CN103100081A - 一种多价联合疫苗 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种多价联合疫苗，包含A群流脑荚膜多糖为2.0-4.8μg的A群流脑荚膜多糖-载体蛋白结合物，C群流脑荚膜多糖为2.0-4.8μg的C群流脑荚膜多糖-载体蛋白结合物，Y群流脑荚膜多糖为2.0-4.8μg的Y群流脑荚膜多糖-载体蛋白结合物，W135群流脑荚膜多糖为2.0-4.8μg的W135群流脑荚膜多糖-载体蛋白结合物，20-25μg百日咳PT抗原，20-25μg百日咳FHA抗原，8-10μg百日咳PRN抗原，10-15Lf白喉类毒素和5Lf破伤风类毒素，载体蛋白为CRM197或破伤风类毒素。本发明的多价联合疫苗可分别减少婴幼儿、成年人和青少年接种疫苗的次数，降低接种成本。
Description
技术领域
本发明属于疫苗生产制备技术领域。涉及一种同时预防百日咳感染和脑膜炎的多价联合疫苗。
背景技术
百日咳是由百日咳杆菌引起的急性呼吸道传染病。其临床特征为阵发性痉挛性咳嗽伴有深长的“鸡鸣”样吸气性吼声，如未得到及时有效的治疗，病程可迁延数个月左右，故称“百日咳”。本病传染性很强，常引起流行。患儿的年龄越小，病情越重，可因并发肺炎、脑病而死亡，近三十年来，由于菌苗的广泛接种，我国百日咳的流行已大大减少，发病率、病死率亦明显降低，但据世卫组织报道，全世界每年仍有3500万的百日咳患者，高达294万的儿童死于百日咳及并发症。近年来全球百日咳发病率有回升趋势，且青少年和成人已成为百日咳高发人群，成人百日咳带菌者也是婴幼儿百日咳感染的重要来源。百日咳的重现，青少年和成人百日咳感染率的升高，使得百日咳越来越引起人们的重视。目前已经有多种疫苗可以预防百日咳，白喉和破伤风的感染。而其中用于疫苗制备的百日咳抗原主要包括FHA抗原（丝状血凝素），PT抗原（百日咳类毒素），PRN（百日咳粘着素）和FIM23（2或3型的百日咳纤毛蛋白抗原）。这些抗原可以按专利（如美国专利4997915，5444159，5877292）中公开的方法进行生产，也可以从一些机构（如英国国家生物制品检定所）购买获得。
流行性脑脊髓膜炎简称流脑，它是由脑膜炎奈瑟氏球菌引起的急性呼吸道传染病，传染性强，可大规模流行，且病情进展迅速，即使进行了最理想的治疗，也常导致在发病后一到几天内死亡，或引起严重的后遗症。因此药物预防对控制大多数地方性或流行性的流脑来说价值不大。全球每年流脑发病人数约为50万，死亡5万。地方性疾病主要发生在儿童和青少年，3-12月龄的婴儿发病率最高，而在流脑流行时，大龄儿童和年轻成人发病率也会增高。由于5-15%的儿童和年轻成人鼻咽部都携带脑膜炎奈瑟菌，因此通过服药消除鼻咽部携带菌来控制流脑几乎是不可能的，而且由于抗生素的大量使用，目前已经出现了耐抗生素的脑膜炎奈瑟菌，因此接种安全有效的疫苗是控制流脑的最有效地措施。目前已经有包括A，C，W135，Y群的多价多糖疫苗和多价结合疫苗。
结合疫苗有效成分为细菌荚膜多糖与载体蛋白的偶联结合物。荚膜多糖抗原引起的抗体可以与细菌的荚膜结合，配合补体来杀死入侵细菌。结合蛋白可以促进抗体成熟使其亲和力增加。同时可以诱导接种者针对荚膜多糖的免疫记忆，使得保护的有效时间大大延长。
联合疫苗是指含有二个或多个活的、灭活的生物体或者提纯的抗原，由生产者联合配制而成，用于预防多种疾病或由同一生物体的不同种或不同血清型引起的疾病。联合疫苗开发 的目的是在减少疫苗注射次数的同时预防更多种类的疾病。其意义不仅可以提高疫苗覆盖率和接种率、减少多次注射给婴儿和父母所带来身体和心理的痛苦、减少疫苗管理上的困难、降低接种和管理费用；还可减少疫苗生产中必含的防腐剂及佐剂等剂量，减低疫苗的不良反应等。目前已经有A，C二价流脑结合疫苗，A，C，W135，Y四价结合疫苗以及他们和嗜血流感杆菌结合疫苗的联合疫苗，其生产方法已经公开（中国专利CN100556459，中国专利CN101559222，中国专利CN1709505）。但是，还未有同时包含A，C，Y，W135群流脑结合疫苗和百日咳抗原组分的疫苗。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种多价联合疫苗。
