CN103086975A - 9-羟甲基-10-咪蒽腙及其合成方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种新的蒽环类抗癌药物衍生物，即9-羟甲基-10-咪蒽腙及其合成方法和应用。它的合成方法为：称取等物质的量的9,10-蒽二甲醛和4,5-二氰咪唑-2-肼溴化氢，混合溶于有机溶剂中，进行醛胺缩合反应，得到混合产物；混合产物经硅胶柱层析，用甲醇和选自二氯甲烷、氯仿和乙酸乙酯中的一种组成的混合溶剂进行洗脱，洗脱液浓缩、干燥，得到目标中间体；取目标中间体与硼氢化钠在醇类溶剂存在条件下进行还原反应，向反应液中加水，静置、析出，分离出固体，即得。申请人发现它对多种人肿瘤细胞的体外抗肿瘤活性显著，对其中某种受测肿瘤株的增殖抑制活性显著，显示出良好的潜在药用价值，有望用于各种抗肿瘤药物的制备。

Description

9-羟甲基-10-咪蒽腙及其合成方法和应用

技术领域

本发明涉及医药技术领域，具体涉及9-羟甲基-10-咪蒽腙及其合成方法和应用。

背景技术

蒽环类抗癌药物是一类比较重要的抗癌抗生素。如阿霉素(Doxorubicin)、依达比星(Idarubicin)、阿克拉霉素(Aclacinomycin)、米托蒽醌(Mitoxantrone)和比生群(Bisantrene)等，可以抑制DNA或者RNA的合成，大多属于周期非特异性抗癌药物。这类化合物在临床化疗方面都得到了广泛的应用，同时在CEF，AC和CAF等联合化疗方案中也占了很重要的地位。

蒽环类药物的抗癌活性基于其蒽环母核：蒽环具有很好的平面结构，因此能够有效的嵌插到DNA的碱基对之间与DNA的双螺旋进行不可逆结合，并最终导致DNA链断裂而引起肿瘤细胞死亡；此外，蒽环上的侧链对蒽环类化合物的抗癌活性也有一定的影响。如比生群的侧链为咪唑腙，在蒽环嵌插到DNA碱基对之间时，侧链基团可以通过氢键和静电作用进一步稳定这种结合。但目前还未见有有关9-羟甲基-10-咪蒽腙及其合成方法等相关报道。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种新的蒽环类抗癌药物衍生物，即9-羟甲基-10-咪蒽腙，以及它的合成方法和应用。

本发明所述的9-羟甲基-10-咪蒽腙，其结构式如下式所示：

本发明所述的9-羟甲基-10-咪蒽腙的合成思路为：取9,10-蒽二甲醛和4,5-二氰咪唑-2-肼溴化氢，进行醛胺缩合反应，得到9-甲醛-10-咪蒽腙和9,10-双缩合的副产物-比生群，然后经硅胶柱层析分离除去比生群，得到单一的目标中间产物，即9-甲醛-10-咪蒽腙；再将9-甲醛-10-咪蒽腙用硼氢化钠（NaBH₄）还原，最后得到9-羟甲基-10-咪蒽腙，合成路线如下：

具体的合成方法为：称取等物质的量的9,10-蒽二甲醛和4,5-二氰咪唑-2-肼溴化氢，混合溶于有机溶剂中，进行醛胺缩合反应，得到混合产物；混合产物经硅胶柱层析，用甲醇和选自二氯甲烷、氯仿和乙酸乙酯中的一种组成的混合溶剂进行洗脱，洗脱液浓缩、干燥，得到目标中间体；取目标中间体与硼氢化钠在醇类溶剂存在条件下进行还原反应，向反应液中加水，静置、析出，分离出固体，即得到9-羟甲基-10-咪蒽腙。

更为具体的合成方法包括以下步骤：

1)称取等物质的量的9,10-蒽二甲醛和4,5-二氰咪唑-2-肼溴化氢，混合溶于有机溶剂中，于70～150℃条件下回流反应至完全，反应液静置、析出，得到混合产物；

2)混合产物经硅胶柱层析，用甲醇和选自二氯甲烷、氯仿和乙酸乙酯中的一种组成的混合溶剂进行洗脱，薄层层析跟踪检测，收集含目的成分的洗脱液，浓缩、干燥，得到目标中间体；

