CN103080083A - 制备截短侧耳素的工艺 - Google Patents

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Abstract

结晶形式的单一立体异构体形式的式I化合物的制备工艺，包括：使式Ⅱa化合物或者式Ⅱa化合物与式Ⅱb化合物的混合物中的胺基团脱保护，以及从反应混合物中分离出式I化合物；结晶形式的式I化合物及其盐；包含这种盐的药物组合物；式I化合物制备工艺中的中间体以及中间体的制备工艺。
Figure 160072DEST_PATH_IMAGE001
Figure 939809DEST_PATH_IMAGE002
Figure 397335DEST_PATH_IMAGE003

Description

制备截短侧耳素的工艺
本发明涉及结晶的14-O-{[(4-氨基-2-羟基-环己基)硫烷基]乙酰基}-木替灵(mutilin)，制备它的新工艺以及它的结晶盐类。
截短侧耳素(pleuromutilin)，即下式的化合物，
Figure 118115DEST_PATH_IMAGE001
截短侧耳素，
是一种天然抗生素，例如由担子菌侧耳属Pleurotus mutilus和P. passeckerianus产生，例如参见默克索引第12版第7694项。
已经开发出了许多其它的截短侧耳素类，例如作为抗微生物剂，它们具有截短侧耳素的主环结构并且在伯醇羟基上被取代。由于它们明显的抗微生物活性，因此已发现一组截短侧耳素衍生物，如WO 2008/113089中所公开的氨基-羟基-取代的环己基硫烷基乙酰基木替灵，特别有用。WO 2008/11089中公开的14-O-{[(4-氨基-2-羟基-环己基)硫烷基]乙酰基}-木替灵类是特别有用的化合物，因为它们显示针对革兰氏阳性和革兰氏阴性病原体的活性，例如与呼吸道和皮肤及皮肤结构感染相关的病原菌。为了制备这组化合物的基本纯的异构体/非对映异构体，需要便于工业规模使用而且还避免使用昂贵的起始材料、环境有害的试剂和溶剂或者使用耗时且耗力的纯化步骤的制备工艺。WO 2008/113089中描述的制备工艺，包括对按照各合成步骤制备的化合物进行色谱纯化，并且最终的非对映异构体通过不能工业规模应用的手性HPLC色谱法分离。
一方面，出人意料地发现了结晶的中间体，这些中间体具有预料不到的化学纯化潜力，这对于避免使用色谱纯化和分离步骤的纯氨基-羟基取代的环己基硫烷基乙酰基木替灵制备工艺而言是非常重要的。
已有人指出，根据在相应的ICH指导原则(关于人用药物注册技术要求的国际协调会议)中所规定的管理要求，14-O-{[(4-氨基-2-羟基-环己基)硫烷基]乙酰基}-木替灵类是潜在的供人用市场的新型药物。关于新药物中杂质的ICH指导原则(Q3A (R2))包括以下阈值：
最大每日剂量 报告的阈值 确认的阈值 合格的阈值
≤2g 0.05% 0.10% 0.15%
>2g 0.03% 0.05% 0.05%
从上述ICH阈值中可见，期望所有各未知杂质低于0.10面积%，并且结构明确的杂质含量低于0.15%。根据本发明提供的工艺，能够制造出符合期望的技术规格并且满足ICH要求的API (活性药物成分)。
另一方面，甚至更出人意料地，所述结晶中间体实现了显著的手性富集，该手性富集对于自更价廉的外消旋物或者手性纯度较低的起始材料起始制造纯立体异构体而言具有巨大的优势。所述工艺不包含任何色谱纯化不管是正相还是手性相，这与WO2008/113089中所描述的合成工序相反，在该申请中例如在实施例1步骤B中公开了在正相色谱法处理之后分离出作为无色无定形泡沫体的非对映异构体混合物形式的14-O-{[(4-氨基-2-羟基-环己基)-硫烷基]乙酰基}-木替灵类。据描述在WO2008/113089中已经获得了手性纯的非对映异构体，例如在实施例1A中对混合物进行手性色谱处理后，其后分离出无色无定形泡沫体的分离的纯非对映异构体。
然而，手性色谱不是可应用于工业大规模生产的技术，而且根据WO 2008/113089并未获得14-O-{[(4-氨基-2-羟基-环己基)硫烷基]乙酰基}-木替灵类的结晶盐。
与此相反，根据本发明，已经发现了与WO2008/113089中所公开的现有技术的无定形盐相比，具有出人意料和更加优越的特性的14-O-{[(4-氨基-2-羟基-环己基)硫烷基]乙酰基}-木替灵类的药学上可接受的结晶盐；例如，出人意料地与无定形的盐形式相比，本发明的结晶盐的化学稳定性得到提高；另外，本发明的结晶盐还显示了出人意料的低吸湿性。
还发现了用于制备这种结晶盐的工艺，其中可从14-O-{[(4-氨基-2-羟基-环己基)硫烷基]乙酰基}-木替灵类获得单一立体异构体形式的这类盐，以及用于制备作为所述结晶盐的基础的结晶形式的立体异构体纯的14-O-{[(4-氨基-2-羟基-环己基)硫烷基]乙酰基}-木替灵类的工艺。
在一个方面，本发明提供了制备结晶形式的单一立体异构体形式的式I化合物的工艺，
Figure 35255DEST_PATH_IMAGE002
，
包括对式Ⅱa的化合物，
Figure 814992DEST_PATH_IMAGE003
，或者
式Ⅱa化合物与式Ⅱb化合物的混合物，
Figure 524716DEST_PATH_IMAGE004
，
中的胺基团进行脱保护，其中R是胺保护基团，以及直接从反应混合物中或者通过在有机溶剂中的重结晶分离出以结晶形式的单一非对映异构体形式得到的式Ⅰ化合物。
在另一方面，本发明提供了结晶形式的单一立体异构体形式的如上定义的式I化合物。
式Ⅱa的化合物是新化合物并且也构成本发明的一部分。
在另一方面，本发明提供了式Ⅱa的化合物。
在式I或Ⅱa的化合物中，分别地，羟基、胺基和硫烷基乙酰基-木替灵基团所附连的环己基环上的碳原子均为R构型，因此式I、或Ⅱa的化合物代表任选经胺保护的14-O-{[(1R,2R,4R)-4-氨基-2-羟基-环己基硫烷基]乙酰基}-木替灵。与此相反，在式Ⅰb或Ⅱb的化合物中，
Figure 339088DEST_PATH_IMAGE005
，
羟基、胺基和硫烷基-乙酰基-木替灵基团所附连的环己基环上的碳原子均为S构型，因此式Ⅱb的化合物代表任选经氨基保护的14-O-{[(1S,2S,4S)-4-氨基-2-羟基-环己基硫烷基]乙酰基}-木替灵。
胺保护基包括本领域技术人员已知的保护基团，并且可在酸性、碱性条件下或者通过氢化、氧化或还原方法除去，例如通过氢解，用酸、碱、氢化物、硫化物处理。合适的胺保护基团例如描述于T. W. Greene，P. G. M. Wuts，Protective Groups in Organic Synthesis (有机合成中的保护基团)，Wiley-Interscience，第4版，2007年，特别是第696-868页。
可方便地用于本发明工艺中的胺保护基团包括例如：
- 苄氧羰基(Cbz)，其可通过例如氢解除去；
- 对甲氧基苄基羰基(Moz或MeOZ)，其可通过例如氢解除去；
- 叔丁氧羰基(BOC)，可通过例如用强酸处理除去，该强酸例如HCl、H3PO4或CF3COOH；
- 三氟乙酰基，其可通过例如用碱处理除去，该碱例如NaOH、K2CO3、Cs2CO3；
- 9-芴基甲氧羰基(FMOC)，其可通过例如用碱处理除去，例如哌啶；
- 苄基(Bn)，其可通过例如氢解除去；
- 对甲氧基苄基(PMB)，其可通过例如氢解除去；
- 3,4-二甲氧基苄基(DMPM)，其可通过例如氢解而除去；
- 对-甲氧基苯基(PMP)，其可通过例如用硝酸铈(Ⅳ)铵处理除去，
- 甲苯磺酰基(Tos)，其可通过例如用浓酸如HBr、H2SO4处理，或者通过用强还原剂如存于液氨中的钠、萘基钠处理除去，
- 用除Tos-酰胺以外的胺磺酰胺形成的基团，包括例如2-硝基苯磺酰胺(nosyl)或者邻硝基苯基亚磺酰基(Nps)，其可通过例如用碘化钐、三丁基氢化锡处理除去；
- 亚苄基，其可通过例如用三氟甲磺酸、三氟乙酸、二甲硫醚处理除去；
- 三苯甲基(三苯基甲基，Tr)、二甲氧基三苯甲基(DMT)，其可通过例如用酸处理除去，例如三氟乙酸；
优选三氟乙酰基或者叔丁氧羰基(BOC)。
在三氟乙酰基的情况下，可使用碱例如无机碱，如NaOH、KOH、Cs2CO3和K2CO3，或者有机碱例如乙醇胺来实现式Ⅱa和Ⅱb化合物的脱保护，以便获得单一立体异构体形式的式I化合物。在优选实施方式中，使用无机碱，例如NaOH和K2CO3。
在叔丁氧羰基(BOC)的情况下，可使用酸例如无机酸，如矿物酸，或者有机酸来实现式Ⅱa和Ⅱb化合物的脱保护，以便获得单一立体异构体形式的式I化合物。在优选实施方式中，使用有机酸如三氟乙酸(TFA)或者矿物酸如正磷酸。
可选择地，R所附连的氮原子形成杂环，例如附连到环己基的氮原子是邻苯二甲酰亚胺基环的一部分；其可通过例如用肼处理除去。在这种情况下，该氮上没有氢(参见实施例17)。
式Ⅱa化合物的脱保护形成单一产物形式的式I化合物。在对式Ⅱa化合物与式Ⅱb化合物的混合物进行脱保护的情况下，使所得的式Ⅰa和Ⅰb的产物经历结晶/重结晶，并且从该混合物中获得式I化合物。
已发现，在胺脱保护反应期间，硫基(thio)、羟基和氨基分别附连的环己基部分上的碳原子的立体化学保持为与用作起始材料的经胺保护的式Ⅱa和Ⅱb化合物中相同。
已出人意料地发现，在分离后可使式I化合物结晶，或者在使胺基团脱保护后甚至可以直接从反应混合物中结晶。例如，用反溶剂如醚，例如二异丙基醚(DIPE)或叔丁基甲基醚(MTBE)、优选DIPE，处理在有机溶剂优选极性有机溶剂中，如CH2Cl2中，获得的单一立体异构体形式的式Ⅰ化合物的溶液；或者浓缩后用有机溶剂优选醇，例如正丁醇，处理在有机溶剂优选极性有机溶剂中，例如CH2Cl2中，获得的单一立体异构体形式的式I化合物的溶液；或者将经分离的单一立体异构体形式的式I化合物的粗材料溶解于有机溶剂例如醚中，如四氢呋喃(THF)中，并且任选地用反溶剂例如醚处理，如用DIPE或MTBE处理。可以使单一立体异构体形式的式Ⅰ化合物结晶，并且可以结晶形式分离出来。
结晶简化了分离和已分离材料的处理，并且非常有利于产物的进一步纯化。
根据本发明获得的结晶化合物可经历进一步纯化，例如重结晶，例如从有机溶剂优选醇，例如正丁醇，中重结晶出来。
如果需要可重复实施(重)结晶，并且可以得到高回收率和极好的纯化。
下表1中显示了结晶的式I化合物的出人意料的高纯化潜力。
表1
反应阶段 式I化合物的HPLC纯度(面积%) 杂质RRT 1.32(面积%)
化合物Ⅱb脱保护后反应完成 87.3 4.2
DCM/DIPE结晶后 95.0 2.2
第一次正丁醇结晶后 99.0 0.6
第二次正丁醇结晶后3 99.7 <0.15
RRT=在HPLC中相对于式I的相对保留时间。
由以上表1清楚可见，式Ⅱa化合物脱保护后的式Ⅰ化合物纯度从87.3%提高到从DCM(CH2Cl2)/DIPE中结晶和分离出来后的95.0%。通过正丁醇(重)结晶可使纯度进一步提高到甚至达99.7%的经分离的式Ⅰ化合物的最终纯度。
下表2示出了在经历正丁醇重结晶后所选杂质的贫化和从工艺母液中回收的式Ⅰ化合物的总体纯化：
表2
  初始纯度(面积%，HPLC) 正丁醇重结晶后的纯度(面积%，HPLC)
化合物Ⅰ 96.29 99.03
杂质1 0.61 0.14
杂质2 1.88 0.54
通过使用晶种可以加强并加速结晶。可通过本文中例示的工艺来获得晶种。式Ⅰ化合物的结晶和重结晶工艺实现了期望的纯度并且在工业规模生产中非常有用。避开了通过色谱法进行的麻烦且昂贵的纯化，并且使该工艺可以工业应用。
甚至更出人意料地，当以式Ⅰ化合物与式Ⅰb化合物的混合物为起始材料时，化合物Ⅰ的结晶导致有利于式Ⅰ化合物的显著的非对映异构体增加。在式Ⅱa化合物与式Ⅱb化合物的混合物的脱保护之后，所得固体在有机溶剂或溶剂混合物如DCM/DIPE中的结晶导致显著的非对映异构体增加。如果是从有机溶剂优选醇，例如正丁醇，中重结晶，那么非对映异构体的增加甚至会更加明显。
下表3中示出了结晶形式的式Ⅰ化合物的手性富集。
表3
Figure 161550DEST_PATH_IMAGE006
从表3中可看出，在脱保护步骤中以式Ⅱa和Ⅱb的化合物的非对映异构体混合物为起始材料并通过DCM/DIPE结晶从反应混合物中分离所得产物，得到了出人意料的有利于式I化合物的59:41的手性增加。使所得经富集的式Ⅰ化合物与式Ⅰb化合物的产物混合物经历正丁醇重结晶，在所分离产物中获得了巨大的甚至更加出人意料的有利于式Ⅰ化合物的富集(93:7)。与式Ⅰ化合物富集的所分离产物相反，正丁醇母液中几乎只含有式Ⅰb的化合物(84%)。
任选地，可以反复实施重结晶直到达到期望的光学纯度。
表1、表2和表3中所示的结晶形式的式Ⅰ化合物的出人意料的性质在药物化合物的制备中极为有用。
本发明提供了结晶形式的单一立体异构体形式的式Ⅰ化合物。
