CN103100109B - 负载万古霉素/明胶微球的丝素蛋白复合支架及其制备方法 - Google Patents
负载万古霉素/明胶微球的丝素蛋白复合支架及其制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种负载万古霉素/明胶微球的丝素蛋白复合支架及其制备方法。本发明将10～50mg/ml万古霉素溶液加到明胶微球中，于4～25℃放置过夜后冷冻干燥，得到万古霉素/明胶微球复合物；然后将万古霉素/明胶微球复合物加入2～10wt%丝素蛋白溶液中，搅拌均匀，冷冻干燥，得到负载万古霉素/明胶微球的丝素蛋白复合支架；将万古霉素与明胶微球复合后负载在丝素蛋白多孔支架上，能达到缓释药物、延长药效的作用，降低了万古霉素对人体的伤害，抗菌效果明显。制备得到的丝素蛋白支架孔隙率为75～95%，孔径为50～200μm。本发明的制备工艺简单、材料来源广泛，生产效率高，成本低，可应用于工业化大生产。
Description
技术领域
本发明属于高分子材料技术领域，特别涉及一种负载万古霉素/明胶微球的丝素蛋白复合支架及其制备方法。
背景技术
丝素蛋白是蚕丝脱胶后得到的天然高分子纤维蛋白，是一种疏水性的蛋白质，具有良好的生物相容性，而且来源丰富，成本低廉，是一种优良的天然的高分子材料。
丝素蛋白，由于其优异的力学性能、良好的韧性，热稳定性、高透氧性和结构的稳定性，特别是其三维多孔支架的形态，一直以来被广泛运用在组织工程领域上，例如软骨修复、网状结缔组织修复、骨修复和神经修复等方面。丝素具有独特的分子结构、良好的生物相容性以及良好的加工性能，可加工成粉体、凝胶、微球、多孔支架、纳米纤维和膜，用于人工器官及其他复合材料的研制，具有广泛的应用前景。
明胶，胶原的衍生物，具有良好的生物相容性，例如能够被人体完全吸收，没有抗原性，已经广泛被运用在生物医学和药物载体等方面上，而且经临床研究证明，胶原具有生物安全性。胶原的结构上具有一系列的官能团，例如氨基酸，因此能够用在骨修复，或者通过一系列的化学改性方法，对其进行改性。但是胶原的力学性能差，从而限制了其在生物医学上的使用。
万古霉素，窄谱性抗生素，对其它抗菌药耐药或疗效差的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、肠球菌特别有效。但是由于万古霉素一般通过静脉给药的方式，长时间的肠胃外投药，将对引起呕吐、耳毒性、肾毒性等不良反应。
近年来，利用丝素蛋白作为三维支架，在组织工程和药物载体上的应用和研究成为了热点；而明胶早已广泛利用在生物医学和药物载体上；另一方面，如何改善万古霉素在人体的投药方式和达到缓释的效果，也是研究人员所关注的问题。
发明内容
本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种负载万古霉素/明胶微球的丝素蛋白复合支架的制备方法。该方法将万古霉素与明胶微球复合后负载在丝素蛋白多孔支架上，能达到缓释药物、延长药效的作用，降低了万古霉素对人体的伤害，抗菌效果明显。
本发明的另一目的在于提供由上述制备方法得到的负载万古霉素/明胶微球的丝素蛋白复合支架。
本发明的再一目的在于提供所述的负载万古霉素/明胶微球的丝素蛋白复合支架的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：一种负载万古霉素/明胶微球的丝素蛋白复合支架的制备方法，包括如下步骤：
（1）将10～50mg/ml万古霉素溶液加到明胶微球中，于4～25℃放置过夜后冷冻干燥，得到万古霉素/明胶微球复合物；每克明胶微球加入万古霉素溶液2～10ml；