本发明的第二个目的是提供另一种多价联合疫苗。
一种多价联合疫苗，其特征是包含A群流脑荚膜多糖为2.0-4.8μg的A群流脑荚膜多糖-载体蛋白结合物，C群流脑荚膜多糖为2.0-4.8μg的C群流脑荚膜多糖-载体蛋白结合物，Y群流脑荚膜多糖为2.0-4.8μg的Y群流脑荚膜多糖-载体蛋白结合物，W135群流脑荚膜多糖为2.0-4.8μg的W135群流脑荚膜多糖-载体蛋白结合物，20-25μg百日咳PT抗原，20-25μg百日咳FHA抗原，8-10μg百日咳PRN抗原，10-15Lf白喉类毒素(DT)和5Lf破伤风类毒素(TT)，所述载体蛋白为CRM197或破伤风类毒素（TT）。
还包含5μg百日咳Fim23抗原。
另一种多价联合疫苗，其特征是包含A群流脑荚膜多糖为2.0-4.8μg的A群流脑荚膜多糖-载体蛋白结合物，C群流脑荚膜多糖为2.0-4.8μg的C群流脑荚膜多糖-载体蛋白结合物，Y群流脑荚膜多糖为2.0-4.8μg的Y群流脑荚膜多糖-载体蛋白结合物，W135群流脑荚膜多糖为2.0-4.8μg的W135群流脑荚膜多糖-载体蛋白结合物，5-8μg百日咳PT抗原，5-8μg百日咳FHA抗原,2.5-5μg百日咳PRN抗原,2.5Lf白喉类毒素(DT)和5Lf破伤风类毒素(TT)，所述载体蛋白为CRM197或破伤风类毒素(TT)。
还包含5μg百日咳Fim23抗原。
本发明的第一种多价联合疫苗在使用时可以减少婴幼儿接种疫苗的次数，减轻婴幼儿的痛苦和家长的负担，降低接种成本，提高免疫覆盖率。
本发明的另一种多价联合疫苗的使用可以减少成年人和青少年接种疫苗的次数，降低接种成本，提高免疫覆盖率。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。下面的说明是为了使本领域的技术人员能够更好地理解本发明，但不对本发明作任何限制。
实施例中的方法若无特殊说明均为常规方法。
A群流脑荚膜多糖-CRM197结合物按照中国专利CN100556459方法制备。
C群流脑荚膜多糖-CRM197结合物按照中国专利CN100556459方法制备。
W135群流脑荚膜多糖-CRM197结合物按照专利中国专利201210351607.5方法制备。
Y群流脑荚膜多糖-CRM197结合物按照中国专利201210351607.5方法制备。
A群流脑荚膜多糖-TT结合物按照中国专利CN1709505方法制备。
C群流脑荚膜多糖-TT结合物按照中国专利CN1709505方法制备。
W135群流脑荚膜多糖-TT结合物按照中国专利CN1709505方法制备。
Y群流脑荚膜多糖-TT结合物按照中国专利CN1709505方法制备。
百日咳抗原FHA，PT，PRN,FIM，白喉类毒素，破伤风类毒素购于英国国家生物制品检定所（NIBSC）。
各群流脑结合疫苗的制备方法不限制于以上描述的方法。美国专利4356170，8003112等描述的方法均可以用于制备各群流脑荚膜多糖-载体蛋白结合物。
实施例1
配制第一种多价联合疫苗
原料：A群流脑荚膜多糖-CRM197结合物，C群流脑荚膜多糖-CRM197结合物，W135群流脑荚膜多糖-CRM197结合物，Y群流脑荚膜多糖-CRM197结合物，百日咳PT抗原，百日咳FHA抗原，百日咳PRN抗原，白喉类毒素和破伤风类毒素按照表1进行配置。其中流脑荚膜多糖-CRM197结合物是以该结合物中所含的流脑荚膜多糖计算。
在6个无菌2L三角瓶中，分别加入表1所示各个配方的各种成分，加入生理盐水至最终体积为500mL。混合均匀后分装于2mL体积西林瓶中，每个西林瓶中装量0.5mL，为人用单次注射剂量。每个配方配制1000个西林瓶注射液。
表1：多价联合疫苗的配方
| 配方1 | 配方2 | 配方3 | 配方4 | 配方5 | 配方6 | |
