CN103074420B

CN103074420B - 一种L型PML/RARα融合基因检测试剂盒及相应的检测方法

Info

Publication number: CN103074420B
Application number: CN201210449468.XA
Authority: CN
Inventors: 李然; 王宏伟; 覃艳红; 陈秀花; 任方刚; 张耀方; 徐智芳; 李莉; 郭海秀; 王晓娟
Original assignee: Shanxi Medical University
Current assignee: Shanxi Medical University
Priority date: 2012-11-12
Filing date: 2012-11-12
Publication date: 2014-08-27
Anticipated expiration: 2032-11-12
Also published as: CN103074420A

Abstract

本发明涉及血液分子生物学领域，具体为一种L型PML/RARα融合基因检测试剂盒及相应的检测方法，由以下试剂组成：功能化氧化石墨烯、序列为5’FITC-TGACCTGCCATTGAG-3’的FITC标记的单链DNA、试剂Ⅰ、甲醛、皂角素以及PBS缓冲液，其中试剂Ⅰ由Tris碱、NaCl、KCl、MgCl₂、HCl、H₂O组成，使用方法包括细胞培养、与细胞共孵育的孵育液制备、细胞预处理和孵育液与细胞共孵育。使用本试剂盒提供的试剂，可以快速、准确检测出某一种细胞是否存在L型PML/RARα融合基因，该试剂盒更敏感、特异，操作简单、快速，这对于APL的诊断及其微小残留的监测具有重要的意义，可以做到早期预测复发、指导临床治疗。

Description

一种L型PML/RARα融合基因检测试剂盒及相应的检测方法

技术领域

本发明属于血液分子生物学领域，具体涉及一种L型PML/RARα融合基因检测试剂盒及相应的检测方法。

背景技术

白血病是一类造血干细胞异常的克隆性恶性疾病。其克隆中的白血病细胞失去进一步分化成熟的能力而停滞在细胞发育的不同阶段。在骨髓和其他造血组织中白血病细胞大量增生积聚并浸润其他器官和组织，同时使正常造血受抑制，临床表现为贫血、出血、感染及各器官浸润症状。染色体异常是白血病发生的常见原因之一。根据白血病细胞的成熟程度和自然病程，白血病可分为急性和慢性两大类。急性白血病的细胞分化停滞在较早阶段，多为原始细胞及早幼细胞，病情发展迅速。其中急性早幼粒细胞白血病(Acute Promyelocytic Leukemia，APL)是一种常伴发严重出血的急性白血病，95％以上的APL发生特异性的染色体易位t(15；17)(q22；q12～21)，导致15号染色体上的早幼粒细胞白血病（(Promyelocytic leukemia，PML）基因与17号染色体上的维甲酸受体α (Retinoic acid receptorα，RARα)基因融合产生PML／RARα融合基因。依据PML基因内部断点不同，可分为L、S和V型三种，其中L型PML／RARα融合基因为主要类型，约占70~80%。分子生物学研究表明，PML／RARα融合基因是APL高度特异性的分子标志物，是APL患者发病的重要机制之一，已作为APL MICM分型诊断的依据之一。近年来，随着维甲酸、三氧化二砷在临床上的应用，APL完全缓解(complete reminion, CR)率明显提高，长期无病生存的病例大大增加。但白血病的复发问题却一直困扰着医务人员，关键原因在于临床上CR患者体内仍有微小残留病灶(minimal residual disease MRD)存在。初发患者体内白血病细胞总数为10¹²～l0¹³，经化疗诱导达到血液学CR后，体内仍残留10⁶～l0⁸ 白血病细胞。因此，准确监测APL微小残留病，预测复发，指导临床治疗是提高APL患者长期生存率的主要途径之一。

目前PML／RARα融合基因检测的方法主要有染色体分析、实时定量RT-PCR、荧光原位杂交技术等，但这些方法均存在特异性不高、操作繁琐、检测费用高等问题，限制了其广泛应用【魏娜，陈敬华，王昆等. 发夹结构DNA探针用于检测白血病PML／RARα融合基因的电化学传感器的研究[J]. 分析测试学报，2008，27(9)：907—910】。所以急需建立一种简便、快速、高特异性的检测新方法。

发明内容

本发明提供了一种L型PML/RARα融合基因检测试剂盒及相应的检测方法，目的是实现某一种细胞该融合基因的检测。

本发明是采用如下技术方案实现的：一种L型PML/RARα融合基因检测试剂盒，由以下成分组成：功能化氧化石墨烯、序列为5’FITC-TGACCTGCCATTGAG-3’的FITC标记的单链DNA、试剂Ⅰ、甲醛、皂角素、PBS缓冲液，试剂盒中各成分浓度及用量见表1，所列试剂的量为10个样本反应：

