CN103087197B

CN103087197B - 一种藻红蛋白标记抗sti抗体、制备方法及其用途

Info

Publication number: CN103087197B
Application number: CN201310019802.2A
Authority: CN
Inventors: 曹敏杰; 蔡秋凤; 沈建东; 江韬玲; 刘光明; 苏文金
Original assignee: Jimei University
Current assignee: Weituo (Xiamen) Biotechnology Co.,Ltd.
Priority date: 2013-01-21
Filing date: 2013-01-21
Publication date: 2015-02-11
Anticipated expiration: 2033-01-21
Also published as: CN103087197A

Abstract

本发明涉及一种藻红蛋白标记抗大豆胰蛋白酶抑制剂(soybeantrypsininhibitor,STI)抗体、制备方法及其用途。所述藻红蛋白标记抗STI抗体为经过处理的藻红蛋白偶联经过处理的抗STI单克隆抗体组合而成。本发明还保护所述抗体的制备方法和用途，优选为检测鱼糜制品中大豆蛋白的用途。本发明的检测方法具有与化学发光法一致的结果，且比化学发光法灵敏度更高，反应时间更短，更简单，准确，安全。

Description

一种藻红蛋白标记抗STI抗体、制备方法及其用途

技术领域

本发明涉及一种抗体，尤其涉及一种藻红蛋白标记抗体、制备方法及其用途。

背景技术

我国是水产品生产大国，2010年水产品总产量达到了5373万吨，其中水产品加工产量为1778万吨，水产品加工业已经成为我国渔业生产中发展速度快、经济社会效益显著的重要支柱产业。鱼糜制品是大宗低值鱼类加工利用的一个重要方向。据统计，在2010年我国鱼糜制品产量达到了96万吨。近年来，随着鱼糜原料价格的大幅上涨，非鱼肉蛋白被添加到了鱼糜制品中。其中，大豆蛋白在原料鱼浆以及生产过程中普遍使用，使得鱼糜制品生产相关企业在原料把关上存在严重的挑战，鱼糜制品的有效成分和品质也难于得到保证，损害了消费者的利益和企业的长远发展。但是目前国内尚未有有效的方法检测鱼糜制品中的大豆蛋白，亟需建立一种快速、有效的检测方法。

发明内容

本发明要解决的技术问题是：提供一种快速、准确、安全的检测大豆蛋白的藻红蛋白标记抗大豆胰蛋白酶抑制剂（soybean trypsin inhibitor，STI）抗体。

为实现上述目的，本发明提供一种藻红蛋白标记抗STI单克隆抗体，其特征在于，由藻红蛋白偶联抗STI单克隆抗体组合而成。所述藻红蛋白与抗STI单克隆抗体均分别进行了处理；优选为藻红蛋白通过SPDP (3-(2-吡啶二巯基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯)和DTT(二硫苏糖醇)处理；抗STI单克隆抗体通过SPDP处理。具体处理方法为：

藻红蛋白的处理：一定量的R-藻红蛋白与SPDP在恒温摇床反应，100 rpm/min，20-30 ℃，反应1 h，反应结束后过脱盐柱去除多余的SPDP，并用10 kDa膜浓缩；加入一定量的DTT于上述SPDP处理的R-藻红蛋白，20-30 ℃恒温摇床反应，100 rpm/min，反应时间为30 min，反应结束后过脱盐柱或透析去除多余的DTT，并用10 kDa膜浓缩，得到处理后的藻红蛋白；

抗STI单克隆抗体的处理：一定量的抗STI单克隆抗体与SPDP在恒温摇床反应，100 rpm/min，20-30 ℃反应1 h，反应结束后过脱盐柱或透析去除多余的SPDP，并用10 kDa膜浓缩，得到处理后的抗STI单克隆抗体；

再将上述SPDP处理后的藻红蛋白和处理后的抗STI单克隆抗体混合，在恒温摇床反应，100 rpm/min，20-30 ℃反应16-18 h，得到藻红蛋白偶联抗STI单克隆抗体复合物；

