CN102942554B - 胡椒乙胺缩水杨醛及其合成方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种胡椒乙胺缩水杨醛及其合成方法和应用。所述胡椒乙胺缩水杨醛的合成方法为：称取相等物质的量的水杨醛和胡椒乙胺溶解于有机溶剂中，于40℃至有机溶剂的沸点温度范围内进行缩合反应，反应完全后冷却，静置析晶，分离出晶体，干燥，即得。申请人通过考察胡椒乙胺缩水杨醛对7种人肿瘤细胞株的增殖抑制活性，结果表明其体外抗肿瘤活性具有一定的选择性，对HepG2肿瘤株的增殖抑制活性显著，具有较好的潜在药用价值；另外，它对SK-OV-3/DDP表现出较好的增殖抑制活性，有利于其有效克服肿瘤株对顺铂的耐药性。上述胡椒乙胺缩水杨醛的结构式如下式所示：

Description

胡椒乙胺缩水杨醛及其合成方法和应用

技术领域

本发明涉及医药技术领域，具体涉及胡椒乙胺缩水杨醛及其合成方法和应用。

背景技术

席夫碱是一类非常重要的有机化合物，其结构特征是含有亚胺或甲亚胺特性基团(-RC=N-)，通常由胺和活性羰基缩合而成。席夫碱的功能和应用领域十分广泛，包括医药学、生物、材料等多个领域，其中在药学研究方面是热点研究领域之一。

已有的研究结果充分表明，席夫碱具有广泛的生物活性和药理活性，如抗肿瘤、抗菌、抗病毒、抗疟疾、消除炎症和解热等。席夫碱所特有的亚胺基团或甲亚胺基团在自然界及派生物和人工合成的化合物中相当常见，而很多研究也表明这些化合物中的亚胺基团在席夫碱的生物活性表现中起着关键作用；而亚胺基两侧所联接的功能基团则为席夫碱活性的多样性提供了更大的选择空间。如有报道显示，胡椒乙胺及其衍生物席夫碱在微摩尔浓度时即具有了一定的抗菌活性，能够显著抑制毛癣菌（MIC=820～980μM）和絮状表皮癣菌（MIC=200～930μM）的生长(Pandeya S N,et al.1999)。但目前尚未见有以胡椒乙胺和水杨醛为结构基础的新型席夫碱的合成及其活性研究的相关报道。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种新的席夫碱化合物，具体是提供以胡椒乙胺和水杨醛为结构基础的胡椒乙胺缩水杨醛及其合成方法和应用。

本发明所述的胡椒乙胺缩水杨醛，其结构式如下式所示：

上述胡椒乙胺缩水杨醛的合成方法为：称取相等物质的量的水杨醛和胡椒乙胺溶解于有机溶剂中，于40℃至有机溶剂的沸点温度范围内进行缩合反应，反应完全后冷却，静置析晶，分离出晶体，干燥，即得到胡椒乙胺缩水杨醛。

上述合成方法中，

所述的有机溶剂可以是选自二氯甲烷、乙醇、甲醇和氯仿中的任意一种或两种以上的组合。当有机溶剂为上述两种以上的组合时，它们之间的配比可以为任意配比。有机溶剂在使用前最好先用分子筛进行脱水，从而更有利于反应的进行。有机溶剂的用量可根据需要确定，通常为能溶解参加反应的水杨醛和胡椒乙胺即可，具体可以是0.01mol的水杨醛和0.01mol胡椒乙胺用20～300mL有机溶剂来溶解，优选用30～100mL来溶解。当有机溶剂的投入量较大时，在停止反应后，可先通过减压蒸馏等方法除去大部分有机溶剂(通常为除去占有机溶剂投入量的80～95%)，然后将反应液冷却、静置后同样会析出目标产物晶体。

缩合反应时采用薄层层析(TLC)跟踪检测缩合反应是否完全，在上述温度范围内缩合反应至完全大约需要1～12h。进行缩合反应的温度优选为60～70°C，此条件下反应至完全约3～6h。