表1

序号	试剂名称	体积ml	说明
				1	功能化氧化石墨烯	0.2	浓度2 mg/ml
2	5’FITC-TGACCTGCCATTGAG-3’	2	浓度为1μmol/l；纯度为HPLC级别；5’端7个碱基位于PML基因，3’端8个碱基位于RARa基因
				3	试剂Ⅰ	7.8
4	甲醛	1.0	浓度10%V/V
				5	皂角素	1.0	浓度0.05%V/V
6	PBS缓冲液	130	浓度0.1mol/L

其中试剂Ⅰ的组分及各成分浓度、用量见表2，

表2

上述试剂中，PBS缓冲液就是使用0.1mol/L的PBS配制，可直接使用，其组成和配比是本领域的公知常识；所述试剂Ⅰ可按上述步骤配制；所述甲醛、皂角素购自贝克曼库尔特公司：其中甲醛起是细胞固定液、皂角素是细胞破膜剂；序列为5’FITC-TGACCTGCCATTGAG-3’的FITC标记的单链DNA可从上海生工生物工程有限公司购得。公知，石墨烯(Graphene) 为单原子层二维原子晶体，其厚度仅为0.35 nm（约为头发直径的二十万分之一），是世界上最薄的新型二维纳米材料，石墨烯优异的电学、力学和热学性质使其在复合材料、传感器、能源等领域具有重要的应用前景，成为近年来纳米领域研究的热点。在生物医学领域应用较多的石墨烯衍生物主要是氧化石墨烯（Graphene Oxide，GO)，本发明是对GO进行功能化，将其与PEG合成，使功能化后的GO具有更好的生物相容性、亲水溶液稳定性等特性。得到的功能化GO对本发明所设计的单链DNA探针具有很强的吸附能力，并能淬灭标记在单链DNA上的荧光；当与本发明中预处理后的细胞中互补的目标分子作用后，荧光探针标记的单链DNA可从功能化GO上脱落，探针的荧光得到恢复。

一种L型PML/RARα融合基因检测试剂盒的检测方法，包括以下步骤：

（1）细胞培养：将待测细胞接种于含10％胎牛血清的RPMI-1640培养液中，在37 ℃，5％CO₂条件下培养，2~3天半量换液；（2）与细胞共孵育的孵育液制备：将功能化氧化石墨烯、序列为5’FITC-TGACCTGCCATTGAG-3’的FITC标记的单链DNA和试剂Ⅰ混合即得到孵育液；（3）细胞预处理：A、将待测细胞收集到流式离心管中，于室温下1000 rpm离心5 min，弃去上清液；B、然后在上述流式离心管中加入100 μl甲醛，立刻混匀，室温下静置10～15min后，向流式离心管中加入4ml PBS缓冲液吹打混匀后，于室温下1000 rpm离心5 min，弃去上清液；C、最后在处理完的流式离心管中加入100μl皂角素，混匀，室温下静置5 min后，向流式离心管中加入4 ml PBS缓冲液轻轻混匀后，于室温下1000 rpm离心5 min，弃去上清液备用；（4）孵育液与细胞共孵育：将步骤（2）得到的孵育液加入步骤（3）处理后的流式离心管中，充分混匀，避光、静置1h后，于室温下1000 rpm离心5 min，弃去上清液，然后向流式离心管中再加入4 ml PBS缓冲液混匀后，于室温下1000 rpm离心5 min，弃去上清液，再向流式离心管中加1ml PBS缓冲液，混匀后进行结果分析。

上述步骤（4）中的分析方法采用激光共聚焦显微镜法和流式细胞仪法。

本发明所述试剂盒的使用原理是：预处理后的待测细胞与试剂Ⅰ、功能化GO、FITC标记的单链DNA的混合液共孵育后，功能化GO与FITC标记的单链DNA探针吸附，并淬灭标记在单链DNA上的FITC荧光，如果待测细胞中有L型PML/RARα融合基因存在，则FITC标记的单链DNA与L型PML/RARα融合基因的mRNA结合，使FITC标记的单链DNA从功能化GO上脱落，出现绿色荧光信号。本发明通过激光共聚焦显微镜和流式细胞仪进行分析。

与现有技术相比，本发明利用功能化GO作为载体及荧光淬灭工具，携带荧光标记的单链DNA作为探针，可以快速、准确检测出某一种细胞是否存在L型PML/RARα融合基因，为急性早幼粒细胞白血病(Acute Promyelocytic Leukemia，APL) PML/RARα融合基因的检测提供了一种操作简单、敏感、特异、快速有效的检测试剂盒。这对于APL的诊断及其微小残留的监测具有重要的意义，可以做到早期预测复发、对临床治疗具有指导意义。