收集：将获得的藻红蛋白偶联抗STI单克隆抗体复合物过凝胶过滤柱，获得藻红蛋白标记的抗体。

所述藻红蛋白与SPDP的比例为摩尔比为1:80-1:100。

所述DTT与所述SPDP标记的R-藻红蛋白的反应浓度为摩尔比为1:100-1:400。

所述抗STI单克隆抗体与SPDP摩尔比为1:80-1:100。

本发明还保护依据上述制备方法所得的藻红蛋白标记抗STI抗体。

本发明还保护藻红蛋白标记抗STI抗体的用途，优选为检测鱼糜制品中大豆蛋白的用途。

本发明还进行了免疫荧光方法与化学发光方法的比较试验，结果表明免疫荧光法比化学发光法灵敏度更高，且反应时间更短。利用免疫荧光法能够检测到1.56 μg/mL STI。化学发光法能够检测到3.12 μg/mL STI。

本发明进行了未添加大豆蛋白的自制鱼丸和市售鱼丸中大豆蛋白的检测试验，八种材料分别为未添加大豆蛋白的自制鱼丸、鱼豆腐、福州鱼丸、A公司墨鱼鱼丸、B公司墨鱼鱼丸、花枝鱼丸、章鱼鱼丸，含2 %（w/w）大豆蛋白的鱼丸。结果表明：未添加大豆蛋白的自制鱼丸，没有对应STI蛋白（21 kDa）的条带，说明该抗体特异性良好。2 %大豆蛋白添加量（w/w）的鱼丸，STI条带清晰明显；鱼豆腐的条带最亮，说明鱼豆腐中的大豆蛋白含量最高。其次为A公司墨鱼鱼丸和福州鱼丸，添加量为2 %左右。虽然B公司墨鱼鱼丸、花枝鱼丸、章鱼丸包装上未标注含大豆蛋白，但泳道5、6、7显示也含有一定量的大豆蛋白，该结果与化学发光法一致。

本发明所实施的实施例，充分说明了本发明的方法结果与化学发光法一致，且比化学发光法灵敏度更高。由于藻红蛋白直接标记了一次抗体，与需要二次抗体反应的荧光法相比较，反应时间更短。本发明的方法简单，准确，安全。

附图说明

图1A. 纯化STI的SDS-PAGE电泳图，图1B.抗STI单克隆抗体的特异性分析电泳图；

图2. 纯化STI对胰蛋白酶的抑制效果图；

图3. 抗STI单克隆抗体纯化结果电泳图；

图4A. 免疫荧光法检测图；

图4B. 化学发光法检测图；

图5A. 8种不同鱼糜制品的免疫荧光法检测结果图；

图5B. 8种不同鱼糜制品的化学发光法检测结果图。

具体实施方式

下面通过具体实施方式对本发明作进一步详细说明。但本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1：大豆蛋白STI标准品的制备

用高速药物粉碎机将大豆磨成粉末，并过60目筛，称取100 g粉末，加入300 mL丙酮搅拌2 h，绢布过滤，弃去丙酮层。残留物用80 %的乙醇洗涤，8000 g离心20 min，弃上清，如此重复4次。将所得沉淀浸泡于0.08 mol/L H₂SO₄中30 min，6000 g离心15 min，弃上清，沉淀再重悬于0.125 mol/L H₂SO₄中，搅拌4 h，8000 g离心20 min，绢布过滤，弃沉淀。上清液用1 mol/L的NaOH调pH至4.7，静置0.5 h，8000 g离心20 min，弃沉淀。上清液加入70 %饱和度的(NH₄)₂SO₄，4 ℃放置2 h，8000 g离心20 min，沉淀用20 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0)的缓冲液溶解，透析过夜。