出人意料地，已分离出两种不同晶形的式I化合物，并通过X射线粉末衍射进行了表征。
在另一方面，本发明提供了晶形1的14-O-{[(1R,2R,4R)-4-氨基-2-羟基-环己基硫烷基]乙酰基}-木替灵，例如该晶形1表征为X射线粉末衍射图谱在如下2θ角处具有峰值(度，±0.2，其中一部分)：
10.6, 11.1, 12.0, 14.3, 15.1, 16.1, 21.1；例如：
10.6, 11.1, 12.0, 14.3, 15.1, 16.1, 18.2, 19.2, 20.7, 21.1, 21.3, 21.8, 22.6, 23.5, 24.7, 28.2, 30.2。
在另一方面，本发明提供了以1:1正丁醇溶剂化物形式获得的晶形2的14-O-{[(1R,2R,4R)-4-氨基-2-羟基-环己基硫烷基]乙酰基}-木替灵，例如其表征为X射线粉末衍射图谱在如下2θ角处具有峰值(度，±0.2，其中一部分)：
9.8, 11.1, 13.1, 14.1, 17.6, 19.7, 22.2；例如：
9.6, 9.8, 11.1, 13.1, 14.1, 16.0, 17.6, 19.7, 22.2, 22.7, 23.0。
晶形2的14-O-{[(1R,2R,4R)-4-氨基-2-羟基-环己基硫烷基]乙酰基}-木替灵的正丁醇含量在10和18 w/w%之间，通常在11和14 w/w%之间。
式I化合物优选以盐形式分离，例如药学上可接受的盐。这类盐优选铵盐，即附连到环己基环上的氨基的酸加成盐，并且包括醋酸盐、乳酸盐如L-乳酸盐、或马来酸盐如马来酸氢盐(hydrogenmaleate)。
在另一方面，本发明提供了单一立体异构体形式和盐如结晶盐形式的式I化合物，在该盐形式中式I化合物为单一立体异构体的形式；该盐优选为醋酸盐、乳酸盐如L-乳酸盐、或者马来酸盐如马来酸氢盐。
根据本发明获得的式Ⅰ的单一立体异构形式的结晶化合物，例如盐形式的结晶化合物，可用于药物组合物。
在又一方面，本发明提供了药物组合物，其包含结晶的14-O-{[((1R,2R,4R)-4-氨基-2-羟基-环己基)硫烷基]乙酰基}-木替灵，或者包含14-O-{[((1R,2R,4R)-4-氨基-2-羟基-环己基)硫烷基]乙酰基}-木替灵的任选结晶的醋酸盐、乳酸盐或马来酸氢盐作为活性成分，以及药学上可接受的载体或稀释剂。
如此获得的游离形式和单一立体异构形式的式I化合物，可通过向式Ⅰ化合物的游离碱中添加酸而转变成盐。例如，式I化合物可溶解或悬浮于有机溶剂中，或者以溶解或悬浮在有机溶剂中的形式获得，所述有机溶剂优选为溶剂或溶剂混合物，例如醇，如甲醇、乙醇；卤代烃，如二氯甲烷；醚，如四氢呋喃；醋酸酯，如醋酸甲酯、醋酸乙酯、醋酸丙酯、醋酸异丙酯；醇与醋酸酯的溶剂混合物，如甲醇/醋酸异丙酯；卤代烃与醋酸酯的溶剂混合物，如二氯甲烷/醋酸异丙酯；醚与醋酸酯的溶剂混合物，如四氢呋喃/醋酸异丙酯，并且向所得混合物中添加酸，例如有机酸或无机酸(矿物酸)，如醋酸、乳酸如L-乳酸、马来酸。可以获得并且可以分离盐形式的式I化合物，例如结晶盐形式。
已发现，在盐形成步骤中，硫基、羟基或氨基所附连的环己基环上的碳原子的立体化学得以保持，并且仍与游离形式的式Ⅰ化合物中相同。
药物活性化合物的分离，如分别在WO 2008/113089的实施例Ⅰ和Ⅰa中所述，是有利的；但是根据本发明的结晶盐形式的分离，例如结晶盐形式的式I化合物，则是更加有利。例如，根据本发明的结晶盐的提高的纯度和出人意料地提高的稳定性对于意图用于兽和人的药物组合物的制备而言是非常重要并且是有用的。与相应的无定形形式相比，式Ⅰ化合物的结晶盐显示提高的稳定性，并且分离出的结晶盐的化学和手性纯度≥90%，例如甚至≥95%。
在下表4中示出了相应的化合物Ⅰ的结晶盐和无定形盐的稳定性比较数据。
表4
Figure 490901DEST_PATH_IMAGE007
*28天(28 d)后样品不完全溶于水，因此对悬浮液进行分析。
对于体内生物利用度如口服生物利用度而言，药物活性化合物的溶解性是重要的性质。对于静脉给药而言，所选形式例如盐的溶解性也是非常重要的，并且期望拥有没有复杂技术或赋形剂的制剂。
本发明的结晶醋酸盐、乳酸盐和马来酸(氢)盐在水以及水基载体如0.9%NaCl溶液或者生物相关媒质如FaSSIF(禁食状态模拟肠液)和FeSSIF(进食状态模拟肠液)中的溶解度出人意料地高，这使得本发明的结晶盐更加可应用于药学领域。
WO 2008/113089中对抗微生物剂，例如14-O-{[(4-氨基-2-羟基-环己基)硫烷基]乙酰基}-木替灵类的抗菌活性作了概述。例如，本发明的化合物如式I化合物显示出抗微生物活性，例如针对革兰氏阳性菌的抗菌活性，例如凝固酶阳性葡萄球菌如金黄色葡萄球菌和链球菌如肺炎链球菌，例如针对金黄色葡萄球菌ATCC49951和肺炎链球菌ATCC49619显示出MIC<0.4 μg/ml。按照CLSI推荐的方法测定最低抑菌浓度(MIC)。
在又一方面，本发明提供了晶形A的醋酸盐形式的结晶14-O-{[(1R,2R,4R)-4-氨基-2-羟基-环己基硫烷基]乙酰基}-木替灵，例如其表征为X射线粉末衍射图谱在如下2θ角处具有峰值(度，±0.2，其中一部分)：
7.0, 7.7, 11.6, 12.1, 12.6, 13.5, 13.7, 15.4, 15.7, 16.9, 17.3, 19.0, 19.9, 21.1, 23.4, 24.2,24.4；例如：
7.0, 7.7, 11.6, 12.1, 12.6, 13.5, 13.7, 14.1, 15.4, 15.7, 16.5, 16.9, 17.3, 19.0, 19.6, 19.9, 20.1, 21.1, 22.2, 22.5, 23.4, 24.2, 24.4, 26.7, 29.1, 29.6, 31.0。
在又一方面，本发明提供了晶形B的醋酸盐形式的结晶14-O-{[(1R,2R,4R)-4-氨基-2-羟基-环己基硫烷基]乙酰基}-木替灵，例如其表征为X射线粉末衍射图谱在如下2θ角处具有峰值(度，±0.2，其中一部分)：
10.3, 10.7, 12.7, 14.3, 15.5, 16.0, 17.2, 19.5, 20.6, 22.9；例如
9.0, 10.3, 10.7, 12.7, 14.3, 15.5, 16.0, 17.2, 19.5, 20.6, 21.7, 22.3, 22.7, 22.9, 24.4。
在又一方面，本发明提供了晶形1的L-乳酸盐形式的结晶14-O-{[(1R,2R,4R)-4-氨基-2-羟基-环己基硫烷基]乙酰基}-木替灵，例如其表征为X射线粉末衍射图谱在如下2θ角处具有峰值(度，±0.2，其中一部分)：
7.0, 11.6, 12.0, 12.5, 13.4, 13.6, 13.9, 15.3, 16.8, 18.8, 19.5, 19.8, 20.9, 23.3, 23.9, 24.2；例如
7.0, 7.6, 11.6, 12.0, 12.5, 13.4, 13.6, 13.9, 15.3, 15.5, 16.8, 17.2, 18.8, 19.5, 19.8, 20.0, 20.9, 22.0, 22.4, 22.7, 23.3, 23.9, 24.2; 25.3, 28.9, 29.4, 30.8。
在又一方面，本发明提供了晶形1的马来酸氢盐形式的结晶14-O-{[(1R,2R,4R)-4-氨基-2-羟基-环己基硫烷基]乙酰基}-木替灵，例如其表征为X射线粉末衍射图谱在如下2θ角处具有峰值(度，±0.2，其中一部分)：
7.0, 11.3, 11.7, 12.5, 13.5, 13.8, 15.3, 16.7, 18.3, 19.4, 19.7, 21.1, 22.2, 23.8, 23.9；例如
7.0, 11.3, 11.7, 12.5, 13.3, 13.5, 13.8, 14.1, 15.3, 16.7, 17.2, 18.0, 18.3, 19.4, 19.7, 20.4, 21.1, 21.9, 22.2, 22.8, 23.8, 23.9, 24.9, 27.1, 27.8, 28.7, 29.3, 30.6, 30.8。
与本发明的(结晶)盐形式的化合物相比，(结晶)游离碱形式的式Ⅰ化合物显示相同量级的药物活性，例如抗微生物活性。
单一立体异构形式的式Ⅱa化合物或者式Ⅱa化合物与式Ⅱb化合物的混合物可视情况例如根据例如常规方法类似地制备。优选地，通过使式Ⅲa的氨基-羟基-巯基-环己烷化合物、或者式Ⅲa化合物与式Ⅲb化合物的混合物，其中的氨基基团受氨基保护基团的保护，与经活化的14-O-乙酰基-木替灵偶合来制备单一立体异构形式的式Ⅱa化合物、或者式Ⅱa化合物与式Ⅱb化合物的混合物。
在又一方面，本发明提供了本发明工艺，其中式Ⅱa化合物、或者式Ⅱa化合物与式Ⅱb化合物的混合物通过使式Ⅲa的化合物，
Figure 689801DEST_PATH_IMAGE008
，
或者式Ⅲa化合物与式Ⅲb化合物的混合物，
Figure 358679DEST_PATH_IMAGE009
，
其中R如上文所定义，分别与经活化的下式的14-O-AKT-乙酰基-木替灵偶合，
Figure 165093DEST_PATH_IMAGE010
14-O-AKT-乙酰基-木替灵，
其中AKT是活化基团，任选地为甲磺酰基、苯磺酰基、甲苯磺酰基，或者-O-AKT是卤素；任选地14-O-AKT-乙酰基-木替灵是下式的化合物
以及从反应混合物中分离出所得的式Ⅱa化合物、或者式Ⅱa化合物与式Ⅱb化合物的混合物来制备。
R如上文所定义的式Ⅲa化合物是新的并且也构成本发明的一部分。
在另一方面，本发明提供了单一立体异构形式的式Ⅲa化合物。
在式Ⅲa化合物中，羟基、胺基和硫基所附连的环己基环上的碳原子均为R构型，因此式Ⅲa化合物代表了任选经氨基保护的(1R,2R,4R)-4-氨基-2-羟基-1-巯基-环己烷；并且在式Ⅲb化合物中，分别地，羟基、胺基和硫基所附连的环己基环上的碳原子均为S构型，因此式Ⅲb化合物代表了任选经氨基保护的(1S,2S,4S)-4-氨基-2-羟基-1-巯基-环己烷。
R如上文所定义的式Ⅲa化合物或者式Ⅲa化合物与式Ⅲb化合物的混合物，分别与AKT如上文所定义的经活化的14-O-AKT-乙酰基-木替灵的，用以获得R如上文所定义的式Ⅱa化合物或式Ⅱa与式Ⅱb化合物的混合物的偶合反应，可以视情况例如根据例如常规方法类似地进行，例如在对于这些反应已知的标准条件下；例如在碱存在下，例如强无机碱如氢氧化物如NaOH，例如在两相体系中，并且如果该反应在两相体系中进行，则优选在催化剂存在下，例如相转移催化剂如苄基-三丁基氯化铵。该偶合反应也可在单一溶剂体系中在碱存在下进行，例如在有机溶剂中，例如卤代烃如氯苯、二氯甲烷，芳族溶剂如甲苯，腈类如乙腈，或者醚如叔丁基甲基醚、四氢呋喃，所述碱优选有机碱如DBU。
优选地，该偶合反应是在有机溶剂中进行，例如非极性溶剂，例如醚如叔丁基甲基醚(MTBE)，或者极性溶剂，例如卤代烃如二氯甲烷；优选地在碱的水溶液存在下，例如NaOH水溶液；或者在位于有机溶剂中的碱存在下，如DBU、DBN，在使用碱的水溶液情况下优选在相转移催化剂存在下，例如苄基-三丁基氯化铵。
已发现，在偶合反应期间，硫基、羟基和氨基所附连的环己基部分上的碳原子的立体化学得以保持，并且仍然分别与用作起始材料的式Ⅲa化合物和式Ⅲb化合物中相同。
单一立体异构体形式的式Ⅲa化合物、或者式Ⅲa化合物与式Ⅲb化合物的混合物，分别可视情况例如根据例如常规方法类似地制备。优选地，分别通过对其中氨基和巯基均受到保护的氨基-羟基-巯基环己烷中的巯基官能团进行脱保护来制备式Ⅲa化合物或者式Ⅲa化合物与式Ⅲb化合物的混合物。
在另一方面，本发明提供了本发明的工艺，其中式Ⅲa化合物，或者式Ⅲa化合物与式Ⅲb化合物的混合物通过对式Ⅳa化合物，
Figure 656434DEST_PATH_IMAGE012
，或者
式Ⅳa化合物与式Ⅳb化合物的混合物中的巯基官能团进行脱保护来得到，
Figure 179819DEST_PATH_IMAGE013
，
其中R如上文所定义并且R1是巯基保护基团，以及
从反应混合物中分别分离所得的式Ⅲa化合物，或者式Ⅲa化合物与式Ⅲb化合物的混合物。
巯基保护基团，例如根据本发明的式Ⅳa和Ⅳb化合物中的R1，包括例如：
- (C1-6)烷基，其中烷基任选地经进一步取代，例如被(C6-12)芳基如苯基进一步取代，例如三苯甲基；例如可通过强酸或AgNO3处理除去，
- (C1-6)烷基羰基，如乙酰基，例如可通过碱如甲醇钠处理除去，
- (C6-12)芳基羰基，如苯甲酰基，例如可通过用还原剂如DIBAL处理、或者通过用碱如肼处理除去，
优选-C(=O)-(C6-12)芳基；更优选苯甲酰基。
合适的巯基保护基团例如描述于T. W. Greene，P. G. M. Wuts，“Protective Groups in Organic Synthesis”，Wiley-Interscience，第4版，2007年，特别是第647-695页。