附图说明

图1为K562细胞激光共聚焦显微镜分析结果图一；

图2为K562细胞激光共聚焦显微镜分析结果图二；

图3为NB4细胞激光共聚焦显微镜分析结果图一；

图4为NB4细胞激光共聚焦显微镜分析结果图二；

图5为没有FITC标记单链DNA 干预NB4细胞对照组PML/RARα融合基因流式细胞仪分析结果图；

图6为FITC标记单链DNA 干预NB4细胞试验组PML/RARα融合基因流式细胞仪分析结果图。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明作进一步描述，但本发明不局限于实施例的内容。

一种L型PML/RARα融合基因检测试剂盒，由以下成分组成：功能化氧化石墨烯、序列为5’FITC-TGACCTGCCATTGAG-3’的FITC标记的单链DNA、试剂Ⅰ、甲醛、皂角素、PBS缓冲液，试剂盒中各成分浓度及用量见表1，所列试剂的量为10个样本反应：

表1

序号	试剂名称	体积ml	说明
				1	功能化氧化石墨烯	0.2	浓度2 mg/ml
2	5^,FITC-TGACCTGCCATTGAG-3^,	2	浓度为1μmol/l；纯度为HPLC级别；5^,端7个碱基位于PML基因，3^,端8个碱基位于RARa基因
				3	试剂Ⅰ	7.8
4	甲醛	1.0	浓度10%V/V
				5	皂角素	1.0	浓度0.05%V/V
6	PBS缓冲液	130	浓度0.1mol/l

其中试剂Ⅰ的组分及各成分浓度、用量见表2，

表2

1×PBS缓冲液的组分及用量如表3所示，表3

L型PML/RARα融合基因检测试剂盒的检测方法，包括以下步骤：

（一）功能化GO的制备

1、GO的制备：

① 将1 g石墨放入烧杯中，向其中加入0.75 g NaNO₃、75 ml浓H₂SO₄ ，将烧杯置于冰浴，并对烧杯中的混合物进行搅拌。边搅拌边缓慢连续在1 h内向烧杯中加入5 g KMnO₄，再在冰浴下持续搅拌2 h，然后置室温搅拌4 d后，再次在冰浴下向烧杯中缓慢加入2.2 g KMnO₄，并继续搅拌30 min。

②将温度升至98 ℃,在1 h内向烧杯中缓慢加入140 ml 5%稀H₂SO₄，此过程仍需在搅拌器搅拌下完成，然后继续在98 ℃水浴下搅拌2 h。

③将温度降至60 ℃后，加入100 ml 30%H₂O₂，在室温下搅拌2 h。

④将所得液体于室温下4000 rpm离心10 min，共离心1次。弃去上清液，留沉淀物。

⑤向中所得沉淀物种加480 ml 3%稀HCl于室温下4000 rpm离心8 min，共离心2次。弃去上清液，留沉淀物。

⑥向中所得沉淀物中加入灭菌蒸馏水反复洗涤，直至上清液PH值偏中性。

⑦将中所得沉淀物收集至烧杯中，加入120 ml灭菌蒸馏水，用细胞破碎仪超声探头超声1 h后，再次离心后取上清液，即得到GO。

2、GO的功能化：

取5 ml GO，向其中加3M NaOH , 超声4 h，与HCl中和、直至液体PH值偏中性。然后再加入10 mg/ml PEG，水浴超声10 min。加EDAC达5mmol/L，超声30 min。然后再加入EDAC达20mmol/L，再搅拌12 h，最后加巯基乙醇结束反应。

（二）细胞培养

NB4细胞（实验组细胞）、K562细胞（对照组细胞）接种于含10％胎牛血清的RPMI-1640培养液中，在37 ℃，5％CO₂条件下培养，2~3天半量换液。实验前进行细胞计数，按实验要求调整细胞密度。

（三）与细胞共孵育的液体制备

准备12个1.5ml EP管分装液体，与细胞共孵育液体制备方法详见表5。

表4：与细胞共孵育液体制备方法

分组	1号液	2号液（避光制备）	说明
				NB4细胞	试剂Ⅰ、功能化GO的混合液	试剂Ⅰ、功能化GO、荧光标记单链 DNA的混合液	1、2号液各制备3份
K562细胞	试剂Ⅰ、功能化GO的混合液	试剂Ⅰ、功能化GO、荧光标记单链 DNA的混合液	1、2号液各制备3份

注：每个样本的用量为：试剂Ⅰ780 μl、荧光标记单链 DNA 200 μl、功能化GO 20 μl

（四）细胞预处理

1、NB4细胞分别收集到6个流式离心管中，同样K562细胞也收集到6个流式离心管中。每个流式管中细胞数约2×10⁶个，于室温下1000 rpm离心5 min，弃去上清液。

2、上述1中的12个离心管中，每管中加入100 μl甲醛、立刻混匀，室温下静置10～15min后，每管中加入4ml PBS（1×）缓冲液吹打混匀后，于室温下1 000 rpm离心5 min，弃去上清液。