反应完全后通常是将反应液冷却至10～25℃进行静置析晶。静置的时间通常为1～12h。所述的干燥通常采用真空干燥，温度一般控制在25～50°C。

由上述方法制备胡椒乙胺缩水杨醛的产率在70～90%左右，制得的胡椒乙胺缩水杨醛可通过溶剂重结晶的方法达到进一步纯化的目的，所述的溶剂与前述有机溶剂相同。

本发明还包括上述胡椒乙胺缩水杨醛在制备抗肿瘤药物中的应用。

本发明还包括以上述胡椒乙胺缩水杨醛为有效成分制备的抗肿瘤药物。

与现有技术相比，本发明以胡椒乙胺和水杨醛两种医药合成中间体为结构基础，通过醛胺脱水缩合反应得到胡椒乙胺缩水杨醛；合成方法简单、反应条件温和，且反应原料价廉易得；申请人还考察了胡椒乙胺缩水杨醛对7种人肿瘤细胞株的增殖抑制活性，结果表明其体外抗肿瘤活性具有一定的选择性，对特定肿瘤株的增殖抑制活性显著，显示出良好的潜在药用价值，有望用于各种抗肿瘤药物的制备。

附图说明

图1为本发明实施例1制得的产物的红外光谱谱图；

图2为本发明实施例1制得的产物的紫外光谱谱图；

图3为本发明实施例1制得的产物的核磁共振氢谱图；

图4为本发明实施例1制得的产物的核磁共振碳谱图；

图5为本发明实施例1制得的产物的电喷雾质谱的正离子峰谱图。

具体实施方式

下面以具体实施方式对本发明作进一步说明，但本发明并不局限于这些实施例。

实施例1

取0.01mol的水杨醛和0.01mol的胡椒乙胺溶解于20mL的无水乙醇中(无水乙醇使用前用

分子筛脱水)，所得溶液在搅拌条件下于78℃回流反应至完全(TLC跟踪检测，约3h)，停止反应，将反应液充分冷却至20℃，静置1h，析出黄色针状晶体，过滤，所得晶体室温条件下真空干燥10h，得到黄色固体产物，产率85%。

对上述得到的黄色固体产物分别进行红外光谱、紫外光谱、¹H和¹³C核磁共振谱和电喷雾质谱鉴定，它们的谱图分别如图1、2、3、4和5所示，具体的波谱特性如下：

红外光谱：(KBr,cm^-1)3429(ν_N-H),2894(ν_Ar-H),1634(ν_C=N),1610,1501,1440(ν_C=C),1283,1244(ν_C-O),1039(ν_C-N)；

紫外光谱（H₂O）：ε_max=3.18×10⁴L·mol^-1·cm^-1(232nm)；

核磁共振谱（氢谱）：¹H NMR(500MHz,CDCl₃)δ13.46(s,1H,OH),8.25(s,1H,HC=N),7.32(d,J=14.1Hz,1H,H-Ar),7.21(d,J=6.2Hz,1H,H-Ar),6.98(d,J=8.2Hz,1H,H-Ar),6.88(t,J=7.4Hz,1H,H-Ar),6.77–6.72(m,2H,H-Ar),6.68(d,J=6.6Hz,1H),H-Ar,5.94(s,2H,OCH₂O),3.81(dd,J=10.7,3.4Hz,2H,CH₂),2.95(dd,J=10.6,3.5Hz,2H,CH₂)；

核磁共振谱（碳谱）：¹³C NMR(125MHz,CDCl₃)δ160.37,156.50,142.96,141.32,128.30,127.44,126.49,117.13,114.02,113.78,112.29,104.47,103.56,96.13,56.53,32.42；

电喷雾质谱：m/z 270[M+H]⁺.

因此，可确定上述黄色固体产物为胡椒乙胺缩水杨醛，分子式为C₁₆H₁₅NO₃，分子量为269g/mol，其化学结构式如下：

实施例2：

取0.01mol的水杨醛和0.01mol的胡椒乙胺溶解于100mL的二氯甲烷中（二氯甲烷用分子筛脱水后使用），所得溶液于40℃条件下搅拌反应至完全(TLC跟踪检测，约12h)，停止反应，减压蒸馏除去大部分二氯甲烷溶剂(占二氯甲烷用量的85%)，余下反应液充分冷却至10℃，静置12h，析出黄色针状晶体，过滤,所得晶体室温条件下真空干燥2h，即得到黄色固体产物，产率90%。