（2）将步骤（1）的万古霉素/明胶微球复合物加入2～10wt%丝素蛋白溶液中，搅拌均匀，冷冻干燥，得到负载万古霉素/明胶微球的丝素蛋白复合支架；每毫升丝素蛋白溶液加入5mg万古霉素/明胶微球复合物；
步骤（1）中：
所述的10～50mg/ml万古霉素溶液优选采用以下方法进行制备：将万古霉素溶于去离子水中，搅拌均匀，得到10～50mg/ml万古霉素溶液；
所述的明胶微球优选为多孔明胶微球；
所述的明胶微球的粒径优选为5～30μm，膨胀率优选为400～500%；
所述的明胶微球优选采用以下方法进行制备：将0.1g山梨糖醇酐油酸酯（斯盘-80，Span80）加到盛有80ml植物油的烧瓶中，于60℃搅拌0.5～5h后加入10wt%明胶水溶液10ml，继续搅拌180min后冰浴搅拌15min，然后加入25wt%戊二醛水溶液0.1ml，继续搅拌2h，加入4℃丙酮40ml，搅拌15min，静置，过滤，得到微球；将微球泡在10ml丙酮中，于4℃固化24h后用1mol/L氨基乙酸浸泡30min，离心，取沉淀，用丙酮和异丙酮洗涤的沉淀，将沉淀置于去离子水中浸泡过夜，冷冻干燥，得到明胶微球；
所述的搅拌的速度优选为300～400r/min；
所述的离心的条件优选为于25℃、10000r/min离心10min；
所述的冷冻干燥的条件优选为-60℃冷冻干燥24h；
步骤（2）中：
所述的2～10wt%丝素蛋白溶液优选采用以下方法进行制备：将蚕茧加入100℃0.2wt%NaCO3水溶液中煮2h，100ml0.2wt%NaCO3水溶液加入1g蚕茧，脱胶后用去离子水清洗丝素至中性，于60℃烘干，得到丝素蛋白；取丝素蛋白，加入9.8mol/L溴化锂水溶液中，40～60℃水浴加热3～5h后用去离子水透析2～4天，离心，得到2～10wt%丝素蛋白溶液；
所述的蚕茧优选为去蛹的蚕茧；
所述的透析优选采用截留分子量为8000～12000的透析袋进行透析；
所述的离心的条件优选为于25℃、10000r/min离心10min；
所述的丝素蛋白溶液优选为3～7wt％丝素蛋白溶液；
所述的冷冻干燥的条件优选为-60℃冷冻干燥24h；
所述的负载万古霉素/明胶微球的丝素蛋白复合支架的孔隙率优选为75～95%，孔径优选为50～200μm；
一种负载万古霉素/明胶微球的丝素蛋白复合支架，由上述制备方法得到；
所述的负载万古霉素/明胶微球的丝素蛋白复合支架应用于皮肤伤口愈合、伤口敷料或骨修复等技术领域。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
（1）本发明将万古霉素与明胶微球复合后负载在丝素蛋白多孔支架上，能达到缓释药物、延长药效的作用，降低了万古霉素对人体的伤害，抗菌效果明显。制备得到的明胶微球粒径为5～30μm，膨胀率为400～500%；制备得到的丝素蛋白支架孔隙率为75～95%，孔径为50～200μm。
（2）本发明的制备工艺简单、材料来源广泛，生产效率高，成本低，可应用于工业化大生产。
附图说明
图1是对比实施例1的丝素蛋白多孔支架扫描电镜图。
图2是实施例1的多孔明胶微球的扫描电镜图。
图3是实施例子1的负载万古霉素/明胶微球的丝素蛋白复合支架的扫描电镜图。
图4是对比实施例2的负载万古霉素的丝素蛋白多孔复合支架和实施例1的负载万古霉素/明胶微球的丝素蛋白复合支架的万古霉素释放图；其中：a为对比实施例2的负载万古霉素的丝素蛋白多孔复合支架的万古霉素释放图；b为实施例1的负载万古霉素/明胶微球的丝素蛋白复合支架的万古霉素释放图。