3、上述2中处理完的12个离心管中、每管中加入100μl皂角素、混匀。室温下静置5 min后，每管中加入4 ml PBS（1×）缓冲液轻轻混匀后，于室温下1000 rpm离心5 min，弃去上清液备用。

（五）孵育液与细胞共孵育

将表4中12个EP管中的液体按照表4中的说明分别加入到（四）3中处理后的12个离心管中，充分混匀、避光、静置1h后，于室温下1000 rpm离心5 min，弃去上清液。然后每个离心管中再加入4 ml PBS（1×）缓冲液混匀后，于室温下1 000 rpm离心5 min，弃去上清液，每个离心管中加1ml PBS（1×）缓冲液，混匀后用移液器移至24孔板中的12个孔中待检测。

分析方法

本结果分析包括激光共聚焦显微镜法和流式细胞仪法

（一）激光共聚焦显微镜法

1、将24孔板置于激光共聚焦显微镜载物台上。

2、点击FV10-ASW软件中的荧光显微镜按钮，关闭汞灯快门。同时，点击明场按钮，关闭卤素灯快门。

3、点击染料选择按钮。在染料列表中，双击FITC荧光染料。

4、点击Apply按钮。

5、点击XY Repeat按钮开始扫描。

6、调节绿色（FITC）图像。

7、点击Stop按钮停止扫描。

8、选择AutoHV，并选择扫描速度。

9、点击XY按钮取得一副图像。

10、点击SeriesDone按钮，“2D View-LiveImage(X)”2D界面就出现。

11、保存图像：右击图像管理器中显示的图像图标，选择另存为保存图像。

（二）流式细胞仪法

1、将激光共聚焦显微镜检测完毕后的24孔板中6个孔的NB4细胞液各收集500 μl 于6个流式管中作为上样标本。

2、标本检测使用CXP采集软件。

3、开机，机器预热。

4、用标准荧光微球Flow-check调整光路，使得每一个荧光通道的half-CV值都小于2。

5、将6个上样标本放在上样盘中，选择FITC荧光通道，调整好电压条件后进行数据采集。

6、收集细胞。

7、实验同时设置阴性对照组，分别上样，在相同采集条件下采集数据。

8、用CXP分析软件进行结果分析。

结果分析

（一）激光共聚焦显微镜法结果分析

图1和图2为K562细胞，图3和图4为NB4细胞；图1和图3无FITC标记的单链DNA探针干预，图2和图4有FITC标记的单链DNA探针干预。可见：图1、图2、图3中均无绿色荧光；而图4中出现绿色荧光。说明图4细胞有L型PML/RARα融合基因；其原因是：预处理后的NB4细胞与试剂Ⅰ、功能化GO、FITC标记单链DNA的混合液共孵育后，功能化GO与FITC标记的单链DNA探针吸附，并淬灭标记在单链DNA上的FITC荧光；如果有L型PML/RARα融合基因存在则FITC标记单链DNA与L型PML/RARα融合基因的mRNA结合，使FITC标记单链DNA从功能化GO上脱落，出现绿色荧光信号。由于K562细胞无PML/RARα融合基因存在，故无论有无FITC标记的单链DNA探针干预均无绿色荧光信号，见图1和2。即使NB4细胞有PML/RARα融合基因mRNA表达，但是由于无FITC标记的单链DNA探针干预，故也无绿色荧光信号，见图3。

（二）流式细胞仪法结果分析

FITC标记单链DNA 干预NB4细胞PML/RARα融合基因流式细胞仪分析结果图。图5为NB4细胞对照组，图6为NB4细胞实验组。对照组FITC阳性的细胞数为（1.20±0.20）%，而实验组FITC阳性的细胞数为（56.00±8.19）%，进一步经统计学分析，实验组与对照组的差异具有显著性（F=134.384，P=0.000 ），见图5、6、表5，说明L型PML/RARα融合基因阳性细胞数占56%以上，可判定为阳性。

表5：FITC标记单链DNA 干预NB4细胞PML/RARα融合基因结果

<110>山西医科大学

<120>一种L型PML/RARα融合基因检测试剂盒及相应的检测方法

<160> 1

<170> PatentIn Version 3.5

<210> 1

<211> 15

<212> DNA

<213> 人（Homo sapiens）

<400> 1

　　 tgacctgcca ttgag

Claims

1.一种L型PML/RARα融合基因检测试剂盒，其特征是由以下成分组成：功能化氧化石墨烯、序列为5’FITC-TGACCTGCCATTGAG-3’的FITC标记的单链DNA、试剂Ⅰ、甲醛、皂角素、PBS缓冲液，试剂盒中各成分浓度及用量见表1，所列试剂的量为10个样本反应：

表1

其中试剂Ⅰ的组分及各成分用量见表2，

表2

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