CN102993018B - 一种5-硝基咖啡酸金刚醇酯及其在制备抗肿瘤药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种如式（I）所示的5-硝基咖啡酸金刚醇酯，并公开了其制备方法及其在制备抗肿瘤药物中的应用，特别是在制备抗胃癌、肝癌或白血病药物中的应用。

Description

一种5-硝基咖啡酸金刚醇酯及其在制备抗肿瘤药物中的应用

（一）技术领域

本发明涉及一种具有广谱抗肿瘤活性的化合物5-硝基咖啡酸金刚醇酯及其在抗癌肿瘤方面的用途。

（二）背景技术

无论在世界范围内还是在中国，以恶性肿瘤（癌症）、心血管疾病以及糖尿病等为代表的慢性病（或者说非传染性疾病），正在成为人类的长期威胁。其中，癌症位列首位。

1988年，Grunberger等人（Experientia,44:230-232,1988）首次从蜂胶中分离出咖啡酸苯乙酯（简称CAPE），并证实CAPE对细胞具有选择性的毒杀作用。他们以受到病毒诱发转型的细胞为底物，发现2μg/ml浓度的CAPE，便可以有效抑制这些不正常细胞的成长，但是对于正常的老鼠细胞，即使CAPE的浓度提高5倍（10μg/ml）时，仍不具毒性。陈建宏等（Cancer Letters，108：211-214，1996）研究表明，在HL-60细胞中，CAPE可以分别抑制DNA、RNA和蛋白质的合成，所对应的IC₅₀浓度分别为1.0μM、5.0μM和1.5μM。2002年，Nagaoka等（Bioorganic&Medicinal Chemistry,10：138-144，2002）研究了CAPE对结肠癌细胞26-L5的抑制作用发现EC₅₀为0.15μM，而且对人肺癌A-549细胞，人纤维肉瘤细胞HT-1080和人宫颈癌细胞（HeLa）等也有明显的抑制作用。李衍章等（Cancer Letters,153,51-56，2000）研究发现，CAPE对人乳腺癌细胞（MCF-7）也有明显的作用,当CAPE浓度为5ug/mL时，抑制率为50%；而当浓度为10ug/mL时，抑制率达100%。此外，对黑素瘤细胞（SK-Mel-28,SK-Mel-170）也有明显的抑制作用（Science,229：984，1985）。

（三）发明内容

本发明即是为了提供一种新的具有显著抗肿瘤活性的咖啡酸酯：5-硝基咖啡酸金刚醇酯及其制备方法。

为达到发明目的本发明采用的技术方案是：

一种如式（I）所示的5-硝基咖啡酸金刚醇酯，又名3-（3,4-二羟基-5-硝基苯基）-丙烯酸金刚酯。

所述5-硝基咖啡酸金刚醇酯的制备方法系以3,4-二羟基-5-硝基苯甲醛、丙二酸亚异丙酯和1-金刚醇为反应底物，经醇解和缩合反应而制得。

具体的，本发明所述的5-硝基咖啡酸金刚醇酯的可按以下方法制得：式（III）所示的丙二酸亚异丙酯和式（IV）1-金刚醇在极性溶剂中，加热回流，进行醇解反应3～5小时，冷却后向反应液中加入式（II）所示的3,4-二羟基-5-硝基苯甲醛、缚酸剂和缩合催化剂，于0～120℃（优选100~120℃）进行缩合反应10～24小时，反应结束后反应体系分离纯化制得所述5-硝基咖啡酸金刚醇酯；

所述式（II）所示的3,4-二羟基-5-硝基苯甲醛、式（III）所示的丙二酸亚异丙酯和式（IV）1-金刚醇的物质的量之比为1:1.2~1.3:1.2~1.3，优选1:1.25:1.25。

所述极性溶剂为甲苯，所述缚酸剂为吡啶。

所述缩合催化剂为哌啶。

所述极性溶剂的用量以式（III）所示的丙二酸亚异丙酯的物质的量计为1.5~3mL/mmol。

所述缚酸剂的用量以式（II）所示的3,4-二羟基-5-硝基苯甲醛的物质的量计为0.5~1mL/mmol。

所述缩合催化剂的物质的量与式（II）所示的3,4-二羟基-5-硝基苯甲醛的物质的量之比为0.5~5:1。

所述反应体系分离纯化方法为：反应结束后，反应体系减压蒸馏除去溶剂，残液冷却后加入乙醇溶解，再加入乙酸乙酯，搅拌20~60min，然后依次用稀HCl、NaHCO₃溶液、蒸馏水洗涤，干燥后抽干溶剂后得固体粗品，固体粗品再用体积比为1：1的乙醚、苯混合溶剂重结晶得5-硝基咖啡酸金刚醇酯纯品。