图5是对比实施例子1的丝素蛋白多孔支架、对比实施例2的负载万古霉素的丝素蛋白多孔复合支架和实施例1的负载万古霉素/明胶微球的丝素蛋白复合支架对金黄色葡萄球菌的抗菌环效果图；其中：a为对比实施例子1的丝素蛋白多孔支架的抗菌效果图；b为实施例1的负载万古霉素/明胶微球的丝素蛋白复合支架对金黄色葡萄球菌的抗菌效果图；c为对比实施例2的负载万古霉素的丝素蛋白多孔复合支架的抗菌效果图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
（1）将去蛹的蚕茧4g在100℃的0.2wt%NaCO3水溶液400ml中煮2h，
脱胶后用去离子水清洗丝素至中性，置于60℃的烘箱中烘干，得到丝素蛋白；
取2.5g丝素蛋白加入25ml、9.8mol/L的溴化锂水溶液中，60℃水浴加热5h后用去离子水透析（透析袋的截留分子量为8000，透析时间为3天，每天换水一次），然后于25℃、10000r/min离心10min，得到3.5wt%丝素蛋白溶液；
（2）将0.1gSpan80加入盛有80ml的植物油的烧瓶中，于60℃、400r/min搅拌0.5h后加入10wt%明胶水溶液10ml，继续搅拌180min后冰浴搅拌15min，然后加入25wt%戊二醛水溶液0.1ml，继续搅拌2h，加入4℃丙酮40ml，搅拌15min，静置，过滤，得到微球；将微球泡在10ml丙酮中，于4℃固化24h后用1mol/L氨基乙酸浸泡30min，然后于25℃、10000r/min离心10min，取沉淀，用丙酮和异丙酮洗涤的沉淀，将沉淀置于去离子水中浸泡过夜，-60℃冷冻干燥24h，得到明胶微球；如图2所示，明胶微球粒径为5～30μm，膨胀率为400～500%；
（3）将100μl、25mg/ml的万古霉素滴加于0.05g步骤（2）的明胶微球中，于4℃放置过夜，-60℃冷冻干燥24h，得到万古霉素/明胶微球复合物；
（4）将5mg步骤（3）的万古霉素/明胶微球复合物加入1ml步骤（1）的3.5wt%丝素蛋白溶液中，搅拌均匀，-60℃冷冻干燥24h，得到负载万古霉素/明胶微球的丝素蛋白复合支架；负载万古霉素/明胶微球的丝素蛋白复合支架的扫描电镜图如图3所示；
（5）将步骤（4）的负载万古霉素/明胶微球的丝素蛋白复合支架置于pH=7.4的PBS溶液中，刚开始时每隔4h取样一次，12h后每隔12h取样一次，24后每隔24h取样一次，每次取样2ml，测试万古霉素的释放效果；结果如图4所示，从图4可以看出，负载万古霉素/明胶微球复合物具有药物缓释作用，药物释放时间长达144h；
（6）将步骤（4）的负载万古霉素/明胶微球的丝素蛋白复合支架置于涂有金黄色葡萄球菌的固体培养基上，37℃放置过夜，进行抗菌环实验，观察负载万古霉素/明胶微球的丝素蛋白复合支架的抗菌效果；结果如图5所示；抗菌环的直径为：26.4mm，从图5可以看出，负载万古霉素/明胶微球的丝素蛋白复合支架具有较好的抗菌效果。
实施例2
（1）将去蛹的蚕茧4g在100℃的0.2wt%NaCO3水溶液400ml中煮2h，脱胶后用去离子水清洗丝素至中性，置于60℃的烘箱中烘干得到丝素蛋白；取1g丝素蛋白加入25ml、9.8mol/L的溴化锂水溶液中，60℃水浴加热3h后用去离子水透析（透析袋的截留分子量为10000，透析时间为3天，每天换水一次），然后于25℃、10000r/min离心10min，得到2wt%丝素蛋白溶液；
（2）将0.1gSpan80加入盛有80ml的植物油的烧瓶中，于60℃、400r/min搅拌2.5h后加入10wt%明胶水溶液10ml，继续搅拌180min后冰浴搅拌15min，然后加入25wt%戊二醛水溶液0.1ml，继续搅拌2h，加入4℃丙酮40ml，搅拌15min，静置，过滤，得到微球；将微球泡在10ml丙酮中，于4℃固化24h后用1mol/L氨基乙酸浸泡30min，然后于25℃、10000r/min离心10min，取沉淀，用丙酮和异丙酮洗涤的沉淀，将沉淀置于去离子水中浸泡过夜，-60℃冷冻干燥24h，得到明胶微球；