在式Ⅳa化合物中，羟基、胺基和硫基所附连的环己基环上的碳原子均为R构型，因此式Ⅳa化合物代表了经胺和巯基保护的(1R,2R,4R)-4-氨基-2-羟基-1-巯基-环己烷；并且，在式Ⅳb化合物中，羟基、胺基和硫基所附连的环己基环上的碳原子均为S构型，因此式Ⅳb化合物代表了经氨基和巯基保护的(1S,2S,4S)-4-氨基-2-羟基-1-巯基-环己烷。
已发现，在巯基脱保护反应期间，硫基、羟基和氨基所附连的环己基部分上的碳原子的立体化学得以保持，并且仍与分别用作起始材料的式Ⅳa化合物和式Ⅳb化合物中相同。
视情况，例如通过使用解离剂(cleaving agent)，如水合肼，进行巯基基团的脱保护。该脱保护反应是在有机溶剂中进行，例如卤代烃如氯苯、二氯甲烷，芳族溶剂如甲苯，腈类例如乙腈，或者醚如叔丁基-甲基醚、四氢呋喃。为了使二硫化物生成最小化，任选地在抗氧化剂或还原剂存在下进行脱保护，例如二硫苏糖醇(DTT)。
式Ⅳa化合物或者式Ⅳa化合物与式Ⅳb化合物的混合物，分别可以视情况例如根据常规方法或本文(例如在实施例部分)所述方法类似地得到。
在另一方面，本发明提供了：
- 制备单一立体异构体形式的式I化合物的工艺，包括分别使用单一立体异构体形式的式Ⅱa化合物，或者式Ⅱa化合物与式Ⅱb化合物的混合物，和/或包括分别使用单一立体异构体形式的式Ⅲa化合物，或者式Ⅲa化合物与式Ⅲb化合物的混合物，和/或分别使用单一立体异构体形式的式Ⅳa化合物，或者式Ⅳa化合物与式Ⅳb化合物的混合物作为中间体，以及
- 用作单一立体异构体形式的式I化合物的制备工艺的中间体的单一立体异构体形式的式Ⅱa化合物、和/或单一立体异构体形式的式Ⅲa化合物、和/或单一立体异构体形式的式Ⅳa的化合物。
在又一方面，本发明提供了单一立体异构体形式的式I化合物的制备工艺，其包括：使R如上文所定义的单一立体异构体形式的式Ⅲa化合物、或者式Ⅲa化合物与式Ⅲb化合物的混合物，分别与经活化的14-O-AKT-乙酰基-木替灵偶合，以分别得到R如上文所定义的式Ⅱa化合物或者式Ⅱa化合物与式Ⅱb化合物的混合物，其中AKT为活化基团例如甲磺酰基、苯磺酰基或甲苯磺酰基，或者-O-AKT是卤素，优选地AKT是甲苯磺酰基，例如式Tos-PLEU的化合物，
任选地自反应混合物中分别分离所得的单一立体异构体形式的式Ⅱa化合物，或者式Ⅱa化合物与式Ⅱb化合物的混合物，其中R如上文所定义，
分别对所得的单一立体异构体形式的式Ⅱa化合物、或者式Ⅱa化合物与式Ⅱb化合物的混合物中的胺官能团进行脱保护，其中R如上文所定义，以及
从反应混合物中分离单一立体异构体形式的式I化合物，任选地为盐形式，任选地通过重结晶，并且如果需要，把以游离形式获得的单一立体异构体形式的式I化合物转化成盐形式的单一立体异构体形式的式I化合物，反之亦然；
其中，任选地R如上文所定义的单一立体异构体形式的式Ⅲa化合物或者式Ⅲa化合物与式Ⅲb化合物的混合物，分别通过对R和R1如上文所定义的单一立体异构体形式的式Ⅳa化合物、或者式Ⅳa化合物与式Ⅳb化合物的混合物中的巯基官能团进行脱保护得到。
作为式Ⅱa、Ⅱb、Ⅲa、Ⅲb、Ⅳa或Ⅳb化合物中的胺保护基团，可使用常规的氨基保护基团，优选三氟乙酰基或叔丁氧羰基。适当情况下，可以使得胺基团所附连的环己基环上的碳原子不改变其构型，即不改变立体化学，的方式改变式Ⅱa、Ⅱb、Ⅲa、Ⅲb、Ⅳa或Ⅳb化合物中的胺保护基团R，例如通过胺基团的脱保护，然后用与之不同的胺保护基团加以保护。
本发明工艺能够分离结晶形式的单一立体异构体形式的式I化合物。一方面，当以手性纯的起始材料为起始时，所述工艺控制了立体化学并产生单一立体异构体形式的产物，由此在分离非对映异构体和区域异构体的混合物时无需复杂的方法，例如色谱法，如正相色谱或者手性相色谱，例如手性HPLC，例如WO 2008/113089中所述，这对于可工业应用的工艺是非常有利的。结晶的式I化合物的发现是关键的发明，由此能够良好地控制化学纯度。结合所观察到的式I化合物的结晶形式的理想收率，本发明工艺对于药物制造极为适用，其中从经济的角度看适宜/良好的收率是必须的，且纯度控制对于活性药物成分(API)的最终质量是必不可少的。
另一方面，本发明工艺再次利用结晶化合物I的出人意料的性质，控制了更出人意料的式I化合物的手性纯度。结晶化合物I的出人意料的性质使得能够以廉价得多的非对映异构体混合物为起始材料。结晶化合物I的手性纯度得到控制，由此分离出结晶固体形式的化合物I并且把不想要的非对映异构体留在母液中。
WO 2008/113089中未以任何方式描述结晶形式的式I化合物的存在。在WO 2008/113089实施例1的步骤B中，14-O-{[(1R,2R,4R)-4-氨基-2-羟基-环己基硫烷基]乙酰基}-木替灵(本发明的化合物I)与14-O-{[(1S,2S,4S)-4-氨基-2-羟基-环己基硫烷基]乙酰基}-木替灵的混合物分离为无定形泡沫体的形式。WO 2008/113089的实施例1A中描述了通过手性色谱对非对映异构体进行分离，并且所分离的14-O-{[(1R,2R,4R)-4-氨基-2-羟基-环己基硫烷基]乙酰基}-木替灵(本发明的化合物I)和14-O-{[(1S,2S,4S)-4-氨基-2-羟基-环己基硫烷基]乙酰基}-木替灵(本发明的化合物Ⅰb)再次分离为无定形泡沫体的形式。
结晶化合物Ⅰ令人意外的控制化合物Ⅰ的化学纯度和手性纯度的性质，对于要对人或动物给药的药物活性化合物的制备是极为有用的。
本发明还涉及醋酸盐、L-乳酸盐或马来酸氢盐形式的14-O-{[(1R,2R,4R)-4-氨基-2-羟基-环己基硫烷基]乙酰基}-木替灵的新晶形。可使用采用盐形成剂的在有机介质中的结晶工艺将14-O-{[(1R,2R,4R)-4-氨基-2-羟基-环己基硫烷基]乙酰基}-木替灵转变成结晶盐形式。通过使用晶种可增强并加速新型结晶盐的制备工艺。可通过例示的工艺获得晶种。
已发现本发明的结晶盐保留了游离形式的单一立体异构体形式的式Ⅰ化合物的立体化学。根据本发明的结晶盐具有显著的预料不到的优点，即与相对应的无定形盐形式相比稳定性增加，如表4中所示。
此外，非常出人意料的是，本发明的结晶盐，优选晶形B的L-乳酸盐和醋酸盐，在相关湿度范围内的吸湿性较小，即在0-80%的相对湿度下吸水率低于2%，使得同时具有优异化学稳定性的所述盐是药学上适用的。
与无定形的冻干形式相比，具有期望的且一致的化学和手性纯度的本发明结晶盐具有更好的稳定性，从而有利于储存和药物组合物的制备。式I化合物的结晶盐形式未曾有过记载，例如在WO 2008/113089中。
总之，式Ⅰ化合物的结晶盐形式具有优异的纯度，并且所观察的稳定性不仅优于无定形的盐形式而且已证明在通常的存储条件下绝对是药学上适用的。
本文中使用的“单一立体异构体形式”是指其中化合物显示出≥90%的非对映异构体或对映体过量的所示立体化学的形式。
本发明的特别优选的化合物包括实施例1至17的化合物，例如选自由以下构成的群组的化合物：
[(1R,3R,4R)-3-羟基-4-巯基-环己基]-氨基甲酸叔丁酯，
14-O-{[(1R,2R,4R)-4-叔丁氧羰基氨基-2-羟基-环己基-硫烷基]乙酰基}-木替灵，
14-O-{[(1R,2R,4R)-4-氨基-2-羟基-环己基硫烷基]乙酰基}-木替灵，晶形1，
14-O-{[(1R,2R,4R)-4-氨基-2-羟基-环己基硫烷基]乙酰基}-木替灵，晶形2，
2,2,2-三氟-N-[(1R,3R,4R)-3-羟基-4-巯基-环己基]乙酰胺，
14-O-{[(1R,2R,4R)-4-[(2,2,2-三氟乙酰基)-氨基]-2-羟基-环己基-硫烷基]乙酰基}-木替灵，
14-O-{[(1R,2R,4R)-4-氨基-2-羟基-环己基-硫烷基]乙酰基}-木替灵醋酸盐，晶形A，
14-O-{[(1R,2R,4R)-4-氨基-2-羟基-环己基-硫烷基]乙酰基}-木替灵醋酸盐，晶形B，
14-O-{[(1R,2R,4R)-4-氨基-2-羟基-环己基硫烷基]乙酰基}-木替灵L-乳酸盐，晶形1，
14-O-{[(1R,2R,4R)-4-氨基-2-羟基-环己基硫烷基]乙酰基}-木替灵马来酸氢盐，晶形1，
14-O-{[(1R,2R,4R)-4-乙氧羰基氨基-2-羟基-环己基-硫烷基]乙酰基}-木替灵，以及
14-O-{[(1R,2R,4R)-2-羟基-4-(邻苯二甲酰亚胺基-N-基)-环己基-硫烷基]乙酰基}-木替灵。
附图说明
在图1示出了晶形1的14-O-{[(1R,2R,4R)-4-氨基-2-羟基-环己基硫烷基]乙酰基}-木替灵的粉末衍射图。
图2示出了晶形2的14-O-{[(1R,2R,4R)-4-氨基-2-羟基-环己基硫烷基]乙酰基}-木替灵的粉末衍射图。
图3示出了晶形A的醋酸盐形式的14-O-{[(1R,2R,4R)-4-氨基-2-羟基-环己基硫烷基]乙酰基}-木替灵的粉末衍射图。
图4示出了晶形B的醋酸盐形式的14-O-{[(1R,2R,4R)-4-氨基-2-羟基-环己基硫烷基]乙酰基}-木替灵的粉末衍射图。
图5示出了晶形1的L-乳酸盐形式的14-O-{[(1R,2R,4R)-4-氨基-2-羟基-环己基硫烷基]乙酰基}-木替灵的粉末衍射图。
图6示出了晶形1的马来酸氢盐形式的14-O-{[(1R,2R,4R)-4-氨基-2-羟基-环己基硫烷基]乙酰基}-木替灵的粉末衍射图。
下面的反应流程1中总结了以手性前体Ⅱa、Ⅲa和Ⅳa为起始材料的式Ⅰ化合物的合成工艺：
反应流程1
，
在反应流程1中，R代表氨基保护基团，R1代表硫保护基团并且如上文所定义。
下面的反应流程2中总结了以Ⅱa与Ⅱb的混合物、Ⅲa与Ⅲb的混合物、以及Ⅳa与Ⅳb的混合物为起始材料的式Ⅰ化合物的合成工艺：
反应流程2
Figure 913606DEST_PATH_IMAGE015
，
在反应流程2中，R代表氨基保护基团，R1代表硫保护基团(R和R1如上所定义)。
在本文中，包括实施例和反应流程1、2、3、4、5和6中，使用下列缩写：
℃ 摄氏度
1H NMR 质子核磁共振谱
13C NMR 碳核磁共振谱
[α]D 589 nm下的比旋光度角
BnBu3NCl 苄基三丁基氯化铵
BOC 叔丁氧羰基
d 天
DCM CH2Cl2
DIBAL 二异丁基氢化铝
DBN 1,5-二氮杂二环[4.3.0]壬-5-烯
DBU 1,8-二氮杂二环[5.4.0]十一碳-7-烯
DIPE 二异丙基醚
DMF N,N-二甲基甲酰胺
DMSO 二甲亚砜
DMTF 二甲基硫代甲酰胺
DPPA 二苯基磷酰基叠氮化物
DTT 1,4-二硫代-DL-苏糖醇
ESI 电喷射离子化
EtOAc 醋酸乙酯
GF 玻璃纤维
h 小时
heptane 正庚烷
HPLC 高效液相色谱法
KF 卡尔-费休
M 摩尔浓度
mCPBA 间氯过氧苯甲酸
MTBE 甲基叔丁基醚
min 分钟
MS 质谱
m/z 质荷比
t-BuOH 叔丁醇
Bu4NCl 四正丁基氯化铵
PhCOSH 硫代苯甲酸
rt 室温
TLC 薄层色谱
TEA，Et3N 三乙胺
TFA 三氟乙酸
THF 四氢呋喃
Wt 重量
w/w 重量/重量
XRPD X射线粉末衍射
实施例中所述的“剥离(strip)重量分析”定义如下：通过除去溶剂并通过HPLC或NMR使用内部或外部标准测定含量和/或自化合物中扣除已知的杂质来确定批料等分试样或整个批料的含量。在采取等分试样的情况下，采用后插法得到总质量/体积。
如实施例中所述的“线路冲洗(line rinse)”是使用合适的溶剂用以使产物及输入材料的损失降至最低的系统冲洗(system rinse)。
Tos-PLEU是下式的化合物，
Figure 188729DEST_PATH_IMAGE016
，
PLEU是下式的残基，
Figure 143785DEST_PATH_IMAGE017
。
本发明所提供的任何化合物在本文中也称为“(根据)本发明(的)化合物(类)”，由本发明所提供的任何工艺在本文中也称为“(根据)本发明(的)工艺”。
本发明的任意化合物可以视情况例如通过常规方法或者本文所述方法类似地获得。
在以下的实施例中，所有温度以摄氏度(℃)表示并且未经校正。
所使用的缩写如上所述(在反应流程2之下)。
实施例1
[(1R,3R,4R)-3-羟基-4-巯基-环己基]-氨基甲酸叔丁酯，
Figure 478951DEST_PATH_IMAGE018
，
将3.94 Kg {(1R,2R,4R)-4-[(叔丁氧羰基)-氨基]-2-羟基-环己基}-苯-硫代甲酸酯和37 L CH2Cl2装入到容器中，于15-25℃下搅拌所得混合物。将0.39 Kg 1,4-二硫代-DL-苏糖醇 (10重量%)添加到该混合物中，用2 L CH2Cl2冲洗。向混合物中添加0.84 Kg一水合肼。将所得混合物于18至22℃下搅拌3小时，利用HPLC追踪反应。反应完成时，添加39 L 1 M磷酸溶液，将混合物再搅拌15-30分钟。将所得的两相加以分离，将所得有机相用39 L的1 M磷酸溶液洗涤，接着用39 L 1%NaCl水溶液洗涤。将所得有机层于<40℃下进行真空浓缩，向浓缩残留物中添加20 L CH2Cl2，将所得混合物再次浓缩。向浓缩残留物中再添加8 L CH2Cl2，将所得混合物浓缩至干。