3)取目标中间体和硼氢化钠分别溶于醇类溶剂中，于0～30℃条件下，将硼氢化钠的醇溶液滴加于目标中间体的醇溶液中，搅拌反应至完全，向反应液中加水，静置、析出，分离出固体，即得到9-羟甲基-10-咪蒽腙。

上述合成方法中，

步骤1)中，所述的有机溶剂为无水乙醇或无水甲醇，或者是无水乙醇与无水甲醇或正丁醇的组合。当有机溶剂的选择为无水乙醇与无水甲醇或正丁醇的组合时，它们的配比可以是任意配比。所述有机溶剂的用量以能够溶解9,10-蒽二甲醛和4,5-二氰咪唑-2-肼溴化氢为宜，通常情况下，0.01mol的蒽二醛和0.01mol4,5-二氰咪唑-2-肼溴化氢用50～200mL有机溶剂来溶解，优选用50～100mL的有机溶剂来溶解。

步骤1)中，回流反应的温度优选为70～100℃。

步骤2)中，用于洗脱的混合溶剂中，甲醇与二氯甲烷或氯仿或乙酸乙酯的体积比为1：20～100，优选为1：30～70。

步骤3)中，硼氢化钠的用量相对于目标中间体通常要过量，以便使目标中间体充分还原，优选地，目标中间体和硼氢化钠的摩尔比为1：1.5～10。该步骤中，所述反应的温度优选为0～15℃；所述的醇类溶剂为无水乙醇和/或无水甲醇，当醇类溶剂的选择为无水乙醇和无水甲醇的组合时，它们的配比可以是任意配比；所述醇类溶剂的用量为能够将产物B或硼氢化钠溶解即可。本步骤中，所述水加入的目的是使目标产物9-羟甲基-10-咪蒽腙的析出，水的加入量通常不能低于反应所需的有机溶剂的量，一般为反应有机溶剂的2～5倍。

上述合成方法中，各种反应是否完全可采用薄层层析跟踪检测，在上述限定条件下，步骤1)中，回流反应至完全大约需要2～8h，优选条件下大约需要4～6h；步骤3)中，搅拌反应至完全大约需要4～24h，优选条件下大约需要4～8h。所述的静置通常在0～25℃条件下进行，优选是在0～4℃条件下进行，静置的时间通常为1～12h。

上述合成方法中使用到的有机溶剂、醇类溶剂等，在使用前最好先用

分子筛脱水，以有利于反应的进行。

本发明还包括上述9-羟甲基-10-咪蒽腙在制备抗肿瘤药物中的应用。

本发明还包括以上述9-羟甲基-10-咪蒽腙为有效成分制备的抗肿瘤药物。

由上述方法合成得到9-羟甲基-10-咪蒽腙的产率为30%～70%。

与现有技术相比，本发明以典型的蒽环类抗癌药物的化学结构为基础，通过改变蒽环的侧链取代基团（在保持类似比生群的咪唑腙侧链的同时，在蒽环另一侧增加羟甲基基团，以提高其水溶性，降低其肝肾毒性），合成得到新的蒽环类抗肿瘤活性化合物——9-羟甲基-10-咪蒽腙。通过考察它对多种人肿瘤细胞的增殖抑制活性，发现其体外抗肿瘤活性显著，对其中某种受测肿瘤株的增殖抑制活性显著，显示出良好的潜在药用价值，有望用于各种抗肿瘤药物的制备。

附图说明

图1为本发明实施例1制得的最终产物的红外光谱谱图；

图2为本发明实施例1制得的最终产物的紫外光谱谱图；

图3为本发明实施例1制得的最终产物的核磁共振氢谱图；

图4为本发明实施例1制得的最终产物的核磁共振碳谱图

图5为本发明实施例1制得的最终产物的电喷雾质谱图。

具体实施方式

下面以实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不局限于这些实施例。

以下各实施例中使用到的有机溶剂、醇类溶剂均在使用前先用

分子筛脱水。

实施例1

1)取0.01mol的9,10-蒽二甲醛和0.01mol的4,5-二氰咪唑-2-肼溴化氢溶于50mL的无水乙醇中，78℃条件下回流反应至完全（TLC跟踪检测，约3h），停止反应，将反应液冷却至室温，静置1h，析出橙色固体，过滤，所得固体于室温条件下真空干燥10h，得到混合产物，产率55%；

2)将产物A进硅胶柱层析，用由体积比为1：50的无水甲醇和二氯甲烷组成的混合溶剂洗脱，薄层层析跟踪检测，收集含目的成分的洗脱液，所得洗脱液浓缩、干燥，得到目标中间体；