（3）将200μl、10mg/ml的万古霉素滴加于0.05g步骤（2）的明胶微球中，于4℃放置过夜，-60℃冷冻干燥24h，得到万古霉素/明胶微球复合物；
（4）将5mg步骤（3）的万古霉素/明胶微球复合物加入1ml步骤（1）的2wt%丝素蛋白溶液中，搅拌均匀，-60℃冷冻干燥24h，得到负载万古霉素/明胶微球的丝素蛋白复合支架。
实施例3
（1）将去蛹的蚕茧4g在100℃的0.2wt%NaCO3水溶液400ml中煮2h，脱胶后用去离子水清洗丝素至中性，置于60℃的烘箱中烘干，得到丝素蛋白；取7.5g丝素蛋白加入25ml、9.8mol/L的溴化锂水溶液中，60℃水浴加热4h后用去离子水透析（透析袋的截留分子量为12000，透析时间为3天，每天换水一次），然后于25℃、10000r/min离心10min，得到10wt％丝素蛋白溶液；
（2）将0.1g Span80加入盛有80ml的植物油的烧瓶中，于60℃、400r/min搅拌5h后加入10wt%明胶水溶液10ml，继续搅拌180min后冰浴搅拌15min，然后加入25wt%戊二醛水溶液0.1ml，继续搅拌2h，加入4℃丙酮40ml，搅拌15min，静置，过滤，得到微球；将微球泡在10ml丙酮中，于4℃固化24h后用1mol/L氨基乙酸浸泡30min，然后于25℃、10000r/min离心10min，取沉淀，用丙酮和异丙酮洗涤的沉淀，将沉淀置于去离子水中浸泡过夜，-60℃冷冻干燥24h，得到明胶微球；
（3）将500μl、50mg/ml的万古霉素滴加于0.05g步骤（2）的明胶微球中，于4℃放置过夜，-60℃冷冻干燥24h，得到万古霉素/明胶微球复合物；
（4）将5mg步骤（3）的万古霉素/明胶微球复合物加入1ml步骤（1）的10wt%丝素蛋白溶液中，搅拌均匀，-60℃冷冻干燥24h，得到负载万古霉素/明胶微球的丝素蛋白复合支架。
对比实施例1
（1）将去蛹的蚕茧4g在100℃的0.2wt%NaCO3水溶液400ml中煮2h，脱胶后用去离子水清洗丝素至中性，置于60℃的烘箱中烘干，得到丝素蛋白；取2.5g丝素蛋白加入25ml、9.8mol/L的溴化锂水溶液中，60℃水浴加热5h后用去离子水透析（透析袋的截留分子量为10000，透析时间为3天，每天换水一次），然后于25℃、10000r/min离心10min，得到3.5wt%丝素蛋白溶液；
（2）取步骤（1）的3.5wt％丝素蛋白溶液，-60℃冷冻干燥24h，得到丝素蛋白多孔支架；丝素蛋白多孔支架的孔隙率为75～95%，孔径为50～200μm；丝素蛋白多孔支架的扫描电镜图如图1所示；
（3）将步骤（2）的丝素蛋白多孔支架放置于涂有金黄色葡萄球菌的固体培养基上，37℃放置过夜，进行抗菌环实验，观察丝素蛋白支架的抗菌效果；从抗菌环实验可以看到，丝素蛋白多孔支架没有抗菌效果，结果如图5所示。
对比实施例2
（1）将去蛹的蚕茧4g在100℃的0.2wt%NaCO3水溶液400ml中煮2h，脱胶后用去离子水清洗丝素至中性，置于60℃的烘箱中烘干，得到丝素蛋白；取2.5g丝素蛋白加入25ml、9.8mol/L的溴化锂水溶液中，60℃水浴加热5h后用去离子水透析（透析袋的截留分子量为8000，透析时间为3天，每天换水一次），然后于25℃、10000r/min离心10min，得到3.5wt%丝素蛋白溶液；
（2）取步骤（1）的3.5wt%丝素蛋白溶液，-60℃冷冻干燥24h，得到丝素蛋白多孔支架；丝素蛋白多孔支架的孔隙率为75～95%，孔径为50～200μm；
（3）将50μl、25mg/ml万古霉素滴加于0.025g步骤（2）的丝素蛋白多孔支架上，37℃放置过夜，-60℃冷冻干燥24h，得到负载有万古霉素的丝素蛋白多孔复合支架；