获得2.89 Kg白色固体形式的[(1R,3R,4R)-3-羟基-4-巯基-环己基]氨基甲酸叔丁酯。
1H NMR (200 MHz，DMSO-d6, ppm)δ6.79 (d, J=7.8Hz, 1H), 4.99 (d，J=5.8Hz，1H)，3.34–3.24 (m, 1H), 3.14–3.04 (m, 1H)，2.37 (d，J=3.8 Hz, 1H)，2.00 -1.89 (m, 1H), 1.87–1.82 (m，1H), 1.73-1.67 (m, 1H), 1.47–1.04 (m, 12H)。
实施例2
22-O-甲苯磺酰基截短侧耳素，
Figure 207873DEST_PATH_IMAGE019
，
22-O-甲苯磺酰基截短侧耳素是文献中的已知化合物。然而，下面将对制备工序加以概述。
于10至15℃下将13.0 kg截短侧耳素和6.57 kg 4-甲苯磺酰氯溶解于42.1 L CH2Cl2中的溶液用9.1 L 5.7 M NaOH水溶液处理20分钟，维持温度<25℃。将所得的灰白色悬浮液加热回流20小时，追踪反应直到HPLC测定反应完成。当反应完成时，将所得混合物冷却到20至30℃，用52 L CH2Cl2稀释，于15至25℃下搅拌10分钟，将所获得的各层加以分离。将所得有机相用52 L水洗涤数次，直到把水层的pH值调节至<9。将所得有机层浓缩到4体积，用52 L CH2Cl2共沸干燥二次。向所得溶液中滴加52 L庚烷，将所得溶液于<40℃温度下浓缩到大约4体积。向所得浓缩物中添加52 L庚烷，将所得悬浮液于20至25℃下搅拌2至2.5小时，过滤，将所得滤饼用39 L庚烷洗涤，并在过滤器中抽干。将该固体于<40℃温度下真空干燥至少12小时。
获得16.9 kg白色固体形式的22-O-甲苯磺酰基截短侧耳素。
1H NMR (200 MHz, DMSO-d6, ppm, 其中一部分) δ7.81 (d, 2H), 7.47 (d, 2H), 6.14–6.0 (m, 1H), 5.54 (d, J=7.8Hz, 1H), 5.08–4.99 (m, 2H), 4.70 (AB, J=16.2Hz, 2H), 3.41 (d, J=5.2Hz, 1H), 2.41 (s, 4H), 1.04 (s, 3H), 0.81 (d, 3H), 0.51 (d, 3H)。
实施例3
14-O-{[(1R,2R,4R)-4-叔丁氧羰基氨基-2-羟基-环己基-硫烷基]乙酰基}-木替灵，
Figure 349004DEST_PATH_IMAGE020
，
将4.75 Kg截短侧耳素对甲苯磺酸盐 (Tos-PLEU)和44.4 L MTBE装入到容器中，向所得混合物中添加0.31 Kg苄基-三正丁基氯化铵，用2.4 L MTBE冲洗。向所得混合物中添加20 L 1M NaOH水溶液和2.84 Kg [(1R,3R,4R)-3-羟基-4-巯基-环己基]氨基甲酸叔丁酯，将所得混合物于17至23℃下搅拌3小时。反应完成时(利用HPLC测定)将形成的两相分离，除去下部水层。将所得有机相用19 L 1M NaOH水溶液洗涤，用20 L 0.1 M磷酸洗涤两次，用20 L 10% NaHCO3水溶液洗涤，用20 L水洗涤两次。将所得有机相浓缩，将所得浓缩物溶解于7.46 Kg 2-丙醇中，将所得混合物再次浓缩，并于<40℃温度下真空干燥。获得6.66 Kg白色泡沫体形式的14-O-{[(1R,2R,4R)-4-叔丁氧羰基氨基-2-羟基-环己基-硫烷基]乙酰基}-木替灵。
1H NMR (200 MHz, DMSO-d6, ppm, 其中一部分)δ6.78 (d, J=7.8Hz, 1H), 6.22–6.08 (m, 1H), 5.55 (d, J=7.8Hz, 1H), 5.13–5.02 (m, 2H), 4.95 (d, J=5Hz, 1H), 4.52 (d, J=6Hz, 1H), 3.36 (AB, J=15Hz, 2H), 2.40 (s, 宽, 1H), 2.15–2.0 (m, 3H), 1.9–1.8 (m, 1H), 1.35 (s, 9H), 0.81 (d, J=7Hz, 3H), 0.62 (d, J=6.6Hz, 3H)，
MS (ESI, g/mol): m/z 653 [M+2Na]+。
实施例4
14-O-{[(1R,2R,4R)-4-氨基-2-羟基-环己基硫烷基]乙酰基}-木替灵，晶形2，
Figure 846981DEST_PATH_IMAGE021
，
步骤A：晶形1的14-O-{[(1R,2R,4R)-4-氨基-2-羟基-环己基硫烷基]乙酰基}-木替灵
将6.6 Kg 14-O-{[(1R,2R,4R)-4-叔丁氧羰基氨基-2-羟基-环己基-硫烷基]乙酰基}-木替灵和13.2 L异丙醇装入到容器中，于20至25℃下搅拌。添加11.20 kg 85%磷酸，将所得混合物加热到大约50℃并维持至少16小时。通过HPLC对所得混合物进行分析，以判断反应是否完成。反应完成时，将混合物冷却到20至25℃，添加52 L CH2Cl2。将所得混合物冷却到0至5℃，于<25℃温度下经1小时添加51 L 30%K2CO3水溶液。将所得混合物升温到室温，搅拌30分钟，测定水层的pH值。于<25℃温度下向所得混合物中再添加15 L 30% K2CO3水溶液，将所得混合物于15℃至25℃下搅拌30分钟，将所得的两相分离。将所得水相用51 L CH2Cl2萃取，将合并的有机相用51 L纯化水洗涤。将所得混合物浓缩到25 L体积，添加33.6 Kg CH2Cl2，将所得混合物浓缩到25 L。向所得浓缩物中添加33.6 Kg CH2Cl2，将所得混合物浓缩到10 L。将所得浓缩残留物冷却到18至22℃，经1小时添加50 L二异丙基醚。将所得浆料于15至25℃下搅拌最少2小时，过滤，将所得固体用10 L二异丙基醚洗涤并干燥。
获得3.79 Kg晶形1的14-O-{[(1R,2R,4R)-4-氨基-2-羟基-环己基硫烷基]乙酰基}-木替灵。
步骤B：晶形2的14-O-{[(1R,2R,4R)-4-氨基-2-羟基-环己基硫烷基]乙酰基}-木替灵
为了进一步纯化，将步骤A的14-O-{[(1R,2R,4R)-4-氨基-2-羟基-环己基硫烷基]乙酰基}-木替灵和18.75 L正丁醇加热到88至92℃直到完全溶解，搅拌30至60分钟。让所得混合物经至少2小时冷却到40至45℃，在此温度下再搅拌2小时。将所得混合物过滤，将所得沉淀物用3.75 L正丁醇洗涤，接着用3.75 L MTBE洗涤。重复该纯化步骤，在<40℃温度下对所得产物进行真空干燥。
获得3.27 Kg白色固体形式的晶形2的结晶14-O-{[(1R,2R,4R)-4-氨基-2-羟基-环己基硫烷基]乙酰基}-木替灵。
1H NMR (400 MHz, CDCl3, ppm, 其中一部分)δ6.51–6.44 (m, 1H), 5.78 (d, J=8Hz, 1H), 5.38–5.20 (m, 2H), 3.48–3.40 (m, 1H), 3.36 (d, J=7Hz, 1H), 3.25 (AB, J=15Hz, 2H), 2.92–2.82 (m, 1H), 2.6–2.5 (m, 1H), 1.45 (s, 3H), 1.20 (s, 3H), 0.88 (d, J=7Hz, 3 H), 0.73 (d, J=8Hz, 3H)，
MS (ESI, g/mol): m/z 508[M+H]+。
实施例5
14-O-{[(1R,2R,4R)-4-氨基-2-羟基-环己基硫烷基]乙酰基}-木替灵，晶形1，
Figure 618628DEST_PATH_IMAGE022
，
于15至25℃下向900 g 14-O-{[(1R,2R,4R)-4-叔丁氧羰基氨基-2-羟基-环己基-硫烷基]乙酰基}-木替灵溶解于9 L CH2Cl2中的溶液中添加1.8 L TFA，将所得的溶液搅拌2小时。反应完成后，将反应混合物进行真空浓缩，用总量为9 L的CH2Cl2对所得浓缩残留物进行共沸干燥。将所得浓缩物溶解于4.5 L CH2Cl2，将该溶液冷却到0至5℃，用3.6 L K2CO3 (2.5M)水溶液将pH值调节到pH=11。将所得的两相混合物升温到15至20℃并搅拌5至10分钟。将所得各层分离，将所得水相用1.8 L CH2Cl2萃取，将所得有机相合并，用2.3 L H2O洗涤，用Na2SO4干燥，于<40℃温度下真空浓缩至干。获得粗14-O-{[(1R,2R,4R)-4-氨基-2-羟基-环己基-硫烷基]乙酰基}-木替灵。产量：744 g。
为了进一步纯化，采用以下工序：
向744 g粗14-O-{[(1R,2R,4R)-氨基-2-羟基-环己基-硫烷基]乙酰基}-木替灵中添加2.23 L THF，将所得悬浮液于15至25℃下搅拌60分钟。经15至30分钟向所得混合物中添加7.44 L MTBE，将所得悬浮液老化60分钟，在氮气环境中过滤。将所收集的固体用总体积为3 L的MTBE洗涤，在氮气环境中在过滤器上进行1.5小时抽滤干燥。
获得626 g 晶形1的14-O-{[(1R,2R,4R)-4-氨基-2-羟基-环己基-硫烷基]乙酰基}-木替灵。
1H NMR谱图确认了14-O-{[(1R,2R,4R)-4-氨基-2-羟基-环己基硫烷基]乙酰基}-木替灵的结构。14-O-{[(1R,2R,4R)-4-氨基-2-羟基-环己基硫烷基]乙酰基}-木替灵的NMR谱图描述于实施例4。
实施例6
14-O-{[(1R,2R,4R)-4-[(2,2,2-三氟乙酰基)-氨基-2-羟基-环己基-硫烷基]乙酰基}-木替灵，
工序1
Figure 382316DEST_PATH_IMAGE023
，
将45.3 g {(1R,2R,4R)-4-[(2,2,2-三氟乙酰基)氨基]-2-羟基-环己基}-苯-硫代甲酸酯和453ml CH2Cl2装入到烧瓶中，在15-25℃下用氩气对所得混合物进行25分钟脱气。向所得混合物中滴加12.79 g一水合肼，接着是90.6ml CH2Cl2线路冲洗。于20至25℃下将所得混合物搅拌2小时，利用TLC追踪反应直到反应完成。反应完成时，将所得混合物冷却到15至20℃，用158.6 ml 2 M HCl溶液洗涤。将所得各相分离，将所得水相倒回容器中，添加158.6ml饱和NaCl水溶液溶液，将所得混合物用2×78.8ml CH2Cl2反萃取。将所得的合并有机相用90.6ml饱和NaCl水溶液洗涤，于<40℃温度下在真空条件下将所得有机层浓缩到2体积。向所得浓缩物中添加226.5ml CH2Cl2，将所得混合物浓缩到2体积。向所得浓缩物中添加362.4ml CH2Cl2。
对所得混合物实施剥离重量分析，以测定2,2,2-三氟-N-[(1R,3R,4R)-3-羟基-4-巯基-环己基]乙酰胺的含量，测定的产量为27.1g。
利用氩气对以上述方式获得的2,2,2-三氟-N-[(1R,3R,4R)-3-羟基-4-巯基-环己基]乙酰胺溶液 (含有27.1g)进行脱气。添加56.5g截短侧耳素对甲苯磺酸盐，接着是54.3ml CH2Cl2线路冲洗，将所得混合物于20至25℃下搅拌15分钟。向所得混合物中经30分钟添加溶解于34ml CH2Cl2中的34.0g DBU，将所得混合物于20至25℃下搅拌1小时，直到反应完成。将所得混合物用2×222.5ml的2M H2SO4洗涤，接着用2×222.5ml的5% NaHCO3水溶液洗涤，将所得混合物于40℃下真空浓缩至干。获得72.7g灰白色泡沫体形式的14-O-{[(1R,2R,4R)-[(2,2,2-三氟乙酰基)-氨基-2-羟基-环己基-硫烷基]乙酰基}-木替灵。
1H NMR (200 MHz, DMSO-d6, ppm, 其中一部分)δ9.31 (d, 1H，), 6.15 (dd, J=17.8 Hz, J=11.1Hz, 1H), 5.55 (d, J=7.8Hz, 1H), 5.17–5.02 (m, 3H, H-20), 5.53 (d, J=5.8Hz, 1H), 3.80–3.60 (m, 1H), 3.50–3.20 (m, 4H), 2.65–2.41 (m, 2H), 2.29–1.84 (m, 6H), 1.80–1.40 (m, 6H), 1.40–1.17 (m, 9H), 1.17-0.95 (m, 5H), 0.82 (d, J=6.8 Hz, 3H), 0.63 (d, J=5.8 Hz, 3H)。
工序2
