CN103086863A - 阿卡宁二聚体类化合物及其在制备药物中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明属制药领域，涉及阿卡宁二聚体类化合物及其在制备抗补体、抗肿瘤药物中的用途。本发明从紫草科紫草属植物新疆紫草(Arnebia euchroma(Royle)Johnst)的乙酸乙酯部位提取阿卡宁二聚体类化合物并通过活性评价试验证实其对补体系统的经典途径和旁路途径具有较强的抑制作用以及细胞毒作用。所述对补体系统抑制作用的CH₅₀为0.42±0.09～0.48±0.08mM，AP₅₀为0.14±0.01～0.19±0.03mM；对肺癌细胞(A549)抑制作用的ED₅₀为＜0.32mM。所述化合物可用于制备抗补体和抗肿瘤药物。

Description

阿卡宁二聚体类化合物及其在制备药物中的用途

技术领域

本发明属中药制药领域，涉及阿卡宁二聚体类化合物及其在制药中的用途，尤其是在制备抗补体或抗肿瘤药物中的用途。

背景技术

补体系统的过度激活会引发系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、急性呼吸窘迫综合征等多种疾病。目前对此类疾病尚无理想的治疗药物，因此临床上急需高效、低毒、专一的新型补体抑制剂。直接从天然产物中研究开发补体抑制剂的成本低，并且大多数活性成分作为天然产物的一部分可以直接被机体消化吸收，因此近年来从天然来源中寻找新的具有抗补体活性的药物受到人们越来越多的关注。国内外的学者从天然产物中分离得到大量的具有补体系统抑制作用的单体化合物，为抗补体药物的研究与开发提供了广阔的前景。

肿瘤，尤其是恶性肿瘤，已成为近年来危害人类健康的主要疾病之一。而传统的治疗方式，多数以单一的化疗、放疗和手术为主。虽然这些治疗方案对于暂时的消除病灶有一定的帮助，但是始终无法达到根治肿瘤的目的，人们在如何遏制肿瘤生长方面已经作了大量的研究工作，因此近年来从天然来源中寻找新的具有抗肿瘤活性的药物受到人们越来越多的关注。

新疆紫草(Arnebia euchroma(Royle)Johnst)为紫草科(Boraginaceae)紫草属(Arnebia)植物的根，多年生草本，分布于新疆的天山南北坡和西藏的西部以及西伯利亚等地，多生长于海拔2500-4200米的山地砾石质阳坡、草地及草甸等处。新疆紫草的根味苦，性寒。有凉血活血、清热解毒、滑肠通便的功能，可用于预防麻疹、热病斑疹、黄疸、紫癜、吐衄尿血、血淋、血痢、痈肿疮毒、丹毒、湿疹、烧伤、热结便秘。现代药理研究证实其具有抗炎、解热、镇痛、镇静、抗病原微生物、抗肿瘤、抗生育等作用。近年来对紫草的研究集中在化学成分的分离及结构鉴定上，从中分离得到了一些紫草素类等化合物，但是迄今为止尚未见阿卡宁二聚体类化合物及其具有抗补体、抗肿瘤活性的报道。

发明内容

本发明的目的是提供新的具有抗补体活性的物质，具体涉及阿卡宁二聚体类化合物，特别涉及其中的化合物异阿卡宁A(isoalkannin A)和异阿卡宁B(isoalkannin B)，所述化合物均为新化合物。

本发明的进一步目的是提供上述阿卡宁二聚体类化合物在制药中的用途，尤其是在制备抗补体或抗肿瘤药物中的用途。

本发明应用现代药理筛选方法，对植物药中抗补体、抗肿瘤活性物质进行研究，从紫草科(Boraginaceae)紫草属(Arnebia)植物新疆紫草(Arnebiaeuchroma(Royle)Johnst)干燥根的乙醇提取物的乙酸乙酯部位分离得到阿卡宁二聚体类活性物质并证实其具有抗补体和抗肿瘤作用。

本发明的阿卡宁二聚体类化合物具有下式的化学结构：

上述的阿卡宁二聚体类化合物，当R＝H时，化合物为7-(3-萘醌基)-阿卡宁(异阿卡宁A，isoalkannin A)；当R＝CH₂CH＝C(CH₃)₂时，化合物为3-异戊烯基-7-(3-萘醌基)-阿卡宁(异阿卡宁B，isoalkannin B)。

本发明所述的异阿卡宁类化合物通过下述方法制备：

新疆紫草根粗粉20kg，室温下以95％乙醇反复冷浸、渗漉提取数次后，减压回收溶剂，得到浸膏820g，浸膏悬浮于蒸馏水中，以石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取，得到乙酸乙酯萃取物420g。取乙酸乙酯萃取物180g经硅胶柱色谱，以石油醚(60～90℃)、石油醚(60～90℃)-丙酮、丙酮梯度洗脱，所得流分以不同洗脱剂进行反复硅胶柱色谱和制备色谱，分离得到化合物7-(3-萘醌基)-阿卡宁(异阿卡宁A，isoalkannin A，1)和3-异戊烯基，7-(3-萘醌基)-阿卡宁(异阿卡宁B，isoalkannin B，2)。