（4）将步骤（3）的负载万古霉素的丝素蛋白多孔复合支架放置于pH=7.4的PBS溶液中，每隔一段时间，取样2ml测试万古霉素的释放效果；结果如图4所示，由图4可以看到，负载万古霉素的丝素蛋白多孔复合支架的万古霉素的释放时间为48h；由于万古霉素是通过直接滴加到丝素蛋白支架上的，所以负载万古霉素的丝素蛋白多孔复合支架没有缓释功能或者说缓释效果很弱，所以在4h内，释放率接近80%，并在48h后释放完全。
（5）将步骤（3）的负载万古霉素的丝素蛋白多孔复合支架放置于涂有金黄色葡萄球菌的固体培养基上，37℃放置过夜，进行抗菌环实验，观察负载万古霉素的丝素蛋白多孔复合支架的抗菌效果；抗菌环的直径为28.5mm，结果如图5所示；从图5可以看到，负载万古霉素的丝素蛋白多孔复合支架的抗菌效果具有一定的抗菌效果。由于万古霉素是通过直接滴加到丝素蛋白支架上的，万古霉素的释放量大，所以其抗菌效果比负载万古霉素/明胶微球的丝素蛋白复合支架好，但是两者都达到抗菌的要求，而且负载万古霉素/明胶微球的丝素蛋白复合支架具有缓释药物的功能，所以其长期抗菌效果会更加优越。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (7)
1.一种负载万古霉素/明胶微球的丝素蛋白复合支架的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)将10～50mg/ml万古霉素溶液加到明胶微球中，于4～25℃放置过夜后冷冻干燥，得到万古霉素/明胶微球复合物；每克明胶微球加入万古霉素溶液2～10ml；
(2)将步骤(1)的万古霉素/明胶微球复合物加入2～10wt％丝素蛋白溶液中，搅拌均匀，冷冻干燥，得到负载万古霉素/明胶微球的丝素蛋白复合支架；每毫升丝素蛋白溶液加入5mg万古霉素/明胶微球复合物。
2.根据权利要求1所述的负载万古霉素/明胶微球的丝素蛋白复合支架的制备方法，其特征在于：步骤(1)中所述的10～50mg/ml万古霉素溶液采用以下方法进行制备：将万古霉素溶于去离子水中，搅拌均匀，得到10～50mg/ml万古霉素溶液。
3.根据权利要求1所述的负载万古霉素/明胶微球的丝素蛋白复合支架的制备方法，其特征在于：步骤(1)中所述的明胶微球的粒径为5～30μm，膨胀率为400～500％。
4.根据权利要求1所述的负载万古霉素/明胶微球的丝素蛋白复合支架的制备方法，其特征在于：步骤(1)中所述的明胶微球采用以下方法进行制备：将0.1g山梨糖醇酐油酸酯加到盛有80ml植物油的烧瓶中，于60℃搅拌0.5～5h后加入10wt％明胶水溶液10ml，继续搅拌180min后冰浴搅拌15min，然后加入25wt％戊二醛水溶液0.1ml，继续搅拌2h，加入4℃丙酮40ml，搅拌15min，静置，过滤，得到微球；将微球泡在10ml丙酮中，于4℃固化24h后用1mol/L氨基乙酸浸泡30min，离心，取沉淀，用丙酮和异丙酮洗涤的沉淀，将沉淀置于去离子水中浸泡过夜，冷冻干燥，得到明胶微球。
5.根据权利要求4所述的负载万古霉素/明胶微球的丝素蛋白复合支架的制备方法，其特征在于：所述的搅拌的速度为300～400r/min；所述的离心的条件为于25℃、10000r/min离心10min。
6.根据权利要求1或4任一项所述的负载万古霉素/明胶微球的丝素蛋白复合支架的制备方法，其特征在于：所述的冷冻干燥的条件为-60℃冷冻干燥24h。
7.一种负载万古霉素/明胶微球的丝素蛋白复合支架，由权利要求1～6任一项所述的制备方法得到。
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