Figure 264822DEST_PATH_IMAGE024
，
步骤A：2,2,2-三氟-N-[(1R,3R,4R)-3-羟基-4-巯基-环己基]-乙酰胺，
将5.79 g {(1R,2R,4R)-4-[(2,2,2-三氟乙酰基)-氨基]-2-羟基-环己基}-苯-硫代甲酸酯溶解于81 ml二氯甲烷，添加1.67 g (1.62 ml) 水合肼，将所得溶液于室温下搅拌3.5小时。向混合物中添加40 ml 1M HCl，将所得两相混合物剧烈搅拌10分钟。将两相分离，将有机相用40 ml 1M HCl洗涤。将所得的合并水层用NaCl饱和，用30 ml DCM洗涤；将所得的合并有机相用无水硫酸钠干燥并浓缩至干。
获得3.41 g无色晶体形式的2,2,2-三氟-N-[(1R,3R,4R)-3-羟基-4-巯基-环己基]-乙酰胺。
1H NMR (200 MHz, DMSO-d6, ppm, 其中一部分)δ9.31 (d, J=7.2Hz, 1H), 5.12 (d, J=5.1Hz, 1H), 3.82–3.6 (m, 1H), 3.24–3.09 (m, 1H), 2.62–2.5 (m, 1H), 2.40 (S,宽, 1H), 2.03–1.84 (m, 2H), 1.74–1.71 (m, 1H), 1.47–1.21 (m, 3H)。
步骤B：14-O-{[(1R,2R,4R)-[(2,2,2-三氟乙酰基)-氨基]-2-羟基-环己基-硫烷基]乙酰基}-木替灵
将5.91 g 2,2,2-三氟-N-[(1R,3R,4R)-3-羟基-4-巯基-环己基]-乙酰胺和11.78 g截短侧耳素对甲苯磺酸盐溶解于82.5 ml DCM，利用氩气对所得溶液进行20分钟脱气。向所得混合物中经30分钟添加6.91 g溶解于27.5 ml DCM的DBU。反应完成时(TLC控制)，向所得混合物中添加25 ml 2M HCl，将所得混合物剧烈搅拌10分钟。将所得各相分离，将所得有机相用12.5 ml 2M HCl洗涤随后用25 ml 5%碳酸氢钠溶液洗涤，用无水硫酸钠干燥并过滤。从所得滤液中真空蒸发掉溶剂。
获得16.8 g无色泡沫体形式的14-O-{[(1R,2R,4R)-4-[(2,2,2-三氟乙酰基)-氨基]-2-羟基-环己基-硫烷基]乙酰基}-木替灵。(该材料中含有DBU对甲苯磺酸盐和残余的DCM)。
1H NMR谱图确认了14-O-{[(1R,2R,4R)-4-[(2,2,2-三氟乙酰基)-氨基]-2-羟基-环己基-硫烷基]乙酰基}-木替灵的结构。14-O-{[(1R,2R,4R)-4-[(2,2,2-三氟乙酰基)-氨基]-2-羟基-环己基-硫烷基]乙酰基}-木替灵的NMR谱图描述于实施例6的工序1中。
实施例7
14-O-{[(1R,2R,4R)-4-氨基-2-羟基-环己基硫烷基]乙酰基}-木替灵，晶形2，
，
将72.7 g粗14-O-{[(1R,2R,4R)-4-[(2,2,2-三氟乙酰基)-氨基-2-羟基-环己基-硫烷基]乙酰基}-木替灵、419.9ml甲醇和168ml水装入到烧瓶中，将所得混合物升温到40至45℃。向所得混合物中添加67.3 g K2CO3，于40至45℃下将所得混合物搅拌5小时。利用HPLC追踪反应进程，直到反应完成。反应完成时，将所得混合物冷却到20至25℃，添加588ml CH2Cl2和588ml 2 M磷酸，将所得混合物于20至25℃下搅拌15分钟。对所得混合物进行双相过滤，分离，将所得有机层用588 ml 1 M磷酸萃取。将所得各相分离，向所得的合并水层(产物)中添加588 ml CH2Cl2，将所得混合物冷却到10至15℃。于<25℃温度下向所得混合物中滴加6 M NaOH，直到pH>9 (需要275ml)。对所得混合物进行双相过滤，将所得各层分离。将所得有机(产物)层于<40℃下真空浓缩到大约5体积，添加176ml CH2Cl2，于<40℃温度下将所得混合物再次真空浓缩到2体积。向所得浓缩物中滴加323.5ml正丁醇，于<40℃温度下将所得混合物真空浓缩到5体积，将所得浓缩物于20至25℃下搅拌2小时。将所得混合物过滤，将所得沉淀物用117.6ml正丁醇洗涤，于40℃下将所得固体真空干燥过夜，产生44.2g晶形2的14-O-{[(1R,2R,4R)-4-氨基-2-羟基-环己基硫烷基]乙酰基}-木替灵。
把44.2g的粗14-O-{[(1R,2R,4R)-4-氨基-2-羟基-环己基硫烷基]乙酰基}-木替灵装入到清洁的容器中，添加221ml正丁醇。将所得混合物加热到88至92℃，搅拌40分钟，使其以稳定的速率经3小时冷却到40至45℃，再搅拌2小时。将所得混合物过滤，用44.2ml的正丁醇洗涤，接着用44.2ml MTBE洗涤，于<40℃温度下真空干燥。
获得37.6g白色结晶固体形式的晶形2的结晶14-O-{[(1R,2R,4R)-4-氨基-2-羟基-环己基硫烷基]乙酰基}-木替灵。
1H NMR谱图确认了14-O-{[(1R,2R,4R)-4-氨基-2-羟基-环己基硫烷基]乙酰基}-木替灵的结构。14-O-{[(1R,2R,4R)-4-氨基-2-羟基-环己基硫烷基]乙酰基}-木替灵的NMR谱图描述于实施例4。
实施例8
[(1R,3R,4R)-3-羟基-4-巯基-环己基]-氨基甲酸叔丁酯和[(1S,3S,4S)-3-羟基-4-巯基-环己基]-氨基甲酸叔丁酯，
Figure 622171DEST_PATH_IMAGE026
，
将7.22 g {(1R,2R,4R)-4-[(叔丁氧羰基)-氨基]-2-羟基-环己基}-苯-硫代甲酸酯与{(1S,2S,4S)-4-[(叔丁氧羰基)-氨基]-2-羟基-环己基}-苯-硫代甲酸酯的混合物以及72 ml CH2Cl2装入到烧瓶中，将所得混合物于15-25℃下搅拌。使用氩气对所得混合物进行20分钟脱气。向所得混合物中添加0.72 g 1,4-二硫代-DL-苏糖醇并滴加1.5 g一水合肼。利用TLC追踪反应直到反应完成。反应完成时(2.5小时)，向所得混合物中添加72 ml 1M磷酸溶液，将所得混合物搅拌15分钟。将所得各相分离，将下部有机相用72 ml 1 M磷酸洗涤，接着用72 ml 1% NaCl溶液洗涤，用无水硫酸镁(10 g)干燥，过滤，将固体用2×10 ml CH2Cl2冲洗。将所得混合物于≤40℃下真空浓缩。获得5.01 g白色固体形式的[(1R,3R,4R)-3-羟基-4-巯基-环己基]氨基甲酸叔丁酯与[(1S,3S,4S)-3-羟基-4-巯基-环己基]氨基甲酸叔丁酯的混合物。
1H NMR (200 MHz, DMSO-d6, ppm, 其中一部分)δ 6.79 (d, J=7.8Hz, 1H), 5.01 (d, J=5.6Hz, 1H), 3.40–3.20 (m, 1H), 3.1–3.0 (m, 1H), 2.38 (d, J=3.8Hz, 1H), 2.01–1.78 (m, 2H)，
1.73–1.61 (m, 1H), 1.47-1.01 (m, 12H)。
实施例9
14-O-{[(1R,2R,4R)-4-叔丁氧羰基氨基-2-羟基-环己基-硫烷基]乙酰基}-木替灵和14-O-{[(1S,2S,4S)-4-叔丁氧羰基氨基-2-羟基-环己基-硫烷基]乙酰基}-木替灵，
，
将9.68 g截短侧耳素对甲苯磺酸盐和101 ml MTBE装入到烧瓶中，于室温下使用氩气对所得混合物进行5至10分钟的脱气。搅拌下向所得混合物中添加0.64 g苄基-三正丁基氯化铵、4.72g [(1R,3R,4R)-3-羟基-4-巯基-环己基]氨基甲酸叔丁酯与[(1S,3S,4S)-3-羟基-4-巯基-环己基]氨基甲酸叔丁酯的混合物、40 ml 1M NaOH水溶液。将所得混合物于20-25℃下搅拌，利用HPLC追踪反应直到反应完成。反应完成时(1小时)将所得各层分离，除去下部水层。将所得有机相用40 ml 1M NaOH水溶液、2×40ml 0.1M磷酸、随后是40 ml 10% NaHCO3溶液和40 ml H2O洗涤。将所得有机层浓缩，于≤40℃温度下真空干燥。获得11.88 g白色泡沫体形式的14-O-{[(1R,2R,4R)-4-叔丁氧羰基氨基-2-羟基-环己基-硫烷基]乙酰基}-木替灵与14-O-{[(1S,2S,4S)-4-叔丁氧羰基氨基-2-羟基-环己基-硫烷基]乙酰基}-木替灵的混合物 (未校正残余溶剂)。
1H NMR (200 MHz, DMSO-d6, ppm, 其中一部分) δ 6.79 (d, J=7.8Hz, 1H), 6.22–6.07 (m, 1H), 5.55 (d, J=8Hz, 1H), 5.12–4.96 (m, 3H), 4.54 (d, J=6Hz, 1H), 3.55–3.24 (m, 4H), 2.54–2.50 (m, 1H), 2.41 (s, 宽, 1H), 2.23–1.80 (m, 5H), 1.71–1.56 (m, 3H), 1.56–1.43 (m, 2H), 1.42–1.31 (m, 14H), 1.31–1.18 (m, 4H), 1.10–0.91 (m, 5H), 0.82 (d, J=6.6Hz, 3H), 0.63 (d, J=5.8Hz, 3H)。
实施例10
14-O-{[(1R,2R,4R)-4-氨基-2-羟基-环己基硫烷基]乙酰基}-木替灵，晶形2，
Figure 789377DEST_PATH_IMAGE028
，
将10.69 g 14-O-{[(1R,2R,4R)-4-叔丁氧羰基氨基-2-羟基-环己基-硫烷基]乙酰基}-木替灵与14-O-{[(1S,2S,4S)-4-叔丁氧羰基氨基-2-羟基-环己基-硫烷基]乙酰基}-木替灵的混合物(未校正残余溶剂)及24 ml异丙醇装入到烧瓶中，将所得混合物加以搅拌。向所得混合物中添加12 ml 85%磷酸，将所得混合物加热到50℃过夜。通过HPLC测定反应完成时，将所得混合物冷却到室温，添加119 ml CH2Cl2。将所得混合物冷却到0至5℃，经1小时滴加119 ml 30% K2CO3水溶液。将所得混合物升温至室温并静置。将所得各相分离，取出所得的下部有机(产物)层。将所得水层(测量的pH=10)用119 ml CH2Cl2萃取，将所得的合并有机相用119 ml H2O洗涤。所得有机相浓缩到大约5体积，添加59 ml CH2Cl2，将所得混合物再次浓缩到大约5体积。再次向所得浓缩物中添加59 ml二氯甲烷，将所得混合物浓缩到2体积。搅拌下向所得浓缩物中经1小时滴加119ml二异丙基醚。获得粘稠油状的沉淀物，该沉淀物在约1小时后变为白色晶体。将所得混合物于15至25℃下搅拌2小时，过滤，将所得沉淀物用24 ml二异丙基醚洗涤，在过滤器上抽干。获得8.28 g (未校正残余溶剂)固体形式的14-O-{[(1R,2R,4R)-4-氨基-2-羟基-环己基硫烷基]乙酰基}-木替灵与14-O-{[(1S,2S,4S)-4-氨基-2-羟基-环己基硫烷基]乙酰基}-木替灵的混合物 (比率=59:41)。将8.28 g所得粗混合物和41 ml正丁醇装入到烧瓶中，搅拌下将所得混合物加热到88至92℃并维持30分钟。让所得混合物经大约3小时冷却到室温。在~50℃时开始观察到沉淀，将所得混合物于室温下搅拌过夜。将所得混合物过滤，将所得沉淀物用16.6 ml正丁醇洗涤，随后用16.6 ml MTBE洗涤，于≤40℃下真空干燥。获得4.27 g白色结晶固体形式的晶形2的14-O-{[(1R,2R,4R)-4-氨基-2-羟基-环己基硫烷基]乙酰基}-木替灵。手性HPLC测定的光学纯度为93%，RP HPLC测定的化学纯度为99.14面积%。
另外，14-O-{[(1R,2R,4R)-4-氨基-2-羟基-环己基硫烷基]乙酰基}-木替灵的可信样品的旋光度与以上述方式获得的14-O-{[(1R,2R,4R)-4-氨基-2-羟基-环己基硫烷基]乙酰基}-木替灵的旋光度的比较也确认了手性纯度；([α]D (CHCl3) = +24.9°相对于可信样品的+25.9°)。
将正丁醇重结晶所得的母液蒸发至干，获得白色泡沫体。获得3.67g 14-O-{[(1S,2S,4S)-4-氨基-2-羟基-环己基硫烷基]乙酰基}-木替灵与14-O-{[(1R,2R,4R)-4-氨基-2-羟基-环己基硫烷基]乙酰基}-木替灵的混合物 (比率=84.0:16.0；通过手性HPLC测定)。
1H NMR谱图确认了14-O-{[(1R,2R,4R)-4-氨基-2-羟基-环己基硫烷基]乙酰基}-木替灵的结构。14-O-{[(1R,2R,4R)-4-氨基-2-羟基-环己基硫烷基]乙酰基}-木替灵的NMR谱图描述于实施例4。
实施例11
14-O-{[(1R,2R,4R)-4-氨基-2-羟基-环己基-硫烷基]乙酰基}-木替灵醋酸盐，晶形A，
，