对上述黄色固体产物进行谱学分析，其波谱特性与实施例1制得的产物相同，因此，可确定本实施例制得的黄色固体产物为胡椒乙胺缩水杨醛。

实施例3

取0.01mol的水杨醛和0.01mol的胡椒乙胺混合溶解于300mL的氯仿/无水乙醇混合溶剂中（氯仿与无水乙醇的体积比为4：1，氯仿与无水乙醇使用前均用

分子筛脱水），所得溶液于60℃条件下搅拌反应至完全(TLC跟踪检测，约1h)，停止反应，通过减压蒸馏方法除去大部分溶剂(占有机溶剂用量的80%)，余下反应液充分冷却至25℃，静置1h，析出黄色针状晶体，过滤，所得晶体室温条件下真空干燥24h，即得到胡椒乙胺缩水杨醛，产率70%。

实施例4

取0.01mol的水杨醛和0.01mol的胡椒乙胺溶解于200mL的无水甲醇中(无水甲醇使用前用

分子筛脱水)，所得溶液于50℃下搅拌反应至完全(TLC跟踪检测，约4h)，停止反应，通过减压蒸馏方法除去大部分溶剂(占有无水甲醛醇用量的90%)，余下反应液充分冷却至10℃，静置5h，析出黄色针状晶体，过滤，所得晶体室温条件真空干燥5h，即得到胡椒乙胺缩水杨醛，产率82%。

为了充分说明本发明所述的胡椒乙胺缩水杨醛在制药中的用途，申请人对胡椒乙胺缩水杨醛进行了体外抗肿瘤活性实验。

一、胡椒乙胺缩水杨醛对7种人类肿瘤细胞株的增殖抑制活性实验：

1、细胞株与细胞培养

本实验选用人肺癌细胞NCI-H460、胃癌细胞MGC80-3、人肝癌细胞BEL-7402、HepG2、膀胱癌细胞T-24、卵巢癌细胞SK-OV-3、卵巢癌耐顺铂细胞SK-OV-3/DDP。

所有细胞株均培养在含10wt%小牛血、100U/mL青霉素、100U/mL链霉素的RPMI-1640或DMEM培养液内，置37℃含体积浓度5%CO₂孵箱中培养。倒置显微镜观察细胞生长情况，0.25%胰蛋白酶消化传代，取对数生长期细胞用于实验。

2、待测化合物的配制

所用的胡椒乙胺缩水杨醛为本发明实施例1制得的产物用无水乙醇重结晶2次所得，其纯度≥95%，将其DMSO储液（浓度为0.001mol/L）通过RMPI1640培养基依次稀释成五个浓度梯度，分别为40、20、10、5、2.5μmol/L，其中助溶剂DMSO终浓度≤1%。首先测试10μmol/L或20μmol/L浓度下胡椒乙胺缩水杨醛对于不同肿瘤细胞增殖的抑制率，视为初筛结果（其中，对SK-OV-3/DDP、T-24、HepG2细胞株，初筛浓度为20μmol/L，对其余细胞株的初筛浓度为10μmol/L）。再分别测试不同梯度浓度下目标产物对各种肿瘤细胞的增殖抑制程度，用以拟合计算半数抑制浓度，即IC₅₀值。

3、细胞生长抑制实验（MTT法）

(1)取对数生长期的肿瘤细胞，经胰蛋白酶消化后，用含10%小牛血清的培养液配制成浓度为5000个/mL的细胞悬液，以每孔190μL接种于96孔培养板中，使待测细胞密度至1000～10000个/孔(边缘孔用无菌PBS填充)；

(2)5%CO2，37℃孵育24h，至细胞单层铺满孔底，每孔加入一定浓度梯度的药物10μL，每个浓度梯度设4个复孔；

(3)5%CO2，37℃孵育48h，倒置显微镜下观察；

(4)每孔加入10μL的MTT溶液(5mg/mL PBS，即0.5%MTT)，继续培养4h；

(5)终止培养，小心吸去孔内培养液，每孔加入150μL DMSO充分溶解甲瓒沉淀，振荡器混匀后，在酶标仪用波长为570nm，参比波长为450nm测定各孔的光密度值；