本发明所述的5-硝基咖啡酸金刚醇酯可应用于制备抗肿瘤药物。具体的，所述5-硝基咖啡酸金刚醇酯可应用于制备抗胃癌、肝癌或白血病药物。

本发明的有益效果主要体现在：合成了一种新化合物；经体外活性筛选得到的5-硝基咖啡酸金刚醇酯对SCG7901、HepG2和HL-60的抑制IC₅₀分别为4.59μM、3.84μM和4.06μM，生长曲线表明5-硝基咖啡酸金刚醇酯对SCG7901细胞有明显的时-效关系，急性毒性实验显示5-硝基咖啡酸金刚醇酯具有很低的毒性。因此，具有抗肿瘤新药开发应用前景。

（四）附图说明

图15-硝基咖啡酸金刚醇酯对SGC7901的抑制曲线

（五）具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1：5-硝基咖啡酸金刚醇酯的制备

将152.2g（1.0mol）香兰素溶于500mL冰醋酸中，在冰浴冷却下慢慢滴加150mL质量浓度65％（d=1.4g/mL）的浓HNO₃，温度控制在20℃以下。加完后在常温下反应1.5h。将反应液倒入2L水中搅拌0.5h。过滤，滤饼用3L水打浆洗涤2次。抽干得黄色固体5-硝基香兰素，低温干燥得181.6g产品。收率：92.1％，熔点：172-173℃（文献值177-178℃（Grenier等，J.Physi.Org.Chem.,13：511-517,2000））。

取5-硝基香兰素66g溶于77.8g冰醋酸中，再加入289g重蒸浓氢溴酸。在116-120℃回流20h后加入5.0g活性碳搅拌0.5h，趁热过滤，滤饼用少量热冰醋酸打浆洗涤，过滤，合并所有冰醋酸层。加入160mL蒸馏水，搅匀。自然冷却到室温后，再冷却到-10℃，析出大量黄色固体。搅拌2h。趁冷过滤，滤饼用适量的蒸馏水打浆洗涤2次。抽干得黄色固体3,4-二羟基-5-硝基苯甲醛，低温干燥得36.6g产品。收率：59.7％，熔点：142-143℃（文献值145-146℃（Perza等，J.Med.Chem.,35,4584-8,1992））。¹H NMR(CDCl₃,500MHz)δppm：9.91(s,1H,CHO),8.23(d,1H,J＝1.9Hz,Ar-H),7.77(d,1H,J＝1.9Hz,Ar-H)。

将丙二酸亚异丙酯0.72g（5mmol），1-金刚醇0.76g（5mmol）和10mL甲苯加入50mL三口瓶中，在110℃回流4h后自然冷却。向冷却到室温的反应液中加3,4-二羟基-5-硝基苯甲醛0.73g（4mmol）和吡啶2.0mL，搅拌，待固体全溶后加哌啶1.0mL。于106℃下搅拌回流约10小时，TLC点板跟踪直至反应完全结束。反应后减压蒸馏去除溶剂，残液冷却后加入5mL乙醇溶解后加入30mL乙酸乙酯，搅拌0.5h。用稀HCl、NaHCO₃溶液和蒸馏水各30mL洗涤；无水MgSO₄干燥过夜。抽干溶剂后得棕黄固体0.82g，收率57.1％，用体积比为1：1乙醚、苯混合溶剂重结晶得淡黄色晶体，即为5-硝基咖啡酸金刚醇酯。

熔点：176-177℃；结构表征：IR(KBr)υcm^-1：3446，2912，2851，1700，1636,1545,1384；1H NMR(DMSO-d6,500MHz)δppm：10.54(brs,1H,OH),7.69(d,1H,J＝2.0Hz,Ar-H),7.44(d,1H,J＝15.9Hz,α-H),7.32(d,1H,J＝2.1Hz,Ar-H),6.32(d,1H,J＝16.0Hz,β-H),2.13-2.16(m,9H,3CH₂,3CH),1.61-1.65(m,6H,3CH₂).