将透析后的样品上样于预先用20 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0)的缓冲液平衡好的DEAE-Sephacel层析柱，经0-0.5 mol/L NaCl线性洗脱、收集对胰蛋白酶抑制活性峰部分，于20 mmol/L的HAc-NaAc (pH 4.0)缓冲液中透析21 h，期间分别间隔1、2、4、6 h更换一次缓冲液。透析后样品进一步上样于SP-Sepharose离子交换层析柱，经20 mmol/L HAc-NaAc (pH 4.0-6.0)的缓冲液洗脱，得到纯化的大豆胰蛋白酶抑制剂（STI）。蛋白的纯化效果如图1A和图1B，其中泳道M为蛋白标准分子量，泳道1为纯化的STI；从图中可以看出泳道1除了STI条带外，不存在其它条带，即经过一系列的分离纯化，得到了高度纯化的STI。纯化的STI抑制活性采用荧光底物进行鉴定。即取50 μL纯化的STI加入850 μL 20 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0)缓冲液中，再加入50 μL适量浓度的胰蛋白酶（sigma公司）混匀，常温孵育10 min后，加入10 μmol/L荧光底物Boc-Phe-Ser-Arg-MCA（Peptide Institute公司，日本）50 μL于37 ^oC反应10 min，用1.5 mL终止液（甲醇:异丙醇:水=35:30:35 v:v:v）终止反应。反应释放的产物7-amino-4-methylcoumarin（AMC）用荧光分光光度计（FP-6200，JASCO，日本），在激发波长380 nm和发射波长450 nm下进行测定。所得到的值即STI的抑制活力用Ti表示。对照（胰蛋白酶酶活力）的测定方法类似，即将50 μL的缓冲液代替50 μL纯化的STI反应，所测得的值用T表示。抑制活力单位（Unit）定义为将胰蛋白酶活性降低1个活力单位的抑制活性，其中胰蛋白酶的活力单位定义为每分钟释放1 nmol AMC所需要的酶量。抑制率采用百分数I（%）表示，计算公式如下：I (%)=((T-Ti)/T)×100。结果如图2所示，横坐标表示纯化的STI的浓度，纵坐标表示抑制率I (%)，从图中可以看出，当纯化的STI浓度为1/64000 mg/mL（15.6 ng/mL）时，对胰蛋白酶仍然有10 %左右的抑制活性，纯化STI的IC ₅₀（测定导致胰蛋白酶活力下降50 %的抑制剂浓度）为1/32000 mg/mL即31.3 ng/mL，说明纯化的STI对胰蛋白酶具有强烈的抑制效果。

实施例2 抗大豆蛋白STI单克隆抗体的制备

选择5只雌性、6～8周龄的BALB/c小鼠（上海斯莱克实验动物有限公司），将实施例1得到纯化的大豆蛋白STI经110 ℃，处理30 min后（100 μL）与等体积的弗氏完全佐剂（Sigma）混匀所得即为抗原，每只小鼠100 μg抗原的剂量进行腹腔注射；之后每隔2周以相同剂量的抗原加强免疫；免疫3次后，对小鼠进行尾部取血，利用间接ELISA法检测小鼠血清效价，即抗原以2 μg/mL的浓度包被酶标板，4 ℃包被过夜，以200 μL/孔TBST洗涤5遍，经5 %的脱脂奶37 ℃条件下温育1.5 h，以200 μL/孔TBST洗涤2遍，将小鼠抗血清以1:200、1:1000、1：5000、1:10000、1:20000、1:60000、1:240000的稀释度稀释，50 μL/孔加样，37 ℃条件下温育1 h，用TBST以200 μL/孔洗涤2遍，羊抗鼠HRP1:5000稀释使用，以100 μL/孔加样，37 ℃条件下温育1 h，用TBST以200 μL/孔洗涤3遍，加100 μL/孔TMB（3',5,5'-四甲基联苯胺）显色液，反应20 min后，加入50 μL/孔的H₂SO₄终止反应，酶标仪测定OD_450 nm读数，选择抗体滴度最高的一只小鼠（血清稀释度为1:10000时，OD_450 nm为1.294）在细胞融合前4天，进行强化免疫1次。免疫量仍然为每只小鼠100 μg抗原。

分离强化免疫的小鼠脾脏淋巴细胞，将其与SP2/0骨髓瘤细胞（中国科学院细胞库）在聚乙二醇（Sigma）的介导下进行融合；融合后的细胞在含有1 % HAT（Sigma）和20 %胎牛血清（Invitrogen）的RPMI 1640（Invitrogen）培养基中37 ^oC培养；杂交瘤细胞通过ELISA法进行筛选（方法同之前提供的间接ELISA法）。