3)取0.01mol的目标中间体，用30mL无水甲醇加热溶解为澄清溶液；取0.05mol的NaBH₄，用10mL无水甲醇溶解为澄清溶液，缓慢滴加到目标中间体的甲醇溶液中，室温搅拌2h，向反应液中加入80mL蒸馏水，然后于4℃条件下静置，析出黄色固体，分离出固体，干燥，得到黄色固体产物，产率为70%。

对上述得到的黄色固体产物分别进行红外光谱、紫外光谱、¹H核磁共振谱、¹³C核磁共振谱和电喷雾质谱鉴定，它们的谱图分别如图1、2、3、4和5所示，具体的波谱特征数据如下：

红外光谱：(KBr,cm^-1)3313.18(ν_N-H),3050(ν_Ar-H),1636.0（ν_C=N）,1577.52(ν_C=C),1053.53(ν_C-N);

紫外光谱（H₂O）：ε_max=2.01×10⁴L·mol^-1·cm^-1(256nm)；

核磁共振谱（氢谱）：¹H NMR(500MHz,DMSO)δ9.10(s,1H,CH=N),8.55(d,J=8.4Hz,2H,Ar-H),8.48(d,J=8.5Hz,2H,Ar-H),7.63–7.48(m,4H,Ar-H),6.65(s,1H,CH2),6.52(s,1H,CH2),5.45(s,2H,NH),3.42(s,4H,CH₂CH₂),2.50(s,1H,-OH);

核磁共振谱（碳谱）：¹³C NMR(125MHz,DMSO)δ165.97,143.90,133.75,130.05,129.78,126.64,126.00,125.58,55.96,42.97,42.17.

电喷雾质谱的正离子峰:m/z=319[M+H]⁺.

因此，可确定上述黄色固体产物为9-羟甲基-10-咪蒽腙，分子式为C₁₉H₁₈N₄O，分子量为318g/mol，其化学结构式如下：

实施例2

1)取0.01mol的9,10-蒽二甲醛和0.01mol的4,5-二氰咪唑-2-肼溴化氢溶于100mL的无水甲醇中，70℃条件下回流反应至完全(TLC跟踪检测，约3h)，停止反应，将反应液冷却至20℃，静置2h，析出橙色固体，过滤，所得固体真空干燥，得到产物A，产率65%；

2)将产物A进硅胶柱层析，用由体积比为1：70的无水甲醇和氯仿组成的混合溶剂洗脱，薄层层析跟踪检测，收集含目的成分的洗脱液，所得洗脱液浓缩、干燥，得到目标中间体；

3)取0.01mol的目标中间体，用20mL无水甲醇加热溶解为澄清溶液；取0.02mol的NaBH₄，用5mL无水甲醇溶解为澄清溶液，缓慢滴加到目标中间体的甲醇溶液中，室温搅拌6h,向反应液中加入200mL蒸馏水，然后于4℃条件下静置，析出黄色固体，分离出固体，干燥，得到9-羟甲基-10-咪蒽腙，产率为35%。

实施例3

1)取0.01mol的9,10-蒽二甲醛和0.01mol的4,5-二氰咪唑-2-肼溴化氢溶于80mL的无水乙醇中，120℃条件下回流反应至完全(TLC跟踪检测，约3h)，停止反应，将反应液冷却至25℃，静置4h，析出橙色固体，过滤，所得固体真空干燥，得到产物A，产率60%；

2)将产物A进硅胶柱层析，用由体积比为1：100的无水甲醇和乙酸乙酯组成的混合溶剂洗脱，薄层层析跟踪检测，收集含目的成分的洗脱液，所得洗脱液浓缩、干燥，得到目标中间体；

3)取0.01mol的目标中间体，用30mL无水甲醇加热溶解为澄清溶液；取0.015mol的NaBH₄，用5mL无水甲醇溶解为澄清溶液，缓慢滴加到目标中间体的甲醇溶液中，室温搅拌2h,向反应液中加入80mL蒸馏水，然后于4℃条件下静置，析出黄色固体，分离出固体，干燥，得到9-羟甲基-10-咪蒽腙，产率为30%。

实施例4

1)取0.01mol的9,10-蒽二甲醛和0.01mol的4,5-二氰咪唑-2-肼溴化氢溶于50mL的由无水乙醇和正丁醇组成的混合溶液（其中无水乙醇和正丁醇的体积比为4：1）中，80℃条件下回流反应至完全(TLC跟踪检测，约4h)，停止反应，将反应液冷却至15℃，静置3h，析出橙色固体，过滤，所得固体真空干燥，得到产物A，产率65%。