于50至55℃下向615 g 14-O-{[(1R,2R,4R)-4-氨基-2-羟基-环己基-硫烷基]乙酰基}-木替灵在12.3 L醋酸甲酯中的悬浮液中添加62 ml水，用GF滤纸使所得的浑浊溶液变澄清。将所得滤液加热到50至55℃ (澄清溶液)，添加123 ml醋酸，于50至55℃下将所得的混合物搅拌25分钟，经80分钟冷却到15至25℃，并且经60分钟进一步冷却到0至5℃。将所得的悬浮液于0至5℃下老化80分钟，过滤，将滤饼用3.08 L醋酸甲酯洗涤。将滤饼在氮气环境中在过滤器上抽滤2小时。获得574.1 g 醋酸盐形式的晶形A的白色细粉状的结晶14-O-{[(1R,2R,4R)-4-氨基-2-羟基-环己基-硫烷基]乙酰基}-木替灵。
1H NMR谱图确认了14-O-{[(1R,2R,4R)-4-氨基-2-羟基-环己基-硫烷基]乙酰基}-木替灵醋酸盐的结构。14-O-{[(1R,2R,4R)-4-氨基-2-羟基-环己基-硫烷基]乙酰基}-木替灵醋酸盐的NMR谱图描述于实施例12。
实施例12
14-O-{[(1R,2R,4R)-4-氨基-2-羟基-环己基-硫烷基]乙酰基}-木替灵醋酸盐，晶形B，
Figure 375396DEST_PATH_IMAGE030
，
工序1
向3260 g 14-O-{[(1R,2R,4R)-4-氨基-2-羟基-环己基-硫烷基]乙酰基}-木替灵在56.8 L醋酸异丙酯中的悬浮液中添加10 g晶形B的14-O-{[(1R,2R,4R)-4-氨基-2-羟基-环己基-硫烷基]乙酰基}-木替灵的晶种。在不添加晶种的情况下也产生结晶。将所得的悬浮液于20至25℃下搅拌≥10分钟。向所得混合物中添加353 ml醋酸，将所得混合物于20至25℃下搅拌1小时，利用XRPD检测反应完成和多晶形。将所得悬浮液于20至25℃下再搅拌1小时，过滤，将所得滤饼用2.84 L (每次)醋酸异丙酯洗涤二次。将所得固体于50℃下真空干燥至少12小时。获得3.15 kg晶形B的白色固体结晶形式的14-O-{[(1R,2R,4R)-4-氨基-2-羟基-环己基-硫烷基]乙酰基}-木替灵醋酸盐。
工序2
将2.00 g 14-O-{[(1R,2R,4R)-4-氨基-2-羟基-环己基-硫烷基]乙酰基}-木替灵溶解于6 ml甲醇。向所得混合物中一次添加0.338 ml醋酸，将所得溶液搅拌15分钟。向所得混合物中经30分钟添加30 ml醋酸异丙酯，将所得悬浮液搅拌30分钟。将所得浆料加热到30℃，蒸馏掉15体积，并进行3次(每次3体积)醋酸异丙酯剥离(strip)。将所得浆料过滤，分离出所得的白色沉淀物，用醋酸异丙酯洗涤，干燥过夜。获得1.74 g晶形B的白色结晶固体形式的{[(1R,2R,4R)-4-氨基-2-羟基-环己基-硫烷基]乙酰基}-木替灵醋酸盐。
1H NMR (500 MHz, DMSO-d6, ppm, 其中一部分) δ 6.16–6.10 (m, 1 H), 5.54 (d, J=8.3Hz, 1H), 5.09-5.02 (m, 2H), 3.42 (d, J=6Hz, 1H), 3.37 (AB, J=15Hz, 2H), 3.29-3.25 (m, 1H), 2.77–2.67 (m, 1H), 2.55-2.5 (m, 1H), 2.40 (s, 宽, 1H), 2.23–2.12 (m, 1H), 2.12–2.03 (m, 3H), 2.03–1.95 (m, 1H), 1.94–1.85 (m, 1H), 1.77 (s, 3H), 1.77–1.71 (m, 1H), 1.7–1.57 (m, 2H), 1.52–1.43 (m, 1H), 1.43–1.37 (m, 1H), 1.36 (s, 3H), 1.37–0.96 (m, 10H), 0.81 (d, J=7Hz, 3H), 0.62 (d, J=7Hz, 3H)。
实施例13
14-O-{[(1R,2R,4R)-4-氨基-2-羟基-环己基硫烷基]乙酰基}-木替灵L-乳酸盐，晶形1，
Figure 362944DEST_PATH_IMAGE031
，
将22 g 14-O-{[(1R,2R,4R)-4-氨基-2-羟基-环己基-硫烷基]乙酰基}-木替灵和1.1 L 醋酸乙酯装入到容器中。将所得悬浮液加热到50℃并保持直到溶解。向所得混合物中添加1当量的98% L-乳酸，所得混合物经3小时逐渐冷却到25℃。
任选地添加14-O-{[(1R,2R,4R)-4-氨基-2-羟基-环己基-硫烷基]乙酰基}-木替灵L-乳酸盐晶种。在不添加晶种的情况下也产生结晶。将所得悬浮液于20-25℃下搅拌过夜，进一步冷却到5℃持续1小时。通过过滤分离出所得的沉淀物，于40℃下真空干燥过夜。
获得23.7 g晶形1的14-O-{[(1R,2R,4R)-4-氨基-2-羟基-环己基-硫烷基]乙酰基}-木替灵L-乳酸盐。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6, ppm, 其中一部分) δ 6.13 (dd, J=11和18Hz, 1H), 5.54 (d, J=8Hz, 1H), 5.10–5.01 (m, 2H), 4.53 (d, 宽, 1H), 3.60 (dd, J=7和14Hz, 1H), 3.40 (AB, J=15Hz, 2H), 2.93 (m, 1H), 2.55–2.48 (m, 1H), 2.39 (s, 宽, 1H), 1.36 (s, 3H), 1.09 (d, J=7Hz, 3H), 1.04 (s, 3H), 0.81 (d, J=7Hz, 3H), 0.61 (d, J=7Hz, 3H)。
实施例14
14-O-{[(1R,2R,4R)-4-氨基-2-羟基-环己基硫烷基]乙酰基}-木替灵马来酸氢盐，晶形1，
Figure 587252DEST_PATH_IMAGE032
，
将5.5 g 14-O-{[(1R,2R,4R)-4-氨基-2-羟基-环己基-硫烷基]乙酰基}-木替灵和110 ml醋酸乙酯装入到烧瓶中。将所得悬浮液加热到80℃并维持直到溶解。向所得混合物中装入10.8 ml溶解于THF的1M马来酸，搅拌下让所得混合物冷却到室温过夜。任选地添加14-O-{[(1R,2R,4R)-4-氨基-2-羟基-环己基-硫烷基]乙酰基}-木替灵马来酸氢盐晶种。在不添加晶种的情况下也产生结晶。
通过过滤分离出6.16 g晶形1的结晶马来酸氢盐形式的14-O-{[(1R,2R,4R)-4-氨基-2-羟基-环己基-硫烷基]乙酰基}-木替灵，并真空干燥6小时。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d-6, ppm, 其中一部分) δ 6.13 (dd, J=11和18Hz, 1H), 6.00 (s, 2H), 5.54 (d, J=8Hz, 1H), 5.10–5.01 (m, 2H), 4.54 (d, J=6Hz, 1H), 3.40 (AB, J=15Hz, 2H), 3.05 (m, 1H), 2.56–2.49 (m, 1H), 2.40 (s, 宽, 1H), 1.36 (s, 3H), 1.05 (s, 3H), 0.81 (d, J=7Hz, 3H), 0.61 (d, J=7Hz, 3H)。
下面的反应流程3中示出了交换式I化合物中的胺保护基团R的工艺：
反应流程3
Figure 648749DEST_PATH_IMAGE033
，
在反应流程3中，R代表氨基保护基团并且如上文所定义。
实施例15
14-O-{[(1R,2R,4R)-4-[(2,2,2-三氟乙酰基)-氨基-2-羟基-环己基-硫烷基]乙酰基}-木替灵，
Figure 746149DEST_PATH_IMAGE034
，
将1 g 14-O-{[(1R,2R,4R)-4-氨基-2-羟基-环己基-硫烷基]乙酰基}-木替灵和10 ml DCM装入到室温下的烧瓶中，将所得混合物加以搅拌。向所得混合物中滴加0.41 ml三乙胺，接着添加0.29 ml 三氟乙酸酐，将所得混合物加以搅拌，直到反应完成(通过TLC测定)。将所得混合物用10 ml 0.1 M HCl洗涤，接着用10 ml的5% NaHCO3和10 ml水洗涤，浓缩至干。获得1.20 g泡沫体形式的14-O-{[(1R,2R,4R)-4-[(2,2,2-三氟乙酰基)-氨基-2-羟基-环己基-硫烷基]乙酰基}-木替灵。
1H NMR谱图确认了14-O-{[(1R,2R,4R)-4-[(2,2,2-三氟乙酰基)-氨基-2-羟基-环己基-硫烷基]乙酰基}-木替灵的结构。14-O-{[(1R,2R,4R)-4-[(2,2,2-三氟乙酰基)-氨基-2-羟基-环己基-硫烷基]乙酰基}-木替灵的NMR谱图描述于实施例6。
实施例16
14-O-{[(1R,2R,4R)-4-乙氧羰基氨基-2-羟基-环己基-硫烷基]乙酰基}-木替灵，
，
将1 g 14-O-{[(1R,2R,4R)-4-氨基-2-羟基-环己基-硫烷基]乙酰基}-木替灵和10 ml DCM装入到室温下的烧瓶中，将所得混合物加以搅拌。向所得混合物中滴加0.41 ml三乙胺，接着添加0.2 ml氯甲酸乙酯，将所得混合物搅拌，直到反应完成(通过TLC测定)。将所得混合物用10 ml 0.1 M HCl洗涤，接着用10 ml 5% NaHCO3和10 ml水洗涤，并浓缩至干。
获得1.05 g泡沫体形式的14-O-{[(1R,2R,4R)-4-乙氧羰基氨基-2-羟基-环己基-硫烷基]乙酰基}-木替灵。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d-6, ppm, 其中一部分) δ 7.07 (d, J=7.6Hz, 1H), 6.16 (dd, J=17.6Hz, J=11.0 Hz, 1H), 5.55 (d, 1H, J=8.0 Hz), 5.13–4.96 (m, 3H), 4.54 (d, 1H, J=5.8Hz), 4.00–3.89 (q, 2H), 3.56–3.14 (m, 5H), 2.51–2.36 (m, 2H), 2.18–1.80 (m, 5H), 1.80–1.40 (m, 5H), 1.40–0.88 (m, 17H), 0.82 (d, J=6.8Hz, 3H), 0.63 (d, J=5.8 Hz, 3H)。
实施例17
14-O-{[(1R,2R,4R)-2-羟基-4-(邻苯二甲酰亚胺基-N-基)-环己基-硫烷基]乙酰基}-木替灵，
Figure 186674DEST_PATH_IMAGE036
，
将1 g 14-O-{[(1R,2R,4R)-4-氨基-2-羟基-环己基-硫烷基]乙酰基}-木替灵和40 ml甲苯装入到室温下的烧瓶中，将所得混合物搅拌。向所得混合物中滴加0.41 ml三乙胺，接着添加0.30 g邻苯二甲酸酐，将所得混合物加热回流，并在Dean-Stark条件下除去水，直到反应完成 (通过HPLC测定)。将所得混合物用10 ml 0.1 M HCl接着用10 ml 5% NaHCO3和10 ml水洗涤，用硫酸钠干燥，并浓缩至干。
获得0.87 g灰白色晶体形式的14-O-{[(1R,2R,4R)-2-羟基-4-(邻苯二甲酰亚胺基-N-基)-环己基-硫烷基]乙酰基}-木替灵。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d-6, ppm, 其中一部分) δ 7.9–7.7 (m, 4H), 6.17 (dd, J=17.6 Hz, J=11.2 Hz, 1H), 5.58 (d, 1H, J=7.8 Hz), 5.16–5.06 (m, 3H), 4.54 (d, 1H, J=6.0Hz), 4.13–4.01 (m, 1H), 3.62–3.29 (m, 4H), 2.69–2.60 (m, 1H), 2.43 (m, 1H), 2.30–1.80 (m, 8H), 1.80–1.15 (m, 12H), 1.1–0.9 (m, 4H), 0.83 (d, J=6.6 Hz, 3H), 0.65 (d, J=5.8 Hz, 3H)。
下面的反应流程4中总结了用于制备式Ⅲa化合物的式Ⅳa起始材料的合成工艺。
反应流程4
Figure 430574DEST_PATH_IMAGE037
，
在反应流程4中，R代表氨基保护基团，R1代表硫保护基团并且如上文所定义。
实施例18
{(1R,2R,4R)-4-[(叔丁氧羰基)-氨基]-2-羟基-环己基}-苯-硫代甲酸酯，
步骤A：环己-3-烯基-1(R)-氨基甲酸叔丁酯，
A. 生成环己-3-烯-1-甲酸的盐，
Figure 620247DEST_PATH_IMAGE038
，