筛选出的阳性细胞采用有限稀释法进行克隆化培养，该操作重复3次以保证筛选出能分泌抗大豆蛋白STI抗体的单克隆阳性细胞株。

筛选的能分泌抗大豆蛋白STI单克隆抗体的阳性细胞株进行扩大培养，收集培养上清，1500 g离心10 min取上清即得抗小清蛋白单克隆抗体。将得到的单克隆抗体与平衡缓冲液（20 mmol/L的PBS，pH 7.0）混合后，上样于预先用20 mmol/L的PBS (pH 7.0)平衡的Protein G Sepharose亲和层析柱（Amersham Biosciences），收集该部分样品（未吸附部分）；继续用平衡缓冲液流洗至A_280nm为基线，然后以0.1 mol/L glycine（甘氨酸）-HCl (pH 2.7)进行洗脱至A_280 nm为基线，收集时先在离心管中预先加入100 μL 1mol/L Tris-HCl (pH 9.0)的缓冲液，每管收集1 mL，洗脱部分所得样品称吸附部分。分别将细胞培养上清、未吸附部分及吸附部分的蛋白峰部分SDS化后（样：上样缓冲液=3:1,v:v），进行SDS-PAGE电泳分析，结果如图3的泳道1、2、3所示。说明经Protein G Sepharose亲和层析柱的纯化，有效去除了杂蛋白，得到了高度纯化的抗STI单克隆抗体。如泳道3所示（吸附部分），在还原条件下（加入β-巯基乙醇）分别显示出50 kDa左右的重链和25 kDa左右的轻链。将得到的单克隆抗体进行特异性分析，结果见图1A和B，其中泳道M为蛋白分子量标准，泳道1为纯化的STI；泳道2为空白对照（鱼肉+淀粉）；泳道3为大豆分离蛋白，图1A的SDS-PAGE电泳所示，除纯化的STI，空白对照及大豆分离蛋白均含有许多杂蛋白，但图1B（抗STI单克隆单克隆抗体的Western blot分析）结果显示，大豆分离蛋白及纯化的STI只在STI处存在免疫反应，空白对照（鱼肉+淀粉）则没有任何反应条带。说明制备的抗STI单克隆抗体具有较好的特异性，除大豆蛋白STI外，不与大豆及鱼糜中的其它蛋白发生免疫反应。

实施例3 藻红蛋白标记抗STI抗体的制备

藻红蛋白的处理：R-藻红蛋白与SPDP的比例为1：80，恒温摇床反应，100 rpm/min，25℃反应1h，反应结束后过脱盐柱去除多余的SPDP，并用10kDa膜浓缩；用DTT处理上述SPDP标记的R-藻红蛋白，DTT与所述SPDP标记的R-藻红蛋白的反应浓度为摩尔比1:100，在25 ℃下100 rpm/min摇床反应30 min，反应结束后过脱盐柱去除多余的DTT，并用10kDa膜浓缩，得到处理后的藻红蛋白。

抗STI单克隆抗体的处理：抗STI单克隆抗体与SPDP摩尔比为1:80，在25 ℃下100 rpm/min摇床反应1 h，反应结束后过脱盐柱去除多余的SPDP，并用10 kDa膜浓缩，得到处理后的抗STI单克隆抗体。

再将所述处理后的藻红蛋白和处理后的抗STI单克隆抗体混合，在25 ℃下，100 rpm/min摇床反应18 h。

收集：将获得的藻红蛋白偶联抗STI单克隆抗体进行Sephacryl S-300柱层析，去除多余的藻红蛋白和抗体。

实施例4 藻红蛋白标记抗STI抗体的制备

藻红蛋白的处理：R-藻红蛋白与SPDP的比例为摩尔比1:100，在25 ℃下，100 rpm/min摇床反应1 h，反应结束后过脱盐柱去除多余的SPDP，并用10kDa膜浓缩；用DTT处理上述SPDP标记的R-藻红蛋白，DTT与所述SPDP标记的R-藻红蛋白的反应浓度为1:400（摩尔比），在25 ℃下100 rpm/min摇床反应30 min，反应结束后过脱盐柱去除多余的DTT，并用10 kDa膜浓缩，得到处理后的藻红蛋白。

抗STI单克隆抗体的处理：抗STI单克隆抗体与SPDP以摩尔比1:100混合，在25 ℃下，100 rpm/min摇床反应1 h，反应结束后过脱盐柱去除多余的SPDP，并用10 kDa膜浓缩，得到处理后的抗STI单克隆抗体。