其中，7-(3-萘醌基)-阿卡宁(异阿卡宁A，isoalkannin A，1)：黑色无定形粉末，mp.112～114℃，

＝-87.2(c 0.015mg/ml，acetone)，UV(acetone)：λmax：252，272，330，406，446，577nm。IR(KBr)v_max：3509～3000(br)，1685，1621，1384cm^-1。¹HNMR(400MHz，DMSO-d₆，ppm)：δ14.66(1H，s)，13.87(1H，s)，13.86(2H，s)，13.62(1H，s)，8.20(1H，s)，7.42(1H，s)，7.40(1H，d，J＝8.7Hz)，7.15(2H，s)，6.78(1H，d，J＝15Hz)，6.06(1H，d，J＝11.2Hz)，5.24(1H，t，J＝6.9Hz)，4.22(2H，d，J＝7.0Hz)，5.23(1H，t，J＝8.6Hz)，3.40(2H，m)，1.86(3H，s)，1.83(6H，s)，1.80(6H，s)，1.62(3H，s)。¹³C NMR(100MHz，acetone-d₆，ppm)：δ186.9，186.2，183.4，183.2，165.8，156.2，155.8，155.7，154.8，142.9，140.2，135.8，130.4，130.2，127.1，127.0，126.9  126.4，125.1，125.0，123.1，121.7，115.3，115.2，114.5，113.4，79.1，56.1，26.3，26.1，25.7，18.6，18.5。

其中，3-异戊烯基，7-(3-萘醌基)-阿卡宁(异阿卡宁B，isoalkannin B，2)：黑色无定形粉末，mp.145～146℃，＝-87.2(c 0.015mg/ml，acetone)，UV(acetone)：λmax：252，272，330，406，446，577nm。IR(KBr)v_max：3509～3000(br)，1685，1621，1384cm^-1。¹H NMR(400MHz，acetone-d₆，ppm)：δ14.66(1H，s)，13.87(1H，s)，13.86(2H，s)，13.62(1H，s)，8.20(1H，s)，7.42(1H，s)，7.40(1H，d，J＝8.7Hz)，7.15(2H，s)，6.78(1H，d，J＝15Hz)，6.06(1H，d，J＝11.2Hz)，5.24(1H，t，J＝6.9Hz)，4.22(2H，d，J＝7.0Hz)，5.23(1H，t，J＝8.6Hz)，3.40(2H，m)，1.86(3H，s)，1.83(6H，s)，1.80(6H，s)，1.62(3H，s)。¹³C NMR(100MHz，acetone-d₆，ppm)：δ188.0，187.7，185.1，185.0，165.8，158.3，157.6，157.5，157.1，154.7，142.3，142.3，140.4，135.2，130.7，128.9，127.6，127.4，126.6，124.3，123.1，120.1，116.6，116.5，116.5，115.6，114.9，69.9，33.7，27.3，26.0，25.9，23.3，20.2，18.5，18.0。

上述阿卡宁二聚体类化合物经体外经典途径和旁路抗补体活性筛选试验结果证实，所述化合物对补体系统的经典途径和旁路途径均有显著抑制作用(如表1所示)。其中，3-异戊烯基-7-(3-萘醌基)-阿卡宁(异阿卡宁B，isoalkannin B，2)对补体系统的经典途径和旁路途径均有强的抑制作用，50％抑制溶血所需供试品浓度CH₅₀为0.42±0.09mM，AP₅₀为0.14±0.01mM。

表1是阿卡宁二聚体类化合物异阿卡宁A-B对补体系统经典途径和旁路途径抑制作用的数据。

表1阿卡宁二聚体类化合物对补体系统的抑制作用

^aμg/ml。

本发明的阿卡宁二聚体类化合物经体外抗肿瘤活性筛选试验结果证实，所述化合物对肺癌细胞(A549)具有显著的抑制作用，对肺癌细胞(A549)抑制作用的ED₅₀为＜0.32mM。

本发明的阿卡宁二聚体类化合物可用于制备抗补体和抗肿瘤药物。

附图说明：

图1是阿卡宁二聚体类化合物异阿卡宁A～异阿卡宁B的提取分离流程图。

具体实施方式

实施例1阿卡宁二聚体类化合物的制备

新疆紫草干燥根20kg，粗粉于室温下以95％乙醇反复冷浸、渗漉提取数次后，减压回收溶剂，得到浸膏820g，浸膏悬浮于蒸馏水中，以石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取，得到乙酸乙酯萃取物420g。取乙酸乙酯萃取物180g，经硅胶柱色谱，以石油醚(60～90℃)、石油醚(60～90℃)-丙酮梯度洗脱得到7个流份Fr.1～Fr.7，Fr.6经硅胶柱色谱，以石油醚-丙酮(4∶1)为洗脱剂，得到9个流份Fr.6-1～Fr.6-9，所得流份Fr6-6经制备色谱，以氯仿-甲醇(20∶1)为展开剂，得到1(8mg)；Fr.7经硅胶柱色谱，以石油醚-丙酮(2∶1)为洗脱剂，得到4个流份Fr.7-1～Fr.7-4，所得流份Fr7-2经制备色谱，以氯仿-甲醇(15∶1)为展开剂，得到2(4mg)；经波谱学鉴定该化合物1-2为具有新骨架的阿卡宁二聚体类化合物，分别命名为异阿卡宁A(isoalkannin A)和异阿卡宁B(isoalkannin B)。