实施例2：5-硝基咖啡酸金刚醇酯的抗肿瘤活性测试

人胃癌细胞株SGC-7901、人肝癌细胞株HepG-2和人白血病HL-60为贴壁生长的细胞，实验操作如下：

（1）将人胃癌细胞株SGC-7901或HepG-2或HL-60培养于含10%小牛血清PRMI1640培养液中，并置于37℃含5%湿饱和CO₂培养箱中，每2-3天传代1次。

（2）取对数生长期的肿瘤细胞株，弃培养液，加0.25%胰蛋白酶消化成单个细胞，加入PRMI1640培养液，中止消化，离心，去除上清液，加入PRMI1640培养液混匀。

（3）调整细胞悬液浓度，接种于96孔培养板，除去两侧的调零孔，其余每孔加入100μl，铺板使待测细胞调密度至1000-10000个/孔（边缘空白调零孔用空白培养液填充）。

（4）5%CO₂，37℃孵育，至细胞单层铺满孔底（96孔平底板），加入浓度梯度的药物。

原则上，细胞贴壁后即可加药，或两小时，或半天时间，通常在前一天下午铺板，次日上午加药。对一种化合物设有5个浓度梯度，4个复孔，重复实验三次以保证实验数据的准确性。

（5）5%CO₂，37℃孵育72小时后，于倒置生物显微镜下观察。

（6）每孔加入20μlMTT溶液（5mg/ml，即0.5%MTT），继续培养4h。若化合物与MTT能够反应，可先离心后弃去培养液，小心用PBS冲2-3遍后，再加入含MTT的培养液。

（7）终止培养，小心吸去孔内培养液。

（8）每孔加入150μl二甲基亚砜，轻轻晃动，使结晶物充分溶解。在酶标仪OD490nm处测量各孔的吸光值。

（9）除了给药的三组实验组，同时设置调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜），对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜）。

通过实验并计算得到5-硝基咖啡酸金刚醇酯对人胃癌细胞株SGC-7901，人肝癌细胞株HepG-2和人白血病HL-60的IC₅₀分别为1.65μg/ml、1.38μg/ml、1.46μg/ml。

实施例3：细胞曲线测定实验

取对数生长期的SGC-7901细胞，贴壁生长的细胞用0.25%的胰酶消化，吹打成单细胞悬液，接种于96孔板中（细胞密度1.0×104和1.5×104cells/mL），每孔100μL。分别于5%CO₂，37℃培育0h、24h、48h、72h、96h、120h、144h、168h、192h、216h、240h后，加药处理，每种药物设5个浓度梯度（药物终浓度呈1/2等比递减），同时设立对照组和空白组，每组均设4个平行孔，使每孔总体积为200μL。加入20μL 5mg/mL的MTT溶液，置于培养箱中5%CO₂，37℃孵育4h，然后弃去各孔中的上清液，再加入150μL DMSO，平面振荡混匀10min，待其各孔中的紫色结晶完全溶解后，置于酶标分光光度读板仪下测定各孔中的吸光值(OD，λ570nm)。

所得结果见图1。

由图1可知，5-硝基咖啡酸金刚醇酯的药物作用于SGC7901细胞24、36、48、72、96、120h后，可明显抑制细胞增殖，并且该抑制作用呈一定的剂量依赖性与时间依赖性在一定剂量范围内，5-硝基咖啡酸金刚醇酯对SGC7901细胞的作用具有明显的时-效关系。

实施例4：急性毒性测定实验

试验用药剂量分为三种，高剂量、中剂量、低剂量，浓度分别为20mg/kg、10mg/kg、5mg/kg，另设一组空白组为生理盐水。小鼠给药体积为0.1mL/10g，则对高剂量组而言：20mg/kg=0.2mg/10g，所以给药浓度为2mg/ml，则中低剂量组分别为1mg/ml、0.5mg/ml。另外小鼠体重较大的约为40-50g，则设给药为0.5ml每天，需连续给药10天，每种剂量组有4只小鼠，一共需给药量为0.5×4×10×2=40ml，所以三组一共需要40+20+10=70ml药物。

将16只小鼠随机分成4组，每组分别在头、背、尾设计好标记，剩下一只不用标记以示区别。对小鼠进行灌胃给药，给药量为0.3ml，每日给药一次，连续10日，停药次日断锥处死，称体重，剖取胸腺和脾脏，计算胸腺、脾脏指数：脾脏（胸腺）指数=脾脏（胸腺）重量（mg）/体重（g）。

下表2为实验初始时的小鼠体重：

表2.实验初始小鼠情况（体重）

之后连续给药10天，在第11天对小鼠进行解剖，解剖前小鼠的体重如表3：

表3.实验结束解剖前小数情况（体重）

从表2、3可以看出，施加不同剂量的药物对小鼠体重没有太大的影响。另外，测试小鼠解剖后分别取四组中相同部位标记的小鼠的肺、肾、肝、心脏、胸腺、脾、胃做比较，发现各器官的颜色、状态、大小无差异，所以可见该药物在所给最大剂量下对小鼠无毒性。

Claims (3)

1.一种如式（I）所示的5-硝基咖啡酸金刚醇酯：

2.如权利要求1所述的5-硝基咖啡酸金刚醇酯在制备抗肿瘤药物中的应用。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述5-硝基咖啡酸金刚醇酯在制备抗胃癌、肝癌或白血病药物中的应用。