将1000 g外消旋环己-3-烯-1-甲酸装入到烧瓶中，添加5体积的丙酮。将所得混合物加以搅拌，加热到55至60℃，搅拌30分钟。向所得混合物中经大约25分钟滴加溶解于2体积丙酮中的960.5g (S)-(-)-α-甲基苄胺。得到澄清的橙色溶液并将其缓慢冷却。于53℃下(30分钟后)开始结晶。在~1小时后于49℃下完全结晶。用冰浴经3小时将所得混合物冷却到室温，然后于室温下再搅拌1.5小时。过滤出所得的沉淀物，用丙酮洗涤。如上述反应流程所示获得了环己-3-烯-1-甲酸的α-甲基苄胺盐。
产量(湿)：1966.9 g；旋光度：20[α]D = +8.05° (c=1, MeOH)。
B. 盐拆分
将1966.9g (湿)步骤A中所述的盐和3.8体积丙酮装入到10 L容器中，将所得混合物加热到55至60℃。当产物已溶解时，将所得混合物再搅拌15分钟，然后缓慢冷却到室温。1小时10分钟后开始结晶 (53℃)。将所得混合物经4.5小时冷却到20至25℃，于室温下再搅拌1.5小时。过滤出所得的沉淀物，用丙酮洗涤。获得R-异构体富集的环己-3-烯-1-甲酸的α-甲基苄胺盐。
产量(湿)：1143 g；旋光度：20[α]D = +20.65° (c=1, MeOH)。
重复步骤B，直到达到所要求的旋光度 (20[α]D > 40°)。
C. 环己-3-烯-1(R)-甲酸
Figure 831654DEST_PATH_IMAGE039
，
将579.6 g环己-3-烯-1(R)-甲酸 (S)-(-)-α-甲基苄胺盐和5体积MTBE装入到20-25℃下的烧瓶中，将所得混合物加以搅拌。向所得混合物中添加10体积的1M HCl，将所得混合物搅拌5-10分钟，形成两层。将所得各层分离，水层用MTBE萃取。将所得有机层合并，用盐水洗涤。将所得有机相用Na2SO4干燥，过滤，所得滤饼用MTBE洗涤。在真空条件下从所得滤液中除去溶剂。获得澄清油状形式的环己-3-烯-1(R)-甲酸。
产量：301.78 g，
旋光度 20[α]D = +83.1° (c=1, CHCl3)。
可类似于Schwartz, H.M等人的JACS 1978, 100, 5199-5203中所公开的方法制备环己-3-烯-1(R)-甲酸。
D. Curtius重排以获得环己-3-烯基-(R)-氨基甲酸叔丁酯
Figure 397765DEST_PATH_IMAGE040
，
将305 g环己-3-烯-1(R)-甲酸和10体积的甲苯装入到20-25℃的烧瓶中，将所得混合物搅拌。向所得混合物中经15分钟滴加1.1当量的三乙胺，将所得混合物再搅拌20分钟。向所得混合物中经大约20分钟滴加1.05当量的DPPA，温度升高到95℃(放热反应)伴随剧烈的气体放出。将所得混合物搅拌15分钟，并加热回流。通过1H NMR检测追踪反应进程，直到反应完成。将所得混合物经35分钟冷却到80℃，并且经10分钟滴加5当量的叔丁醇，接着添加7.65 g CuCl。将所得混合物升温至100℃，再搅拌40分钟。通过1H NMR检测追踪反应进程，直到反应完成。冷却所得混合物，并且经10分钟添加5体积的NaHCO3饱和水溶液。将所得混合物搅拌20分钟，并静置过夜。将所得混合物过滤，并将剩余的固体用甲苯洗涤两次。分离有机层，水层用甲苯洗涤两次。将所得的全部有机层合并，用H2O洗涤，并在真空条件下除去溶剂。获得浅褐色固体的环己-3-烯基-1(R)-氨基甲酸叔丁酯。粗产量：479.7 g。
使所得的粗环己-3-烯基-1(R)-氨基甲酸叔丁酯经受色谱处理。对于160 g粗产物来说，柱装填1.5 Kg硅胶，使用2.5 L环己烷并用沙封顶。将粗产物加载于0.8 L 5% EtOAc/环己烷中。用以下梯度体系快速洗脱(flashed)所述柱，每次采集不连续的级分(fraction)：
2% EtOAc/环己烷(9×0.8 L级分)，
5% EtOAc/环己烷(7×0.8 L级分)，
10% EtOAc/环己烷(4×0.8 L级分)。
色谱处理后的总收率：理论值的81.3%。
1H NMR (CDCl3, 500 MHz, ppm):δ 5.64-5.67 (m, 1H), 5.56-5-60 (m, 1H), 4.54 (s, 宽, 1H), 3.77 (s, 宽, 1H), 2.32-2.34 (m, 1H), 2.07-2.17 (m, 2H), 1.81-1.87 (m, 2H), 1.48-1.56 (m, 1H), 1.44 (s, 9H)；
13C NMR (CDCl3, 500 MHz, ppm): δ 155.3, 126.9, 124.5, 79.1, 45.7, 32.1, 28.4, 23.6。
步骤B：(1R,3R,6S)-(7-氧杂-二环[4.1.0]庚-3-基)-氨基甲酸叔丁酯，
Figure 699433DEST_PATH_IMAGE041
，
将4500 g m-CPBA (70%)和24 L CH2Cl2装入到容器中，将所得混合物冷却到15℃。经大约30分钟滴加溶解于4.5 L CH2Cl2中的3000 g环己-3-烯基-1(R)-氨基甲酸叔丁酯，维持温度在15至25℃。向所得混合物中添加1.5 L CH2Cl2，于20至25℃下将所得混合物搅拌1小时，并加热回流(40℃) 2小时。反应完成时(1H NMR控制)，将混合物冷却到-5至0℃，搅拌过夜，过滤出所得固体沉淀物，并用CH2Cl2洗涤。所得滤液用10%硫代硫酸钠水溶液洗涤以除去氧化物，用10% NaHCO3水溶液洗涤直到水相的pH>7，并用水洗涤。将所得有机相浓缩到最小体积，并添加15 L甲苯，将所得混合物再次浓缩到最小体积。再重复两次该剥离过程。获得2.63 Kg甲苯溶液形式的(1R,3R,6S)-(7-氧杂-二环[4.1.0]庚-3-基)-氨基甲酸叔丁酯(产量2.05 Kg，对残余mCBA和甲苯进行校正)。
1H NMR (200 MHz, CDCl3, ppm)δ4.85 (d, J=7Hz, 1H), 3.6–3.54 (m, 1H), 3.10 (s, 宽, 2H), 2.23–1.99 (m, 2H), 1.92–1.67 (m, 2H), 1.54–1.27 (m, 11H)。
步骤C：{(1R,2R,4R)-4-[(叔丁氧羰基)-氨基]-2-羟基-环己基}-苯-硫代甲酸酯
Figure 122324DEST_PATH_IMAGE042
将2630 g (校正后2050g)上述步骤B得到的甲苯溶液形式(溶液重量：15.44 Kg)的(1R,3R,6S)-(7-氧杂-二环[4.1.0]庚-3-基)氨基甲酸叔丁酯和3.1 L甲苯装入到容器中，将所得混合物于15-25℃下搅拌。向所得混合物中滴加1.44 L硫代苯甲酸(10%)。将温度保持在低于30℃。进而，一次添加1.9 L甲苯和85.3 g的四丁基氯化铵一水合物，停止外部温度控制，使所得混合物发生放热反应。将所得混合物加热到40-45℃并搅拌4小时。反应完成时(TLC和1H NMR-控制)，将所得混合物冷却到15至20℃，用5%NaHCO3水溶液洗涤，接着用H2O洗涤两次。将所得有机层真空浓缩至最小体积。添加10.25 L甲苯，并将所得混合物再次浓缩到最小体积。重复此过程，测定所得干重。所有后续再制浆的体积均相对于该重量。
搅拌下向所得粗浓缩残留物中添加0.5体积的甲苯，于15至25℃下将所得混合物搅拌30分钟。向所得混合物中经15分钟滴加0.5体积的庚烷，于15至25℃下将所得混合物搅拌40分钟。将所得固体过滤并用0.25体积的甲苯-庚烷(1:1)洗涤，接着用0.5体积的甲苯-庚烷(1:1)洗涤浆料，接着用0.25体积的甲苯-庚烷(1:1)置换洗涤。该工序把不想要的区域异构体和硫代苯甲酸的量降低到不可测的水平(通过1H NMR)。将所得固体分离并于30℃真空干燥。获得1090 g白色固体形式的{(1R,2R,4R)-4-[(叔丁氧羰基)-氨基]-2-羟基-环己基}-苯-硫代甲酸酯。
1H NMR (200 MHz, DMSO-d6, ppm) δ 7.92–7.87 (m, 2H), 7.71–7.63 (m, 1H), 7.58–7.49 (m, 2H), 6.85 (d, J=8Hz, 1H), 5.11 (d, J=5.6Hz, 1H), 3.49–3.25 (m, 3H), 2.12–1.95 (m, 2H), 1.79–1.69 (m, 1H), 1.54–1.14 (m, 12H)。
下面的反应流程5中总结了获得用于制备式Ⅲa化合物的式Ⅳa起始材料的替代工艺 (缩短工艺)：
反应流程5
Figure 509443DEST_PATH_IMAGE043
，
其中R代表氨基保护基团，R1代表硫保护基团并且如上文所定义。
实施例19
{(1R,2R,4R)-4-[(2,2,2-三氟乙酰基)-氨基]-2-羟基-环己基}-苯-硫代甲酸酯，
Figure 879245DEST_PATH_IMAGE044
，
步骤A：N-(环己-3-烯-1(R)-基)-2,2,2-三氟-乙酰胺
于20-25℃下将50 g 3-环己烯-1(R)-甲酸和425 ml氯苯装入到烧瓶中，将所得混合物搅拌。向所得混合物中滴加110 ml三乙胺，接着添加25ml氯苯。将所得混合物升温到78至82℃，并以剂量控制方式添加109.2 g DPPA，维持温度在80至90℃并且有气体稳定放出，给予20 ml氯苯线路冲洗。将所得混合物于78至82℃下搅拌1小时，直到TLC测定反应完成。将所得混合物冷却到大约70℃，滴加溶解于34 ml氯苯的226 g三氟乙酸并维持温度在70至80℃，接着添加1.57 g的CuCl，并添加25 ml氯苯线路冲洗。将所得混合物于90至95℃搅拌2小时，通过TLC追踪反应直到反应完成。将所得混合物冷却到15至25℃，添加375ml 20% K2CO3水溶液，将所得混合物搅拌15分钟。将所得各层分离，向所得的上部有机层中添加375ml 20% K2CO3水溶液。用硅藻土对所得混合物进行过滤以除去残留的固体，用50 ml氯苯洗涤硅藻土。将所得各层分离。将所得的下部水层合并，并用250 ml氯苯反萃取，将所得的合并有机相用500ml 0.5M 磷酸洗涤。将所得水层用300ml氯苯反萃取，将所得的合并有机相用500ml 5% NaCl水溶液洗涤。
实施剥离重量分析，以测定用于下面的环氧化步骤B中的N-(环己-3-烯-1(R)-基)-2,2,2-三氟-乙酰胺的含量。获得含有69.52g N-(环己-3-烯-1(R)-基)-2,2,2-三氟-乙酰胺的氯苯溶液。
1H NMR (200 MHz, D6-DMSO, ppm)δ9.33 (d, 1H), 5.69–5.56 (m, 2H), 3.82 (s, 宽, 1H), 2.25–1.96 (m, 4H), 1.81–1.74 (m, 1H), 1.66–1.58 (m, 1H)，
MS (ESI, g/mol): m/z 194[M+H]+。
步骤B：2,2,2-三氟-N-(1R,3R,6S)-(7-氧杂-二环[4.1.0]庚-3-基)-乙酰胺
将106.5g间氯过氧苯甲酸(70%)分多份装入到含有经冷却的(10-15℃)步骤A的69.5g N-(环己-3-烯-1(R)-基)-2,2,2-三氟-乙酰胺的溶液的容器中，维持温度在<30℃，用69.5ml氯苯冲洗。将所得混合物于20至25℃下搅拌1小时，通过TLC追踪反应直到反应完成。反应完成时，将所得混合物冷却到0至-5℃，搅拌30分钟，过滤出所得的固体沉淀物(m-CBA)，用2×34.8ml的氯苯洗涤。将所得滤液用347.6ml 10%硫代硫酸钠溶液洗涤以除去过氧化物，将所得水层用208.6ml氯苯反萃取。将所得的合并有机层用347.6ml 5%碳酸氢钠溶液洗涤以确保水相的pH>7，将所得水层用208.6ml氯苯反萃取。将合并的有机层用347.6ml水洗涤。
实施剥离重量分析以测定2,2,2-三氟-N-(1R,3R,6S)-(7-氧杂-二环[4.1.0]庚-3-基)-乙酰胺的含量。
获得含有58.64g 2,2,2-三氟-N-(1R,3R,6S)-(7-氧杂-二环[4.1.0]庚-3-基)-乙酰胺的氯苯溶液，含有大约11%的异侧(反式)环氧化物，将该有机溶液用于下面的步骤C (开环)。
1H NMR (400 MHz, D6-DMSO, ppm)δ9.21 (d, J=7.2Hz, 1H), 3.80–3.52 (m, 1H), 3.10–3.09 (m, 2H), 2.22–1.66 (m, 4H), 2.03–2.10 (m, 1H), 1.91–1.78 (m, 1H), 1.76–1.68 (m, 1H), 1.52–1.30 (m, 2H)，
MS (ESI, g/mol): m/z 208 [MH]-。
步骤C：{(1R,2R,4R)-4-[(2,2,2-三氟乙酰基)氨基]-2-羟基-环己基}-苯-硫代甲酸酯