再将所述处理后的藻红蛋白和处理后的抗STI单克隆抗体混合，在25 ℃下，100 rpm/min摇床反应16 h。

收集：将获得的藻红蛋白偶联抗STI单克隆抗体复合物进行Sephacryl S-300柱层析，去除多余的藻红蛋白和抗体。

实施例5 藻红蛋白标记抗STI抗体的制备

藻红蛋白的处理：R-藻红蛋白与SPDP的摩尔为1：90，在25 ℃下，100 rpm/min摇床反应1h，反应结束后过脱盐柱去除多余的SPDP，并用10 kDa膜浓缩；用DTT处理上述SPDP标记的R-藻红蛋白，DTT与所述SPDP标记的R-藻红蛋白的反应摩尔比为1:250，在25 ℃下，100 rpm/min摇床反应30 min，反应结束后过脱盐柱去除多余的DTT，并用10kDa膜浓缩，得到处理后的藻红蛋白。

抗STI单克隆抗体的处理：抗STI单克隆抗体与SPDP摩尔比为1:90，在25 ℃下，100 rpm/min摇床反应1h，反应结束后过脱盐柱去除多余的SPDP，并用10kDa膜浓缩，得到处理后的抗STI单克隆抗体。

实施例6 免疫荧光方法与化学发光方法比较

免疫荧光方法（本发明方法）：免疫荧光检测即用藻红蛋白标记一次抗体，直接利用藻红蛋白本身的荧光来检测抗原的方法。先将纯化的STI（实施例1所得）以1/20 mg/mL为起始浓度，进行2倍梯度稀释，SDS化后进行SDS-PAGE电泳，采用电转移装置将蛋白转至硝酸纤维素膜上，经脱脂奶封闭，藻红蛋白标记的抗STI单克隆抗体（实施例3或实施例4或实施例5所得）孵育后，利用化学发光成像系统（Fluor chem Q）记录结果。如图4A所示，利用免疫荧光法能够检测到STI的最低浓度为1.56 μg/mL。

化学发光方法：化学发光法操作步骤与传统的Western blot法一致，即抗原转膜后，经一抗（抗STI单克隆抗体）、二抗（HRP标记的兔抗鼠IgG）孵育后，采用ECL显色2 min，利用化学发光成像系统（Fluor chem Q）记录结果。结果如图4B所示，化学发光法能够检测到STI的最低浓度为3.12μg/mL。

图4A和4B中；泳道1-8的STI浓度分别为：1/20 mg/mL; 1/40 mg/mL; 1/80 mg/mL; 1/160 mg/mL; 1/320 mg/mL; 1/640 mg/mL; 1/1280 mg/mL和1/2560 mg/mL；泳道9为空白对照。

比较图4A、B可知免疫荧光法比化学发光法灵敏度更高，而且因不需二次抗体，检测时间更短。

实施例7 鱼丸中大豆蛋白的检测

8种不同鱼糜制品：未添加大豆蛋白的自制鱼丸、鱼豆腐、福州鱼丸、A公司墨鱼鱼丸、B公司墨鱼鱼丸、花枝鱼丸、章鱼鱼丸，含2 %（w/w）大豆蛋白的鱼丸。

检测方法见实施例6的免疫荧光方法。

其中，鱼豆腐、福州鱼丸、A公司墨鱼鱼丸包装上有添加大豆蛋白的标识，结果如图5A和5B所示，其中泳道M为标准分子量蛋白；泳道1为未添加大豆蛋白的自制鱼丸；泳道2为鱼豆腐；泳道3为福州鱼丸；泳道4为A公司墨鱼丸；泳道5为B公司墨鱼丸；泳道6为花枝鱼丸；泳道7为章鱼鱼丸；泳道8为含2 %大豆蛋白的鱼丸。从图中可以看出，泳道1为空白对照（未添加大豆蛋白的自制鱼丸），没有STI条带，再次说明该抗体特异性良好。泳道8为2 %大豆蛋白添加量（w/w）的鱼丸，STI条带清晰明显。图中，泳道2的条带最亮，说明鱼豆腐中的大豆蛋白含量最多，且超过2 %（w/w）大豆蛋白的添加量。其次为A公司墨鱼鱼丸和福州鱼丸，添加量为2 %左右。虽然B公司墨鱼鱼丸、花枝鱼丸、章鱼丸包装上未标注含大豆蛋白，但泳道5、6、7显示也含有一定量的大豆蛋白，该结果与化学发光法一致。出现该结果的原因可能有两个，一是这些鱼丸的原料鱼浆被添加了大豆蛋白，另一个原因是企业在生产过程中添加了大豆蛋白但对产品未标示。

以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种藻红蛋白标记抗STI抗体的用途，其特征在于，所述用途为检测鱼糜制品中大豆蛋白的用途。