2)将产物A进硅胶柱层析，用由体积比为1：50的无水甲醇和二氯甲烷组成的混合溶剂洗脱，薄层层析跟踪检测，收集含目的成分的洗脱液，所得洗脱液浓缩、干燥，得到目标中间体；

3)取0.01mol的目标中间体，用30mL无水甲醇加热溶解为澄清溶液；取0.1mol的NaBH₄，用20mL无水甲醇溶解为澄清溶液，缓慢滴加到目标中间体的甲醇溶液中，室温搅拌4h,向反应液中加入50mL蒸馏水，然后于10℃条件下静置，析出黄色固体，分离出固体，干燥，得到9-羟甲基-10-咪蒽腙，产率为55%。

实施例5

1)取0.01mol的9,10-蒽二甲醛和0.01mol的4,5-二氰咪唑-2-肼溴化氢溶于200mL的由无水乙醇和无水甲醇组成的混合溶液（其中无水乙醇和无水甲醇的体积比为5：1）中，80℃条件下回流反应至完全(TLC跟踪检测，约6h)，停止反应，将反应液冷却至10℃，静置2h，析出橙色固体，过滤，所得固体真空干燥，得到产物A，产率65%。

2)将产物A进硅胶柱层析，用由体积比为1：20的无水甲醇和氯仿组成的混合溶剂洗脱，薄层层析跟踪检测，收集含目的成分的洗脱液，所得洗脱液浓缩、干燥，得到目标中间体；

3)取0.01mol的目标中间体，用20mL无水甲醇加热溶解为澄清溶液；取0.04mol的NaBH₄，用10mL无水甲醇溶解为澄清溶液，缓慢滴加到目标中间体的甲醇溶液中，室温搅拌12h,向反应液中加入100mL蒸馏水，然后于20℃条件下静置，析出黄色固体，分离出固体，干燥，得到9-羟甲基-10-咪蒽腙，产率为60%。

为了充分说明本发明所述的9-羟甲基-10-咪蒽腙在制药中的用途，申请人对9-羟甲基-10-咪蒽腙进行了体外抗肿瘤活性实验。

1、细胞株的培养

本实验选用人肝癌细胞HepG2、人肺腺癌细胞A549，白血病K562细胞，人乳腺癌细胞MDA-MB-231，人骨肉瘤细胞MG-63等5种人类肿瘤细胞株。所有细胞株均培养在含10wt%小牛血、100U/mL青霉素、100U/mL链霉素的RPMI-1640或DMEM培养液内，在37℃含体积浓度5%CO₂孵箱中培养。倒置显微镜观察细胞生长情况。

2.初筛

本发明使用的化合物9-羟甲基-10-咪蒽腙的纯度≥95%（由本发明实施例1制得）。将化合物配制成20μmol/L，助溶剂DMSO终浓度≤1%，测试该浓度下化合物对肿瘤细胞生长的抑制程度。凡是对肿瘤细胞生长产生明显抑制效果的，且符合光镜下细胞受抑的形态变化（如细胞皱缩，破碎，漂浮等）的，则判定为初筛有效。

3.细胞生长抑制实验

将化合物以DMSO助溶后，使用完全培养基稀释至终浓度为20μmol/L的工作液，再用直径d=0.22μm的微孔滤膜过滤除菌，置于4℃下保存。分别将处于对数生长期的不同肿瘤细胞株以每孔190μL接种于96孔板，使待测细胞密度至1000～10000孔（边缘孔用无菌的PBS填充）培养12小时，待细胞贴壁后，加入受试化合物工作液，化合物平行设4个复孔，其中DMSO终浓度≤1%，同时设相应的阴性对照组（培养液中只有细胞和等量DMSO，无化合物）和空白对照组（培养液中只有等量的化合物，无细胞），每个浓度梯度平行设有4个复孔，化合物作用时间48小时。培养结束前4小时每孔加入10μL MTT（5mg/mL PBS，即0.5%MTT），继续培养4小时后，倾去孔内残余培养液，每孔加入DMSO150μL/孔，平板震荡器振荡5min，空白对照组调零，用酶标仪以570nm/630nm双波长测定去除本底光吸收值后的吸光度（A）值，测得抑制率。根据不同梯度浓度下所测得的抑制率，通过Bliss软件计算出化合物对不同细胞株的半数生长抑制浓度值，即IC₅₀值。活性测试结果如下述表1所示。