(6)同时设置调零孔(培养基、MTT、DMSO)，对照孔(细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、DMSO)。

(7)根据测得的光密度值(OD值)，来判断活细胞数量，OD值越大，细胞活性越强。利用公式：

计算化合物对肿瘤细胞生长的抑制率。其测试结果如下表1所示：

表1：胡椒乙胺缩水杨醛对不同肿瘤细胞株的生长抑制率(%)

注：对SK-OV-3/DDP、T-24、HepG2细胞株，初筛浓度为20μmol/L，对其余细胞株的初筛浓度为10μmol/L；“—”表示无活性；“ND”表示未测定。

进一步通过Bliss软件对五个浓度梯度的抑制率数据进行拟合，求出产物对不同肿瘤株的半数抑制浓度（IC₅₀值，单位μmol/L），结果如下表2所示：

表2：胡椒乙胺缩水杨醛对不同肿瘤细胞株的IC₅₀值（μM）

从体外抗肿瘤活性测试结果来看，胡椒乙胺缩水杨醛对于不同的人肿瘤细胞株表现出不同的增殖抑制活性。从初筛结果来看，除对宫颈癌细胞HeLa229细胞和卵巢癌细胞SK-OV-3没有活性以外，对其它5种肿瘤株均表现出一定的抑制活性，但总体活性较弱，只有对肝癌细胞HepG2表现出较高的活性，在20μmol/L浓度下抑制率超过了50%，达到52.34±9.90。此外，值得注意的是，化合物具有对人宫颈癌耐顺铂细胞株SK-OV-3/DDP的抑制活性，而对SK-OV-3则无活性。这与一线临床抗癌药物——顺铂的活性作用是相反的，表明其与顺铂的抗肿瘤作用机制完全不同，有利于其克服肿瘤株对顺铂的耐药性。

而进一步的IC₅₀值数据也同样表明其对肝癌细胞HepG2的活性最高，IC₅₀值达到15.63±3.38μM；而对膀胱癌细胞T-24也有一定的抑制活性，IC₅₀值达到34.59±1.80μM。上述结果显示，胡椒乙胺缩水杨醛对不同人肿瘤细胞株具有一定的活性选择性，其对人肝癌细胞HepG2具有明显的毒性选择性，具有深入研究开发的价值。另一方面，胡椒乙胺缩水杨醛对上述肿瘤细胞株的增殖抑制活性仍然明显低于顺铂，但这也表明胡椒乙胺缩水杨醛对正常组织细胞的毒性也比较低。

综上所述，本发明所涉及的化合物——胡椒乙胺缩水杨醛总体表现出了一定的体外抗肿瘤活性，对人肝癌细胞HepG2具有明显的毒性选择性，具有良好的潜在药用价值，有望用于各种抗肿瘤药物的制备。

Claims (8)

1.胡椒乙胺缩水杨醛，其结构式如下式所示：

2.权利要求1所述的胡椒乙胺缩水杨醛的合成方法，其特征在于：称取相等物质的量的水杨醛和胡椒乙胺溶解于有机溶剂中，于40℃至有机溶剂的沸点温度范围内进行缩合反应，反应完全后冷却，静置析晶，分离出晶体，干燥，即得到胡椒乙胺缩水杨醛。

3.根据权利要求2所述的胡椒乙胺缩水杨醛的合成方法，其特征在于：所述的有机溶剂选自二氯甲烷、无水乙醇、甲醇和氯仿中的任意一种或两种以上的组合。

4.根据权利要求2所述的胡椒乙胺缩水杨醛的合成方法，其特征在于：所述缩合反应的温度为60～70℃。

5.根据权利要求2所述的胡椒乙胺缩水杨醛的合成方法，其特征在于：反应完全后将反应液冷却至10～25℃。

6.根据权利要求2所述的胡椒乙胺缩水杨醛的合成方法，其特征在于：静置的时间为1～12h。

7.权利要求1所述的胡椒乙胺缩水杨醛在制备抗肿瘤药物中的应用。

8.以权利要求1所述的胡椒乙胺缩水杨醛为有效成分制备的抗肿瘤药物。

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