将步骤B的含有58.64 g 2,2,2-三氟-N-(1R,3R,6S)-(7-氧杂-二环[4.1.0]庚-3-基)-乙酰胺的氯苯溶液浓缩到大约5体积，以环氧化物计。于15-25℃下用氩气对所得浓缩物进行30分钟脱气，并将温度调节到15至20℃。向所得混合物中滴加58.1 g硫代苯甲酸(90 %)，确保温度低于30℃。向所得混合物中添加17.6ml氯苯到容器中作为线路冲洗，于<30℃温度下分多份添加2.49g四丁基氯化铵一水合物。将所得混合物加热到40-45℃，搅拌，通过TLC追踪反应直到反应完成。反应完成时，将所得混合物冷却到0至5℃，搅拌1小时，过滤，将所得滤饼用2×58.64ml氯苯洗涤。将所得固体于<40℃下真空干燥。获得45.5 g固体形式的{(1R,2R,4R)-4-[(2,2,2-三氟乙酰基)-氨基]-2-羟基-环己基}-苯-硫代甲酸酯。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6, ppm) δ 9.38 (S,1H), 7.91 (m, 2H), 7.68 (m, 1H), 7.55 (m, 2H), 5.23 (S,1H), 3.80 (m, 1H), 3.55–3.49 (m, 1H), 3.41–3.34 (m, 1H), 2.13–2.03 (m, 2H), 1.82–1.79 (m, 1H), 1.60–1.38 (m, 3H)。
MS (ESI, g/mol): m/z 348.0 [M+H]+。
下面的反应流程6中总结了用于制备式Ⅲa化合物与式Ⅲb化合物的混合物的式Ⅳa化合物与式Ⅳb化合物的混合物起始材料的合成工艺：
反应流程6
Figure 769840DEST_PATH_IMAGE045
，
其中R代表氨基保护基团，R1代表硫保护基团并且如上文所定义。
实施例20
{(1R,2R,4R)-4-[(叔丁氧羰基)-氨基]-2-羟基-环己基}-苯-硫代甲酸酯和{(1S,2S,4S)-4-[(叔丁氧羰基)-氨基]-2-羟基-环己基}-苯-硫代甲酸酯，
步骤A：环己-3-烯基-1(R)-氨基甲酸叔丁酯和环己-3-烯基-1(S)-氨基甲酸叔丁酯，
Figure 379944DEST_PATH_IMAGE046
，
将50.0 g 3-环己烯-1-甲酸和500 ml甲苯装入到20-25℃的2 L烧瓶中，将所得混合物搅拌，经15分钟滴加60.7 ml三乙胺，接着经20分钟滴加89.7ml DPPA (有气体放出，温升至~50℃)。向所得混合物中添加50ml的甲苯作为线路冲洗。将所得混合物加热回流并搅拌，直到通过TLC和1H NMR测定反应完成。在1小时后显示反应完成。将所得混合物冷却到80℃，经10分钟滴加186ml t-BuOH，接着添加1.26 g CuCl，将所得混合物加热回流。通过1H NMR追踪反应，在1小时后显示反应完成。将所得混合物冷却到20至25℃，经5至10分钟添加250ml饱和NaHCO3溶液。将所得混合物搅拌30分钟，过滤除去剩余的固体，将该固体用25 ml甲苯冲洗。将各层分离，水层用2×150 ml甲苯萃取。合并有机层，用150 ml水洗涤，并真空浓缩。获得79.8 g棕色固体形式的环己-3-烯基-1(R)-氨基甲酸叔丁酯与环己-3-烯基-1(S)-氨基甲酸叔丁酯的混合物。
旋光度：[α]D (CHCl3) = 0°。
通过柱色谱纯化：
通过柱色谱对环己-3-烯基-1(R)-氨基甲酸叔丁酯与环己-3-烯基-1(S)-氨基甲酸叔丁酯的粗混合物进行纯化(洗脱剂：环己烷/醋酸乙酯 9:1)。
鉴定所需的清洁级分并合并。真空浓缩得到所需产物。获得60.88 g白色固体形式的环己-3-烯基-1(R)-氨基甲酸叔丁酯与环己-3-烯基-1(S)-氨基甲酸叔丁酯的混合物。
旋光度：[α]D (CHCl3) =0°。
1H NMR (200 MHz, CDCl3, ppm) δ 5.69-5.53 (m, 2H), 4.55 (s, 宽, 1H), 3.76 (s, 宽, 1H), 2.41–2.30 (m, 1H), 2.12-2.08 (m, 2H), 1.91-1.76 (m, 2H), 1.6–1.48 (m, 1H), 1.43 (s, 9H)。
步骤B：(1R,3R,6S)-(7-氧杂-二环[4.1.0]庚-3-基)-氨基甲酸叔丁酯和(1S,3S,6R)-(7-氧杂-二环[4.1.0]庚-3-基)-氨基甲酸叔丁酯
Figure 988780DEST_PATH_IMAGE047
，
将45 g间氯过氧苯甲酸(70 %)和240 ml CH2Cl2装入到1 L烧瓶中，将所得混合物冷却到10至15℃。向所得混合物中经大约30分钟滴加溶解于45ml CH2Cl2中的30.0 g的环己-3-烯基-1(R)-氨基甲酸叔丁酯和环己-3-烯基-1(S)-氨基甲酸叔丁酯，确保温度低于25℃。向所得混合物中添加15 ml CH2Cl2作为线路冲洗，并将所得混合物于室温下搅拌1小时，加热回流(40℃) 2小时，通过HPLC和TLC追踪反应直到反应完成。反应完成时，将所得混合物冷却到0至5℃，搅拌30分钟，过滤出所得的固体沉淀物(mCBA)并用2×15ml CH2Cl2洗刷。将所得滤液用3×150 ml 10%硫代硫酸钠水溶液洗涤以除去过氧化物，接着用3×150 ml饱和碳酸氢钠溶液洗涤以确保pH>7 (记录为pH=8-9)，接着用2×150 ml水洗涤。将所得有机层浓缩，添加150 ml甲苯，并将所得混合物再次浓缩。向所得浓缩物中添加150 ml甲苯，将所得混合物浓缩至干，添加甲苯至大约2体积，并将所得混合物保存在冰箱中待用于下一步骤。
获得25.73g (1R,3R,6S)-(7-氧杂-二环[4.1.0]庚-3-基)-氨基甲酸叔丁酯与(1S,3S,6R)-(7-氧杂-二环[4.1.0]庚-3-基)-氨基甲酸叔丁酯的混合物(将整批料蒸发至干，称重，并通过NMR分析测定环氧化物、mCBA和甲苯的含量)。该材料中仍然含有mCBA和甲苯。
顺式:反式比例 =100:0，通过1H NMR测定。
旋光度：[α]D (CHCl3) = 0°，
1H NMR (200 MHz, CDCl3, ppm) δ4.82 (s, 宽, 1H), 3.63–3.54 (m, 1H), 3.13 (s, 2H) 2.26–2.03 (m, 2H), 1.96–1.70 (m, 2H), 1.49–1.28 (m, 11H)。
步骤C：{(1R,2R,4R)-4-[(叔丁氧羰基)-氨基]-2-羟基-环己基}-苯-硫代甲酸酯和{(1S,2S,4S)-4-[(叔丁氧羰基)-氨基]-2-羟基-环己基}-苯-硫代甲酸酯
Figure 162272DEST_PATH_IMAGE048
，
将步骤B中获得的含有20.1 g (1R,3R,6S)-(7-氧杂-二环[4.1.0]庚-3-基)-氨基甲酸叔丁酯和(1S,3S,6R)-(7-氧杂-二环[4.1.0]庚-3-基)-氨基甲酸叔丁酯的产物溶液以及60 ml甲苯装入到烧瓶中，将所得混合物于15-25℃下搅拌，将15 ml硫代苯甲酸熔化并滴加到所得的混合物中，确保温度低于30℃。向所得混合物中添加18 ml甲苯作为线路冲洗，一次添加0.8 g四丁基氯化铵一水合物，停止外部温度控制，让所得混合物升温。将所得混合物加热到40-45℃，通过TLC追踪反应直到反应完成。反应完成时(3小时)，将所得混合物冷却到室温，用2×101 ml的5%碳酸氢钠溶液洗涤两次，接着用2×101 ml水洗涤。将所得有机层真空浓缩到最小体积。然后加入101 ml甲苯，将该批料再次浓缩到最小体积。重复该过程，并向所得混合物中再添加101 ml甲苯，并将该混合物浓缩到~40 ml。利用KF (0.04 %)分析水含量。向所得混合物中添加101 ml的甲苯，将所得混合物浓缩至干。
粗产物的产量：35.29g。
向所得粗产物中添加17.6 ml甲苯，搅拌下将所得混合物冷却到10至15℃，在此温度下产生固体沉淀。将所得浆料搅拌45分钟。向所得混合物中滴加17.6 ml庚烷，将所得混合物搅拌1小时。将所得混合物过滤，将所得固体抽干，用甲苯-庚烷(1:1, 8.8 ml)进行置换洗涤，接着用甲苯-庚烷 (1:1，17.6 ml)洗涤浆料，这把不想要的区域异构体的量降至NMR分析不可测的水平。于≤40℃温度下将所得固体真空干燥。获得8.24 g灰白色固体形式的{(1R,2R,4R)-4-[(叔丁氧羰基)-氨基]-2-羟基-环己基}-苯-硫代甲酸酯与{(1S,2S,4S)-4-[(叔丁氧羰基)-氨基]-2-羟基-环己基}-苯-硫代甲酸酯的混合物。
旋光度：[α]D (CHCl3) = 0°，
1H NMR (200 MHz, DMSO-d6, ppm)δ7.91–7.87 (m, 2H), 7.70–7.50 (m, 3H), 6.85 (d, J=6Hz, 1H), 5.13 (d, J=5，6Hz, 1H), 3.50–3.26 (m, 3H), 2.13–1.96 (m, 2H), 1.79–1.69 (m, 1H), 1.54–1.15 (m, 12H)。

Claims (16)

1.结晶形式的单一立体异构体形式的式I化合物的制备工艺，
Figure FDA00002776694200011
该工艺包括：
使式IIa化合物，
Figure FDA00002776694200012
或者
式IIa化合物与式IIb化合物，
的混合物中的胺基团脱保护，其中R是胺保护基团，以及
直接从反应混合物中或者通过在有机溶剂中重结晶分离出以结晶形式的单一非对映异构体形式获得的式I化合物。
2.权利要求1中所定义的式I化合物，该化合物为结晶形式的单一立体异构体形式。
3.如权利要求2所述的化合物，该化合物是晶形1的14-O-{[(1R，2R，4R)-4-氨基-2-羟基-环己基硫烷基]乙酰基}-木替灵。
4.如权利要求2所述的化合物，该化合物是晶形2的正丁醇溶剂化物形式的14-O-{[(1R，2R，4R)-4-氨基-2-羟基-环己基硫烷基]乙酰基}-木替灵。
5.权利要求1中所定义的式I化合物，该化合物为结晶盐形式的单一立体异构体形式。
6.如权利要求5所述的结晶盐，该结晶盐是醋酸盐、乳酸盐、或马来酸氢盐。
7.如权利要求5或6任一项所述的化合物，该化合物选自：
晶形A的14-O-{[(1R，2R，4R)-4-氨基-2-羟基-环己基硫烷基]乙酰基}-木替灵醋酸盐，
晶形B的14-O-{[(1R，2R，4R)-4-氨基-2-羟基-环己基硫烷基]乙酰基}-木替灵醋酸盐，
晶形1的14-O-{[(1R，2R，4R)-4-氨基-2-羟基-环己基硫烷基]乙酰基}-木替灵L-乳酸盐，以及
晶形1的14-O-{[(1R，2R，4R)-4-氨基-2-羟基-环己基硫烷基]乙酰基}-木替灵马来酸氢盐。
8.如权利要求1或2所述的工艺，其中式IIa化合物、或者式IIa化合物与式IIb化合物的混合物通过如下方式得到：
分别使式IIIa化合物，
Figure FDA00002776694200021
或者
式IIIa化合物与式IIIb化合物，
的混合物与经活化的14-O-AKT-乙酰基-木替灵偶合，其中R如权利要求1中所定义，并且其中AKT是活化基团，任选地是甲磺酰基、苯磺酰基、甲苯磺酰基，或者-O-AKT是卤素；任选地14-O-AKT-乙酰基-木替灵是下式的化合物，
以及自反应混合物中分别分离出所得的式IIa化合物、或者式IIa化合物与式IIb化合物的混合物。
9.如权利要求8所述的工艺，其中式IIIa化合物、或者式IIIa化合物与式IIIb化合物的混合物通过如下方式得到：
分别使式IVa化合物，
Figure FDA00002776694200031
或者
式IVa化合物与式IVb化合物，
Figure FDA00002776694200032
的混合物中的巯基官能团脱保护，其中R如权利要求8中所定义并且R1是巯基保护基团，以及自反应混合物中分离所得的式IIIa化合物、或者式IIIa化合物与式IIIb化合物的混合物。
11.权利要求1中所定义的式IIa化合物，用作权利要求1中所定义的式I化合物的制备工艺中的中间体，并且为单一立体异构体的形式。
12.药物组合物，包含结晶的14-O-{[((1R，2R，4R)-4-氨基-2-羟基-环己基)硫烷基]乙酰基}-木替灵，或者包含任选结晶的14-O-{[((1R，2R，4R)-4-氨基-2-羟基-环己基)硫烷基]乙酰基}-木替灵的醋酸盐、乳酸盐或马来酸氢盐作为活性成分，以及药学上可接受的载体或稀释剂。
13.权利要求8中所定义的式IIIa化合物，用作权利要求1中所定义的式IIa化合物的制备工艺中的中间体，并且为单一立体异构体的形式。
14.如权利要求1所述的式IIa化合物，其中R如权利要求1中所定义。
15.如权利要求14所述的化合物，其中式IIa化合物中的R是叔丁氧羰基或三氟乙酰基。
16.如权利要求8所述的式IIIa化合物，其中R如权利要求8中所定义。
17.如权利要求16所述的化合物，其中式IIIa化合物中的R是叔丁氧羰基或三氟乙酰基。
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