实施例2体外抗肿瘤试验(SRB法)

A549(人肺癌)肿瘤细胞株在含25mM HEPES、0.2％(w/v)碳酸氢钠和100μg/ml卡那霉素的10％小牛血清RPMI1640培养液4ml的T-25烧瓶中，37℃，5％CO₂的条件下培养。经胰蛋白酶消化后的细胞悬浮液加入96孔板中，细胞浓度为0.25-1×10⁴/孔。肿瘤细胞加入不同浓度的待测组分在37℃培养72小时后，用冰冷的50％三氯乙酸固定并用0.4％的(SRB)染色，待染料溶解后，562nm下测定吸收值。细胞半数生长抑制时的药物浓度ED₅₀按照量效数据进行换算。每个实验重复三次，吸收值差异小于5％，ED₅₀差异小于30％。

实施例3体外抗补体经典途径试验

取补体(豚鼠血清)0.1ml，加入BBS配制成1∶5溶液，用BBS对倍稀释成1∶10、1∶20、1∶40、1∶80、1∶160、1∶320和1∶640溶液。取1∶1000溶血素、各浓度补体及2％SRBC各0.1ml溶于0.3ml BBS中，混匀，37℃水浴30min后放入低温高速离心机，在5000rpm、4℃条件下离心10min。分别取每管上清0.2ml于96孔板，在405nm测定吸光度。实验同时设置全溶血组(0.1ml 2％SRBC溶于0.5ml三蒸水中)。以三蒸水溶血管的吸光度作为全溶血标准，计算溶血率。以补体稀释度为X轴，各稀释浓度补体造成的溶血百分率为Y轴作图。选择达到相似高溶血率的最低补体浓度作为确保体系能正常溶血所需的临界补体浓度。取临界浓度的补体与供试品混匀，于37℃预水浴10min后，加入适量BBS、溶血素和2％SRBC。将每管37℃水浴30min后放入低温高速离心机，5000rpm、4℃条件下离心10min后分别取每管上清0.2ml于96孔板，405nm下测定吸光度。实验同时设置供试品对照组、补体组和全溶血组。将供试品吸光度值扣除相应供试品对照组吸光度值后计算溶血率。以供试品浓度作为X轴，溶血抑制率作为Y轴作图。计算CH₅₀值。

实施例4体外抗补体旁路途径试验

取补体(人血清)0.2ml，加入AP稀释液配制成1∶5稀释溶液，并对倍稀释成1∶10、1∶20、1∶40、1∶80、1∶160、1∶320和1∶640溶液。取各浓度补体0.15ml、AP稀释液0.15ml及0.5％RE 0.20ml，混匀，37℃水浴30min后放置入低温高速离心机，在5000rpm、4℃条件下离心10min。分别取每管上清0.2ml于96孔板，在405nm测定吸光度。实验同时设置全溶血组(0.20ml 0.5％RE溶于0.3ml三蒸水中)。以三蒸水溶血管的吸光度作为全溶血标准，计算溶血率。以补体稀释度为X轴，各稀释浓度补体造成的溶血百分率为Y轴作图。选择达到相似高溶血率的最低补体浓度作为确保体系能正常溶血所需的临界补体浓度。取确定的临界浓度的补体与供试品混匀，于37℃预水浴10min后，加入0.2ml 0.5％RE。将每管37℃水浴30min后放置入低温高速离心机，5000rpm、4℃，离心10min后分别取每管上清0.2ml于96孔板，405nm下测定其吸光度。实验同时设置供试品对照组、补体组和全溶血组。将供试品吸光度值扣除相应供试品对照组吸光度值后计算溶血率。以供试品浓度作为X轴，溶血抑制率作为Y轴作图，计算AP₅₀值。

Claims (5)

1.具有下述结构通式的阿卡宁二聚体类化合物，

当R＝H时，所述化合物是7-(3-萘醌基)-阿卡宁(异阿卡宁A，isoalkannin A)；

当R＝CH₂CH＝C(CH₃)₂时，所述化合物是3-异戊烯基-7-(3-萘醌基)-阿卡宁(异阿卡宁B，isoalkannin B)。

2.按权利要求1所述的阿卡宁二聚体类化合物，其特征在于，所述的化合物通过紫草科紫草属植物新疆紫草(Arnebia euchroma(Royle)Johnst)干燥根的乙醇提取物的乙酸乙酯部位分离制得。

3.权利要求1所述的阿卡宁二聚体类化合物在制备抗补体药物中的用途。

4.权利要求1所述的阿卡宁二聚体类化合物在制备抗肿瘤药物中的用途。

5.按权利要求4的用途，其特征在于，所述的肿瘤是肺癌。

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