表1.9-羟甲基-10-咪蒽腙对不同肿瘤细胞株的IC₅₀值（μM）

从体外抗肿瘤活性测试结果来看，9-羟甲基-10-咪蒽腙对于所测的5种肿瘤细胞株大多具有显著的体外增殖抑制活性，其中，对人肝癌细胞株HepG2、人乳腺癌细胞MDA-MB-231、人肺腺癌细胞A549的抑制活性均低于4μM，显示出较强的活性；对白血病细胞K562的抑制活性则较低，约20μM；只有对骨肉瘤细胞株MG-63无显著抑制率。这表明，9-羟甲基-10-咪蒽腙不但具有显著的体外抗肿瘤活性，还表现出一定的选择性。另一方面，与临床抗癌药物-顺铂相比，9-羟甲基-10-咪蒽腙在已经对比测试的3种肿瘤细胞中，对HepG2和A549的活性均高于顺铂。

综上所述，本发明所涉及的化合物—9-羟甲基-10-咪蒽腙的体外抗肿瘤活性显著，且表现出对不同肿瘤细胞的增殖抑制活性的选择性，具有作为潜在的新型有机抗肿瘤药物进行深入研究开发的价值，有望用于各种抗肿瘤药物的制备。

Claims (10)

1.9-羟甲基-10-咪蒽腙，其结构式如下式所示：

2.权利要求1所述的9-羟甲基-10-咪蒽腙的合成方法，其特征在于：称取等物质的量的9,10-蒽二甲醛和4,5-二氰咪唑-2-肼溴化氢，混合溶于有机溶剂中，进行醛胺缩合反应，得到混合产物；混合产物经硅胶柱层析，用甲醇和选自二氯甲烷、氯仿和乙酸乙酯中的一种组成的混合溶剂进行洗脱，洗脱液浓缩、干燥，得到目标中间体；取目标中间体与硼氢化钠在醇类溶剂存在条件下进行还原反应，向反应液中加水，静置、析出，分离出固体，即得到9-羟甲基-10-咪蒽腙。

3.根据权利要求2所述的9-羟甲基-10-咪蒽腙的合成方法，其特征在于：具体包括以下步骤：

1)称取等物质的量的9,10-蒽二甲醛和4,5-二氰咪唑-2-肼溴化氢，混合溶于有机溶剂中，于70～150℃条件下回流反应至完全，反应液静置、析出，得到混合产物；

2)混合产物经硅胶柱层析，用无水甲醇和选自二氯甲烷、氯仿和乙酸乙酯中的一种组成的混合溶剂进行洗脱，薄层层析跟踪检测，收集含目的成分的洗脱液，浓缩、干燥，得到目标中间体；

3)取目标中间体和硼氢化钠分别溶于醇类溶剂中，于0～30℃条件下，将硼氢化钠的醇溶液滴加于目标中间体的醇溶液中，搅拌反应至完全，向反应液中加水，静置、析出，分离出固体，即得到9-羟甲基-10-咪蒽腙。

4.根据权利要求3所述的9-羟甲基-10-咪蒽腙的合成方法，其特征在于：步骤1）中，所述的有机溶剂为无水乙醇或无水甲醇，或者是无水乙醇与无水甲醇或正丁醇的组合。

5.根据权利要求3所述的9-羟甲基-10-咪蒽腙的合成方法，其特征在于：步骤1）中，回流反应的温度为70～100℃。

6.根据权利要求3所述的9-羟甲基-10-咪蒽腙的合成方法，其特征在于：步骤2）中，用于洗脱的混合溶剂中，甲醇与二氯甲烷或氯仿或乙酸乙酯的体积比为1：20～100。

7.根据权利要求3所述的9-羟甲基-10-咪蒽腙的合成方法，其特征在于：步骤3）中，产物B和硼氢化钠的摩尔比为1：1.5～10。

8.根据权利要求3所述的9-羟甲基-10-咪蒽腙的合成方法，其特征在于：步骤3）中，所述的醇类溶剂为无水乙醇和/或无水甲醇。

9.权利要求1所述的9-羟甲基-10-咪蒽腙在制备抗肿瘤药物中的应用。

10.以权利要求1所述的9-羟甲基-10-咪蒽腙为有效成分制备的抗肿瘤药物。

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