| A群流脑荚膜多糖（mg） | 2.0 | 2.0 | 2.0 | 4.8 | 4.8 | 4.8 |
| C群流脑荚膜多糖（mg） | 2.0 | 2.0 | 4.8 | 2.0 | 4.8 | 4.8 |
| W135群流脑荚膜（mg） | 2.0 | 4.8 | 2.0 | 2.0 | 2.0 | 4.8 |
| Y群流脑荚膜多糖（mg） | 2.0 | 4.8 | 4.8 | 2.0 | 2.0 | 4.8 |
| 百日咳PT抗原（mg） | 25 | 25 | 25 | 25 | 20 | 25 |
| 百日咳FHA抗原（mg） | 25 | 25 | 25 | 25 | 20 | 25 |
| 百日咳PRN抗原（mg） | 8 | 8 | 10 | 8 | 10 | 10 |
| 白喉类毒素（Lf） | 10000 | 15000 | 15000 | 15000 | 15000 | 15000 |
| 破伤风类毒素（Lf） | 5000 | 5000 | 5000 | 5000 | 5000 | 5000 |
实施例2
配制含有百日咳Fim23抗原的多价联合疫苗
原料：A群流脑荚膜多糖-CRM197结合物，C群流脑荚膜多糖-CRM197结合物，W135群流脑荚膜多糖-CRM197结合物，Y群流脑荚膜多糖-CRM197结合物，百日咳PT抗原，百日咳FHA抗原，百日咳PRN抗原，百日咳Fim23抗原，白喉类毒素和破伤风类毒素按照表2进行配置。其中流脑荚膜多糖-CRM197结合物是以该结合物中所含的流脑荚膜多糖计算。
在8个无菌2L三角瓶中，分别加入表2所示含量的各种成分，加入生理盐水至最终体积 为500mL。混合均匀后分装置2mL体积西林瓶中，每个西林瓶中装量0.5mL，为人用单次注射剂量。每个配方配制1000个西林瓶注射液。
表2：多价联合疫苗的配方
实施例3
配制第二种多价联合疫苗
原料：A群流脑荚膜多糖-CRM197结合物，C群流脑荚膜多糖-CRM197结合物，W135群流脑荚膜多糖-CRM197结合物，Y群流脑荚膜多糖-CRM197结合物，百日咳PT抗原，百日咳FHA抗原，百日咳PRN抗原，白喉类毒素和破伤风类毒素按照表3进行配置。其中流脑荚膜多糖-CRM197结合物是以该结合物中所含的流脑荚膜多糖计算。
在6个无菌2L三角瓶中，分别加入表3所示含量的各种成分，加入生理盐水至最终体积为500mL。混合均匀后分装置2mL体积西林瓶中，每个西林瓶中装量0.5mL，为人用单次注射剂量。每个配方配制得到1000个西林瓶注射液，总计制备6000西林瓶注射液。
表3：多价联合疫苗的配方
实施例4
配制含有百日咳Fim23抗原的第二种多价联合疫苗
原料：A群流脑荚膜多糖-CRM197结合物，C群流脑荚膜多糖-CRM197结合物，W135群流脑荚膜多糖-CRM197结合物，Y群流脑荚膜多糖-CRM197结合物，百日咳PT抗原，百日咳FHA抗原，百日咳PRN抗原，百日咳Fim23抗原，白喉类毒素和破伤风类毒素按照表4进行配置。其中流脑荚膜多糖-CRM197结合物是以该结合物中所含的流脑荚膜多糖计算。
在8个无菌2L三角瓶中，分别加入表4所示含量的各种成分，加入生理盐水至最终体积为500mL。混合均匀后分装置2mL体积西林瓶中，每个西林瓶中装量0.5mL，为人用单次注射剂量。每个配方配制得到1000个西林瓶注射液，总计制备8000西林瓶注射液。
表4：多价联合疫苗的配方
实施例5联合疫苗的免疫评价
在临床评价之前，研究了多价结合疫苗在小鼠上引起免疫应答的能力。利用小鼠进行疫苗（表1中配方1-6，表2中配方7-14，表3中的配方15-20，表4中的配方21-28）的免疫原性对比研究。由于小鼠动物模型能够通过免疫应答反应对比其免疫原性，因此该研究是有意义的。
