行观察和分析。统计出成脂分化的细胞数占细胞总数的百分比。
实施例3
选取大鼠骨髓间充质干细胞作为细胞模型，利用全骨髓贴壁法从新生SD大鼠的胫骨和股骨骨髓腔中提取MSC并进行培养。MSC的培养液为含有10%（体积比）胎牛血清(FBS)、100 U/mL青霉素、100微克/毫升链霉素以及2 mM L-谷氨酰胺的低糖DMEM培养基。MSC提取后置于37 °C、5% CO2的培养箱中进行原代培养，每2~3天进行更换一次新的培养液，直至MSC基本铺满培养瓶底，然后进行传代培养。传代时间不需要过早。
在进行细胞传代时，首先进行消化和离心操作，在离心结束后，吸出上层清液，即原先的细胞培养液，并不丢弃，而是将其与新配制的细胞培养液按20:80的体积比进行混合，然后重新加入离心管后进行重悬，并将MSC接种在细胞培养板表面，继续在37 °C和5%CO2的条件下进行MSC培养。待MSC接近长满后重复进行传代操作。
经过7次传代培养之后，对MSC进行油红染色来检测脂肪细胞特异性表达物脂肪滴的产生和积聚以表征MSC成脂分化程度。首先用4%多聚甲醛对细胞进行固定，然后用3 mg/mL油红/异丙醇溶液进行脂肪滴染色，最后以2微克/毫升的DAPI溶液进行细胞核染色，于倒置荧光显微镜下进行观察和分析。统计出成脂分化的细胞数占细胞总数的百分比。

Claims (3)

1.一种提高骨髓间充质干细胞成脂分化效率的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）选取大鼠骨髓间充质干细胞作为细胞模型，利用全骨髓贴壁法从新生SD大鼠的胫骨和股骨骨髓腔中提取MSC并进行培养，MSC的培养液为含有10%（体积比）胎牛血清(FBS)、100 U/mL青霉素、100 μg/mL链霉素以及2 mM L-谷氨酰胺的低糖DMEM培养基，MSC提取后置于37 °C、5% CO2的培养箱中进行原代培养，每2~3天进行更换一次新的培养液，直至MSC基本铺满培养瓶底，然后进行传代培养，传代时间不需要过早；
（2）在进行细胞传代时，首先进行消化和离心操作，在离心结束后，吸出上层清液，即原先的细胞培养液，并不丢弃，而是将其与新配制的细胞培养液按80:20的体积比进行混合，然后重新加入离心管后进行重悬，并将MSC接种在细胞培养瓶表面，继续在37 °C和5% CO2的条件下进行MSC培养，待MSC接近长满后重复进行传代操作；
（3）经过3次传代培养之后，对MSC进行油红染色来检测脂肪细胞特异性表达物脂肪滴的产生和积聚以表征MSC成脂分化程度，首先用4%多聚甲醛对细胞进行固定，然后用3 mg/mL油红/异丙醇溶液进行脂肪滴染色，最后以2 μg/mL的DAPI溶液进行细胞核染色，于倒置荧光显微镜下进行观察和分析，统计出成脂分化的细胞数占细胞总数的百分比。
2.一种提高骨髓间充质干细胞成脂分化效率的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）选取大鼠骨髓间充质干细胞作为细胞模型，利用全骨髓贴壁法从新生SD大鼠的胫骨和股骨骨髓腔中提取MSC并进行培养，MSC的培养液为含有10%（体积比）胎牛血清(FBS)、100 U/mL青霉素、100 μg/mL链霉素以及2 mM L-谷氨酰胺的低糖DMEM培养基，MSC提取后置于37 °C、5% CO2的培养箱中进行原代培养，每2~3天进行更换一次新的培养液，直至MSC基本铺满培养瓶底，然后进行传代培养，传代时间不需要过早；
（2）在进行细胞传代时，首先进行消化和离心操作，在离心结束后，吸出上层清液，即原先的细胞培养液，并不丢弃，而是将其与新配制的细胞培养液按50:50的体积比进行混合，然后重新加入离心管后进行重悬，并将MSC接种在细胞培养皿表面，继续在37 °C和5% CO2的条件下进行MSC培养，待MSC接近长满后重复进行传代操作；
（3）经过5次传代培养之后，对MSC进行油红染色来检测脂肪细胞特异性表达物脂肪滴的产生和积聚以表征MSC成脂分化程度，首先用4%多聚甲醛对细胞进行固定，然后用3 mg/mL油红/异丙醇溶液进行脂肪滴染色，最后以2 μg/mL的DAPI溶液进行细胞核染色，于倒置荧光显微镜下进行观察和分析，统计出成脂分化的细胞数占细胞总数的百分比。
3.一种提高骨髓间充质干细胞成脂分化效率的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）选取大鼠骨髓间充质干细胞作为细胞模型，利用全骨髓贴壁法从新生SD大鼠的胫骨和股骨骨髓腔中提取MSC并进行培养，MSC的培养液为含有10%（体积比）胎牛血清(FBS)、100 U/mL青霉素、100 μg/mL链霉素以及2 mM L-谷氨酰胺的低糖DMEM培养基，MSC提取后置于37 °C、5% CO2的培养箱中进行原代培养，每2~3天进行更换一次新的培养液，直至MSC基本铺满培养瓶底，然后进行传代培养，传代时间不需要过早；
（2）在进行细胞传代时，首先进行消化和离心操作，在离心结束后，吸出上层清液，即原先的细胞培养液，并不丢弃，而是将其与新配制的细胞培养液按20:80的体积比进行混合，然后重新加入离心管后进行重悬，并将MSC接种在细胞培养板表面，继续在37 °C和5% CO2的条件下进行MSC培养，待MSC接近长满后重复进行传代操作；
（3）经过7次传代培养之后，对MSC进行油红染色来检测脂肪细胞特异性表达物脂肪滴的产生和积聚以表征MSC成脂分化程度，首先用4%多聚甲醛对细胞进行固定，然后用3 mg/mL油红/异丙醇溶液进行脂肪滴染色，最后以2 μg/mL的DAPI溶液进行细胞核染色，于倒置荧光显微镜下进行观察和分析，统计出成脂分化的细胞数占细胞总数的百分比。
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