在小鼠免疫原性研究中，共进行了29组实验，每组10小鼠（健康状况良好的,体重在12-14g的BALB∕c雌性小鼠（SPF级）），这29组分别为阴性对照组即生理盐水（0.85%氯化钠），表1中配方1-6，表2中配方7-14，表3中的配方15-20，表4中的配方21-28。分别按人用剂量的1/4施用，即每只小鼠皮下多点注射125ul。分别于免疫的第1天，第14天，第28天进行免疫接种，共计免疫次数3次，并在最后一次接种结束后的第14天进行每只小鼠分别进行眼球取血，血液样本离心后取上清，即血清样本，每只小鼠血清样本单独保存。
利用ELISA方法测定针对A群流脑荚膜多糖，C群流脑荚膜多糖,W134群流脑荚膜多糖, Y群流脑荚膜多糖，百日咳抗原FHA，PT，PRN，FIM23，白喉类毒素和破伤风类毒素的抗体。将上述4群流脑荚膜多糖和各种蛋白抗原分别包被于ELISA酶标板的滴定孔上，使每一群多糖和蛋白抗原固相结合在酶标板的滴定孔上。血清样本与固相结合在ELISA酶标板滴定孔上的过量的每一种抗原孵育形成抗原-抗体复合物。孵育后，用PBST缓冲液（0.5ml的Tween20溶于1000ml的pH7.4的磷酸钾缓冲液中）洗涤滴定孔弃去未结合部分，并将能够结合待测抗原——抗体复合物的二级抗体——酶缀合物加至抗原-抗体复合物滴定孔中进行孵育。孵育后，用PBST溶液洗涤滴定孔，并将化学底物加至抗原-抗体-二级抗体一酶缀合物中。经酶水解化学底物的一部分后导致颜色形成。颜色形成的量(光吸收度OD)与结合在滴定孔中的抗体成正比。统计不同实验组缀合疫苗免疫后各血清型抗体滴度水平（OD>2倍的生理盐水对照组的OD值最大稀释倍数），实验结果见下表5和表6。
按照表1-表4的配方，用A群流脑荚膜多糖-TT结合物，C群流脑荚膜多糖-TT结合物，Y群流脑荚膜多糖-TT结合物，W135群流脑荚膜多糖-TT结合物，百日咳各种抗原，白喉类毒素和破伤风类毒素进行联合疫苗的配置，并进行免疫实验，也可以得到与表5，6类似的免疫效价。
实验结果表明，本发明的多价联合疫苗可以诱导机体产生良好的免疫反应。可以用于联合疫苗的配置，减少婴幼儿接种疫苗的次数，减轻婴幼儿的痛苦和家长的负担，降低接种成本，提高免疫覆盖率
参考文献
中国专利CN1889975A
中国专利CN100556459
中国专利CN101559222
中国专利CN1709505
中国专利201210351607.5
美国专利4356170
美国专利8003112
美国专利4997915，
美国专利5444159，
美国专利5877292
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Claims (4)
1.一种多价联合疫苗，其特征是包含A群流脑荚膜多糖为2.0-4.8μg的A群流脑荚膜多糖-载体蛋白结合物，C群流脑荚膜多糖为2.0-4.8μg的C群流脑荚膜多糖-载体蛋白结合物，Y群流脑荚膜多糖为2.0-4.8μg的Y群流脑荚膜多糖-载体蛋白结合物，W135群流脑荚膜多糖为2.0-4.8μg的W135群流脑荚膜多糖-载体蛋白结合物，20-25μg百日咳PT抗原，20-25μg百日咳FHA抗原，8-10μg百日咳PRN抗原，10-15Lf白喉类毒素和5Lf破伤风类毒素，所述载体蛋白为CRM197或破伤风类毒素。
2.根据权利要求1所述的多价联合疫苗，其特征是还包含5μg百日咳Fim23抗原。
3.一种多价联合疫苗，其特征是包含A群流脑荚膜多糖为2.0-4.8μg的A群流脑荚膜多糖-载体蛋白结合物，C群流脑荚膜多糖为2.0-4.8μg的C群流脑荚膜多糖-载体蛋白结合物，Y群流脑荚膜多糖为2.0-4.8μg的Y群流脑荚膜多糖-载体蛋白结合物，W135群流脑荚膜多糖为2.0-4.8μg的W135群流脑荚膜多糖-载体蛋白结合物，5-8μg百日咳PT抗原，5-8μg百日咳FHA抗原,2.5-5μg百日咳PRN抗原,2.5Lf白喉类毒素和5Lf破伤风类毒素，所述载体蛋白为CRM197或破伤风类毒素。
4.根据权利要求3所述的多价联合疫苗，其特征是还包含5μg百日咳Fim23抗原。
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